Fehérjék glikozilációja, a cukorláncok heterogenitása, és ennek tömegspektrometria alapú vizsgálata Vékey Károly és Drahos László MTA Természettudományi Kutatóközpont Budapest
szénhidrátok N-glikoproteinek O-glikoproteinek protein-glikáció, stb. fehérjék
N-glikoproteinek Gyakori poszt-transzlációs módosulás Heterogén cukorszerkezetek Biológiai szerepük jelentős, de ez csak részben ismert Fehérje alapú gyógyszerek egyik legfontosabb jellemzője proteinek tulajdonságait módosítják a sejtek közötti kommunikáció, immunválasz egyik fő eszköze számos betegségben szerepük van
Publikációs statisztika Publikációk száma évente glycosylation Web of science A glikoziláció tudományterülete gyorsan fejlődik
N-glikoproteinek analízise cukorláncok vizsgálata peptidlánc vizsg. adott fehérje, adott pontján levő cukorláncok leírása fehérjespecifikus glikoziláció a mintában levő összes szénhidrát helyspecifikus glikoziláció jelentős heterogenitás proteolitikus emésztést követően gyakorlatilag csak MS nehéz, bonyolult az esetek 1%-ban tömegspektrometrián alapul overall gliko mintázat gyakran a cukorlánc lehasítása után számos kísérleti technika leggyakrabban alkalmazott egyszerű, gyakori megoldás kromatográfia, elektroforézis
A tömegspektrometria
Publikációs statisztika Publikációk száma évente Publikációk számának változása glycosylation glycosylation + MS Web of science A tömegspektrometria szerepe a glikoziláció vizsgálatában fontos, kiemelkedően gyorsan növekszik Szélesebb körben használják, mint a kromatográfiát és az elektroforázist A helyspecifikus glikozilációval csak a cikkek 1% foglalkozik, ez gyorsan bővül (technikai lehetőségek változása)
Helyspecifikus glikozilációs mintázat A vizsgálat elve: A fehérje proteolitikus emésztése, majd A glikopeptidek tömegspektrometriás analízise A vizsgálat előnyei: Új, részletes, korábban ismeretlen info A fehérje izolálása nem szükséges; a vizsgálat keverékekben is elvégezhető Szennyezések nem zavarnak A vizsgálat hátrányai: Módszerfejlesztést igényel, időigényes Izomerekről ( linkage analysis ) csak korlátozott info A proteomikában megszokottnál 1000-10.000-szer kevésbé érzékeny (pmol mennnyiségű anyagot igényel)
A vizsgálat menete Mintaelőkészítés Humán várplazma A (gliko)proteinek frakcionálása (RP-HPLC) A frakciók tripszines emésztése, így komplex peptid-glikopeptid elegyhez jutunk Nano-UHPLC-MS(MS) analízis Több, egymást követő HPLC-MS vizsgálat Számítógépes értékelés Az eredmények értékelése a szűk keresztmetszet Saját fejlesztésű algoritmus és szoftver (Glycominer és Glycopattern; 1-2000 felhasználó) Az eredmények alapján új MS és MS/MS kísérletek
% % A HPLC-MS/MS mérés 13.11 27.26 30.37 30.44 kromatogramm 100 47.41 komponens-szelekció 24.18 24.36 31.09 12.57 12.42 14.90 18.00 23.64 31.48 33.66 43.51 44.73 39.06 49.17 51.02 56.71 52.24 57.32 61.46 62.27 65.90 66.21 70.28 79.39 79.46 81.18 68.04 12.22 11.68 58.60 60.04 73.25 75.01 75.58 77.08 88.58 84.75 89.48 88.41 90.26 11.35 90.55 0 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 Time 0 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 Time MS/MS spektrum MS-spektrum
Az értékelés elve és logikája Glikoproteinek azonosítása std. MS/MS, Mascot rutin Glikopeptidek azonosítása std. MS/MS, Glycominer nem rutin glikopeptidek: kis mennyiség, kis érzékenység Oligoszaccharid struktúrák hely- és protein-specifikus azonosítása speciális MS/MS, Glycominer kihívás MS/MS spektrumok automatikus értékelése interferenciák kiszűrése retenciós idők figyelembe vétele Helyspecifikus glikozilációs mintázatok meghatározása Speciális MS, Glycopattern kihívás kvantitatív mérések, interferenciák kiszűrése www.szki.ttk.hu/ms/glycominer www.szki.ttk.hu/ms/glycopattern
Eredmények 1: Különböző fehérjék helypecifikus glikozilációs mintázata
Eredmények 2: helypecifikus mintázatok különböző emberekben
Eredmények 3: ~5000 glikoforma-intenzitást azonosítottunk és értékeltünk... 879.2888 20.66692 3392.156 53.94325 98.4795 106.8194 53.53566 10.79487 92.24821 119.5369 3931.353 164.0474 89.07406 46.91871 26.91111 361.249 263.9675 31.16395 3 583.9128 22.72805 3501.64 90.96524 107.4856 34.16451 14.64319 84.02992 45.10372 4243.437 167.2035 109.8002 53.17426 27.89439 336.5583 28.7322 240.4393 107.3876 1 711.1419 23.78376 3434.215 65.49496 85.47472 45.08138 16.95067 68.24852 3559.147 169.3107 79.84666 37.29689 15.62672 251.3989 17.52184 207.8075 48.3497 106.8235 405.5989 15.2296 2364.45 22.77364 78.5252 91.55459 49.96683 20.75363 112.1115 20.78709 3417.132 145.8501 105.9062 39.23856 16.75461 245.6821 35.48311 187.59 27.13092 2 874.2324 13.64116 2695.573 96.72399 94.38402 65.90741 10.56139 105.7909 143.4639 3188.317 135.6685 103.4717 42.15478 27.87793 320.8873 21.56103 236.4051 52.58777 39.06956 4 861.7956 21.98731 2133.813 26.74729 76.43281 107.6015 45.8787 16.45464 93.09336 131.1165 3178.084 147.9789 106.5576 57.6884 19.01048 313.8294 29.60908 114.9945 3.946762 3 336.7241 14.00473 2468.772 42.51203 57.72934 70.30151 47.69538 9.572016 62.00732 60.19106 3005.305 127.0169 82.72026 44.31366 12.99002 380.8971 180.3022 34.73118 101.4688 2 217.9028 18.32908 3081.033 47.85858 94.36293 86.83779 67.35817 58.99396 3152.618 133.0791 21.55845 16.33874 299.396 14.59826 244.0051 110.0706 372.808 10.93952 2814.797 67.95411 68.19674 81.52752 89.97142 26.65648 3115.713 129.5928 57.133 20.60719 307.8287 16.94491 226.1841 32.76303 68.30142 377.6002 18.32565 2528.878 56.01385 64.22017 88.38033 33.2209 23.98982 83.808 121.4666 2930.295 107.8708 47.20444 19.38246 218.4245 10.76901 144.2403 23.39287 46.60108 3 698.2948 21.75339 3334.555 76.40866 62.05582 86.89521 21.36809 12.1484 2268.863 210.6217 15.83941 33.76068 21.25774 255.8418 171.6218 42.56122 124.9069 818.1007 23.54553 2951.647 62.11186 71.14689 89.78275 53.15173 92.96644 68.66684 2825.136 97.85193 31.19201 49.83702 16.63996 282.3055 7.58241 186.5136 9.45177 71.01998 1 688.037 9.095772 2043.213 11.91334 79.24673 107.2988 57.2946 34.48501 79.46777 82.94539 4221.502 138.8839 136.5516 44.11398 26.52419 275.6971 14.97446 226.3308 23.05792 4 658.0858 7.896488 2381.479 82.64132 100.0957 65.03868 9.487775 95.02697 162.8627 4176.751 139.4391 107.8218 61.09809 14.22836 403.7011 43.08594 210.8814 8.915003 3 885.2087 3533.954 48.19665 52.97513 82.70748 62.09104 5.523902 86.91598 47.98179 3502.497 124.7314 130.61 39.68692 28.08934 358.5961 37.3993 247.4495 34.35113 89.06547 212.2524 18.37166 2242.935 22.53774 94.34054 108.2744 53.26582 100.3992 85.12449 4197.309 198.4922 162.4667 55.87012 16.58225 307.5646 19.13765 178.6875 45.34424 51.08505 3 812.1037 34.15174 4316.41 34.08998 150.3313 103.8109 65.10693 134.7977 3045.716 178.1197 77.76755 23.27868 317.5181 21.26184 227.5937 47.22173 145.9115 2 649.5198 20.73621 3647.738 60.89538 83.20189 104.1179 4.275038 4.290568 91.81909 89.86046 4059.37 192.1566 360.469 26.26674 268.4725 49.4228 66.5239 5 1924.356 66.92195 26.11486 63.6147 28.29737 9.800727 45.84396 84.83384 1822.604 78.77326 59.15453 32.58532 137.5722 13.65144 134.8386 17.46777 47.90212 2 122.6538 2153.536 80.72175 34.06964 52.3154 48.31685 36.68402 51.04268 20.39241 2055.774 83.5774 48.35498 29.69981 197.4276 5.075066 133.2915 23.75796 111.8837 1 572.4022 6.804973 3059.924 65.80604 77.29973 115.7736 64.57681 17.97603 87.86781 87.6628 3276.449 154.2162 45.74747 52.08117 24.64668 293.9884 12.40016 167.1694 20.72488 148.3897 2 917.1453 13.69299 2306.012 39.4329 56.69123 91.0748 51.14601 19.69206 104.2892 89.96194 3018.404 147.3408 121.4474 44.37755 10.18399 356.2429 19.59253 133.791 11.56165 538.0671 2268.576 25.99865 59.4138 87.87743 43.24035 6.778781 124.127 44.79768 3883.223 167.1043 35.36805 68.69376 10.47581 343.1495 38.45465 204.8099 24.87227 13.55111 3 582.6006 17.92335 2876.272 43.63148 80.76786 92.44297 48.88998 14.2472 88.32636 74.8998 3421.234 146.6387 91.81372 42.79296 20.44569 313.0807 23.49292 211.2995 32.95333 88.85358 631.3319 21.20819 2938.36 64.84479 65.80763 88.35276 35.91357 23.98982 88.38722 67.42728 2674.765 138.7815 23.51571 43.60071 19.09338 252.1906 9.175711 167.4586 25.13528 80.84264 2 743.7772 8.49613 2652.882 30.055 71.62106 96.70064 61.47477 16.4989 87.13691 97.92995 3966.917 134.3515 124.9945 48.29966 22.9473 345.9981 31.8199 228.2206 22.10802 89.06547 3 557.9586 24.41987 3402.361 39.17436 109.2912 105.4011 40.8826 4.290568 109.0053 87.49247 3767.465 189.5895 120.1171 39.5744 16.58225 328.5172 22.22207 224.9179 47.32959 87.84015 3 122.6538 2038.946 73.82185 30.09225 57.96505 38.30711 23.24237 48.44332 52.61312 1939.189 81.17533 53.75475 31.14257 167.4999 9.363251 134.0651 20.61287 79.89291 2 675.8715 10.24898 2544.837 43.74586 64.46825 98.24194 52.98773 14.81562 105.428 74.14081 3392.692 156.2204 67.52097 55.05083 15.10216 331.1269 23.48244 168.5901 19.05293 80.97038 3 0.444435 0.25822 0.174969 0.38857 0.185872 0.14087 0.196575 0.289444 0.194332 0.606539 0.122586 0.113657 0.197923 0.256464 0.280919 0.143262 0.334263 0.21398 0.480489 0.325275 0 0.360756 0.12506 0.137152 0.161439 0.072163 0.016343 0.44724 0.073268 0.810794 0.132883 0.449749 0.461646 0.197767 0.121635 0.127271 0.245569 0.128043 0.661355 0.495609 0 0.165904 0.099813 0.294604 0.853641 0.226704 0.130736 0.063581 0.951701 0.089307 0.601329 0.101545 0.062045 0.121331 0.234011 0.330813 0.187646 0.4671 0.080436 0.576471 0 0.55601 0.34851 0.311046 0.502313 0.32917 0.023653 0.788873 0.208661 0.038276 0.166915 0.054993 0.498608 0.582337 0.085582 0.164713 0.199861 0.043132 0.579237 0 0.07948 0.132182 0.186921 0.137838 0.369537 0.817875 0.075884 0.866076 0.085023 0.041848 0.142061 0.065517 0.252682 0.647682 0.00816 0.21578 0.566281 0 0.310197 0.475224 0.175442 0.462927 0.173658 0.1554 0.203572 0.473338 0.172216 0.343102 0.130862 0.064224 0.695919 0.225739 0.547411 0.099123 0.573014 0.210752 0.357478 1.177532 0
NEEYNK AGP Értékelés: Korrelációk és következtetések Fukoziláció mértéke: AGP, 2 helyzet Fukoziláció mértéke: TRFE vs. AGP LVPVPITNATLDR TRFE Az egyes fehérjék és egyes helyek eltérő mértékben fukoziláltak kék: egyedi minták narancs: betegcsoportok A fukoziláció mértéke jól korrelál: - van, aki nagy mértékben, - van aki kevéssé fukozilált Jól értelmezhető a fukoziláció mechanizmusával
TRFE - QQQHLFGSNVTDcSGNFcLFR TRFE QQQHLFGSNVTDcSGNFcLFR-BiS2F Értékelés: Nem mindenki korrelál... Triantennás láncok rel. mennyisége Adott típusú fukoziláció TRFE - cglvpvlaenynk AGP LVPVPITNATLDQITGK-TriS2F Sok esetben a paraméterek nem korrelálnak egymással kék: egyedi minták narancs: betegcsoportok Egyes helyek-szerkezetek konzervativak, mások variábilisak
Összefoglalás és kitekintés Glikoproteinek helyspecifikus glikozilációja fontos információt nyújt alig vizsgált, új irányzat Tömegspektrometria (nano-hplc-ms/ms) + saját algoritmusfejlesztés
Köszönet: Kollégák, diákok Ács A, Drahos L, Gömöry Á, Gulyássy P, Ozohanics O, Révész Á, Tóth E, Turiák L, Újszászy K Berényi L, Bihari M, Bobály B, Budai L, Czuczy N, Dobó A, Gömöry Á, Imre T, Jakab A, Jekő A, Kiss A, Krenyácz J, Együttműködő partnerek Averna M, Bongiorno D, Buzás E, Ceraulo L, Cooks RG, Diez-Masa C, de Frutos M, Gráf L, Héberger K., Jekő J, Kéki S, Kremmer T, Malorni A, Noto D, Paizs B, Pocsfalvi G, de Puerta A, Somogyi A, Telekes A Korábbi kollégék, diákok Lengyel Á,Lipták M, Lovász Cs, Ludányi K, Marino F, Memboeuf A, Nagy K, Nemes P, Pollreisz F, Schlosser G, Szabó P, Szabó R, Szilágyi Z, Sztáray J, Takáts Z, Vas Gy $ $ $ MTA, OTKA, Medichem, Obekon, FP7 Marie Curie, Center for Biochem. Excellence