COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, version 2.0

COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, version 2.0 IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 48 Tests P/N: 05212294 190 HI2CAP HIV-1 Test, v2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 5.1 Liters P/N: 03587797 190 PG WR Wash Reagent FELHASZNÁLÁS MÓDJA A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 2.0 verziójú (v2.0) HIV-1 teszt egy in vitro nukleinsavamplifikációs vizsgálat a humán immundeficiencia vírus 1 (HIV-1) RNS mennyiségi meghatározására humán plazmában, a COBAS AmpliPrep készülék automatizált mintaelőkészítő és a COBAS TaqMan analizátor, illetve a COBAS TaqMan 48 analizátor automatizált amplifikáló és mérőberendezések segítségével. A vizsgálat a HIV-1 RNS mennyiségét méri a 20 10 000 000 kópia/ml tartományban (33 1,67 x 10 7 nemzetközi egység [IU]/ml). A HIV-1 RNS nukleinsav-amplifikációs technikákra (NAT) vonatkozó 1. WHO nemzetközi standard (NIBSC 97/656) alapján egy kópia HIV-1 RNS 1,67 IU egyenértékű 36. A vizsgálat a klinikai megjelenéssel és a betegség progressziójának egyéb laboratóriumi markereivel együtt a HIV-1 M csoportú, valamint HIV-1 O csoportú fertőzést hordozó betegek klinikai gondozásában nyújthat segítséget. A vizsgálat az alap HIV-1 RNS-szint mérése révén használható a beteg prognózisának megállapítására, illetve az antiretrovirális kezelés során az EDTA-s plazma HIV-1 RNS-szint változásainak mérése révén az antiretrovirális kezelés hatásának monitorozására. A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan v2.0 HIV-1 teszt nem való vér vagy vérkészítmények HIV-1 fertőzöttségének szűrésére, vagy diagnosztikus vizsgálatként HIV-1 fertőzés jelenlétének megerősítésére. A VIZSGÁLAT ÖSSZEGZÉSE ÉS MAGYARÁZATA A humán immundeficiencia vírus (HIV) a szerzett immunhiányos tünetegyüttes [Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS)] kóroki ágense 1-3. A HIV-fertőzés átvihető szexuális kontaktussal, fertőzött vérrel vagy vérkészítményekkel, illetve fertőzött anyáról a magzatra 4. A HIV átvitelétől számított három-hat héten belül a fertőzött egyénekben rendszerint egy rövid, náthaszerű tünetekkel jellemezhető akut tünetegyüttes alakul ki, amely a perifériás vérben levő nagyfokú viraemiával kapcsolatos 5-8. A legtöbb fertőzött egyénben ezt egy HIV-specifikus immunválasz és a plazma viraemia csökkenése követi, rendszerint a tünetek felléptétől számított négy-hat héten belül 9,10. A szerokonverziót követően a fertőzött egyének típusosan egy klinikailag stabil, tünetmentes fázisba kerülnek, amely évekig tarthat 11-13. A tünetmentes periódust állandó, alacsony szintű viraemia 14 és egy fokozatosan kialakuló CD4 + T limfocita hiány jellemzi, amely súlyos immunhiányhoz, halmozott opportunista fertőzések, malignomák kialakulásához, végül halálhoz vezet 15. Bár a fertőzés tünetmentes fázisában a vírusszintek a perifériás vérben viszonylag alacsonyak, úgy tűnik, hogy a vírus szaporodása és kiürülése egy dinamikus folyamat, amelynek során a nagyfokú vírustermelés és CD4 + sejtfertőzés egyensúlyban van a nagyfokú víruskiürüléssel, a fertőzött sejtek pusztulásával és a CD4 + sejtek utánképződésével, ezáltal mind a plazma viraemia, mind a CD4 + sejtek viszonylag stabil szintjeit eredményezve 16-18. A perifériás vérben lévő HIV viraemia mennyiségi mérései megmutatták, hogy a magasabb vírusszintek a HIV-betegség klinikai progressziójának emelkedett kockázatával korrelálhatnak, és hogy a plazma vírusszintek csökkenése a klinikai progresszió csökkent kockázatával járhat együtt 19-21. A vírusszintek mennyiségi meghatározása perifériás vérben történhet a HIV p24 antigén mérésével szérumban, a HIV kvantitatív tenyésztésével plazmából, vagy a vírus RNS direkt mérésével nukleinsav-amplifikációs vagy szignálamplifikációs technológiákat alkalmazva 22-26. A Dokumentum verzióinformációi rész a dokumentum végén található. 05447950001-12HU 1 Doc Rev. 13.0

A p24 antigén a HIV legjelentősebb magfehérjéje, és vagy szabadon, vagy anti-p24 antitesthez kötve található meg a szérumban. A szabad p24 antigén kereskedelemben kapható enzim immunoassayvel (EIA) mérhető, bár a p24 antigén haszna, mint vírusmennyiség marker, korlátozott, miután az antigén a tünetmentes betegek csupán 20%-ában, a tünetes betegek 40-50%-ában mutatható ki. Az antigén-antitest komplexeket disszociáló eljárások ugyan javítják a p24 vizsgálatok érzékenységét, mégis a vírusfehérje a legtöbb tünetmentes betegben kimutathatatlan marad 22. A plazmában lévő fertőző HIV normál donorokból származó aktivált perifériás vér mononukleáris sejtekbe történő inokulációval tenyészthető. A plazmaminták hígítási sorával történő perifériás vér mononukleáris sejtinokuláció révén mennyiségi meghatározás végezhető. A vírusszintek monitorozásában a kvantitatív tenyésztés korlátozott haszonnal bír, miután a víruspartikulumoknak csak kis hányada fertőző in vitro. Tünetmentes egyénekben fertőző vírus gyakran nem mutatható ki 22. A HIV RNS mennyiségi meghatározása a plazmában olyan nukleinsav-amplifikációs technológiákkal történhet, mint a polimeráz-láncreakció (PCR) 27-29. A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan v2.0 HIV-1 teszt PCR-technológiát alkalmaz, ezáltal maximális érzékenységet és dinamikus tartományt valósít meg a HIV-1 RNS EDTA-val antikoagulált plazmában való mennyiségi meghatározásához. AZ ELJÁRÁS ALAPELVEI A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan v2.0 HIV-1 teszt egy nukleinsav-amplifikációs vizsgálat a humán immundeficiencia vírus 1 (HIV-1) RNS mennyiségi meghatározására humán plazmában. A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan v2.0 HIV-1 teszt három fő folyamaton alapul: (1) mintaelőkészítés a HIV-1 RNS izolálására és (2) a target RNS reverz transzkripciója, azaz komplementer DNS (cdns) szintézise, valamint (3) szimultán target cdns PCR-amplifikálás és a hasított targetspecifikus kettős-jelölt oligonukleotid próba kimutatás. A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan v2.0 HIV-1 teszt lehetővé teszi az automatikus mintaelőkészítést, amelyet a HIV-1 target RNS és a HIV-1 mennyiségi standard (QS) Armored RNA automatikus reverz transzkripciója, PCR-amplifikációja és detektálása követ. A master mix reagens a HIV-1 RNS-re és a HIV-1 QS RNS-re egyaránt specifikus primereket és próbákat tartalmaz. A master mix reagenst a HIV-1 M csoport és HIV-1 O csoport szubtípusainak ekvivalens mennyiségi meghatározásának biztosítására fejlesztették ki. Az amplifikált DNS kimutatása targetspecifikus és QS-specifikus kettős-jelölt oligonukleotid próbák segítségével történik, amely lehetővé teszi a HIV-1 amplikon és a HIV-1 QS amplikon független azonosítását. A HIV-1 virális RNS mennyiségi meghatározása során HIV-1 QS használatos. Ez kompenzálja a gátló hatásokat, és az előkészítési és amplifikációs folyamatok szabályozásával lehetővé teszi a HIV-1 RNS pontosabb mennyiségi meghatározását valamennyi mintában. A HIV-1 QS egy nem fertőző Armored RNA-konstrukció, amely a HIV-1 target RNS-hez és egy, a HIV-1 QS amplikon és a HIV-1 target amplikon megkülönböztetését lehetővé tevő egyedi próbakötő régióval identikus primerkötő helyekkel bíró HIV-szekvenciákat tartalmaz. A HIV-1 QS minden egyes mintához ismert kópiaszámban hozzáadásra kerül, és megy tovább a minta-előkészítés, a reverz transzkripció, a szimultán PCR-amplifikáció és a hasított kettős-jelölt oligonukleotid próbák kimutatásának lépésein keresztül. A COBAS TaqMan analizátor, illetve a COBAS TaqMan 48 analizátor a vizsgálati mintákban levő HIV-1 RNS-koncentrációt a HIV-1- szignálnak a HIV-1 QS-szignállal való összehasonlításával számolja ki minden egyes minta és kontroll esetén. A targetszekvencia kiválasztása A HIV-1 target RNS-szekvencia kiválasztása a különböző HIV-1 M csoportú szubtípusok és HIV-1 O csoportú minták között a HIV-1 genomban maximálisan konzervált régiók azonosításán múlik. A vírus nagyfokú genetikai változékonysága miatt a COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan v2.0 HIV-1 teszt a HIV genom két régióját amplifikálja és detektálja párhuzamosan. Targetspecifikus és QS-specifikus kettős-jelölt oligonukleotid próbák teszik lehetővé a HIV-1-amplikon és a HIV-1 QS-amplikon független azonosítását. Következésképpen a primerek és a kettős-jelölt oligonukleotid próbák megfelelő kiválasztása kritikus a vizsgálat HIV-1 M csoportú szubtípusának és HIV-1 O csoportjának amplifikáló és detektáló képessége szempontjából. A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan v2.0 HIV-1 teszt olyan reverz transzkripciós és PCR amplifikációs primereket használ, melyek a nagyfokban konzervált HIV-1 gag gén 32 és HIV-1 LTR régió génszakaszaiban lévő szekvenciáknak felelnek meg. 05447950001-12HU 2 Doc Rev. 13.0

Minta előkészítése A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Teszt, v2.0 automata minta-előkészítést alkalmaz a COBAS AmpliPrep készülék segítségével egy generikus szilikon-alapú capture technika révén. Az eljárás 850 µl plazmát dolgoz fel. A HIV-1 víruspartikulumokat magas hőmérsékleten való inkubálás során roncsolják egy proteáz és egy olyan kaotróp lízis/kötőpuffer segítségével, amely szabaddá teszi a nukleinsavakat, és megvédi a szabaddá tett HIV-1 RNS-t a plazmában lévő RNázoktól. Proteáz és ismert számú HIV-1 QS Armored RNA-molekula kerül bejuttatásra minden egyes mintába a roncsoló reagenssel és mágneses üvegpartikulumokkal együtt. Ezt követően az elegy inkubálódik, és a HIV-1 RNS és HIV-1 QS RNS a mágneses üvegpartikulumok felületéhez kötődik. A nem kötődött anyagok, mint sók, fehérjék és egyéb sejtszennyeződések a mágneses üvegpartikulumok mosásával kerülnek eltávolításra. A mágneses üvegpartikulumok szeparálását és a mosási lépések befejezését követően az adszorbeált nukleinsavakat magas hőmérsékleten vizes oldattal eluálják. A mágneses üvegpartikulumokat, valamint a szabaddá tett HIV-1 RNS-t és HIV-1 QS RNS-t tartalmazó feldolgozott minták az amplifikációs elegyhez kell adni, és a COBAS TaqMan analizátorba, illetve a COBAS TaqMan 48 analizátorba helyezni. Ezután a két targetspecifikus és egy QS-specifikus kettős-jelölt oligonukleotid próba hasítása révén végbemegy a HIV-1 target RNS és a HIV-1 QS RNS reverz transzkripciója, amplifikációja és párhuzamosan detektálásra kerül. Reverz transzkripció és PCR-amplifikálás A reverz transzkripciót és PCR-amplifikálási reakciót a hőstabil rekombináns enzim, Thermus specie Z05 DNS-polimeráz (Z05) segítségével végzik. Mangán (Mn 2+ ) jelenlétében, valamint megfelelő pufferviszonyok között a Z05 mind reverz transzkriptáz, mind DNS-polimeráz aktivitást mutat 30,31. Ez lehetővé teszi, hogy mind a reverz transzkripció, mind a PCR-amplifikáció az amplikon valós idejű detektálásával együtt történjen. A feldolgozott mintákat amplifikációs csövekben (K-csövek) lévő amplifikáló keverékhez adják, ahol mind a reverz transzkripció, mind a PCR-amplifikálás megtörténik. A reakcióelegyet fel kell hevíteni, hogy lehetővé váljon a downstream primereknek a HIV-1 target RNS-hez és a HIV-1 QS RNS-hez való specifikus kapcsolódása. Mn 2+ és dezoxinukleozid-trifoszfátok (dntps), azaz dezoxiadenozin-, dezoxiguanozin-, dezoxicitidin-, dezoxiuridin- és dezoxitimidin-trifoszfátok feleslegének jelenlétében a Z05 polimeráz a kapcsolódott primerhez a target RNS-sel komplementer cdns-szálat szintetizál. Target-amplifikáció A mintákat az amplifikációs csövekben (K-csövekben) lévő amplifikáló elegyhez adják, itt megy végbe a PCR-amplifikáció. A HIV-1 target RNS és a HIV-1 QS RNS reverz transzkripcióját követően a reakcióelegyet az RNS:cDNS hibrid denaturálása és a specifikus primer targetszekvenciák szabaddá tétele végett a COBAS TaqMan analizátor, illetve a COBAS TaqMan 48 analizátor PCR-készüléke felhevíti. Az elegy kihűlésével a primerek a target DNS-hez kapcsolódnak. A Z05 polimeráz Mn 2+ és dezoxinukleozid-trifoszfátok (dntp-k), azaz dezoxiadenozin-, dezoxiguanozin-, dezoxicitidin-, dezoxiuridin- és dezoxitimidin-trifoszfátok feleslegének jelenlétében a target templát mentén meghosszabbítja a kapcsolódott primereket kétszálú DNS-molekulákat létrehozva, ezek neve amplikon. A COBAS TaqMan analizátor, illetve a COBAS TaqMan 48 analizátor adott számú cikluson keresztül automatikusan ismétli ezt a folyamatot, hogy az amplikon DNSmennyiségét ciklusonként megduplázza. A szükséges számú ciklus a COBAS TaqMan analizátorba, illetve a COBAS TaqMan 48 analizátorba előre be van programozva. Amplifikálás a HIV-1-genomnak csak a két primer közötti régiójában zajlik; a teljes HIV-1-genom nem amplifikálódik. 05447950001-12HU 3 Doc Rev. 13.0

Szelektív amplifikálás A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan v2.0 HIV-1 teszt a target-nukleinsav szelektív amplifikálását a mintából az AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim és dezoxiuridin-trifoszfát (dutp) használatával éri el. Az AmpErase enzim felismeri és katalizálja az olyan DNS-szálak megsemmisítését, amelyek dezoxiuridint tartalmaznak 33, a dezoxitimidint tartalmazókét viszont nem. A dezoxiuridin a természetes DNS-ben nincs jelen, ugyanakkor az amplikonban mindig megtalálható, miután a master mix reagens a dntp-k egyikeként dezoxiuridin-trifoszfátot használ; tehát csak az amplikon tartalmaz dezoxiuridint. A dezoxiuridinnak köszönhetően a szennyező amplikont az AmpErase enzim még a target DNS amplifikálását megelőzően lebontja. Az AmpErase enzim lebont továbbá minden olyan nem specifikus terméket, amely a master mix kezdeti, mangán okozta aktiválódása után képződik. A master mix reagensben lévő AmpErase enzim katalizálja a dezoxiuridint tartalmazó DNS hasítását a dezoxiuridin-csoportoknál úgy, hogy a dezoxiribózlánc felnyílását okozza a C1 helyen. Az első hevítési lépésben az amplikon DNS-lánc a dezoxiuridin helyén eltörik, tehát a DNS nem lesz amplifikálható. Az AmpErase enzim hosszabb ideig inaktív marad, ha egyszer 55 C feletti hőmérsékletnek lett kitéve, azaz a hevítési lépések ideje alatt, ezért nem bontja le az amplifikáció során keletkezett targetamplikont. A PCR-termékek kimutatása COBAS TaqMan teszt során A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan v2.0 HIV-1 teszt valós idejű 34,35 PCR-technológiát alkalmaz. A kettős-jelölt fluoreszcens próbák használata lehetővé teszi a PCR-termék felszaporodásának valós idejű detektálását az amplifikálási folyamat során felszabaduló fluoreszcens jelzőfestékek emissziós intenzitásának monitorozása révén. A HIV-1 tartalmú és HIV-1 QS-specifikus oligonukleotid próbák egy jelző (reporter) és egy blokkoló (quencher) festékkel jelöltek. A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan v2.0 HIV-1 teszt során a HIV-1 és HIV-1 QS próbák különböző fluoreszcens jelzőfestékkel vannak jelölve. Amikor ezek a próbák érintetlenek, a jelzőfesték fluoreszcenciája Förster-típusú energiatranszfer-effektus révén gátolt a blokkoló festék közelsége miatt. PCR során a próba hibridizál egy targetszekvenciával, és az 5' 3' nukleáz aktivitású hőstabil Z05 DNS-polimeráz hasítja. Ha egyszer a jelző és blokkoló festékek felszabadulnak és különválnak, megszűnik a blokkolás, és a jelzőfesték fluoreszcens aktivitása megnő. A HIV-1 RNS és a HIV-1 QS RNS amplifikációja egymástól függetlenül, különböző hullámhosszokon van mérve. Ez a folyamat adott számú cikluson keresztül ismétlődik, minden egyes ciklus jelentősen megnöveli az adott jelzőfestékek emissziós intenzitását, ezáltal lehetővé téve a HIV-1 RNS és HIV-1 QS RNS független azonosítását. A PCR-ciklus, amelynek során a növekedési görbe még exponenciális jelleget mutat, a PCR kezdetekor jelenlévő kiindulási anyag mennyiségével mutat összefüggést. A COBAS TaqMan teszt mennyiségi meghatározás alapjai A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan v2.0 HIV-1 teszt jellemzően kvantitatív egy nagyon széles dinamikus tartományon, miután az amplikon monitorozása az amplifikáció exponenciális fázisa során történik. Minél magasabb a minta HIV-1 titere, annál korábban emelkedik a HIV-1 próbák jelző festékének fluoreszcenciája az alap fluoreszcencia szint fölé (lásd 1. ábra). Mivel a HIV-1 QS RNS mennyisége állandó valamennyi mintában, a HIV-1 QS próba jelzőfestékének fluoreszcenciája valamennyi minta esetén ugyanazon ciklus során kell megjelenjen (lásd 2. ábra). Azokban a mintákban, ahol a QS fluoreszcenciája befolyásolva van, a koncentráció ennek megfelelően módosul. A specifikus fluoreszcenciaszignálok megjelenését kritikus küszöbértéknek (Ct) nevezik. A kritikus küszöbérték definíció szerint az a tört alakú ciklus szám, amelynél a jelzőfesték fluoreszcenciája meghalad egy előre meghatározott küszöbértéket (a kijelölt fluoreszcenciaszintet), és megkezdődik ezen szignál exponenciális növekedési fázisa (lásd 3. ábra). Egy magasabb kritikus küszöbérték a kiindulási HIV-1 target anyag egy alacsonyabb titerét jelzi. Egy 2-szeres titeremelkedés a target HIV-1 RNS kritikus küszöbértékének 1-gyel való csökkenésével korrelál, míg egy 10-szeres titeremelkedés a kritikus küszöbérték 3,3-del való csökkenésével korrelál. 05447950001-12HU 4 Doc Rev. 13.0

Az 1. ábra egy hígítási sor target növekedési görbéit mutatja az 5-log 10 tartományon. Ahogy a víruskoncentráció nő, a növekedési görbék korábbi ciklusokra tolódnak. Emiatt a legbaloldalibb növekedési görbe a legmagasabb vírustiterszinthez tartozik, a legjobboldalibb növekedési görbe pedig a legalacsonyabb vírustiterszinthez tartozik. 1. ábra Hígítási sor target növekedési görbéi az 5-log 10 tartományon Normalizált fluoreszcencia 10 5 Legmagasabb titer Legalacsonyabb titer 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Ciklusszám A 2. ábra egy vírushígítási sorból származó minták mennyiségi standard növekedési görbéit mutatja az 5-log 10 tartományon. A mintákhoz adott mennyiségi standard mennyisége állandó minden egyes reakcióban. A mennyiségi standard kritikus küszöbértéke a vírustitertől függetlenül hasonló. 2. ábra Hígítási sor mennyiségi standard növekedési görbéi az 5-log 10 tartományon 50 40 Normalizált fluoreszcencia 30 20 10 Legalacsonyabb titer Legmagasabb titer 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Ciklusszám 05447950001-12HU 5 Doc Rev. 13.0

A 3. ábra egy példát mutat be arra, hogyan történik az egyes növekedési görbék összes ciklusban mért fluoreszcenciaértékeinek normalizálása. A tört alakú ciklusszámot (kritikus küszöb) úgy határozzák meg, hogy hol keresztezi a fluoreszcenciaszignál a kijelölt fluoreszcenciaszintet. 3. ábra Egyes növekedési görbék összes ciklusban mért fluoreszcenciaértékeinek normalizálása 1,0 0,8 Normalizált fluoreszcencia 0,6 0,4 0,2 0,0 Rögzített fluoreszcenciaszint Ct-érték = 28,2 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31-0,2 Ciklusszám A HIV-1 RNS mennyiségi meghatározása A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan v2.0 HIV-1 teszt a HIV-1 vírus RNS-t mennyiségileg határozza meg egy második targetszekvencia (HIV-1 mennyiségi standard) felhasználásával, amely minden egyes mintához ismert koncentrációban van hozzáadva. A HIV-1 QS egy olyan nem fertőző Armored RNA-konstrukció, amely a HIV-1 gag targetszekvencia kötő régióival identikus primerkötő régiójú HIV-1 szekvenciarészleteket tartalmaz. A HIV-1 QS HIV-1 primerkötő régiókat tartalmaz, és egy ugyanolyan hosszúságú és bázisösszetételű amplifikációs terméket szintetizál, mint a HIV-1 gag target RNS. A HIV-1 QS próbakötő régióját úgy módosították, hogy a HIV-1 QS amplikon különbözzön a HIV-1 gag target amplikontól. A COBAS TaqMan analizátor, illetve a COBAS TaqMan 48 analizátor a PCR anellációs fázisa során a mintákat szűrt fénnyel világítja meg és gerjeszti, és minden egyes minta szűrt emissziójú fluoreszcencia adatait gyűjti. Ezután a műszer ingadozásai miatt minden egyes minta leolvasási értékét korrigálja. Ezeket a fluoreszcencia leolvasási adatokat a készülék az AMPLILINK szoftverre küldi, és eltárolja egy adatbázisban. Előellenőrzéseket végez annak meghatározására, hogy a HIV-1 RNS és a HIV-1 QS RNS adatok érvényes sorokat mutatnak-e, és az előre beállított határokon kívül eső adatokat jelzőkkel látja el. Miután minden előellenőrzés befejeződött és megfelelt, a készülék feldolgozza a fluoreszcencia leolvasásokat, és létrehozza a HIV-1 RNS és a HIV-1 QS RNS kritikus küszöbértékeit. A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan v2.0 HIV-1 teszt mellé biztosított tételspecifikus kalibrációs állandók szolgálnak a minták és kontrollok titerértékeinek kiszámítására a HIV-1 RNS és HIV-1 QS RNS kritikus küszöbértékeken alapján. A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 teszt, v2.0 standardizálása az Egészségügyi Világszervezet (WHO) HIV-1 RNS nemzetközi standardja szerint történt. A titereredmények kópia/ml (cp/ml) vagy nemzetközi egység/ml (International Units, IU/mL) mértékegységben vannak megadva. A HIV-1 RNS cp/ml (kópia/ml) és a HIV-1 IU/ml közti váltószám a Roche Molecular Systems, Inc. meghatározása szerint 0,6 cp/iu (1,67 IU/cp). 05447950001-12HU 6 Doc Rev. 13.0

REAGENSEK COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 (P/N: 05212294 190) HIV-1 v2.0 CS1 (HIV-1 mágneses üvegpartikulum reagenskazetta) Mágneses üvegpartikulum 93% izopropanol HIV-1 v2.0 CS2 (HIV-1 roncsoló reagenskazetta) nátrium-citrát-dihidrát 42,5% guanidin-tiocianát < 14% polidokanol 0,9% ditiotreitol HIV-1 v2.0 CS3 HIV-1 multi-reagens kazetta tartalmaz: Pase (proteináz oldat) trisz puffer < 0,05% EDTA kalcium-klorid kalcium-acetát 7,8% proteináz glicerin EB (eluáló puffer) trisz-bázis puffer 0,2% metilparaben HIV-1 v2.0 CS4 HIV-1 tesztspecifikus reagenskazetta tartalmaz: HIV-1 QS (HIV-1 mennyiségi standard) trisz-hcl puffer EDTA < 0,005% Poli ra RNS (szintetikus) < 0,001% Armored HIV-1 RNS konstrukció, amely HIV-1 primerkötő szekvenciákat és egy egyedi próbához kötődő régiót tartalmaz (nem fertőző RNS MS2 bakteriofágban) 0,05% nátrium-azid HI2CAP 48 teszt 1 x 48 teszt 1 x 48 teszt 1 x 48 teszt 1 x 3,8 ml 1 x 7,0 ml 1 x 48 teszt 1 x 3,6 ml 05447950001-12HU 7 Doc Rev. 13.0

HIV-1 MMX (HIV-1 master mix) tricin puffer kálium-acetát kálium-hidroxid 20% dimetilszulfoxid glicerin < 0,04% datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,003% upstream és downstream primerek a HIV-1 gag és LTR régióihoz < 0,003% oligonukleotid aptamer < 0,003% fluoreszcens-jelzett oligonukleotid próbák, specifikusak HIV-1-re és a HIV-1 QS-re < 0,05% Z05 DNS-polimeráz (mikrobiális) < 0,1% AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim (mikrobiális) 0,09% nátrium-azid CAP/CTM Mn 2+ (CAP/CTM mangánoldat) < 0,5% mangán-acetát jégecet 0,09% nátrium-azid HIV-1 H(+)C, v2.0 (HIV-1 magas pozitív kontroll, v2.0) < 0,001% HIV-1 szekvenciákat tartalmazó Armored HIV-1 RNS konstrukció (nem fertőző RNS MS2 bakteriofágban) Negatív humán plazma, tesztekkel nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCR-technikával nem kimutatható 0,1% ProClin 300 tartósítószer HIV-1 L(+)C, v2.0 (HIV-1 alacsony pozitív kontroll, v2.0) < 0,001% HIV-1 szekvenciákat tartalmazó Armored HIV-1 RNS konstrukció (nem fertőző RNS MS2 bakteriofágban) Negatív humán plazma, tesztekkel nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCR-technikával nem kimutatható 0,1% ProClin 300 tartósítószer CTM ( ) C [COBAS TaqMan negatív kontroll (humán plazma)] Negatív humán plazma, tesztekkel nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCR-technikával nem kimutatható 0,1% ProClin 300 tartósítószer HIV-1 H(+)C, v2.0 Clip (HIV-1 magas pozitív kontroll, v2.0 vonalkódklipsz) HIV-1 L(+)C, v2.0 Clip (HIV-1 alacsony pozitív kontroll, v2.0 vonalkódklipsz) HIV-1 ( ) C Clip (HIV-1 negatív kontroll, v2.0 vonalkódklipsz) 1 x 2,5 ml 1 x 19,8 ml 4 x 1,0 ml 4 x 1,0 ml 4 x 1,0 ml 1 x 4 klipsz 1 x 4 klipsz 1 x 4 klipsz 05447950001-12HU 8 Doc Rev. 13.0

COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan mosóreagens (P/N: 03587797 190) PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan mosóreagens) nátrium-citrát-dihidrát < 0,1% N-metilizotiazolon-HCl PG WR 1 x 5,1 l FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK A. IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. B. A vizsgálat csak EDTA véralvadásgátlóval gyűjtött humán plazmamintákkal végezhető. C. Ne pipettázzon szájjal. D. Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a laboratórium területén. Viseljen egyszer használatos védőkesztyűt, védőruhát és szemvédőt a minták és a készlet reagensei kezelése közben. A minták és a tesztreagensek kezelését követően gondosan mosson kezet. E. A kontrollfiolákból való anyagkivétel során kerülje el a reagensek mikrobiális és ribonukleáz-szennyezését. F. Steril, egyszer használatos pipetták és RNázmentes pipettahegyek használata javasolt. G. Ne öntsön össze különböző tételekből, vagy azonos tételből, de különböző flakonokból származó kontrollokat. H. Ne keverje a különböző készletekből származó kazettákat, illetve kontrollokat. I. Ne nyissa ki a COBAS AmpliPrep kazettákat, ne cseréljen ki, ne keverjen össze, ne vegyen ki vagy tegyen be flakonokat. J. A fel nem használt reagensek, hulladék és minták kezelésének összhangban kell lennie a megfelelő országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásokkal. K. A készletet ne használja a szavatossági idő után. L. A biztonsági adatlapok (SDS) igény esetén hozzáférhetőek a helyi Roche irodában. M. A mintákat és kontrollokat fertőzőként kell kezelni a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 37 és a CLSI Document M29-A3 38 előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet. Megjegyzés: A kereskedelemben kapható háztartási fehérítő rendszerint 5,25%-ban tartalmaz nátrium-hipokloritot. Az 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő megfelel 0,5% nátrium-hipoklorit oldatnak. N. FIGYELMEZTETÉS: CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 és HIV-1 H(+)C, v2.0 emberi vérből származó humán plazmát tartalmaz. A forrás anyag tesztekkel vizsgálva nem bizonyult reaktívnak Hepatitis B felületi antigénre (HBsAg), HIV-1/2 és HCV antitestekre, valamint HIV p24 antigénre. A negatív humán plazma PCR-technikával történő vizsgálata során HIV-1 RNS, HCV RNS vagy HBV DNS nem volt kimutatható. Egyetlen vizsgálati módszer sem nyújthat teljes garanciát arra, hogy a humán vérkészítményekben nincs jelen fertőző anyag. Emiatt minden humán eredetű anyagot potenciálisan fertőzőnek kell tekinteni. A CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 és HIV-1 H(+)C, v2.0 fertőzőként kezelendő a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 37 és a CLSI Document M29-A3 38 előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet. 05447950001-12HU 9 Doc Rev. 13.0

O. A HIV-1 QS, CAP/CTM Mn 2+ és HIV-1 MMX nátrium-azidot tartalmaz. A nátrium-azid ólom- és rézcsövekkel erősen robbanékony fém-azidokat képezve reakcióba léphet. Amikor nátriumazid tartalmú oldatokat önt ki a laboratóriumi mosogatóba, az azidlerakódás megakadályozására nagy mennyiségű vízzel öblítse ki a lefolyót. P. Viseljen szemvédőt, köpenyt és egyszer használatos gumikesztyűt minden reagens kezelése közben. Ezen anyagok bőrrel, szemmel és nyálkahártyákkal való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal mossa le nagy mennyiségű vízzel. Ellenkező esetben égő érzés előfordulhat. Ezen reagenseket kiömlés esetén a szárazra törlés előtt vízzel hígítsuk. Q. Ügyeljen rá, hogy a HIV-1 v2.0 CS2 és a COBAS AmpliPrep készülékből származó folyékony hulladék, amely guanidin-tiocianátot tartalmaz, ne érintkezzen nátrium-hipoklorit (fehérítő) oldattal. Az ilyen keverékekből erősen mérgező gáz fejlődhet. R. Amikor használt COBAS AmpliPrep mintafeldolgozó egységet [Sample Processing Unit (SPU)] dob ki, amely guanidin-tiocianátot tartalmaz, ügyeljen rá, hogy az ne kerüljön kapcsolatba nátrium-hipoklorit (fehérítő) oldattal. Az ilyen keverékekből erősen mérgező gáz fejlődhet. TÁROLÁSI ÉS KEZELÉSI KÖVETELMÉNYEK A. A reagenseket és kontrollokat tilos lefagyasztani. B. A HIV-1 v2.0 CS1, HIV-1 v2.0 CS2, HIV-1 v2.0 CS3 és HIV-1 v2.0 CS4 reagenseket 2 8 C között tárolja. Használaton kívül ezek a reagensek a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. Felbontást követően ezek a reagensek 2 8 C-on 28 napig stabilak (vagy a lejárati időig, amelyik előbb következik). A HIV-1 v2.0 CS1, HIV-1 v2.0 CS2, HIV-1 v2.0 CS3 és HIV-1 v2.0 CS4 maximum 4 gépi cikluson át használható, legfeljebb összesen 64 órát eltöltve a COBAS AmpliPrep készülékben. A gépi ciklusok között a reagenseket 2 8 C között tárolja. C. A HIV-1 H(+)C, v2.0, HIV-1 L(+)C, v2.0 és CTM ( ) C reagenseket 2 8 C között tárolja. A kontrollok a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. Felbontást követően a fel nem használt részt ki kell dobni. D. A vonalkódklipszeket [HIV-1 H(+)C, v2.0 Clip, HIV-1 L(+)C, v2.0 Clip és HIV-1 ( ) C Clip] 2 30 C között tárolja. E. A PG WR reagenst 2 30 C között tárolja. A PG WR a feltüntetett lejárati időn belül stabil. Felbontást követően ez a reagens 2 30 C között 28 napig stabil (vagy a lejárati időig, amelyik előbb következik). 05447950001-12HU 10 Doc Rev. 13.0

A KÉSZLET TARTALMA A. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test, v2.0 (P/N: 05212294 190) HI2CAP HIV-1 v2.0 CS1 (HIV-1 mágneses üvegpartikulum reagenskazetta) HIV-1 v2.0 CS2 (HIV-1 roncsoló reagenskazetta) HIV-1 v2.0 CS3 (HIV-1 multi-reagens kazetta) HIV-1 v2.0 CS4 (HIV-1 teszt-specifikus reagenskazetta) HIV-1 H(+)C, v2.0 (HIV-1 magas pozitív kontroll, v2.0) HIV-1 L(+)C, v2.0 (HIV-1 alacsony pozitív kontroll, v2.0) CTM ( ) C [COBAS TaqMan negatív kontroll (humán plazma)] HIV-1 H(+)C, v2.0 Clip (HIV-1 magas pozitív kontroll, v2.0 vonalkódklipsz) HIV-1 L(+)C, v2.0 Clip (HIV-1 alacsony pozitív kontroll, v2.0 vonalkódklipsz) HIV-1 ( ) C Clip (HIV-1 negatív kontroll vonalkódklipsz) B. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan mosóreagens (P/N: 03587797 190) PG WR PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan mosóreagens) 05447950001-12HU 11 Doc Rev. 13.0

SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK Műszerezettség és szoftver COBAS AmpliPrep készülék COBAS TaqMan analizátor, illetve COBAS TaqMan 48 analizátor Opcionális: cobas p 630 készülék Opcionális: Docking Station AMPLILINK szoftver, 3.3-as vagy 3.4-es verzió AMPLILINK szoftver Vezérlőegysége, nyomtatóval Készülék és szoftver kézikönyvek: COBAS AmpliPrep készülék kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.3-as és 3.4-es verziójával való használatra COBAS TaqMan analizátorkészülék kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.3-as és 3.4-es verziójával való használatra COBAS TaqMan 48 analizátorkészülék kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.3- as és 3.4-es verziójával való használatra AMPLILINK 3.3-as verziójú szoftver alkalmazási kézikönyve a COBAS AmpliPrep készülékkel, COBAS TaqMan analizátorral, COBAS TaqMan 48 analizátorral, COBAS AMPLICOR analizátorral és cobas p 630 készülékkel való használatra vagy AMPLILINK szoftver, 3.4-es verzió alkalmazási kézikönyve - Opcionális: cobas p 630 készülék felhasználói kézikönyve, 2.2-es szoftververzió Vizsgálatdefiníciós fájl (Test Definition File, TDF). A TDF neve és aktuális verziója a készlethez mellékelt termékinformációs kártyán található. Egyszer használatos anyagok Mintafeldolgozó egységek: SPU-k Mintabeviteli csövek (S-csövek) vonalkódklipsszel K-hegy állványok 12 x 96-os K-cső doboz 05447950001-12HU 12 Doc Rev. 13.0

EGYÉB SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK Mintaállvány (SK 24 állvány) Reagensállvány SPU-állványok K-cső kupakrögzítő, motorizált K-cső kupakrögzítő K-hordozó K-hordozó transzporter K-hordozó állvány Pipettahegyek aeroszolbarrierrel (szűrő) vagy pozitív kiszorításos RNázmentes hegyek (1000 µl)* Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes Vortex keverő * A pipetták pontossága a névleges térfogat 3%-án belül legyen. Aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos RNázmentes pipettahegyeket kell használni ott, ahol alapvető megelőzni a minta és az amplikon keresztszennyeződését. A MINTA LEVÉTELE, TRANSZPORTJA ÉS TÁROLÁSA Megjegyzés: Valamennyi mintát és kontrollt fertőzések átvitelére alkalmasként kell kezelni. Megjegyzés: A vizsgálatot csak EDTA véralvadásgátlóval gyűjtött humán plazma használatára validálták. Más típusú minták vizsgálata pontatlan eredménnyel járhat. A. A minta levétele A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan v2.0 HIV-1 teszt plazmamintákkal való használatra alkalmas. A vért EDTA (lila kupak) alvadásgátlót tartalmazó steril csövekbe kell levenni és a gyártó utasításainak megfelelően összekeverni. A vért ne hagyja 2 25 C-on 24 óránál hosszabb ideig. A plazmát a levételtől számított 24 órán belül szeparálja el a teljes vérből centrifugálással (800-1600 x g, 20 perc, szobahőmérséklet). Vigye át a plazmát egy steril polipropilén csőbe. A 4. ábra a mintastabilitási vizsgálatokból származó mintastabilitási adatokat tünteti fel, melyeket a COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 teszt használatával végeztek (P/N: 03543005 190). 05447950001-12HU 13 Doc Rev. 13.0

4. ábra HIV-1 stabilitása teljes vérben (EDTA-s plazmacsövekbe levéve) Átlag (n=4) HIV-1 RNS eredmény log 10 HIV-1 RNS cp/ml 5.0 5,0 4.0 4,0 3.0 3,0 2.0 2,0 1.0 1,0 < 1 óra (T0) 24 óra, 25 30 C 24 óra, 2 8 C 0.0 0,0 Donor P1 Donor P2 Donor P3 Mintaazonosító B. A minta transzportja A teljes vér vagy plazma transzportja meg kell, hogy feleljen a kóroki ágensek transzportjára vonatkozó országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásoknak 39. A teljes vért 2 25 C között kell szállítani, és a levételtől számított 24 órán belül lecentrifugázni. A plazmát 2 8 C között, illetve -20 C és -80 C között fagyasztva kell szállítani. C. A minta tárolása A plazmamintákat szobahőmérsékleten (25 30 C) 1 napig vagy 2 8 C között 6 napig lehet tárolni. A plazmaminták -20 C és -80 C között fagyasztva hat hétig maradnak stabilak. A minták tárolása 1100 1200 µl részletekben steril, 2,0 ml-es polipropilén csavarókupakos csövekben (pl. Sarstedt 72.694.006) javasolt. Az 5. ábra a mintatárolási vizsgálatokból származó mintastabilitási adatokat tünteti fel, melyeket a COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 teszt használatával végeztek (P/N: 03543005 190). 5. ábra HIV-1 stabilitása EDTA-s plazmában 5.0 5,0 Átlag (n=4) HIV-1 RNS eredmény log 10 HIV-1 RNS cp/ml 4.0 4,0 3.0 3,0 2.0 2,0 1.0 1,0 T=0 24 óra, 28 C 6 nap, 2 8 C 6 hét, -20 C 6 hét, -80 C 0.0 0,0 Donor P4 Donor P5 Donor P6 Mintaazonosító A plazmaminták legfeljebb öt alkalommal olvaszthatók és fagyaszthatók szignifikáns HIV-1 RNSveszteség nélkül. A 6. ábra egy fagyasztás-olvasztási vizsgálatból származó adatokat tünteti fel, melyet a COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 teszt használatával végeztek (P/N: 03543005 190). 05447950001-12HU 14 Doc Rev. 13.0

6. ábra HIV-1 eredmények öt fagyasztás-olvasztási (F-O) ciklus után (EDTA-s plazma) 5.0 5,0 Átlag (n=4) HIV-1 RNS eredmény log 10 HIV-1 RNS cp/ml 4.0 4,0 3.0 3,0 2.0 2,0 1.0 1,0 0.0 0,0 Donor P10 Donor P11 Donor P12 Mintaazonosító Kontroll 3 F-O 5 F-O HASZNÁLATI UTASÍTÁS Megjegyzés: A részletes üzemeltetési utasításokat, lehetséges konfigurációk részletes leírását, az eredmények nyomtatását, valamint a jelzők, megjegyzések és hibaüzenetek értelmezését a következő kézikönyvekben találja: (1) a COBAS AmpliPrep készülék kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.3-as és 3.4-es verziójával való használatra; (2) a COBAS TaqMan analizátorkészülék kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.3-as és 3.4-es verziójával való használatra; (3) a COBAS TaqMan 48 analizátorkészülék kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.3-as és 3.4-es verziójával való használatra; (4) az AMPLILINK 3.3-as verziójú szoftver alkalmazási kézikönyve a COBAS AmpliPrep készülékkel, COBAS TaqMan analizátorral, COBAS TaqMan 48 analizátorral, COBAS AMPLICOR analizátorral és cobas p 630 készülékkel vagy az AMPLILINK szoftver 3.4-es verziójú alkalmazási kézikönyvével való használatra; (5) Opcionális: cobas p 630 készülék felhasználói kézikönyve, 2.2-es szoftververzió. Mintacsoport mennyisége Valamennyi készlet 48 vizsgálatra elegendő reagenst tartalmaz, amely 12 vagy 24 mintás csoportokban végezhető. Valamennyi csoportnak legalább egy CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 és HIV-1 H(+)C, v2.0 kontrollt kell tartalmaznia (lásd Minőség-ellenőrzés rész). Munkafolyamat A COBAS TaqMan analizátoron, illetve COBAS TaqMan 48 analizátoron történő futtatást a minta- és kontroll-előkészítés befejezését követő 120 percen belül meg kell kezdeni. Megjegyzés: A feldolgozott mintákat és kontrollokat tilos lefagyasztani vagy 2 8 C-on tárolni. Minta és kontroll előkészítése Megjegyzés: Fagyasztott minták használatakor tegye a mintákat szobahőmérsékletre, amíg azok teljesen fel nem olvadnak, majd felhasználás előtt vortexelje 3 5 másodpercig azokat. A 2 8 C-on tárolt kontrollokat vegye ki, és hagyja, hogy felhasználás előtt felvegyék a szobahőmérsékletet. 05447950001-12HU 15 Doc Rev. 13.0

A COBAS AmpliPrep készülék beállítása A. Karbantartás és üzembehelyezés A1. A COBAS AmpliPrep készülék készenléti (stand-by) módban működésre kész. A2. Kapcsolja be az AMPLILINK szoftver Vezérlőegységét (ON). Készítse elő a Vezérlőegységet az alábbiak szerint: 1. Jelentkezzen be a Microsoft Windows operációs rendszerbe. 2. Kattintson duplán az AMPLILINK szoftver ikonjára. 3. A megfelelő felhasználói azonosítóval és jelszóval jelentkezzen be az AMPLILINK szoftverbe. A3. A Status képernyő segítségével ellenőrizze a PG WR-ellátást, és ha szükséges, pótolja. A4. Végezze el a Due lapon felsorolt karbantartási műveleteket. A COBAS AmpliPrep készülék automatikusan üzembe helyezi a rendszert. B. Reagenskazetták betöltése Megjegyzés: A 2 8 C-on tárolt valamennyi reagenskazettát vegye ki, helyezze be azonnal a COBAS AmpliPrep készülékbe, és hagyja legalább 30 percig, hogy felvegye a készülékben a szobahőmérsékletet az első minta feldolgozása előtt. Ne hagyja a reagenskazettákat a készüléken kívül szobahőmérsékletre melegedni, mert a vonalkódcímkéken páralecsapódás jöhet létre. Ne törölje le, ha a vonalkódcímkéken páralecsapódás történik. B1. Helyezze a HIV-1 v2.0 CS1 kazettát a reagensállványba. Helyezze a HIV-1 v2.0 CS2, HIV-1 v2.0 CS3 és HIV-1 v2.0 CS4 kazettákat egy külön reagensállványba. B2. Helyezze a HIV-1 v2.0 CS1 kazettát tartalmazó reagensállványt a COBAS AmpliPrep készülék A állványpozíciójába. B3. Helyezze a HIV-1 v2.0 CS2, HIV-1 v2.0 CS3 és HIV-1 v2.0 CS4 kazettákat tartalmazó reagensállványt a COBAS AmpliPrep készülék B, C, D vagy E állványpozíciójába. (További információért lásd 1. táblázat.) 05447950001-12HU 16 Doc Rev. 13.0

C. Egyszer használatos anyagok betöltése Megjegyzés: Határozza meg a szükséges COBAS AmpliPrep reagenskazetták, mintafeldolgozó egységek (SPU-k), mintabeviteli csövek (S-csövek), K-hegyek és K-csövek számát. Minden egyes mintához, illetve kontrollhoz egy SPU, egy beviteli S-cső, egy K-hegy és egy K-cső szükséges. A COBAS AmpliPrep készülék COBAS TaqMan analizátorral, illetve COBAS TaqMan 48 analizátorral való együttes használata többféle munkafolyamatban lehetséges. Tanulmányozza alább a 1. táblázatot. Az alkalmazott munkafolyamattól függően helyezze a megfelelő számú reagenskazetta-állványt, mintaállványt a beviteli S-csövekkel, SPU állványt, K-hegy állványt, K-cső állványt és K-hordozó állványt a K-hordozókkal a COBAS AmpliPrep készülék megfelelő pozícióiba (további információért lásd az 1. táblázatot). C1. Helyezze az SPU-kat az SPU állvány(ok)ra, és tegye az állvány(oka)t a COBAS AmpliPrep Instrument J, K vagy L állványpozíciójába. C2. Az alkalmazott munkafolyamattól függően, helyezze a teli K-cső állvány(oka)t a COBAS AmpliPrep készülék M, N, O vagy P állványpozíciójába. C3. Helyezze a teli K-hegy állvány(oka)t a COBAS AmpliPrep készülék M, N, O vagy P állványpozíciójába. C4. A COBAS TaqMan 48 analizátor 3. munkafolyamatának alkalmazása folyamán helyezze a K-hordozókat a K-hordozó állvány(ok)ra, a COBAS AmpliPrep készülék M & N vagy O & P állvány-pozíciójába. 05447950001-12HU 17 Doc Rev. 13.0

1. táblázat Lehetséges munkafolyamatok a COBAS AmpliPrep készülék COBAS TaqMan analizátorral, illetve COBAS TaqMan 48 analizátorral való együttes használata esetén 1 2 3 Munkafolyamat COBAS AmpliPrep készülék plusz Docking Station plusz COBAS TaqMan analizátor COBAS AmpliPrep készülék plusz COBAS TaqMan analizátor COBAS AmpliPrep készülék plusz COBAS TaqMan 48 analizátor(ok) Átviteli mód a COBAS TaqMan analizátorra, illetve COBAS TaqMan 48 analizátorra K-hordozó automatizált átvitele K-csövek manuális átvitele a mintaállvány(ok)on a COBAS TaqMan analizátorba K-hordozó(k) manuális átvitele a K-hordozó állvány(ok)on a COBAS TaqMan 48 analizátorba Állványok, hordozók és egyszer használatos anyagok K-csövek teli K-cső állványokon K-hegyek teli K-hegy állványokon Mintákat és kontrollokat tartalmazó beviteli S-csövek, mintaállványokon SPU-k SPU-állványokon CS1 a kazettaállványon CS2, CS3, CS4 a kazettaállványon K-csövek teli K-cső állványokon K-hegyek teli K-hegy állványokon Mintákat és kontrollokat tartalmazó beviteli S-csövek, mintaállványokon SPU-k SPU-állványokon CS1 a kazettaállványon CS2, CS3, CS4 a kazettaállványon A mintafeldolgozás befejezése után: K-csövek a mintaállványokon (manuális átvitelre kész) K-csövek a mintaállványokon K-hegyek teli K-hegy állványokon Mintákat és kontrollokat tartalmazó beviteli S-csövek, mintaállványokon SPU-k SPU-állványokon CS1 a kazettaállványon CS2, CS3, CS4 a kazettaállványon Üres vonalkódú K-hordozó a K-hordozó állványon A mintafeldolgozás befejezése után: K-csövek K-hordozóban a K-hordozó állványon Pozíció a COBAS AmpliPrep készülékben M P M P F H J L A B E M P M P F H J L A B E Ugyanaz, mint fent (F H) F - H M - P F - H J - L A B - E M - P Ugyanaz, mint fent (M P) 05447950001-12HU 18 Doc Rev. 13.0

D. A minták azonosítása és betöltése D1. Készítse el a mintaállványokat a következők szerint: Tegyen egy vonalkódcímke-klipszet minden egyes mintaállvány-pozícióba, ahova minta (S-cső) fog kerülni. Tegyen egy-egy kontrollspecifikus [CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 és HIV-1 H(+)C, v2.0] vonalkódcímkeklipszet minden egyes mintaállvány-pozícióba, ahova kontroll (S-cső) fog kerülni. A kontroll vonalkódcímke-klipszeken ugyanannak a kontroll tételszámnak kell lennie, mint a készletben lévő kontroll fiolákon. Ügyeljen arra, hogy az adott kontrollt a megfelelő kontroll vonalkódklipsszel jelölt pozícióba tegye. Helyezzen egy-egy beviteli S-csövet minden egyes vonalkód-címke klipszet tartalmazó pozícióba. D2. Az AMPLILINK szoftver segítségével hozzon létre mintaazonosítót minden egyes minta és kontroll számára az Orders ablakban a Sample mappában. Válassza ki a megfelelő tesztfájlt, és végezze el a mentést. D3. Rendelje a minta- és kontrollazonosítókat mintaállvány-pozíciókhoz az Orders ablakban a Sample Rack mappában. A mintaállványszám a D1. lépésben előkészített állványé kell legyen. D4. Nyomtassa ki a Sample Rack Order lapot, mint munkalapot. D5. Készítsen elő minta- és kontrollállványokat a minta- és kontrollhozzáadásra kijelölt területre az alábbiak szerint: Vortexeljen minden egyes mintát és kontrollt [CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 és HIV-1 H(+)C, v2.0] 3-5 másodpercig. A mintákkal és kontrollokkal való munka során ügyeljen a kesztyűk szennyezésének elkerülésére. D6. Mérjen aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos RNáz-mentes heggyel ellátott mikropipettával minden egyes mintából és kontrollból [CTM ( ) C, HIV-1 L(+)C, v2.0 és HIV-1 H(+)C, v2.0] 1000-1050 µl-t a megfelelően vonalkóddal címkézett beviteli S-csőbe. Ügyeljen arra, hogy ne vigyen át szemcséket és/vagy fibrinrögöket az eredeti mintából a beviteli S-csőbe. A mintákat és kontrollokat át kell vinni a D4. lépésben kijelölt és a munkalapon rögzített csőpozíciókba. A kontroll vonalkódcímke-klipszeken ugyanannak a kontroll tételszámnak kell szerepelnie, mint a készletben lévő kontroll fiolákon. Az adott kontrollt a megfelelő kontroll vonalkódklipsszel jelölt pozícióba tegye. Ügyeljen arra, hogy ne szennyezze be mintával vagy kontrollal az S-csövek felső részét. A cobas p 630 készülék használata esetén a minta-előkészítéssel kapcsolatban olvassa el a cobas p 630 készülék felhasználói kézikönyvét. D7. Az 1. és 2. munkafolyamatok esetén helyezze a beviteli S-csövekkel töltött mintaállvány(oka)t a COBAS AmpliPrep készülék F, G vagy H állványpozícióiba. D8. A COBAS TaqMan 48 analizátor 3. munkafolyamatának alkalmazása során helyezze a mintaállvány(oka)t a beviteli S-csövekkel és K-csövekkel (beviteli S-csövenként egy, a helyes pozícióban elhelyezve a beviteli S-csövek mellé) a COBAS AmpliPrep készülék F, G vagy H állványpozícióiba. E. A COBAS AmpliPrep készülék futtatásának indítása E1. Indítsa el a COBAS AmpliPrep készüléket az AMPLILINK szoftver segítségével. 05447950001-12HU 19 Doc Rev. 13.0

F. A COBAS AmpliPrep készülék futtatásának befejezése és átvitel a COBAS TaqMan analizátorra, illetve COBAS TaqMan 48 analizátorra (csak a 2. és 3. munkafolyamat esetén) F1. Ellenőrizze a jelzőket, illetve hibaüzeneteket. F2. Remove processed specimens and controls from the COBAS AmpliPrep készülékből vagy minta állványokon (Docking Station nélküli COBAS TaqMan analizátor esetén) vagy K-hordozó állványokon (COBAS TaqMan 48 analizátor esetén), a munkafolyamattól függően (további részleteket illetően lásd a G. pontot). F3. Távolítsa el a hulladékot a COBAS AmpliPrep készülékből. Megjegyzés: A minta- és kontroll-előkészítés befejezése után a feldolgozott mintákat és kontrollokat nem szabad fénynek kitenni. Amplifikáció és kimutatás A COBAS TaqMan analizátor, illetve COBAS TaqMan 48 analizátor beállítása A COBAS TaqMan analizátoron, illetve COBAS TaqMan 48 analizátoron történő futtatást a minta- és kontroll-előkészítés befejezését követő 120 percen belül meg kell kezdeni. Megjegyzés: A feldolgozott mintákat és kontrollokat tilos lefagyasztani vagy 2 8 C-on tárolni. G. A feldolgozott minták betöltése G1. A munkafolyamattól függően a megfelelő lépéseket elvégezve vigye át a K-csöveket a COBAS TaqMan analizátorba, illetve COBAS TaqMan 48 analizátorba: 1. munkafolyamat: A K-hordozó automatizált átvitele a docking stationon keresztül COBAS TaqMan analizátorba. Manuális beavatkozás nem szükséges. 2. munkafolyamat: A mintaállvány(ok)on levő K-csövek manuális átvitele a COBAS TaqMan analizátorba. 3. munkafolyamat: A K-hordozó állvány(ok)on lévő K-hordozó(k) manuális átvitele a COBAS TaqMan 48 analizátorba. A K-hordozók manuális átvitele a COBAS TaqMan 48 analizátorba a K-hordozó transzporter segítségével. H. A COBAS TaqMan analizátor, illetve COBAS TaqMan 48 analizátor futtatásának indítása H1. A munkafolyamattól függően az alábbi lehetőségek egyike útján indítsa be a COBAS TaqMan analizátort, illetve a COBAS TaqMan 48 analizátort: 1. munkafolyamat: Beavatkozás nem szükséges. 2. munkafolyamat: A mintaállvány(ok) behelyezését követően a COBAS TaqMan analizátor automatikusan indul. 3. munkafolyamat: Töltse fel a K-hordozót üres K-csövekkel, ha 6-nál kevesebb K-cső van a K-hordozón. A feltöltést az AMPLILINK szoftver irányítja. Nyissa fel a PCR-készülék tetejét, helyezze be a K-hordozót a készülékbe, és zárja le a fedelet. Indítsa el a COBAS TaqMan 48 analizátor futtatását. 05447950001-12HU 20 Doc Rev. 13.0

I. A COBAS TaqMan analizátor, illetve COBAS TaqMan 48 analizátor futtatásának befejezése I1. A COBAS TaqMan analizátor, illetve a COBAS TaqMan 48 analizátor futtatásának befejeztével nyomtasson ki eredménylapot. Ellenőrizze az eredménylapon a jelzőket, illetve hibaüzeneteket. A jelzőkkel és megjegyzésekkel ellátott minták értékelése az Eredmények részben leírtaknak megfelelően történik. Elfogadásukat követően tárolja az adatokat az archívumban. I2. Vegye ki a használt K-csöveket a COBAS TaqMan analizátorból, illetve COBAS TaqMan 48 analizátorból. EREDMÉNYEK A COBAS TaqMan analizátor, illetve a COBAS TaqMan 48 analizátor automatikusan meghatározza a minták és kontrollok HIV-1 RNS-koncentrációját. A HIV-1 RNS-koncentrációját cp/ml vagy IU/ml mértékegységben fejezik ki a használt vizsgálatdefiníciós fájltól (TDF) függően. A nukleinsav-amplifikációs technikákra (NAT) vonatkozó HIV-1 RNS 1. WHO nemzetközi standardot (NIBSC 97/656) alkalmazva a HIV-1 RNS cp/ml és a HIV-1 IU/ml közti váltószám 0,6 cp/iu 36. Ezt a váltószámot a COBAS AMPLICOR v1.5 HIV-1 MONITOR teszt, a COBAS AmpliPrep/COBAS AMPLICOR v1.5 HIV-1 MONITOR teszt és a COBAS TaqMan HIV-1 Test For Use With The High Pure System használatával határozták meg. AMPLILINK szoftver: Meghatározza a HIV-1 RNS és a HIV-1 QS RNS ciklus küszöbértékét (Ct). Meghatározza a HIV-1 RNS-koncentrációt a HIV-1 RNS és a HIV-1 QS RNS küszöbértékek, valamint a kazettavonalkódokban megadott tételspecifikus kalibrációs együtthatók alapján. Meghatározza, hogy a HIV-1 L(+)C, v2.0-ra és HIV-1 H(+)C, v2.0-ra számított cp/ml a kijelölt tartományokba esik-e. Mintacsoport validálása AMPLILINK 3.3-as és 3.4-es verzió Ellenőrizze az AMPLILINK szoftver eredmény ablakban vagy a kinyomtatott eredménylapon a jelzőket és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön a mintacsoport érvényességéről. A készülék ellenőrzi a kontrollokat, hogy azok cp/ml vagy IU/ml értéke a kijelölt tartományon belül esik-e. Ha a kontroll cp/ml vagy IU/ml értéke a tartományon kívül esik, akkor JELZŐT kap, amely mutatja, hogy a kontroll nem felelt meg. A mintacsoport akkor érvényes, ha a kontrollok [HIV-1 L(+)C, v2.0; HIV-1 H(+)C, v2.0 és CTM ( ) C] egyike sem kap jelzőt. A mintacsoport nem érvényes, ha a HIV-1 kontrollok az alábbi jelzők bármelyikét kapják: 05447950001-12HU 21 Doc Rev. 13.0

Negatív kontroll Jelző Eredmény Értékelés NC_INVALID Invalid Érvénytelen eredmény vagy érvényes eredmény, amely nem volt negatív a HIV-1 targetre HIV-1 alacsony pozitív kontroll, v2.0 Jelző Eredmény Értékelés LPCINVALID Invalid Érvénytelen eredmény vagy egy kontroll tartományon kívül esik HIV-1 magas pozitív kontroll, v2.0 Jelző Eredmény Értékelés HPCINVALID Invalid Érvénytelen eredmény vagy egy kontroll tartományon kívül esik Ha a mintacsoport érvénytelen (invalid), ismételje meg a teljes mintacsoport vizsgálatát (minta- és kontroll-előkészítés, amplifikálás és kimutatás). Eredmények értelmezése Érvényes mintacsoport esetén ellenőrizzen minden egyes mintát, hogy kapott-e jelzőt vagy megjegyzést az eredménylapon. Értékelje az eredményeket az alábbiak szerint: Egy érvényes futtatás mind érvényes, mind érvénytelen mintaeredményeket is tartalmazhat, attól függően, hogy a jelzők és/vagy megjegyzések az egyes mintákra vonatkoznak-e. 05447950001-12HU 22 Doc Rev. 13.0

A mintaeredmények az alábbiak szerint értelmezendőek: Titereredmény Target Not Detected < 2.00E+01 cp/ml Magyarázat A HIV-1 kritikus küszöbérték meghaladja a vizsgálat korlátait, vagy nincs HIV-1 küszöbérték. Adja ki az eredményt, mint Nincs kimutatható HIV-1 RNS. A számított cp/ml a vizsgálat kimutatási határa alatt van. Adja ki az eredményeket, mint HIV-1 RNS kimutatható, kevesebb, mint 20 HIV-1 RNS cp/ml. Kópia/ml 2.00E+01 cp/ml és 1.00E+07 cp/ml > 1.00E+07 cp/ml A 20 cp/ml-nél nagyobb vagy egyenlő és 1,00E+07 cp/ml-nél kisebb vagy egyenlő számított eredmények belül esnek a vizsgálat lineáris tartományán. A számított cp/ml a vizsgálati tartomány felett van. Adja ki az eredményeket, mint nagyobb, mint 1,00E+07 HIV-1 RNS cp/ml. Amennyiben ilyen minták mennyiségi eredményére van szükség, az eredeti mintát HIV-1-negatív humán EDTA-s plazmával való 1:100 hígítását követően újra kell tesztelni. Szorozza meg a mért eredményt a hígítási faktorral. Nemzetközi egység (IU)/ml Megjegyzés: Megjegyzés: < 3.34E+01 IU/mL 3.34E+01 IU/mL és 1.67E+07 IU/mL > 1.67E+07 IU/mL A számított IU/ml a vizsgálat kimutatási határa alatt van. Adja ki az eredményeket, mint HIV-1 RNS kimutatható, kevesebb, mint 33,4 HIV-1 RNS IU/ml. A 33,4 IU/ml-nél nagyobb vagy egyenlő és 1,67E+07 IU/mlnél kisebb vagy egyenlő számított eredmények belül esnek a vizsgálat lineáris tartományán. A számított IU/ml a vizsgálat mérési tartománya felett van. Az eredményt úgy jelentse, hogy nagyobb, mint 1,67E+07 HIV-1 RNS IU/ml. Amennyiben ilyen minták mennyiségi eredményére van szükség, az eredeti mintát HIV-1-negatív humán EDTA-s plazmával való 1:100 hígítását követően újra kell tesztelni. Szorozza meg a mért eredményt a hígítási faktorral. A vizsgálati tartomány feletti minták, amelyek "QS_INVALID" jelzővel ellátott érvénytelen (Invalid) eredményt adnak, nem adhatók ki, mint > 1,00E+07 cp/ml vagy 1,67E +07 IU/ml. Az eredeti mintát HIV-1-negatív humán EDTA-s plazmával való 1:100 hígítást követően újra kell tesztelni. Szorozza meg a mért eredményt a hígítási faktorral. A titer eredmény "Failed". Értékelés: A minta feldolgozása nem volt megfelelő a COBAS AmpliPrep készüléken való minta-előkészítés során. Megjegyzés: A titer eredmény "Invalid". Értékelés: Érvénytelen eredmény. 05447950001-12HU 23 Doc Rev. 13.0