Monolisa HBe Ag-Ab PLUS

Monolisa HBe Ag-Ab PLUS 2 lemez 192 72396 96 HBe Ag - 96 HBe Ab Tesztkészlet HBe antigén és HBe antitest kimutatására enzimimmunoassay módszerrel 883599-2014/01

TARTALOMJEGYZÉK 1. A FELHASZNÁLÁS CÉLJA 2. KLINIKAI JELENTŐSÉG 3. A TESZT ALAPELVE 4. A KÉSZLET ÖSSZETÉTELE 5. A TESZTHEZ SZÜKSÉGES, DE A KÉSZLETTEL NEM SZÁLLÍTOTT ANYAGOK 6. ELŐVIGYÁZATOSSÁGI RENDSZABÁLYOK 7. EGÉSZSÉGVÉDELMI ÉS BIZTONSÁGI ELŐÍRÁSOK 8. A REAGENSEK ELŐKÉSZÍTÉSE 9. ELTARTHATÓSÁG, TÁROLÁS 10. MINTÁK 11. A TESZT KIVITELEZÉSE 12. AZ EREDMÉNYEK KISZÁMÍTÁSA ÉS ÉRTELMEZÉSE 13. A MINTÁK ÉS REAGENSEK PIPETTÁZÁSÁNAK ELLENŐRZÉSE SPEKTROFOTOMÉTERREL 14. A TESZT TELJESÍTMÉNYE 15. REFERENCIÁK 2 [HU]

1 - A FELHASZNÁLÁS CÉLJA A Monolisa HBe Ag-Ab PLUS a hepatitis Be antigén (HBe Ag) és a hepatitis Be antigén elleni antitestek (Anti-HBe) emberi szérumban vagy plazmában történő kvalitatív kimutatására szolgál enzim-immoassay segítségével. 2 - KLINIKAI JELENTŐSÉG A HBe antigén jelenléte általában a vírus aktív replikációjának a jele, és a szérum minta fertőzött voltát jelzi. A HBe-antigén már a hepatitis B fertőzés korai stádiumában megjelenik és egy hónapon túli, állandó jelenléte a vírus replikációja miatt fokozott kockázatot jelent a máj károsodására vonatkozóan. A HBe-antigén elleni ellenanyag megjelenése a csökkent vírusreplikáció jele, és általában kedvező klinikai prognózist jelent. 3 - A TESZT ALAPELVE a) A HBe antigén meghatározása A HBe antigén meghatározása kétlépéses, un. szendvics enzim-immunoassay módszeren alapul, amelyhez az eljárás humán anti-hbe antitestet, valamint egy pár, különböző epitópok elleni, peroxidázzal jelölt egér monoklonális anti-hbe antitestet (mab1 és mab2) használ. A szilárd fázist 8 tesztlyukú, polisztirolból készült, humán HBe antitesttel bevont csík alkotja. A teszt a következő lépésekből áll: 1. Az ismeretlen minta és a kontroll inkubációja anti- HBe antitesttel bevont szilárd fázison. 2. Mosás, majd a megkötött komplexek inkubálása a peroxidázzal jelölt monoklonális antitestekkel. 3. A szabad konjugátumok eltávolítása mosással, majd a szilárd fázishoz kötött emzimaktivitás kimutatása szubsztrát hozzáadásával. 4. A színreakció leállítása és az optikai elnyelés mértékének megállapítása 450/620 nmen. Az eredmények kiértékelése. b) Az Anti-HBe antitestek meghatározása Az anti-hbe kimutatásához ugyanazt a szilárd fázist használjuk, mint a HBe antigén teszthez. A teszt a rögzített antitest és a mintában található antitest vetélkedésén alapul a semlegesítő reagens korlátozott mennyiségű HBe antigén-helyeiért. A kimutatás aztán peroxidázzal megjelölt, monoklonális antitestek (mab 1 és mab 2) újabb keverékével történik. A teszt a következő lépésekből áll: 1. Az ismeretlen minta és a kontroll inkubációja az anti-hbe antitesttel bevont szilárd fázison, semlegesítő reagenssel. 2. Mosás, utána a megkötött komplexek inkubálása peroxidázzal jelölt monoklonális antitestekkel. 3. A szabad konjugátum eltávolítása mosással, majd a szilárd fázishoz kötött enzimaktivitás kimutatása szubsztrát hozzáadásával. 4. A színreakció leállítása és az optikai elnyelés megállapítása 492/620 nm-en. Az eredmények kiértékelése. 3 [HU]

4 - A TESZT ÖSSZETÉTELE Valamennyi reagens kizárólag in vitro diagnosztikai célra használható. A reagensek mennyisége 2 x 96 meghatározáshoz elegendő 1-12 egymástól független mérési sorozatban, a következő kombinációkban: Vagy 96 HBe Ag meghatározás és 96 anti-hbe meghatározás Vagy 2 x 48 HBe meghatározás és 2 x 48 anti-hbe meghatározás egyidőben. Címke R1 Microplate R2 Concentrated washing solution (20X) R3 Negative control R4 HBe Ab positive control R5 HBe Ag positive control A reagens összetétele Mikrolemez 12 x 8 tesztlyukú csík, inaktivált, HBs Ag-pozitív plazmából származó humán anti-hbe antitesttel bevonva Koncentrált mosófolyadék (20X) Tris Na Cl puffer, ph 7,4 Konzerválószer: 0,04 % ProClin Negatív Kontroll a HBe Ag és az anti-hbe teszthez egyaránt humán szérum, amely negatív HBs Ag-re, anti-hiv1-re, anti- HIV2-re és anti-hcv-re Konzerválószer: < 0,1% nátrium azid HBe Ab pozitív kontroll szérum Inaktivált, defibrinált HBe és HBs pozitív humán plazma, amely potenciálisan pozitív HBs Ag-re és amely negatív anti-hiv1, anti-hiv2 és anti-hcv antitestekre. Konzerválószer: < 0,1% nátrium azid HBe Ag pozitív kontroll szérum Defibrinált HBe Ag- és HBs Ag-pozitív humán plazma, amely anti-hiv1-re és anti-hiv2-re, valamint anti-hcv-re negatív. Konzerválószer: < 0,1% nátrium azid R6 Neutralizing HBe Ag Semlegesített HBe antigén Defibrinált HBe Ag- és HBs Ag-pozitív humán plazma, amely anti-hiv1-re és anti-hiv2-re, valamint anti-hcv-re negatív. Konzerválószer: < 0,1% nátrium azid R7a Concentrated anti HBe conjugate R7b Concentrated Ag HBe conjugate R8 Substrate buffer R9 Chromogen: TMB solution (11X) R10 Stopping solution Koncentrált anti-hbe teszt-konjugátum (5X) Peroxidázzal jelölt monoklonális anti-hbe antitest-pár (mab1 és mab2)* Konzerválószer: 0,5 % ProClin Koncentrált Ag HBe konjugátum (5 x) Peroxidázzal jelölt monoklonális anti-hbe antitest-pár (mab1 és mab2)* Konzerválószer: 0,5 % ProClin Peroxidáz szubsztrát puffer Citromsav és nátrium-acetát oldata, ph 4,0, amely H 2 O 2 -t, (0,015%), valamint DMSO-t tartalmaz, (4%) Kromogén Tetrametil-benzidint tartalmazó (TMB) oldat Leállító reagens 1 N kénsav Üres üvegcse hígításhoz Kiszerelés 72396 2 lemez 235 ml 8 ml 1,5 ml 1,5 ml 8 ml 3 ml 3 ml 60 ml 5 ml 28 ml 25 ml * A mab1/mab2 arány más az R7a és más az R7b konjugátumban. Ne cseréljük össze a két konjugátumot. 4 [HU]

5 - A TESZTHEZ SZÜKSÉGES, DE A KÉSZLETTEL NEM SZÁLLÍTOTT ANYAGOK Desztillált, vagy teljes mértékben ionmentes víz Nátrium-hipoklorit, és nátrium-bikarbonát Papírtörlő Egyszer használatos kesztyűk Egyszer használatos polisztirol csövek (12 x 75 mm) Kézi, vagy félautomata, beállítható, vagy rögzített beállítású pipetták, amelyek képesek kimérni és adagolni a következő mennyiségeket: 50 µl, 100 µl, 200 µl és 1 ml. Mérőhengerek: 10 ml, 50 ml, 100 ml, 1000 ml. Mágneses keverő Szeméttartók veszélyes biológiai hulladék számára Kézi, félautomata, vagy automata mikrolemez-mosó berendezés* Termosztáttal ellátott vízfürdő,40±1 C fokra beállítva, vagy ennek megfelelő, mikrolemezinkubátor. Mikrolemez leolvasó, 450 és 620 nm-es szűrőkkel ellátva. * Érdeklődjön technikai osztályunkon a javasolt berendezések részleteiről. 6 - ELŐVIGYÁZATOSSÁGI RENDSZABÁLYOK Az eredmények megbízhatósága nagyban függ az alább ismertetett Helyes Laboratóriumi Gyakorlattól: A teszt neve és a teszt speciális azonosítószáma mindegyik mikrotiter-lemez keretén fel van tüntetve. Ez a speciális azonosító szám szerepel minden csíkon is. A Monolisa HBe AG-AB PLUS speciális azonosító száma = 56 Bizonyosodjunk meg a megfelelő speciális azonosító szám meglétéről minden használat előtt. Ha az azonosító szám hiányzik, vagy eltér a fent leírttól, akkor a csík nem használható. Egy adott teszt futtatása közben ne keverjük a különböző készletekhez tartozó reagenseket Megjegyzés: az alábbi reagensek esetében a kitben levőtől eltérő gyártási számú reagensek is használhatók, de egy vizsgálaton belül azonos gyártási számú terméket kell használni: mosófolyadék (R2, címke felirata: 20x, zöld színű), peroxidáz szubsztrát puffer (R8, címke felirata: TMB puffer, kék színű), kromogén (R9, címke felirata: TMB 11X, bíbor színű) és leállító oldat (R10, címke felirata: 1 N, piros színű). Ezek a reagensek néhány más Bio-Rad gyártmányú termékhez is használhatók. A mosóoldat (R2, címke felirata: 20X, zöld színű) készítésekor továbbá felhasználhatunk különböző Bio-Rad reagenskészletekből származó mosófolyadékokat (R2, címke felirata: 10X, kék színű, vagy 10X, narancs színű), ha azokat megfelelően hígítjuk és egy vizsgálatsorozaton belül azonos keveréket használunk. Részletes felvilágosításért forduljanak műszaki szolgálatunkhoz. Ne használjunk lejárt szavatosságú reagenseket. Használat előtt 30 perc várakozási időre van szükség a reagensnek, hogy hőmérséklete a szobahőmérsékleten stabilizálódjon. A hígított R2 puffer esetében a várakozási idő egy óra. Gondosan oldjuk fel a reagenseket, hogy elkerüljük az esetleges szennyeződéseket. Ne végezzük a tesztet maró, vagy reakcióképes gőzök jelenlétében (savak, lúgok, aldehidek gőzei), vagy porral telitett légtérben, mert ez megváltoztathatja a konjugátumok enzimaktivitását. Használjunk alaposan elmosott és ionmentes vízzel elöblített üvegedényeket, vagy leginkább egyszer használatos edényeket használjunk. Ne hagyjuk a mikrolemezt megszáradni a mosási művelet vége és a reagensek bemérése között. 5 [HU]

Használjunk minden mintához új pipettahegyet Az alapos mosás az eljárás kritikus lépése. Tartsuk be az ajánlott mosási ciklusokat és bizonyosodjunk meg róla, hogy a tesztlyukak teljesen megteljenek és teljesen kiürüljenek. Nem megfelelő mosás helytelen eredményekre vezethet Soha se használjuk ugyanazt az edényt a konjugátummal és az előhívó oldattal végzett műveletekhez. Ellenőrizzük a pipetták és a többi eszköz pontosságát és megfelelő működését Ne változtassunk a vizsgálati eljáráson Az előhívó folyadék (a szubsztrát puffer és a kromogén), színének rózsaszínűnek kell lennie. A feloldás után ennek a rózsaszínű színnek néhány percen belüli megváltozása arra utal, hogy a reagens nem használható és ki kell cserélni. Az előhívó folyadékot tiszta, egyszer használatos műanyag edényben lehet elkészíteni, vagy olyan üvegedényben, amelyet először 1 N HCl-el előmostunk, majd alaposan kiöblítettük desztillált vízzel és utána megszárítottuk. A reagenst sötétben kell tárolni. 7 - EGÉSZSÉGVÉDELMI ÉS BIZTONSÁGI ELŐÍRÁSOK A készletben található valamennyi reagens kizárólag in vitro diagnosztikai célokra használható. Viseljünk egyszer használatos kesztyűt a reagensek és a minták kezelése során és utána alaposan mossunk kezet. Soha ne pipettázzunk szájjal. Az R3 reagens (negatív kontroll) elkészítéséhez használt emberi eredetű alapanyag az előzetes tesztek során nem reaktívnak mutatkozott hepatitis B felületi antigénre (HBs Ag) és az emberi immunhiányt okozó vírusok (anti-hiv-1 és anti-hiv-2) antitesteire. Az R1 (mikrolemez) elkészítéséhez használt emberi eredetű alapanyag az előzetes tesztek során nem reaktívnak mutatkozott az emberi immunhiányt okozó vírusok (anti- HIV-1 és anti-hiv-2) valamint a Hepatitis C vírus (HCV) ellenanyagaira. Hepatitis B felületi antigénre (HBs Ag) reaktív. Fotokémiai eljárással deaktivált. Az R4 reagens (anti-hbe pozitív kontroll), az R5 reagens (HBe Ag pozitív kontroll) és az R6 reagens (semlegesítő HBe Ag) elkészítéséhez használt emberi eredetű alapanyag az előzetes tesztek során nem reaktívnak mutatkozott emberi immunhiányt okozó vírusok (anti-hiv-1 és anti-hiv-2), továbbá hepatitis C vírus (anti-hcv) antitesteire. Az R5 és az R6 reaktív hepatitis B felületi antigénre (HBs Ag). Az R4 potenciálisan reaktív lehet HBs Ag-re. Fotokémiai eljárással deaktivált. Mivel egyetlen vizsgálati eljárás sem tudja teljes biztonsággal kizárni fertőző ágensek jelenlétét, ezért kezeljük a reagenseket és a vizsgálati mintákat úgy, mintha fertőző anyagot tartalmaznának. Minden eszközt, amely közvetlenül érintkezésbe kerül akár a reagensekkel, akár a vizsgálandó mintákkal, fertőzöttnek kell tekinteni, és ennek megfelelően kell kezelni. Kerüljük a vizsgálandó minták és mintákat tartalmazó oldatok kifröccsenését. A kifröccsent oldatok vagy minták cseppjeit 10%-osra higított nátrium-hipoklorittal kell leöblíteni. Ha a szennyező folyadék sav, akkor a kifröccsent anyagot először semlegesíteni kell nátrium-bikarbonáttal, és papírtörlővel fel kell szárítani. A tisztításhoz használt anyagokat a fertőzött hulladékot tartalmazó konténerbe kell tenni. Humán eredetű mintákat és reagenseket, továbbá a fertőzött egyéb anyagokat és termékeket eltávolításuk előtt fertőtleníteni kell, az alábbi módon: - vagy merítsük az eszközöket 30 percre 5% végkoncentrációjú nátriumhipokloritba (1 térfogatnyi hipoklorit 10 térfogat fertőzőt folyadékhoz vagy vízhez). - vagy helyezzük autoklávba minimum 2 órára 121 C fokon. Az autoklávozás a legbiztosabb módja a HIV és a HBV vírusok inaktiválásának. NE HELYEZZÜNK HIPOKLORITOT TARTALMAZÓ OLDATOT AZ AUTOKLÁVBA! 6 [HU]

Ne felejtsük el semlegesíteni, vagy/és autoklávozni az oldatokat, a mosóvizet, illetőleg az összes olyan oldatot, amely biológiai mintákat tartalmaz, mielőtt a lefolyóba öntjük őket. A Biztonsági Adatlapot kérésükre rendelkezésükre bocsátjuk. A vegyszereket a helyes laboratórium gyakorlatnak és előírásoknak megfelelően kell kezelni. Kerüljünk minden érintkezést a szubsztrát puffer, a kromogén és a leállító oldattal. Ezek a bőrrel és a nyálkahártyákkal kapcsolatba kerülve mérgezést, gyulladást vagy égési sérülést okozhatnak. A tesztben fellelhető egyes kémiai összetevők kockázati és óvintézkedési ajánlásaihoz tekintse át a címkéken biztosított képjelzést (képjelzéseket) és a használati utasítás végén adott tájékoztatást. A biztonsági adatlap a következő címen érhető el: www.biorad.com. 8 - A REAGENSEK ELŐKÉSZÍTÉSE MEGJEGYZÉS: Használat előtt hagyjuk a reagenseket szobahőmérsékletre melegedni (18-30C ). Mikrolemez (R1) Mindegyik, 12 csíkot tartalmazó tartókeret lezárt alimínium tasakban található. Vágja el a tasakot ollóval vagy szikével 0,5 vagy 1 centiméterrel a hegesztés fölött. Nyissa ki a tasakot, és vegye ki a keretet. A fel nem használt csíkokat tegye vissza a tasakba. Go,dosan zárja vissza a tasakoy, majd tegye vissza a +2-8 C hőmérsékletű tárolóhelyiségbe. R2 reagens: koncentrált mosófolyadék (20X töménységű) Desztillált vízzel 1:20 arányban hígítva kapjuk a felhasználásra kész mosófolyadékot. Egy 12 tesztcsíkos lemezhez 800 ml-t készítsünk. Koncentrált Anti-HBe konjugátum (R7a) Hígítsuk fel az R7a-t az elkészített R2 oldattal, a használt csíkoknak megfelelő mennyiségben: A használt csíkok száma Az R7a reagens mennyisége (ml) Feltöltendő R2-vel ennyi ml-re 1 0,2 1 2 0,4 2 3 0,6 3 4 0,8 4 5 1,0 5 6 1,2 6 7 1,4 7 8 1,6 8 9 1,8 9 10 2,0 10 11 2,2 11 12 2,4 12 Keverjük össze. Az R7a konjugátumot eredeti állapotában is használhatjuk, előzetes hígítás nélkül, ha követjük a következő eljárást: mérjünk a tesztlyukba 80 µl higított mosóoldatot (R2) 20 µl Anti-HBe konjugátumhoz (R7a). 7 [HU]

Koncentrált Ag HBe konjugátum teszt (R7b) Az eljárás azonos az R7a elkészítése során követett eljárással. Színelőhívó oldat (R8 + R9) Hígítsuk az R9 reagenst az R8-as reagenssel 1:11 arányban (például adjunk 1 ml R9 reagenst 10 ml R8-as reagenshez). Homogenizáljuk. 10 ml elegendő 1-10 csíkhoz. 9 - ELTARTHATÓSÁG, TÁROLÁS A kitet +2-8 C között kell tárolni. A kitben található minden, ezen a hőmérsékleten tárolt reagens felhasználható a csomagoláson feltüntetett szavatossági ideig a felnyitás után is, kivéve a speciális eseteket: R1: A vákuumtasak felnyitását követően a gondosan lezárt, eredeti tasakokban +2-8 C hőmérsékleten tárolt csíkok 1 hónapig használhatók fel. R2: A +2 - +30 C-on tárolt, felhasználáshoz felhígított mosófolyadék 2 hétig felhasználható. A koncentrált mosófolyadék (R2) +2 - +30 C-on tárolható. R7a: Az anti-hbe teszthez kihígított konjugátum +2-8 C között tárova1 hétig, szobahőmérsékleten (+2 - +30 C) tárolva 8 órán át felhasználható. R7b: A HBe Ag teszthez kihígított konjugátum +2-8 C között tárova1 hétig, szobahőmérsékleten (+2 - +30 C) tárolva 8 órán át felhasználható. R8 + R9: Feloldás után a reagens sötétben, szobahőmérsékleten (+2 - +30 C) 6 órán át felhasználható. 10 - A MINTÁK Vegyünk egy vérmintát a szokásos módon. A tesztet hígítatlan szérummal vagy plazmával kell elvégezni (a mintavétel történhet EDTA, citrát, ACD alapú alvadásgátlóval). A savót (plazmát) amilyen hamar lehet, válasszuk el, hogy elkerüljük a hemolízist. Az aggregátumokat tartalmazó mintákat a teszt elvégzése előtt centrifugálással meg kell tisztítani. A mintában lebegő fibrin aggregátumok és részecskék hamis pozitív eredményekre vezethetnek. A mintákat +2-8 C n kell tárolni, ha a tesztet 7 napon belül végezzük el, más esetben -20 C on mélyhűtve kell tárolni. Ne melegítse a mintákat. Kerüljük az ismételt felolvasztást és lefagyasztást. Ha a mintákat szállítani kell, akkor csomagoljuk a fertőző anyagok szállítására vonatkozó előírások szerint. Ha lehetséges, mélyhűtve szállítsuk az anyagot. NE HASZNÁLJUNK FERTŐZÖTT, HIPERLIPAEMIÁS VAGY HIPERHEMOLIZÁLT SZÉRUMOT MEGJEGYZÉS: Az olyan minták, amelyek nem tartalmaznak 100 mg/l bilirubinnál többet, továbbá az olyan lipémiás minták, amelyek nem tartalmaznak többet 36 g/l triolein egyenértékénél és az olyan hemolizált minták, amelyek nem tartalmaznak többet 2,5 mg/l hemoglobinnál, nem befolyásolják az eredményeket. 45 mg/l albuminnal kiegészített minták esetében az értékek csökkenése volt megfigyelhető. 11 - A TESZT MENETE Ha az Anti-HBe és HB Ag teszteket egyszerre végezzük el ugyanazon a lemezen, akkor a következő lemez-elrendezést javasoljuk: Anti-HBe teszt: 1-6 sor HBe Ag teszt: 7-12 sor 8 [HU]

a) Anti HBe teszteljárás 1. Készítsük el a mosófolyadékot 2. Vegyünk ki egy csíkot és egy keretet a védőcsomagolásból. A nem használt csíkokat tegyük vissza a csomagba és zárjuk le gondosan. 3. Mérjük minden tesztlyukba a következő mennyiségeket: A1, B1, C1: 100 µl negatív kontroll (R3) D1: 100 µl pozitív kontroll (R4) E1, F1, G1: 100 µl vizsgálati minta Az aktuálisan használt rendszertől függően a kontrollok helyzete vagy az elosztás sorrendje módosítható. N.B.: Határozott színkülönbség van az üres, és a mintát tartalmazó tesztlyukak között, az utóbbi sárga. A minta jelenlétéről spektrofotométerrel győződhetünk meg, 490 nm hullámhosszon (egyedüli hullámhossz). Lásd még a 13.fejezetet:.A MINTA ÉS A PIPETTÁZOTT REAGENS ELLENŐRZÉSE SPEKTROFOTOMÉTERREL. 4. Gyorsan adjunk minden tesztlyukba 50 µl semlegesítő HBe antigént (R6). Fedjük le az öntapadó filmmel és inkubáljuk 3 órán át, (± 10 perc), 37 C on (±1 C ). N. B.: A semlegesítő HBe antigén (R6) bevitele szemmel is ellenőrizhető, mert az oldat rózsaszínű. A semlegesítő HBe antigén jelenlétéről a tesztlyukakban spektrofotométerrel győződhetünk meg 490 nm hullámhosszon (egyedüli hullámhossz). Lásd még a 13. fejezetet: A MINTA ÉS A PIPETTÁZOTT REAGENS ELLENŐRZÉSE SPEKTROFOTOMÉTERREL. 5. Készítsük el a higított konjugátum oldatot (R7a), még a 4. lépés befejezése előtt. 6. Távolítsuk el az öntapadó filmet. Szívjuk ki minden tesztlyukból annak tartalmát, és helyezzük a veszélyes biológiai anyagokat tartalmazó konténerbe. Utána mossuk négyszer. 7. Gyorsan adjunk minden tesztlyukba100 µl (R7a) higított konjugátum oldatot. (lásd a8. fejezetet: 8. A REAGENSEK ELŐKÉSZÍTÉSE). Az R7a konjugátumot használhatjuk Eredeti formájában is. Ilyenkor az eljárás a következő: mérjünk először 80 µl higított mosófolyadékot (R2) minden tesztlyukba, majd mérjünk bele 20 µl anti-hbe konjugátumot (R7a) (5 x). Keverjük össze. Zárjuk le egy öntapadó filmmel és inkubáljuk 30 percig 37 C (± 1 C ). (Az inkubációs idő legalább 25 perc, legfeljebb 40 perc). Az inkubáció után távolítsuk el az öntapadó filmet, szívjuk le a tesztlyukak tartalmát a veszélyes biológiai anyagokat tartalmazó konténerbe, majd mossuk ötször. N.B.: Az eljárásnak ebben a szakaszában az R7a higított konjugátum bevitele szemmel is ellenőrizhető, mert ibolyaszínű. A higított R7a konjugátum oldat jelenlétéről a tesztlyukakban spektrofotométerrel győződhetünk meg, 620 nm hullámhosszon vizsgálva. Egyedüli hullámhossz). Lásd még a 13. fejezetet: 13. A MINTA ÉS A PIPETTÁZOTT REAGENS ELLENŐRZÉSE SPEKTROFOTOMÉTERREL. 8. Közvetlenül a használat előtt készítsük el a színelőhívó oldatot (R8+R9). Lásd a 8. fejezetet: A REAGENSEK ELŐKÉSZÍTÉSE. 9. Gyorsan adagoljunk 80 µl színelőhívót minden tesztlyukba. Tartsuk a lemezt 30 percig (±5 perc) szobahőmérsékleten (+18-30 C ) sötétben. NB :Az előhívó folyadék bemérését az eljárásnak ebben a szakaszában szemmel is ellenőrizhetjük, mivel az oldat rózsaszínű. Határozott különbséget észlelhetünk az üres tesztlyuk és az előhívót tartalmazó tesztlyuk színe között. Lásd a 13. fejezetet: 13. A MINTA ÉS A PIPETTÁZOTT REAGENS ELLENŐRZÉSE SPEKTROFOTOMÉTERREL. 10. Gyorsan adagoljunk 100 µl leállító oldatot (R10) mindegyik tesztlyukba. N.B.: Az eljárásnak ebben a szakaszában a színtelen leállító oldat adagolása szemmel is ellenőrizhető. Miután hozzáadtuk a leállító oldatot, a rózsaszínű szubsztrát 9 [HU]

negatív mintákban színtelenné válik, a kék színű szubsztrát pedig pozitív mintákban megsárgul. 11. Gondosan töröljük meg a lemez alját. Mérjük az optikai denzitást 420/620 nm-en egy lemezleolvasóval legalább 4 perccel a leállító oldat hozzáadása után, de még a reakció leállításától számított 30 percen belül. b) HBe Ag teszteljárás 1. Készítsük el a mosófolyadékot 2. Vegyünk ki egy vagy több csíkot és egy keretet a védőcsomagolásból. Tegyük vissza a többi csíkot a csomagba és zárjuk le gondosan a csomagot. 3. Adagoljuk mindegyik tesztlyukba a következő oldatokat: A1, B1, C1: 100 µl negatív kontrolloldat (R3) D1: 100 µl pozitív kontrolloldat (R5) E1, F1, G1: 100 µl minta N.B.: Jól megkülönböztethető az üres és a mintát tartalmazó tesztlyuk a színe alapján. Ez utóbbi sárga. A minta jelenlétéről spektrofotometriai méréssel is meggyőződhetünk 490 nm hullámhosszon( egyedüli hullámhossz). Lásd: 13. A MINTA ÉS A PIPETTÁZOTT REAGENS ELLENŐRZÉSE SPEKTROFOTOMÉTERREL. 4. Fedjük le öntapadó filmmel és inkubáljuk a mintákat 3 órán át (±10 perc) 37 C -on (± 1 C). 5. Készítsük el a konjugátumot tartalmazó oldatot még a 4. lépés befejezése előtt. 6. Távolítsuk el az öntapadó filmet. Szívjuk le a tesztlyukak tartalmát a veszélyes biológiai anyagokat tartalmazó konténerbe. Utána mossuk négyszer. 7. Gyorsan adagoljunk 100 µl higított konjugátum oldatot (R7b) mindegyik tesztlyukba vagy, mivel a konjugátumot önmagában is használhatjuk, kövessük a következő eljárást: adagoljunk először 80 µl higított mosófolyadékot (R2) mindegyik tesztlyukba, majd adjunk hozzá tesztlyukanként 20 µl anti-hbe konjugátumot (Rb7) (5X).Keverjük össze. Fedjük le öntapadó filmmel és inkubáljuk 30 percig 37 C -on (±1 C ). Az inkubációs idő legalább 25 perc, legfeljebb 40 perc. Távolítsuk el az öntapadó filmet, szívjuk le a tesztlyukak tartalmát a veszélyes biológiai hulladékanyagokat tartalmazó konténerbe. N.B.:Az R7b higított konjugátum oldat adagolását szemmel is ellenőrizhetjük az eljárásnak ebben a szakaszában, mivel az türkiz színű. A higított konjugátum oldat (R7a) jelenlétét spektrofotometriai úton is ellenőrizhetjük 620 nm-es hullámhosszon (egyedüli hullámhossz). Lásd: 13. A MINTA ÉS A PIPETTÁZOTT REAGENS ELLENŐRZÉSE SPEKTROFOTOMÉTERREL. 8. Közvetlenül használat előtt készítsük el a színelőhívóoldatot (R8+R9). 9. Gyorsan adagoljunk 80 µl színelőhívó oldatot (R8+R9) mindegyik tesztlyukba. Inkubáljuk a lemezt sötétben 30 percig (± 5 perc), szobahőmérsékleten (+18-30 C ). N.B.: Az előhívó oldat adagolását az eljárásnak ebben a szakaszában szemmel is ellenőrizhetjük, mivel az oldat rózsaszínű. Az üres és rózsaszínű oldatot tartalmazó tesztlyukak között jelentős színbeli eltérés van. Bővebbet: 13. A MINTA ÉS A PIPETTÁZOTT REAGENS ELLENŐRZÉSE SPEKTROFOTOMÉTERREL. 10. Gyorsan adagoljunk 100 µl leállító oldatot (R10) mindegyik tesztlyukba. N.B: A leállító oldat adagolása szemmel is ellenőrizhető, bár az oldat színtelen. A leállító oldat hozzáadása után a rózsaszínű szubsztrát negatív minták esetében színtelen lesz, a kék színű szubsztrát pozitív minták esetében sárga lesz. 11. Gondosan töröljük le a lemez alját. Mérjük az optikai denzitást 450/620 nm-en lemezolvasóval legalább 4 perccel a leállító oldat hozzáadása után, de még 30 percen belül. 10 [HU]

c) Az Anti-HBe és HB Ag tesztek egyidejű elvégzésének menete (Ugyanazon a lemezen) Az eljárásnak ugyanazok a lépései, mint amiket az előbb leírtunk. Egyedül a minták felvitelének sablonja változik az alábbiak szerint: Anti-HB teszt: 1-6 sor HB Ag teszt : 7-12 sor 12 - AZ EREDMÉNYEK KISZÁMÍTÁSA ÉS ÉRTELMEZÉSE a) Anti- HBe teszt 1. Számítsuk ki a negatív kontroll ismétlések átlagos fényelnyelését (= Optikai Denzitás, O.D.): Átlag (OD R3) Például: R3 Negatív kontroll OD 1 1,607 2 1,410 3 1,552 Összes OD= 4,569 Az átlag (OD R3) = összes OD / 3 =4,569 / 3 = 1,523 Ha legfeljebb egy R3 abszorbancia érték az átlagtól több mint 25 %-al tér el, akkor hagyjuk ki a számításból és a maradék kettőből számoljunk átlagot. 2. A Cut-Off érték számítása A Cut-Off értéket minden egyes lemezhez a következő képlettel számoljuk ki: Cut-Off érték = Átlagérték (OD R3) x 0,4 Például: Átlagérték (OD R3) = 1,523 Alsó Cut-Off érték = 1,523 x 0,4 = 0,609 3. Az Anti-HBe teszt validitása Átlagérték OD R3 > 0,900 OD R4 < 0,150 4. Arányszámítás Valamennyi minta arányértékét a következő képlet alapján számoljuk: Arányérték = minta OD / alsó Cut-Off érték 5. Az eredmények értékelése A mintákat Pozitívnak tekintjük, ha az arányérték kisebb vagy egyenlő 0,9-el (arányérték 0,9) Negatívnak tekintjük, ha az arányérték nagyobb, mint 1,1 (arányérték > 1,1) Azonban, ha az eredmény 0,9 és 1,1 között van, tanácsos az anti-hbe vizsgálatot megismételni egy következő mintával. Tanácsos a pozitívnak bizonyult mintákat duplán újratesztelni. Ha az újratesztelés során legalább egy érték pozitívnak bizonyult, akkor a mintát pozitívnak tekinthetjük. b) HBe Ag teszt 1. Számítsuk ki a negatív kontrollok átlagos fényelnyelését (= Optikai Denzitás O.D.): Átlag (OD R3) Például: R3 Negatív kontroll OD 1 0,023 2 0,022 3 0,026 Összes OD= 0,071 11 [HU]

Átlagérték (OD R3) = Összes OD / 3 = 0.071 /3 = 0.024 Ha legfeljebb egy R3 abszorbancia érték több mint 25 %-al tér el az átlagtól, akkor hagyjuk ki a számításból és csak a maradék kettőből számoljunk átlagot. 2. A Cut-Off érték számítása A Cut-Off értéket minden egyes lemezhez a következő képlettel számoljuk ki: A Cut-Off érték= Átlagérték (OD R3) +0,025 Például: Átlag (OD R3) = 0,024 Cut-Off érték = 0,24 + 0,025 = 0,049 3. A HBe Ag teszt validitása Átlag (OD R3) < 0,060 OD R5 > 0,800 4. Arányszámítás Valamennyi minta arányértékét a következő képlet alapján számoljuk: Arányérték = minta OD / Cut-Off érték 5. Az eredmények értékelése A mintákat Negatívnak tekintjük, ha az arányérték kisebb 1,0-nél (arányérték < 1) Pozitívnak tekintjük, ha az arányérték nagyobb 1,0-nál, vagy egyenlő 1,0-el (arányérték 1,0) Tanácsos a pozitívnak bizonyult mintákat duplán újratesztelni. Ha az újratesztelés során legalább egy érték pozitívnak bizonyult, akkor a mintát pozitívnak tekinthetjük. 13 - A MINTÁK ÉS REAGENSEK PIPETTÁZÁSÁNAK ELLENŐRZÉSE SPEKTROFOTOMÉTERREL 1 - Anti HBe Teszt A minták és a kontroll jelenlétének vizsgálata A minta és a kontroll minta jelenlétét a tesztlyukakban 490 nm-en történő automatikus leolvasással ellenőrizhetjük. A mintát vagy kontrollt tartalmazó tesztlyukak OD-jének nagyobbnak kell lennie, mint 0,050. A semlegesítő HBe antigén jelenlétének vizsgálata (R6) A semlegesítő HBe antigén jelenlétét a tesztlyukakban 490 nm-en történő automatikus leolvasással ellenőrizhetjük OD-eltérés számítással. OD eltérés = (OD 490 minta (vagy kontroll) R6-al) (OD 490 minta (vagy kontroll), R6 nélkül). Az OD eltérésnek nagyobbnak kell lennie, mint 0,150. A koncentrált Anti-HBe teszt konjugátum jelenlétének vizsgálata (R7a) A hígított konjugátum (R7a) jelenlétét a tesztlyukakban 620 nm-en történő automatikus leolvasással ellenőrizhetjük. A leolvasott OD értéknek minden tesztlyukban egyenlőnek, vagy nagyobbnak kell lennie 0,070-nél és kisebbnek kell lennie 0,200-nál. Az előhívó folyadék jelenlétének vizsgálata (R8 + R9) Az előhívó folyadék jelenlétét a tesztlyukakban 490 nm-en történő automatikus leolvasással ellenőrizhetjük. A leolvasott OD értéknek minden tesztlyukban nagyobbnak kell lennie 0,100-nál. 12 [HU]

2 - HBe Ag Teszt A minták és a kontroll jelenlétének a vizsgálata A minta és a kontroll minta jelenlétét a tesztlyukakban 490 nm-en történő automatikus leolvasással ellenőrizhetjük. A mintát vagy kontrollt tartalmazó tesztlyukak OD-jének nagyobbnak kell lennie 0,050-nél. A koncentrált AG HBe konjugátum jelenlétének a vizsgálata (R7b) A higított R7b konjugátum jelenlétét a tesztlyukakban 620 nm-en történő automatikus leolvasással ellenőrizhetjük. Az egyes tesztlyukak OD értékének nagyobbnak kell lennie 0,210-nél. Az előhívó folyadék jelenlétének ellenőrzése (R8 + R9) Az előhívó folyadék jelenlétét a tesztlyukakban 490 nm-en történő automatikus leolvasással ellenőrizhetjük. Az egyes tesztlyukak OD értékének nagyobbnak kell lennie, mint 0,100. 14 - A TESZT TELJESÍTMÉNYE A Monolisa HBe Ag-AB PLUS teljesítményét az alábbiakban foglaljuk össze. Az vizsgálatokat 2 helyszínen végezték. A minták véradóktól, páciensektől és szerokonverziós panelekből származtak. 1 - HBe Ag Teszt Specificitás A specificitás 200 véletlenül kiválasztott véradó esetében 100 %-os volt [98.51-100%], (IC95). Továbbá vizsgálták a specificitást páciens mintákon és az 100%-osnak bizonyult [99,28-100%] (IC95, 416/416 minta). A 195 páciensen elvégzett analízis, akiknél olyan állapotot, vagy kórokot lehetett kimutatni, amely nem volt kapcsolható Hepatitis B-hez (terhes asszonyok, rheumatoid faktor, antinukleáris antitestek, anti-egér lg vagy más vírus- vagy baktériumfertőzés) 99,49%-os specificitást mutatott [97,18-99.99](IC 95, 194/195 negatívnak talált minta). Az analitikai érzékenység A teszt érzékenységi küszöbét 0,64 NE/ml-re[0,49-0,84] (IC 95) becsülték a PEI standarddal végzett kiértékelés során. Érzékenység Az érzékenységet 203 pozitív mintán vizsgálták. A minták krónikus HBV fertőzött betegektől folyamatosan vett mintákból, illetőleg kereskedelmi szerokonverziós panelekből származnak. Az érzékenység ezeknél a mintáknál 99,51%-nak [97,29-99,99%] (IC 95, 202/203) bizonyult. Az eljárás reprodukálhatósága A Monolisa HBe Ag-Ab PLUS (HBe Ag) teszt reprodukálhatóságát 4 minta analízisével állapították meg: 1 negatív minta, 1 alacsony HBe Ag pozitív minta, 1 magas HBe Ag pozitív minta és egy átmeneti HBe Ag pozitív minta. A teszten belüli reprodukálhatóság ennek a 4 mintának a tesztelésével történt. A mintákat egy sorozatban, 30-szor tesztelték. A tesztek közötti reprodukálhatóság ugyanennek a 4 mintának két párhuzamos sorozatban, 20 napon keresztül, napi 2 teszttel való vizsgálatával történt. Az eredményeket az alábbi táblázat mutatja: 13 [HU]

1 - Táblázat: Teszteken belüli reprodukálhatóság n = 30 1 minta 2 minta 3 minta 4 minta arányok átlaga 3,56 5,29 27,24 45,56 standard eltérés 0,05 0,35 0,63 2,88 CV (%) 14,20 6,53 2,31 6,33 2. Táblázat: Tesztek közötti reprodukálhatóság n = 80 1 minta 2 minta 3 minta 4 minta arányok átlaga 0,51 8,19 27,33 46,35 standard eltérés 0,12 1,17 3,26 4,98 CV (%) 23,86 14,27 11,92 10,74 2 - HBe Ab teszt Specificitás A specifitást 200 véletlenül kiválasztott véradón vizsgálták és 100%-osnak [98,51-100%], (IC 95) bizonyult. A specificitást továbbá 206 páciens mintán is vizsgálták és 98,54%-osnak [95,80-99,70%], találták (IC95, 203/206). Megvizsgáltak 198 olyan beteg mintáit, akik különböző betegségek különböző stádiumaiban voltak, melyek nem voltak a hepatitis B-vel kapcsolatba hozhatók (terhes asszonyok, rheumatoid faktor, anti-nukleáris antitestek, anti-egér lg vagy más virális vagy bakteriális fertőzés). Három mintát találtak pozitívnak (2 HCV mintát és 1 rheumatoid faktor mintát). Ezen a népességen a specificitás 98,48 % volt [95,64-99,69%] (IC95, 195/198). Ezt a 3 mintát újratesztelték; a rheumatoid faktort tartalmazó minta ismételt reaktivitást mutatott, a másik kettő közül az egyik HCV minta negatívnak, a másik kétesnek bizonyult. Érzékenység Az érzékenységi vizsgálatokat 220 pozitív mintán végezték el. A minták részben krónikus, HBV-vel fertőzött páciensektől származtak, folyamatos mintavételekből, részben kereskedelmi panelekből. Az érzékenység 98,64%-nak bizonyult [96,07-99,72%] (IC 95, 217/220). A teszteljárás reprodukálhatósága A Monolisa HBe Ag-Ab PLUS (anti-hbe Ab) reprodukálhatóságát 4 minta analízisével végezték el: 1 negatív minta, 1 alacsony HBe Ab pozitív minta, 1 magas HBe Ab Pozitív minta és egy köztes HBe Ab pozitív minta. A teszten belüli reprodukálhatóság értékelését úgy végezték, hogy a 4 mintát 30-szor tesztelték egyetlen sorozatban, a tesztek közötti reprodukálhatóságot pedig 4 mintának két sorozatban 20 napon keresztül történő tesztelésével, napi két teszttel vizsgálták. Az eredményeket az alábbi táblázat mutatja: 1. Táblázat : Teszteken belüli reprodukálhatóság n=30 1 minta 2 minta 3 minta 4 minta arányok átlaga 3,15 0,69 0,42 0,03 standard eltérés (SD) 0,05 0,04 0,04 0,00 CV (%) 1,7 5,7 10,5 6,6 14 [HU]

2. Táblázat: Tesztek közötti reprodukálhatóság n = 80 1 minta 2 minta 3 minta 4 minta arányok átlaga 2,39 0,81 0,59 0,3 standard eltérés 0,23 0,077 0,09 0,01 (SD) CV (%) 9,6 9,5 14,5 39,3 15 - REFERENCIÁK 1 - MIYAKAWA Y.; MAYUMI M.; (1985) Hepatitis Be antigen and antibody (HBe Ag/Anti-HBe) in Hepatitis B. Academic Press., chap. 4: 47-76 2 - KANNO A.; OHORI H., MATSUDA K.; NAKAYAMA H.; MIYAZAKI Y.; ISHIIM.; SUZUKI H.; OHTSUKI M.; GOTO Y. (1987) Virological significance of HBe Ag subtypes (HBe Ag/1 and HBe Ag/2) in patients with type B hepatitis. Hepatology; 7 (1) 15-19 3 - BRECHOT C.; (1987) Les marqueurs et la prévention des infections par le virus de l'hépatite B en 1987. Encyclopédie Médicochirurgicale; Instantanés Médicaux, 4; 9-12 4 - THIERS V.; BOUCHARDEAU F.; COUROUCE A.M.; TIOLLAIS P.; BRECHOT C., (1986) L'ADN du virus de l'hépatite B comme marqueur de multiplication virale: comparaison avec l'antigène HBe et l'anticorps anti Hbe. La Presse Médicale: 15: 1219-1222 5 - LAROUZE B., PENALBA C., DAZZA M.C. (1983) Signification des marqueurs sériques du virus de l'hépatite B. Biologiste et praticien; 56; 13-22 6 - ALDERSHVILE J., FROSNER G.G.; NIELSEN J.O.; HARDT F. DEINHARTD F.; SKINHOJ P., (1980) Hepatitis Be antigen and antibody measured by radioimmuno-assay in acute hepatitis B surface antigen positive hepatitis. J. Infect. dis.: 141 (3), 293-297 7 - TAKAHASHI K.; IMAI M., TSUDA F., TAKAHASHI T., MIYAKAWA Y. MAYUMI M. (1976) Association of Dane particles with e antigen in the serum of asymptomatic carriers of hepatitis B surface antigen. J. of Immunol. 117 (1); 102-105 15 [HU]

16 [HU]

17 [HU]

18 [HU]

19 [HU]

20 [HU]