COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test

Átírás

1 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. CMVCAP COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test 72 Tests P/N: COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent 5.1 Liters P/N: PG WR FELHASZNÁLÁS MÓDJA A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test egy in vitro nukleinsav-amplifikációs vizsgálat a cytomegalovírus DNS mennyiségi meghatározására EDTA-s humán plazmában, a COBAS AmpliPrep készülék automatizált mintaelőkészítő és a COBAS TaqMan analizátor, illetve a COBAS TaqMan 48 analizátor automatizált amplifikáló és mérőberendezések segítségével. A vizsgálat kópia/ml tartományon képes a CMV DNS mennyiségi meghatározására. A nukleinsav-amplifikációs technológiai vizsgálatokra szolgáló humán cytomegalovírus első WHO Nemzetközi standard (NIBSC 09/162) 40 alapján egy kópia CMV DNS (a COBAS AmpliPrep/ COBAS TaqMan CMV Test által meghatározva) 0,91 nemzetközi egységgel [international unit (IU)] [1,1 cp/iu] egyenértékű. A vizsgálat a klinikai megjelenéssel és egyéb laboratóriumi markerekkel együtt a CMV fertőzés diagnózisában és kezelésében nyújthat segítséget CMV betegség veszélyének kitett betegekben. A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test nem való vér vagy vérkészítmények CMV fertőzöttségének szűrésére, vagy diagnosztikus vizsgálatként CMV fertőzés jelenlétének megerősítésére. A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test eredményét valamennyi releváns klinikai és laboratóriumi lelettel összefüggésben kell értékelni. A VIZSGÁLAT ÖSSZEGZÉSE ÉS MAGYARÁZATA A humán cytomegalovírus (HCMV vagy CMV) a Herpesvírus családba tartozó virális patogén, amely mind a fejlett ipari társadalmakban, mind elszigetelt őslakos csoportokban megtalálható. 1,2 Átvihető vér, szájüregi váladék, vizelet, cervicalis és hüvelyi váladék, ondó, szoptatás, könny és széklet útján. 3-9 Immunkompetens személyek primér CMV fertőzése rendszerint tünetmentes, és gyakran felderítetlen látens fertőzés marad. Úgy tűnik, hogy a fertőzés fő helye a perifériás vérben lévő mononukleáris sejtek és endotheliális sejtek. A CMV látens állapotban van jelen az emberi monocitákban/makrofágokban. 2 Látensen fertőzött egyének időszakosan üríthetik a vírust testfolyadékaikkal, és így fertőzhetnek másokat. Immunkompromittált egyének, így újszülöttek, szervátültetettek és AIDS-betegek különösen veszélyeztetettek súlyos CMV fertőzés kialakulására, amely nagyobb morbiditást és mortalitást okozhat. 10 A CMV betegség súlyos klinikai manifesztációi a CMV tünetegyüttes, retinitis, gastroenteritis, hepatitis, encephalitis, oesophagitis, enterocolitis, pancreatitis és pneumonia A humán cytomegalovírus okozta disszeminált fertőzés és aktív célszervi betegség diagnosztikájára szolgáló laboratóriumi módszerek a következők: a vírus sejtkultúrában történő izolálása perifériás fehérvérsejtekből, biopsziák szövettani vizsgálata, szerológiai módszerek, pp65 antigén mérése, valamint CMV DNS detektálása polimerázláncreakció (PCR) segítségével. 14 A tenyésztéses módszerek prediktív értéke gyenge; 48 óra 3 hét időtartamot igényelnek, és különösen immunekompromittált betegek esetén korlátozott a felhasználásuk. A pp65 antigén kimutatása intenzív laboratóriumi munkát igényel, és az antigenaemia tárolás közbeni csökkenése miatt a vér hat órán belüli feldolgozását kívánja meg. 15,22 A pp65 vizsgálatot súlyos neutropeniás betegek esetén ugyancsak nehéz kivitelezni. A plazmából PCR segítségével kimutatható, pozitív CMV DNS eredmények jól korrelálnak a perifériás fehérvérsejt-kultúra pozitivitásával és a szisztémás CMV betegség kialakulásának emelkedett kockázatával. Számos vizsgálat kimutatta az összefüggést a CMV vírusmennyiség és a CMV betegség kialakulásának kockázata között A CMV betegség kockázatát nyilvánvalóan magas vírusmennyiség jellemzi, ez aláhúzza a virusmennyiség fontos szerepét a betegség patogenezisében. 18,27,30,31 Transzplantációs recipiensek és AIDS-betegek vizsgálata megmutatta, hogy a CMV DNS PCR-kimutatása nagy fokban prediktív a betegség kialakulására és klinikai kimenetelére nézve. 17,23-26 CMV DNS-szintek mennyiségi vizsgálata kimutatta, hogy a magas vírusmennyiség, valamint a vírusmennyiségnek az idővel való emelkedése rosszabb klinikai prognózissal jár együtt számos CMV okozta állapot esetén. 18,27,28 A mennyiségi PCR-vizsgálatok továbbá lehetővé teszik az antivirális kezelés hatékonyságának monitorozását, és a vírusrezisztencia indirekt értékelését. 26,29,30,32 A CMV vírusmennyiség felhasználása az aktuális kezelési irányelvek szerint javasolt solid szervtranszplantált betegekben CMV betegség kialakulási kockázatának monitorozására és a preemptív kezelés szükségességének megítélésére, valamint aktív CMV betegség esetén a kezelésre adott válasz monitorozására. 21,22 Ugyancsak javasolt a diagnosztikus kritériumok részeként CMV betegség kórismézésére hematopoetikus őssejt transzplantált recipiensekben. 33 A Dokumentum verzióinformációi rész a dokumentum végén található HU 1 Doc Rev. 7.0

2 AZ ELJÁRÁS ALAPELVEI A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test egy nukleinsav-amplifikációs vizsgálat a citomegalovírus (CMV) DNS mennyiségi meghatározására humán plazmában. A COBAS AmpliPrep/ COBAS TaqMan CMV Testkét fő eljáráson alapul: (1) minta-előkészítés a CMV DNS izolálásához és (2) a target DNS PCR-amplifikációja és a hasított, kettősen jelölt targetspecifikus oligonukleotid kimutatási próba szimultán kimutatása. A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test lehetővé teszi az automatikus minta-előkészítést, amelyet a CMV target DNS és a CMV mennyiségi standard (QS) DNS PCR-amplifikációja és detektálása követ. A master mix reagens a CMV DNS-re és a CMV QS DNS-re egyaránt specifikus primereket és próbákat tartalmaz. Az amplifikált DNS kimutatása targetspecifikus és QS-specifikus kettősen jelölt oligonukleotid próbák segítségével történik, amelyek lehetővé teszik a CMV amplikon és a CMV QS független azonosítását. A CMV vírus-dns mennyiségi meghatározása során CMV mennyiségi standardot (QS) kell használni. Ez kompenzálja a gátló hatásokat, és az előkészítési és amplifikációs folyamatok szabályozásával lehetővé teszi a CMV DNS pontosabb mennyiségi meghatározását valamennyi mintában. A CMV QS egy nem fertőző DNS konstrukció, amely a CMV target DNS-hez és egy a CMV QS amplikon és a CMV target amplikon megkülönböztetését lehetővé tevő egyedi próbához kötődő régióval identikus primer kötő helyeket tartalmaz. A CMV QS minden egyes mintához ismert kópiaszámban hozzáadásra kerül, és halad tovább a minta-előkészítés, valamint a szimultán PCR-amplifikáció és a hasított, kettősen jelölt oligonukleotid próbák kimutatásának lépésein keresztül. A COBAS TaqMan analizátor, illetve a COBAS TaqMan 48 analizátor a vizsgálati mintákban levő CMV DNS-koncentrációt a CMV-szignálnak a CMV QS-szignállal való összehasonlításával számolja ki minden egyes minta és kontroll esetén. A targetszekvencia kiválasztása A CMV DNS és CMV QS DNS capture-jéhez generikus szilikon alapú minta-előkészítés, a CMV DNS és CMV QS DNS amplifikálása során primerként pedig meghatározott oligonukleotidok használatosak. Targetspecifikus és QS-specifikus kettős-jelölt oligonukleotid próbák teszik lehetővé a CMV-amplikon és a CMV QS-amplikon független azonosítását. A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test két amplifikációs primert használ a PCR-hez. A szignált létrehozó kettősen jelölt próba a két szál egyikéhez hibridizál, és a Z05 DNS-polimeráz hasítja a primerek extenziója során. Minta előkészítése A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV teszt automata minta-előkészítést alkalmaz a COBAS AmpliPrep készülék segítségével egy generikus szilikonon alapuló capture technika révén. A munkafolyamathoz 500 µl bemeneti mintamennyiségű EDTA-plazma szükséges, amelyből 350 µl mennyiséget dolgoz fel a COBAS AmpliPrep készülék. A CMV-víruspartikulumokat magas hőmérsékleten való inkubálás során roncsolják egy proteáz és egy olyan chaotrop roncsoló/kötő puffer segítségével, amely szabaddá teszi a nukleinsavakat, és megvédi a szabaddá tett CMV DNS-t a plazmában lévő DNázoktól. Proteáz és ismert számú CMV QS DNS-molekula kerül bejuttatásra minden egyes mintába a roncsoló reagenssel és mágneses üvegpartikulumokkal együtt. Ezt követően az elegy inkubálódik, és a CMV DNS és CMV QS DNS a mágneses üvegpartikulumok felületéhez kötődik. A nem kötődött anyagok, mint sók, fehérjék és egyéb sejtszennyeződések a mágneses üvegpartikulumok mosásával kerülnek eltávolításra. A mágneses üvegpartikulumok szeparálását és a mosási lépések befejezését követően az adszorbeált nukleinsavakat magas hőmérsékleten vizes oldattal eluálják. A szabaddá tett CMV DNS-t és CMV QS DNS-t tartalmazó feldolgozott minták az amplifikációs elegyhez kell adni, és a COBAS TaqMan analizátorba, illetve a COBAS TaqMan 48 analizátorba helyezni. PCR-amplifikálás A PCR-amplifikálási reakciót a hőstabil rekombináns enzim, Thermus specie Z05 DNS polimeráz (Z05) segítségével végzik. Magnézium (Mg 2+ ) jelenlétében, valamint megfelelő pufferviszonyok között a Z05 DNS-polimeráz aktivitást mutat. 34 Ez lehetővé teszi, hogy mind a PCR-amplifikáció az amplikon valós idejű kimutatásával együtt menjen végbe. A mintákat az amplifikációs csövekben (K-csövekben) lévő amplifikáló elegyhez adják, itt megy végbe a PCRamplifikáció. Mg 2+ és dezoxinukleozid-trifoszfátok (dntps), azaz dezoxiadenozin-, dezoxiguanozin-, dezoxicitidin-, dezoxiuridin- és dezoxitimidin-trifoszfátok feleslegének jelenlétében a Z05 polimeráz a kapcsolódott primerhez DNS szálat szintetizál. Targetamplifikálás A COBAS TaqMan Analizátor vagy COBAS TaqMan 48 Analizátor PCR készüléke felhevíti a reakcióelegyet, hogy denaturálja a kettős szálú DNS-t, és hozzáférhetővé tegye a specifikus primer szekvenciákat. Az elegy kihűlésével a primerek a target DNS-hez kapcsolódnak. A Z05 Mg 2+ és feleslegben lévő dezoxinukleotid-trifoszfátok (dntp-k) jelenlétében a kötött primereket a targettemplátok mentén meghosszabbítva egy kettős szálú DNS molekulát szintetizál, amelyet amplikonnak neveznek. A COBAS TaqMan analizátor, illetve a COBAS TaqMan 48 analizátor adott számú cikluson keresztül automatikusan ismétli ezt a folyamatot, hogy az amplikon DNS-mennyiségét ciklusonként megduplázza. A szükséges számú ciklus a COBAS TaqMan analizátorba, illetve a COBAS TaqMan 48 analizátorba előre be van programozva. Az amplifikálás a CMV-genomnak csak a primerek közötti régiójában zajlik; a teljes CMV-genom nem amplifikálódik HU 2 Doc Rev. 7.0

3 Szelektív amplifikálás A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test a target-nukleinsav szelektív amplifikálását a mintából az AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim és dezoxiuridin-trifoszfát (dutp) használatával éri el. Az AmpErase enzim felismeri és katalizálja az olyan DNS-szálak megsemmisítését, amelyek dezoxiuridint tartalmaznak 35, a dezoxitimidint tartalmazókét viszont nem. A dezoxiuridin a természetes DNS-ben nincs jelen, ugyanakkor az amplikonban mindig megtalálható, miután a master mix reagens a dntp-k egyikeként dezoxiuridin-trifoszfátot használ; tehát csak az amplikon tartalmaz dezoxiuridint. A dezoxiuridinnak köszönhetően a szennyező amplikont az AmpErase enzim még a target DNS amplifikálását megelőzően lebontja. Az AmpErase enzim lebont továbbá minden olyan nem specifikus terméket, amely a master mix kezdeti, magnézium okozta aktiválódása után képződik. A master mix reagensben lévő AmpErase enzim katalizálja a dezoxiuridint tartalmazó DNS hasítását a dezoxiuridin-csoportoknál úgy, hogy a dezoxiribózlánc felnyílását okozza a C1 helyen. Az első hevítési lépésben az amplikon DNS-lánc eltörik a dezoxiuridin helyén, tehát a DNS nem lesz amplifikálható. Az AmpErase enzim hosszabb ideig inaktív marad, ha egyszer 55 C feletti hőmérsékletnek lett kitéve, azaz a hevítési lépések ideje alatt, ezért nem bontja le az amplifikáció során keletkezett targetamplikont. A PCR-termékek kimutatása COBAS TaqMan Test során A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test valós idejű 36,37 PCR-technológiát alkalmaz. A kettős-jelölt fluoreszcens próbák használata lehetővé teszi a PCR-termék felszaporodásának valós idejű detektálását az amplifikálási folyamat során felszabaduló fluoreszcens jelzőfestékek emissziós intenzitásának monitorozása révén. A CMV-re és a CMV QS-specifikus oligonukleotidokból álló próbák egy jelző (reporter) és egy blokkoló (quencher) festékkel jelöltek. A COBAS AmpliPrep/ COBAS TaqMan CMV Test során a CMV és CMV QS próbák különböző fluoreszcens jelző festékkel vannak jelölve. Amikor ezek a próbák érintetlenek, a jelzőfesték fluoreszcenciája Förster-típusú energiatranszfer-effektus révén gátolt a blokkoló festék közelsége miatt. PCR során a próba hibridizál egy targetszekvenciával, és az 5' 3' nukleáz aktivitású hőstabil Z05 DNS-polimeráz hasítja. Ha egyszer a jelző és blokkoló festékek felszabadulnak és különválnak, megszűnik a blokkolás, és a jelzőfesték fluoreszcens aktivitása megnő. A CMV DNS és a CMV QS DNS amplifikációjának mérése egymástól függetlenül, különböző hullámhosszokon történik. Ez a folyamat adott számú cikluson keresztül ismétlődik, minden ciklusban jelentősen megnövelve az egyes jelzőfestékek emissziós intenzitását, ezáltal lehetővé téve az CMV DNS és a CMV QS DNS független azonosítását. A PCR-ciklus, amelynek során a növekedési görbe még exponenciális jelleget mutat, a PCR kezdetekor jelenlévő kiindulási anyag mennyiségével mutat összefüggést. A COBAS TaqMan Test mennyiségi meghatározás alapjai A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test kvantitatív egy nagyon széles dinamikus tartományon, mivel az amplikon monitorozása az amplifikáció exponenciális fázisa során történik. Minél magasabb a minta CMV-titere, annál korábban emelkedik a CMV próba jelző festékének fluoreszcenciája az alap fluoreszcenciaszint fölé (lásd 1. ábra). Mivel a CMV QS DNS mennyisége állandó valamennyi mintában, a CMV QS próba jelzőfestékének fluoreszcenciája valamennyi minta esetén ugyanazon ciklus során kell megjelenjen (lásd 2. ábra). Azokban a mintákban, ahol a QS fluoreszcenciája befolyásolva van, a koncentráció ennek megfelelően módosul. A specifikus fluoreszcenciaszignálok megjelenését kritikus küszöbértéknek (Ct) nevezik. A kritikus küszöbérték definíció szerint az a tört alakú ciklus szám, amelynél a jelzőfesték fluoreszcenciája meghalad egy előre meghatározott küszöbértéket (a kijelölt fluoreszcenciaszintet), és megkezdődik ezen szignál exponenciális növekedési fázisa (lásd 3. ábra). Egy magasabb kritikus küszöbérték a kiindulási CMV target anyag egy alacsonyabb titerét jelzi. Általánosságban egy 2-szeres titeremelkedés a target CMV DNS kritikus küszöbértékének 1-gyel való csökkenésével korrelál, míg egy 10-szeres titeremelkedés a kritikus küszöbérték 3,3-del való csökkenésével korrelál. Az 1. ábra egy hígítási sor target növekedési görbéit mutatja az 5-log 10 tartományon. Ahogy a víruskoncentráció nő, a növekedési görbék korábbi ciklusokra tolódnak. Emiatt a legbaloldalibb növekedési görbe a legmagasabb vírustiterszinthez tartozik, a legjobboldalibb növekedési görbe pedig a legalacsonyabb vírustiterszinthez tartozik HU 3 Doc Rev. 7.0

4 1. ábra Vírushígítási sor target növekedési görbéi az 5-log 10 tartományon Normalizált fluoreszcencia Legmagasabb titer Legalacsonyabb titer Ciklusszám A 2. ábra egy vírushígítási sorból származó minták mennyiségi standard növekedési görbéit mutatja az 5-log 10 tartományon. A mintákhoz adott mennyiségi standard mennyisége állandó minden egyes reakcióban. A mennyiségi standard kritikus küszöbértéke a vírustitertől függetlenül hasonló. 2. ábra Hígítási sor mennyiségi standard növekedési görbéi az 5-log 10 tartományon Normalizált fluoreszcencia Legalacsonyabb titer Legmagasabb titer Ciklusszám A 3. ábra egy példát mutat be arra, hogyan történik az egyes növekedési görbék összes ciklusban mért fluoreszcenciaértékeinek normalizálása. A tört alakú ciklusszámot (kritikus küszöb) úgy határozzák meg, hogy hol keresztezi a fluoreszcenciaszignál a kijelölt fluoreszcenciaszintet HU 4 Doc Rev. 7.0

5 3. ábra Egyes növekedési görbék összes ciklusban mért fluoreszcenciaértékeinek normalizálása Normalizált fluoreszcencia Rögzített fluoreszcenciaszint Ct-érték = 27,3 Ciklusszám A CMV DNS mennyiségi meghatározása A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test a CMV vírus DNS-t mennyiségileg határozza meg egy második targetszekvencia (CMV mennyiségi standard) felhasználásával, amely minden egyes mintához ismert koncentrációban van hozzáadva. A CMV QS egy nem fertőző olyan CMV-szekvenciadarabokat tartalmazó DNS konstrukció, amelyek a CMV-targetszekvencia kötő régióival identikus primer kötő régiókat tartalmaznak. A CMV QS primer kötő régiókat tartalmaz, és egy ugyanolyan hosszúságú és bázisösszetételű amplifikációs terméket szintetizál, mint a CMV target DNS. A CMV QS próbakötő régióját úgy módosították, hogy az különbözzön a CMV target amplikontól. A COBAS TaqMan analizátor, illetve a COBAS TaqMan 48 analizátor a PCR anellációs fázisa során a mintákat szűrt fénnyel világítja meg és gerjeszti, és minden egyes minta szűrt emissziójú fluoreszcencia adatait gyűjti. Ezután a műszer ingadozásai miatt minden egyes minta leolvasási értékét korrigálja. Ezeket a fluoreszcencia leolvasási adatokat a készülék az AMPLILINK szoftverre küldi, és eltárolja egy adatbázisban. Előellenőrzések történnek annak meghatározására, hogy a CMV DNS és CMV QS DNS adatok érvényes sorokat mutatnak-e, és az előre beállított határokon kívül fekvő adatok jelzőket kapnak. Valamennyi előellenőrzés befejezése után a készülék a fluoreszcens leolvasásokat feldolgozza, és kritikus küszöbértékeket hoz létre a CMV DNS és a CMV QS DNS számára. A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test mellé biztosított tételspecifikus kalibrációs állandók szolgálnak a minták és kontrollok titerértékeinek kiszámítására a CMV DNS és CMV QS DNS kritikus küszöbértékeken alapján. A titereredmények nemzetközi egység/ml (International Units, IU/mL) vagy kópia/ml (cp/ml) mértékegységben vannak megadva HU 5 Doc Rev. 7.0

6 REAGENSEK COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test (P/N: ) CMV CS1 (mágneses üvegpartikulumok reagenskazetta) mágneses üvegpartikulumok trisz-bázis puffer 0,09% nátrium-azid 0,1% metilparabén CMV CS2 (CMV lízis reagenskazetta) nátrium-citrát-dihidrát 42,5% guanidin-tiocianát 3,6% polidokanol 1,8% ditiotreitol CMV CS3 CMV multireagens kazetta tartalma: Pase (proteináz oldat) trisz puffer < 0,05% EDTA kalcium-klorid kalcium-acetát 7,8% proteináz glicerin EB (eluáló puffer) trisz-bázis puffer nátrium-hidroxid 0,09% nátrium-azid CMV CS4 CMV tesztspecifikus reagenskazetta tartalma: CMVCAP 72 teszt 1 x 72 teszt 1 x 72 teszt 1 x 72 teszt 1 x 3,8 ml 1 x 8,1 ml 1 x 72 teszt CMV QS (CMV mennyiségi standard) trisz-hcl puffer EDTA < 0,005% Poli ra RNS (szintetikus) < 0,001% nem fertőző plazmid (mikrobiális) DNS, amely CMV primer kötő szekvenciákat és egy egyedi próba kötő régiót tartalmaz 0,05% nátrium-azid 1 x 6,2 ml HU 6 Doc Rev. 7.0

7 CMV MMX (CMV master mix) tricin puffer kálium-acetát kálium-hidroxid < 20% dimetil-szulfoxid glicerin < 0,05% datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,01% upstream és downstream CMV primerek < 0,01% oligonukleotid aptamer < 0,01% CMV-re és a CMV mennyiségi standardra specifikus fluoreszcensen jelölt oligonukleotid próbák < 0,05% Z05 DNS-polimeráz (mikrobiális) < 0,1% AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim (mikrobiális) 0,09% nátrium-azid MgCl 2 (CAP/CTM magnéziumoldat) < 0,6% magnézium-klorid 0,09% nátrium-azid CMV H(+)C (CMV magas pozitív kontroll) < 0,001% CMV DNS-t tartalmazó lambda fág Humán plazma, US FDA engedélyezett tesztekkel nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre és HIV p24 antigénre vagy HIV-1 RNS-re, HBsAg-re; CMV DNS PCR technikával nem kimutatható. 0,1% ProClin 300 tartósítószer CMV L(+)C (CMV alacsony pozitív kontroll) < 0,001% lambda fág, amely CMV DNS-t tartalmaz 100-szor kisebb átlagkoncentrációban, mint a CMV H(+)C reagens CMV DNS átlagkoncentrációja Humán plazma, US FDA engedélyezett tesztekkel nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre és HIV p24 antigénre vagy HIV-1 RNS-re, HBsAg-re; CMV DNS PCR technikával nem kimutatható. 0,1% ProClin 300 tartósítószer CMV ( ) C (CMV negatív kontroll) Humán plazma, US FDA engedélyezett tesztekkel nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre és HIV p24 antigénre vagy HIV-1 RNS-re, HBsAg-re; CMV DNS PCR technikával nem kimutatható. 0,1% ProClin 300 tartósítószer CMV H(+)C Clip (CMV magas pozitív kontroll vonalkódklipsz) CMV L(+)C Clip (CMV alacsony pozitív kontroll vonalkódklipsz) CMV ( ) C Clip (CMV negatív kontroll vonalkódklipsz) 1 x 3,2 ml 1 x 9,8 ml 6 x 0,65 ml 6 x 0,65 ml 6 x 0,65 ml 1 x 6 klipsz 1 x 6 klipsz 1 x 6 klipsz COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan mosóreagens (P/N: ) PG WR 1 x 5,1 l PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan mosóreagens) nátrium-citrát-dihidrát < 0,1% N-metilizotiazolon-HCl HU 7 Doc Rev. 7.0

8 FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK A. IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. B. A vizsgálat csak EDTA véralvadásgátlóval gyűjtött humán plazmamintákkal végezhető. C. Ne pipettázzon szájjal. D. Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a laboratórium területén. Viseljen egyszer használatos védőkesztyűt, laboratóriumi köpenyt és szemvédőt a minták és tesztreagensek kezelése közben. A minták és a tesztreagensek kezelését követően gondosan mosson kezet. E. A kontrollfiolákból való anyagkivétel során kerülje el a reagensek mikrobiális és nukleázszennyezését. F. Steril, egyszer használatos pipetták és DNáz mentes pipettahegyek használata javasolt. G. Ne öntsön össze különböző tételekből, vagy azonos tételből, de különböző fiolákból származó kontrollokat. H. Ne keverje a különböző készletekből származó kazettákat, illetve kontrollokat. I. Ne nyissa ki a COBAS AmpliPrep kazettákat, ne cseréljen ki, ne keverjen össze, ne vegyen ki vagy tegyen be flakonokat. J. A fel nem használt reagensek, hulladék és minták kezelésének összhangban kell lennie a megfelelő országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásokkal. K. A kitet ne használja a szavatossági idő után. L. A biztonsági adatlapok (SDS) igény esetén hozzáférhetőek a helyi Roche irodában. M. A mintákat és kontrollokat fertőzőként kell kezelni a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 38 és a CLSI Dokumentum M29-A3 39 előírásainak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Gondosan tisztítson meg, és desztillált vagy ioncserélt vízből frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkafelületet. Megjegyzés: A kereskedelemben kapható háztartási fehérítő rendszerint 5,25%-ban tartalmaz nátriumhipokloritot. Az 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő megfelel 0,5% nátrium-hipoklorit oldatnak. N. FIGYELEM: a CMV ( ) C, CMV L(+)C és CMV H(+)C emberi vérből származó humán plazmát tartalmaz. A forrásanyag tesztekkel vizsgálva nem bizonyult reaktívnak Hepatitis B felületi antigénre (HBsAg), HIV-1/2 és HCV antitestekre, valamint HIV p24 antigénre vagy HIV-1 RNS-re. A negatív humán plazma PCR-technikával történő vizsgálata során CMV DNS nem volt kimutatható. Egyetlen vizsgálati módszer sem nyújthat teljes garanciát arra, hogy a humán vérkészítményekben nincs jelen fertőző anyag. Emiatt minden humán eredetű anyagot potenciálisan fertőzőnek kell tekinteni. A CMV ( ) C, CMV L(+)C és CMV H(+)C reagenseket fertőzőként kell kezelni a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 38 és a CLSI Dokumentum M29-A3 39 előírásainak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Gondosan tisztítson meg, és desztillált vagy ioncserélt vízből frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkafelületet. O. AMGP, EB, CMV QS, MgCl 2 és CMV MMX nátrium-azidot tartalmaz. A nátrium-azid ólom- és rézcsövekkel erősen robbanékony fém-azidokat képezve reakcióba léphet. Amikor nátrium-azid tartalmú oldatokat önt ki a laboratóriumi mosogatóba, az azidlerakódás megakadályozására nagy mennyiségű vízzel öblítse ki a lefolyót. P. Viseljen szemvédőt, köpenyt és egyszer használatos gumikesztyűt minden reagens kezelése közben. Ezen anyagok bőrrel, szemmel és nyálkahártyákkal való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal öblítse le bő vízzel. Ellenkező esetben égető érzés jelentkezhet. Ezen reagenseket kiömlés esetén a szárazra törlés előtt vízzel hígítsuk. Q. Ügyeljen rá, hogy a CMV CS2 és a COBAS AmpliPrep készülékből származó folyékony hulladék, amely guanidintiocianátot tartalmaz, ne érintkezzen nátrium-hipoklorit (fehérítő) oldattal. Az ilyen keverékekből erősen mérgező gáz fejlődhet. R. Amikor használt COBAS AmpliPrep mintafeldolgozó egységet [Sample Processing Unit (SPU)] dob ki, amely guanidin-tiocianátot tartalmaz, ügyeljen rá, hogy az ne kerüljön kapcsolatba nátrium-hipoklorit (fehérítő) oldattal. Az ilyen keverékekből erősen mérgező gáz fejlődhet HU 8 Doc Rev. 7.0

9 TÁROLÁSI ÉS KEZELÉSI KÖVETELMÉNYEK A. A reagenseket és kontrollokat tilos lefagyasztani. B. A CMV CS1, CMV CS2, CMV CS3 és CMV CS4 reagenseket 2 és 8 C között tárolja. Használaton kívül ezek a reagensek a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. Felbontást követően ezek a reagensek 2 8 C-on 70 napig stabilak (vagy a lejárati időig, amelyik előbb következik). A CMV CS1, CMV CS2, CMV CS3 és CMV CS4 maximum 6 gépi ciklusban használható, legfeljebb összesen 100 órát eltöltve a COBAS AmpliPrep készülékben. A gépi ciklusok között a reagenseket 2 8 C között tárolja. C. ACMV H(+)C, CMV L(+)C és CMV ( ) C reagenseket 2 8 C között tárolja. A kontrollok a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. Felbontást követően a fel nem használt részt ki kell dobni. D. A vonalkódklipszeket [CMV H(+)C Clip, CMV L(+)C Clip és CMV ( ) C Clip] 2 30 C között tárolja. E. A PG WR reagenst 2 30 C között tárolja. A PG WR a feltüntetett lejárati időn belül stabil. Felbontást követően ez a reagens 2 30 C között 28 napig stabil (vagy a lejárati időig, amelyik előbb következik). A KÉSZLET TARTALMA A. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test (P/N: ) CMVCAP CMV CS1 (CMV mágneses üvegpartikulum reagenskazetta) CMV CS2 (CMV lízis reagenskazetta) CMV CS3 (CMV multireagens kazetta) CMV CS4 (CMV tesztspecifikus reagenskazetta) CMV H(+)C (CMV magas pozitív kontroll) CMV L(+)C (CMV alacsony pozitív kontroll) CMV ( ) C (CMV negatív kontroll) CMV H(+)C Clip (CMV magas pozitív vonalkódklipsz) CMV H(+)C Clip (CMV alacsony pozitív vonalkódklipsz) CMV ( ) C Clip (CMV negatív kontroll vonalkódklipsz) B. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan mosóreagens (P/N: ) PG WR PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan mosóreagens) HU 9 Doc Rev. 7.0

10 SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK Műszerezettség és szoftver COBAS AmpliPrep készülék COBAS TaqMan Analizátor, illetve COBAS TaqMan 48 Analizátor Opcionális: dokkoló állomás (Docking Station) Opcionális: cobas p 630 készülék AMPLILINK szoftver, 3,3-as verziójú sorozat AMPLILINK szoftver adatállomás, nyomtatóval. AMPLILINK szoftver, 3.3 verziójú sorozat alkalmazási kézikönyvei: COBAS AmpliPrep készülék felhasználói kézikönyve a COBAS TaqMan analizátorral, a COBAS TaqMan 48 analizátorral, a COBAS AMPLICOR analizátorral, illetve a cobas p 630 készülékkel, és az AMPLILINK szoftver 3.2 és 3.3 verziójú sorozatával való együttes használatra COBAS TaqMan analizátor (plusz opcionális dokkoló állomás) készülék felhasználói kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.2 és 3.3 verziójú sorozatának alkalmazási kézikönyvével való együttes használatra COBAS TaqMan 48 analizátor felhasználói kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.2 és 3.3 verziójú sorozatának alkalmazási kézikönyvével való együttes használatra AMPLILINK szoftver 3.3 verziójú sorozatának alkalmazási kézikönyve a COBAS AmpliPrep készülékkel, a COBAS TaqMan analizátorral, a COBAS TaqMan 48 analizátorral, a COBAS AMPLICOR analizátorral és a cobas p 630 készülékkel való együttes használatra Opcionális: cobas p 630 készülék felhasználói kézikönyve, 2.2 szoftververzió Egyszer használatos anyagok Minta feldolgozó egységek (sample processing unit): SPU-k Mintabeviteli csövek (S-csövek) vonalkódklipsszel K-hegy állványok K-cső állványok EGYÉB SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK Mintaállvány (SK 24 állvány) Reagensállvány SPU-állványok K-hordozó K-hordozó transzporter K-hordozó állvány (csak a COBAS TaqMan 48 analizátorral való használathoz szükséges) Pipettahegyek aeroszolbarrierrel (szűrő) vagy pozitív kiszorításos DNáz-mentes hegyek (1000 µl)* Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes Vortex keverő * A pipetták pontossága a névleges térfogat 3%-án belül legyen. Aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos DNázmentes pipettahegyeket kell használni ott, ahol alapvető megelőzni a minta és az amplikon keresztszennyeződését HU 10 Doc Rev. 7.0

11 A MINTA LEVÉTELE, TRANSZPORTJA ÉS TÁROLÁSA Megjegyzés: Valamennyi mintát és kontrollt fertőző ágensek átvitelére alkalmasként kell kezelni. Megjegyzés: A vizsgálatot csak EDTA véralvadásgátlóval gyűjtött humán plazma használatára validálták. Más típusú minták vizsgálata pontatlan eredménnyel járhat. A. A minta levétele A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test plazmamintákkal való használatra alkalmas. A vért EDTA (lila kupak) alvadásgátlót tartalmazó steril csövekbe kell levenni és a gyártó utasításainak megfelelően összekeverni. B. A minta transzportja A vért ne hagyja 2 25 C-on 6 óránál tovább. A plazmát a levételtől számított 6 órán belül szeparálja el a teljes vérből centrifugálással ( g, 20 perc, szobahőmérséklet). Vigye át a plazmát egy steril polipropilén csőbe. A teljes vér, szérum vagy plazma transzportja meg kell feleljen a kóroki ágensek transzportjára vonatkozó országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásoknak. 41 A teljes vért 2-25 C között kell szállítani és a levételtől számított 6 órán belül fel kell dolgozni. A plazmát 2 8 C-on vagy 20 C-ra fagyasztva kell szállítani. C. A minta tárolása A plazmamintákat 2-8 C-on, legfeljebb 7 napig lehet tárolni. A plazmaminták 20 C-ra fagyasztva 6 hétig maradnak stabilak. A minták tárolása µl részletekben steril, 2,0 ml-es csavarókupakos polipropilén csövekben (pl. Sarstedt ) javasolt. A 4. ábra a mintatárolási vizsgálatokból származó mintastabilitási adatokat tünteti fel, melyeket a COBAS AmpliPrep/ COBAS TaqMan CMV Testtel végeztek. 4. ábra A CMV stabilitása EDTA-s plazmában 3,50 Titer log 10 (kópia/ml) 3,00 2,50 2,00 1,50 1, Minta 2 8 ºC 0 nap 2 8 ºC 3 nap 2 8 ºC 7 nap -20 ºC 6 hét A plazmaminták legfeljebb 3 alkalommal fagyaszthatóak és olvaszthatóak szignifikáns CMV DNS veszteség nélkül. A 5. ábra egy fagyasztási-olvasztási vizsgálatból származó adatokat tünteti fel, melyet a COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Testtel végeztek HU 11 Doc Rev. 7.0

12 5. ábra CMV eredmények 3 fagyasztási-olvasztási (F-O) ciklus után (EDTA-s plazma) 3,50 Titer log 10 (kópia/ml) 3,00 2,50 2,00 1,50 1, Minta 0x fagy/olv 1x fagy/olv 2x fagy/olv 3x fagy/olv HASZNÁLATI UTASÍTÁS Megjegyzés: A részletes üzemeltetési utasításokért, lehetséges konfigurációk részletes leírásáért, az eredmények kinyomtatásáért, valamint a jelzők, megjegyzések és hibaüzenetek értelmezéséért forduljon a következő kézikönyvekhez: (1) COBAS AmpliPrep készülék felhasználói kézikönyve a COBAS TaqMan analizátorral, a COBAS TaqMan 48 analizátorral, a COBAS AMPLICOR analizátorral, valamint a cobas p 630 készülékkel, és az AMPLILINK szoftver 3.3 verziójú sorozatával való együttes használatra; (2) a COBAS TaqMan analizátor (plusz opcionális dokkoló állomás) felhasználói kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.2 és 3.3 verziójú sorozatának alkalmazási kézikönyvével való együttes használatra; (3) a COBAS TaqMan 48 analizátor felhasználói kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.2 és 3.3 verziójú sorozatának alkalmazási kézikönyvével való együttes használatra; (4) az AMPLILINK szoftver 3.3 verziójú sorozatának alkalmazási kézikönyve a COBAS AmpliPrep készülékkel, a COBAS TaqMan analizátorral és a COBAS TaqMan 48 analizátorral, a COBAS AMPLICOR analizátorral és a cobas p 630 készülékkel való együttes használatra; (5) Opcionális: cobas p 630 készülék felhasználói kézikönyve, 2.2 szoftververzió. Mintacsoport mennyisége Valamennyi készlet 72 vizsgálatra elegendő reagenst tartalmaz, amely 12 vagy 24 mintás csoportokban végezhető. Valamennyi csoportnak legalább egy CMV ( ) C, CMV L(+)C és CMV H(+)C kontrollt kell tartalmaznia (lásd Minőségellenőrzés ). Munkafolyamat A COBAS TaqMan analizátoron, illetve COBAS TaqMan 48 analizátoron történő futtatást a minta- és kontrollelőkészítés befejezését követő 120 percen belül meg kell kezdeni. Megjegyzés: A feldolgozott mintákat és kontrollokat tilos lefagyasztani vagy 2 8 C-on tárolni. Minta és kontroll előkészítése Megjegyzés: Fagyasztott minták használatakor tegye a mintákat szobahőmérsékletre, amíg azok teljesen fel nem olvadnak, majd felhasználás előtt vortexelje őket 3 5 másodpercig. A 2 8 C-on tárolt kontrollokat vegye ki, és hagyja, hogy felhasználás előtt felvegyék a szobahőmérsékletet HU 12 Doc Rev. 7.0

13 A COBAS AmpliPrep készülék beállítása A. Karbantartás és üzembehelyezés A1. A COBAS AmpliPrep készülék készenléti (stand-by) módban működésre kész. A2. Kapcsolja be az AMPLILINK szoftver Adatállomást (ON). Készítse elő az Adatállomást az alábbiak szerint: 1. Jelentkezzen be a Windows XP operációs rendszerbe. 2. Kattintson duplán az AMPLILINK szoftver ikonjára. 3. A megfelelő felhasználói azonosítóval és jelszóval jelentkezzen be az AMPLILINK szoftverbe. A3. A Status képernyő segítségével ellenőrizze a PG WR-ellátást, és ha szükséges, pótolja. A4. Végezze el a Due lapon felsorolt karbantartási műveleteket. A COBAS AmpliPrep készülék automatikusan üzembe helyezi a rendszert. B. Reagenskazetták betöltése Megjegyzés: A 2 8 C-on tárolt valamennyi reagenskazettát vegye ki, helyezze be azonnal a COBAS AmpliPrep készülékbe, és hagyja legalább 30 percig, hogy felvegye a készülékben a szobahőmérsékletet az első minta feldolgozása előtt. Ne hagyja a reagenskazettákat a készüléken kívül szobahőmérsékletre melegedni, mert a vonalkódcímkéken páralecsapódás jöhet létre. Ne törölje le, ha a vonalkódcímkéken páralecsapódás történik. B1. Helyezze a CMV CS1 kazettát a reagensállványra. Helyezze a CMV CS2, CMV CS3 és CMV CS4 kazettákat egy külön reagensállványba. B2. Helyezze a CMV CS1 kazettát tartalmazó reagensállványt a COBAS AmpliPrep készülék A állványpozíciójába. B3. Helyezze a CMV CS2, CMV CS3 és CMV CS4 kazettákat tartalmazó reagensállványt a COBAS AmpliPrep készülék B, C, D vagy E állványpozíciójába. További információért lásd 1. táblázat. C. Egyszer használatos anyagok betöltése Megjegyzés: Határozza meg a szükséges COBAS AmpliPrep reagenskazetták, mintafeldolgozó egységek (SPU-k), mintabeviteli csövek (S-csövek), K-hegyek és K-csövek számát. Minden egyes mintához, illetve kontrollhoz egy SPU, egy beviteli S-cső, egy K-hegy és egy K-cső szükséges. A COBAS AmpliPrep készülék COBAS TaqMan analizátorral, illetve COBAS TaqMan 48 analizátorral való együttes használata többféle munkafolyamatban lehetséges. Tanulmányozza alább a 1. táblázatot. Az alkalmazott munkafolyamattól függően helyezze a megfelelő számú reagenskazetta-állványt, mintaállványt a beviteli S-csövekkel, SPU állványt, K-hegy állványt, K-cső állványt és K-hordozó állványt a K-hordozókkal a COBAS AmpliPrep készülék megfelelő pozícióiba (további információért lásd az 1. táblázatot). C1. Helyezze az SPU-kat az SPU állvány(ok)ra, és tegye az állvány(oka)t a COBAS AmpliPrep Instrument J, K vagy L állványpozíciójába. C2. Az alkalmazott munkafolyamattól függően, helyezze a teli K-cső állvány(oka)t a COBAS AmpliPrep készülék M, N, O vagy P állványpozíciójába. C3. Helyezze a teli K-hegy állvány(oka)t a COBAS AmpliPrep készülék M, N, O vagy P állványpozíciójába. C4. A COBAS TaqMan 48 analizátor 3. munkafolyamatának alkalmazása folyamán helyezze a K-hordozókat a K-hordozó állvány(ok)ra, a COBAS AmpliPrep készülék M, N, O vagy P állvány-pozíciójába HU 13 Doc Rev. 7.0

14 1. táblázat Lehetséges munkafolyamatok a COBAS AmpliPrep készülék COBAS TaqMan analizátorral, illetve COBAS TaqMan 48 analizátorral való együttes használata esetén Munkafolyamat Átviteli mód a COBAS TaqMan analizátorra, illetve COBAS TaqMan 48 analizátorra Állványok, hordozók és egyszer használatos anyagok Pozíció a COBAS AmpliPrep készülékben K-csövek teli K-cső állványokon M P COBAS AmpliPrep készülék K-hegyek teli K-hegy állványokon M P 1 plusz Docking Station plusz K-hordozó automatizált átvitele Mintákat és kontrollokat tartalmazó beviteli S-csövek, mintaállványokon SPU-k SPU-állványokon F H J L COBAS TaqMan analizátor CS1 a kazettaállványon A CS2, CS3, CS4 a kazettaállványon B E K-csövek teli K-cső állványokon M P K-hegyek teli K-hegy állványokon M P 2 COBAS AmpliPrep készülék plusz COBAS TaqMan analizátor K-csövek manuális átvitele a mintaállvány(ok)on a COBAS TaqMan analizátorba Mintákat és kontrollokat tartalmazó beviteli S-csövek, mintaállványokon SPU-k SPU-állványokon CS1 a kazettaállványon CS2, CS3, CS4 a kazettaállványon F H J L A B E A mintafeldolgozás befejezése után: K-csövek a mintaállványokon (manuális átvitelre kész) Ugyanaz, mint fent (F H) K-csövek a mintaállványokon F H K-hegyek teli K-hegy állványokon M P Mintákat és kontrollokat tartalmazó beviteli S-csövek, mintaállványokon F H 3 COBAS AmpliPrep készülék plusz COBAS TaqMan 48 analizátor(ok) K-hordozó(k) manuális átvitele a K-hordozó állvány(ok)on a COBAS TaqMan 48 analizátorba SPU-k SPU-állványokon CS1 a kazettaállványon CS2, CS3, CS4 a kazettaállványon Üres vonalkódú K-hordozó a K-hordozó állványon J L A B E M P A mintafeldolgozás befejezése után: K-csövek K-hordozóban a K-hordozó állványon Ugyanaz, mint fent (M P) HU 14 Doc Rev. 7.0

15 D. A minták azonosítása és betöltése Megjegyzés: A cobas p 630 készülék használata esetén a minta-előkészítéssel kapcsolatban olvassa el a cobas p 630 készülék felhasználói kézikönyvét. D1. Készítse el a mintaállványokat a következők szerint: Tegyen egy vonalkódcímke-klipszet minden egyes mintaállványpozícióba, ahova minta (S-cső) lesz elhelyezve. Tegyen egy-egy kontrollspecifikus [CMV ( ) C, CMV L(+)C és CMV H(+)C] vonalkódcímke-klipszet minden egyes mintaállvány-pozícióba, ahova kontroll (S-cső) lesz elhelyezve. A kontroll vonalkódcímke-klipszeken ugyanannak a kontroll tételszámnak kell lennie, mint a készletben lévő kontroll fiolákon. Ügyeljen arra, hogy az adott kontrollt a megfelelő kontroll vonalkódklipsszel jelölt pozícióba tegye. Helyezzen egy-egy beviteli S-csövet minden egyes vonalkód-címke klipszet tartalmazó pozícióba. D2. Az AMPLILINK szoftver segítségével hozzon létre mintaazonosítót minden egyes minta és kontroll számára az Orders ablakban a Sample mappában. Válassza ki a megfelelő tesztfájlt, és végezze el a mentést. D3. Rendelje a minta- és kontrollazonosítókat mintaállvány-pozíciókhoz az Orders ablakban a Sample Rack mappában. A mintaállványszám a D1. lépésben előkészített állványé kell legyen. D4. Nyomtassa ki a Sample Rack Order lapot, mint munkalapot. D5. Készítsen elő minta- és kontrollállványokat a minta- és kontrollhozzáadásra kijelölt területre az alábbiak szerint: Vortexeljen minden egyes mintát és kontrollt [CMV ( ) C, CMV L(+)C és CMV H(+)C] 3 5 másodpercig. A mintákkal és kontrollokkal való munka során ügyeljen a kesztyűk szennyezésének elkerülésére. D6. Mérjen aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos DNáz-mentes heggyel ellátott mikropipettával minden egyes mintából és kontrollból [CMV ( ) C, CMV L(+)C és CMV H(+)C] 500 µl-t a megfelelően vonalkóddal címkézett beviteli S-csőbe. Ügyeljen arra, hogy ne vigyen át szemcséket és/vagy fibrinrögöket az eredeti mintából a beviteli S-csőbe. A mintákat és kontrollokat át kell vinni a D4. lépésben kijelölt és a munkalapon rögzített csőpozíciókba. A kontroll vonalkódcímke-klipszeken ugyanannak a kontroll tételszámnak kell lennie, mint a készletben lévő kontroll fiolákon. Az adott kontrollt a megfelelő kontroll vonalkódklipsszel jelölt pozícióba tegye. Ügyeljen arra, hogy ne szennyezze be mintával vagy kontrollal az S-csövek felső részét. D7. Az 1. és 2. munkafolyamatok esetén helyezze a beviteli S-csövekkel töltött mintaállvány(oka)t a COBAS AmpliPrep készülék F, G vagy H állványpozícióiba. D8. A COBAS TaqMan 48 analizátor 3. munkafolyamatának alkalmazása során helyezze a mintaállvány(oka)t a beviteli S-csövekkel és K-csövekkel (beviteli S-csövenként egy, a jobb oldali pozícióban elhelyezve a beviteli S-csövek mellé) a COBAS AmpliPrep készülék F, G vagy H állványpozícióiba. E. A COBAS AmpliPrep készülék futtatásának indítása E1. Indítsa el a COBAS AmpliPrep készüléket az AMPLILINK szoftver segítségével. F. A COBAS AmpliPrep készülék futtatásának befejezése és átvitel a COBAS TaqMan analizátorra, illetve COBAS TaqMan 48 analizátorra (csak a 2. és 3. munkafolyamat esetén) F1. Ellenőrizze a jelzőket, illetve hibaüzeneteket. F2. Távolítsa el a feldolgozott mintákat és kontrollokat a COBAS AmpliPrep készülékből vagy mintaállványokról (Docking Station nélküli COBAS TaqMan analizátor esetén) vagy K-hordozó állványokról (COBAS TaqMan 48 analizátor esetén), a munkafolyamattól függően (további részleteket illetően lásd a G. pontot). F3. Távolítsa el a hulladékot a COBAS AmpliPrep készülékből. Megjegyzés: A minta- és kontroll-előkészítés befejezése után a feldolgozott mintákat és kontrollokat nem szabad fénynek kitenni HU 15 Doc Rev. 7.0

16 Amplifikáció és kimutatás A COBAS TaqMan analizátor, illetve COBAS TaqMan 48 analizátor beállítása A COBAS TaqMan analizátoron, illetve COBAS TaqMan 48 analizátoron történő futtatást a minta- és kontrollelőkészítés befejezését követő 120 percen belül meg kell kezdeni. Megjegyzés: A feldolgozott mintákat és kontrollokat tilos lefagyasztani vagy 2 8 C-on tárolni. G. A feldolgozott minták betöltése G1. A munkafolyamattól függően a megfelelő lépéseket elvégezve vigye át a K-csöveket a COBAS TaqMan analizátorba, illetve COBAS TaqMan 48 analizátorba: 1. munkafolyamat: A K-hordozó automata transzferje a dokkoló állomáson keresztül a COBAS TaqMan Analizátorba. Manuális beavatkozás nem szükséges. 2. munkafolyamat: A mintaállvány(ok)on levő K-csövek manuális átvitele a COBAS TaqMan Analizátorba 3. munkafolyamat: A K-hordozó állvány(ok)on lévő K-hordozó(k) manuális átvitele a COBAS TaqMan 48 Analizátorba. A K-hordozók manuális átvitele a COBAS TaqMan 48 analizátorba a K-hordozó transzporter segítségével. H. A COBAS TaqMan analizátor, illetve COBAS TaqMan 48 analizátor futtatásának indítása H1. A munkafolyamattól függően az alábbi lehetőségek egyike útján indítsa be a COBAS TaqMan analizátort, illetve a COBAS TaqMan 48 analizátort: 1. munkafolyamat: Beavatkozás nem szükséges. 2. munkafolyamat: A mintaállvány(ok) behelyezését követően a COBAS TaqMan analizátor automatikusan indul. 3. munkafolyamat: Töltse fel a K-hordozót üres K-csövekkel, ha 6-nál kevesebb K-cső van a K-hordozón. A feltöltést az AMPLILINK szoftver irányítja. Nyissa fel a PCR-készülék tetejét, helyezze be a K-hordozót a készülékbe, és zárja le a fedelet. Indítsa el a COBAS TaqMan 48 analizátor futtatását. I. A COBAS TaqMan analizátor, illetve COBAS TaqMan 48 analizátor futtatásának befejezése I1. A COBAS TaqMan analizátor, illetve a COBAS TaqMan 48 analizátor futtatásának befejeztével nyomtasson ki eredménylapot. Ellenőrizze az eredménylapon a jelzőket, illetve hibaüzeneteket. A jelzőkkel és megjegyzésekkel ellátott minták értékelése az "Eredmények" szakaszban leírtaknak megfelelően történik. Elfogadásukat követően tárolja az adatokat az archívumban. I2. Vegye ki a használt K-csöveket a COBAS TaqMan analizátorból, illetve COBAS TaqMan 48 analizátorból. EREDMÉNYEK A COBAS TaqMan analizátor, illetve a COBAS TaqMan 48 analizátor automatikusan meghatározza a minták és kontrollok CMV DNS-koncentrációját. A CMV DNS-koncentráció kópia (cp)/ml-ben van kifejezve. A CMV DNS kópia/ml (a COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test által meghatározva) és a nemzetközi egység (IU)/ml között az átváltási faktor 1,1 cp/iu a nukleinsav-amplifikációs technológiai vizsgálatokra szolgáló humán cytomegalovírus első WHO Nemzetközi standardot (NIBSC 09/162) használva 40. Ez az átváltási faktor a kópia és a nemzetközi egység között eltérő lehet más CMV-DNS vizsgálatoknál. AMPLILINK szoftver: Meghatározza az CMV DNS és a CMV QS DNS ciklus küszöbértékét (Ct). Meghatározza a CMV DNS-koncentrációt a CMV DNS és a CMV QS DNS küszöbértékek, valamint a kazettavonalkódokban megadott tételspecifikus kalibrációs együtthatók alapján. Meghatározza, hogy a számított CMV L(+)C és CMV H(+)C cp/ml értékek a megadott tartományba esnek-e HU 16 Doc Rev. 7.0

17 Mintacsoport validálása AMPLILINK 3.3-as verziójú sorozata Ellenőrizze az AMPLILINK szoftver eredmény ablakban vagy a kinyomtatott eredménylapon a jelzőket és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön a mintacsoport érvényességéről. A készülék ellenőrzi a kontrollokat, hogy azok cp/ml értéke a rögzített tartományon belül esik-e. Ha a kontroll cp/ml értéke a tartományon kívül fekszik, akkor JELZŐT kap, amely mutatja, hogy a kontroll nem felelt meg. A mintacsoport akkor érvényes, ha a kontrollok [CMV ( ) C, CMV L(+)C és CMV H(+)C] egyike sem kap jelzőt. A mintacsoport nem érvényes, ha a CMV kontrollok az alábbi jelzők bármelyikét kapják: Negatív kontroll Jelző Eredmény Magyarázat NC_INVALID Invalid CMV alacsony pozitív kontroll Érvénytelen eredmény vagy érvényes eredmény, amely nem volt negatív a CMV targetre Jelző Eredmény Magyarázat LPCINVALID Invalid Érvénytelen eredmény vagy egy kontroll tartományon kívül esik CMV magas pozitív kontroll Jelző Eredmény Magyarázat HPCINVALID Invalid Érvénytelen eredmény vagy egy kontroll tartományon kívül esik Ha a mintacsoport érvénytelen (invalid), ismételje meg a teljes mintacsoport vizsgálatát (minta- és kontroll-előkészítés, amplifikálás és kimutatás). Eredmények értelmezése Érvényes mintacsoport esetén ellenőrizzen minden egyes mintát, hogy kapott-e jelzőt vagy megjegyzést az eredménylapon. Az alábbiak szerint értelmezze az eredményeket: Egy érvényes futtatás mind érvényes, mind érvénytelen mintaeredményeket is tartalmazhat, attól függően, hogy a jelzők és/vagy megjegyzések az egyes mintákra vonatkoznak-e HU 17 Doc Rev. 7.0

18 A mintaeredmények az alábbiak szerint értelmezendőek: Titereredmény Target Not Detected <1.50E+02 cp/ml Magyarázat Adja ki az eredményt, mint Nincs kimutatható CMV DNS. A számított cp/ml a vizsgálat alsó mennyiségi meghatározási határa alatt van. Adja ki az eredményeket, mint CMV DNS kimutatható, kevesebb, mint 150 CMV DNS cp/ml. Kópia/ml Nemzetközi egység (IU)/ml ³1.50E+02 cp/ml és 1.00E+07 cp/ml >1.00E+07 cp/ml <1.37E+02 IU/mL ³1.37E+02 IU/mL és 9.10E+06 IU/mL >9.10E+06 IU/mL 150 CMV DNS cp/ml-nél nagyobb vagy egyenlő és 1,00E+07 CMV DNS cp/mlnél kisebb vagy egyenlő számított eredmények belül esnek a vizsgálat lineáris tartományán. A számított cp/ml a vizsgálati tartomány felett van. Adja ki az eredményeket, mint nagyobb, mint 1,00E+07 CMV DNS cp/ml. Amennyiben ilyen minták mennyiségi eredményeire van szükség, az eredeti mintát CMV-negatív humán EDTA-s plazmával való hígítást követően újra kell tesztelni. Szorozza meg a mért eredményt a hígítási faktorral. A számított IU/ml a vizsgálat alsó mennyiségi meghatározási határa alatt van. Adja ki az eredményeket, mint CMV DNS kimutatható, kevesebb, mint 137 CMV DNS IU/ml. 137 CMV DNS IU/ml-nél nagyobb vagy egyenlő és 9,10E+06 CMV DNS IU/mlnél kisebb vagy egyenlő számított eredmények belül esnek a vizsgálat lineáris tartományán. A számított IU/ml a vizsgálat mérési tartománya felett van. Adja ki az eredményeket, mint nagyobb, mint 9,10E+06 CMV DNS cp/ml. Amennyiben ilyen minták mennyiségi eredményeire van szükség, az eredeti mintát CMVnegatív humán EDTA-s plazmával való hígítást követően újra kell tesztelni. Szorozza meg a mért eredményt a hígítási faktorral. Megjegyzés: Azok a vizsgálati tartomány feletti minták, amelyek QS_INVALID jelzővel ellátott érvénytelen eredményt adnak, nem adhatóak ki úgy, mint > 9,10E+06 IU/ml, sem > 1,00E+07 cp/ml. Az eredeti mintát CMV-negatív EDTA-s plazmával való hígítást követően újra kell tesztelni. Szorozza meg a mért eredményt a hígítási faktorral. Megjegyzés: A titer eredmény "Failed". Értelmezés: A minta feldolgozása nem volt megfelelő. Megjegyzés: A titer eredmény "Invalid". Értelmezés: egy érvénytelen eredmény. MINŐSÉG-ELLENŐRZÉS Valamennyi mintacsoportnak egy COBAS TaqMan negatív kontrollt, egy CMV alacsony pozitív kontrollt és egy CMV magas pozitív kontrollt kell tartalmaznia. A mintacsoport akkor érvényes, ha a kontrollok [CMV ( ) C, CMV L(+)C és CMV H(+)C] egyike sem kap jelzőt. Ellenőrizze a kinyomtatott eredménylapon a jelzőket és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön a mintacsoport értékelhetőségéről. Negatív kontroll A CMV ( ) C kontrollnak Target Not Detected eredményt kell adnia. Ha a CMV ( ) C kontroll érvénytelen jelzést kap, akkor az egész mintacsoport érvénytelen. A teljes eljárást (minta és kontroll előkészítése, amplifikálás és kimutatás) meg kell ismételni. Ha a CMV ( ) C kontroll következetesen érvénytelen több mintacsoportban is, vegye fel a kapcsolatot a helyi Roche-irodával HU 18 Doc Rev. 7.0

19 Pozitív kontrollok Az elfogadható CMV L(+)C és CMV H(+)C titertartományokat a COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test reagenskazetta vonalkódja tartalmazza. A CMV L(+)C és CMV H(+)C kontrollok CMV DNS cp/ml értékeinek az elfogadható titertartományokon belül kell esniük. Ha egyik vagy mindkét pozitív kontroll érvénytelen jelzést kap, akkor az egész mintacsoport érvénytelen. A teljes eljárást (minta és kontroll előkészítése, amplifikálás és kimutatás) meg kell ismételni. Ha egyik vagy mindkettő pozitív kontroll CMV DNS titere rendszeresen kívül esik az elfogadható tartományon több mintacsoportban is, kérjen technikai segítséget a helyi Roche-irodától. ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS ÓVINTÉZKEDÉSEK Mint minden vizsgálati eljárásnál, a helyes laboratóriumi technika alapvető a vizsgálat megfelelő kivitelezéséhez. ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS KORLÁTOZÁSOK 1. A vizsgálatot csak EDTA véralvadásgátlóval gyűjtött humán plazma használatára validálták. Más típusú minták vizsgálata pontatlan eredménnyel járhat. 2. A megbízható eredmény a megfelelő mintalevételen, -transzporton, -tároláson és -feldolgozáson múlik. 3. A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test master mixben jelen lévő AmpErase enzim csökkenti az amplikonszennyezés kockázatát. Ugyanakkor a CMV-pozitív kontrollokból vagy klinikai mintákból származó szennyeződés csak helyes laboratóriumi gyakorlattal és ezen Használati utasításban meghatározott eljárások gondos betartásával kerülhető el. 4. A terméket csak a PCR-technikák terén képzett személy használhatja. 5. Ez a termék kizárólag a COBAS AmpliPrep készülékkel és a COBAS TaqMan analizátorral, illetve COBAS TaqMan 48 analizátorral használható együtt. 6. Ritkán bár, de előfordulhat, hogy a COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test primerei és/vagy próbái által lefedett virális genom nagyfokban konzervált régióiban lévő mutációk következtében a vírusmennyiség kevesebbnek adódik, vagy a vírus kimutatása sikertelen lesz. 7. A CMV DNS kimutatása a mintában jelen lévő vírus partikulumok jelenlététől függ, ezért befolyásolhatják a mintalevételi módszerek és betegfaktorok (azaz kor, tünetek megléte és/vagy a fertőzés stádiuma). 8. A technológiák különbözősége miatt javasolt, hogy az egyik technológiáról a másikra való áttéréskor a felhasználók végezzenek korrelációs laboratóriumi vizsgálatokat, hogy a technológiák közötti különbség számszerűsíthető legyen. 9. A vírusszint értékek klinikai döntéshez szükséges küszöbértékeit nemzetközi egység/ml (IU/ml)-ben még nem állapították meg. A klinikusoknak tanácsos a megfelelő átváltási faktor alkalmazása IU/ml-ről kópia/ml (cp/ml)-re, amikor az IU/ml-ben jelentett eredményeket felhasználva hoznak klinikai döntést HU 19 Doc Rev. 7.0

20 ZAVARÁST OKOZÓ ANYAGOK Megemelkedett trigliceridszint (3300 mg/dl alatt), konjugált bilirubin (20 mg/dl alatt), nem konjugált bilirubin (20 mg/dl alatt), hemoglobin (200 mg/dl alatt) és humán DNS (0,4 mg/dl alatt) jelenléte a mintákban, továbbá autoimmun megbetegedések, illetve laboratóriumi markereik, pl. systemás lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA) és antinukleáris antitest (ANA) igazoltan nem zavarták a CMV DNS mennyiségi meghatározását, illetve nem befolyásolták a COBAS AmpliPrep/ COBAS TaqMan CMV Test specificitását. A kiértékelést a CLSI EP7-A2 irányelv 41 szerint végezték, azonos sorozatszámú COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test reagenseket használva. Az alábbi gyógyszerösszetevőket 3 alkalommal vizsgálták a plazma-csúcskoncentrációjukon (Cmax) és nem észleltek zavaró hatást a CMV DNS mennyiségi meghatározása során, illetve nem befolyásolták a COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test specificitását: Immunszuppresszív szerek Azathioprin Cyclosporin Mycophenolát mofetil Mycophenolát nátrium Sirolimus Tacrolimus Everolimus Prednison Anti-CMV szerek Ganciclovir Valganciclovir Cidofovir Foscarnet Antibiotikumok Sulfamethoxazol Trimethoprim Cefotetan Piperacillin Tazobactam nátrium Kálium-klavulanát Ticarcillin dinátrium Vancomycin Gombaellenes szerek Flukonazol HU 20 Doc Rev. 7.0

21 NEM KLINIKAI ÉRTÉKELÉS A. Nyomon követhetőség a humán cytomegalovírus első WHO nemzetközi szabvány szerint A vizsgálat fejlesztése során számos szabványt és kontrollt használtak fel, hogy biztosítsák a WHO szabvány szerinti nyomon követhetőséget [a nukleinsav amplifikációs technológiákra szolgáló humán cytomegalovírus első WHO nemzetközi szabvány (NIBSC 09/162)]. 40 A vizsgálat fejlesztése során használt szabványok tartalmazzák a CMV WHO szabványt, RMS CMV másodlagos szabványt, RMS CMV másodlagos szabvány forrásanyagot és az RMS CMV kalibrációs panelt (Lambda CMA1.2). A szabványokat, a kalibrációs panelt és a független CMV klinikai mintát hasonló szinteken vizsgálták. A CMV WHO szabvány vizsgálatának koncentráció tartománya 5,00E+02 IU/ml és 5,00E+05 IU/ml (2,70 5,70 log 10 IU/ml) között volt, az RMS CMV másodlagos szabvány forrásanyag vizsgálatáé 5,00E+02 IU/ml és 1,00E+07 IU/ml (2,70 7,00 log 10 IU/ml) között, az RMS CMV kalibrációs panel vizsgálatáé 5,23E+02 és 9,30E+06 IU/ml (2,72 6,97 log 10 IU/ml) között, a független CMV klinikai mintáé pedig 5,00E+02 IU/ml és IU/ml (2,70 4,36 log 10 IU/ml) között. Minden anyag hasonlóan viselkedett és kolineáris hígítási teljesítményt mutatott a COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test (CAP/CTM CMV) lineáris tartományában (6. ábra). 6. ábra A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test nyomon követhetősége a humán cytomegalovírus első WHO nemzetközi szabvány szerint HU 21 Doc Rev. 7.0

22 B. Kimutatási határ A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test kimutatási határát CMV-negatív humán EDTA-s plazmában hígított CMV DNS-pozitív minta és az RMS CMV másodlagos standard vizsgálatával határozták meg. Mind a 2 CMV forrásanyag esetén a vizsgálati panelt 6 egyedi CMV-negatív EDTA-s plazma donor egységből való 6 független hígítási sorból készítették. A CMV DNS-pozitív klinikai minta hígítási sorok 6 koncentrációt tartalmaztak (43, 85, 127, 169, 255 és 339 IU/ml vagy 47, 93, 140, 186, 280 és 373 kópia/ml); az RMS CMV másodlagos szabvány hígítási sorok 6 koncentrációt tartalmaztak (46, 91, 137, 182, 273 és 364 IU/ml vagy 50, 100, 150, 200, 300 és 400 kópia/ml). A CMV DNS-pozitív mintákból és az RMS CMV másodlagos standardból készített panelek ismétléseit kombinálva koncentrációnként legalább 208 ismétlést teszteltek. A kimutatási határt 3 különböző sorozatszámú reagens és mind a 3 munkafolyamat (COBAS AmpliPrep COBAS TaqMan -hoz dokkolva, COBAS AmpliPrep COBAS TaqMan -hoz kapcsolva és COBAS AmpliPrep COBAS TaqMan 48-hoz kapcsolva) segítségével határozták meg. Az értékelést a CLSI EP17-A irányelv, a protokoll a kimutatási határ és a quantifikálási határ meghatározására, valamint a jóváhagyott irányelv szerint végezték. 43 PROBIT analízissel végzett meghatározás szerint a 95%-nál nagyobb pozitivitási aránnyal kimutatható CMV DNSkoncentráció 56 IU/ml (95%-os konfidenciaintervallum: IU/ml) vagy 61 kópia/ml (95%-os konfidenciaintervallum: kópia/ml). A 3 sorozatszámú reagens összesített eredményeit a 2. táblázat mutatja. 2. táblázat A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test kimutatási határa és PROBIT analízise minta és az RMS CMV másodlagos standard segítségével meghatározva Névleges bevitel (CMV DNS IU/ml) RMS CMV másodlagos standard Klinikai minták Névleges bevitel (CMV DNS kópia/ml) RMS CMV másodlagos standard Klinikai minták Párhuzamos mérések száma Pozitívok száma Pozitivitási arány % % % % ,50% ,50% % PROBIT 95% találati arány 56 IU/ml (95%-os konfidenciaintervallum: IU/ml) 61 kópia/ml (95%-os konfidenciaintervallum: kópia/ml) HU 22 Doc Rev. 7.0

23 C. Pontosság A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test pontosságát egy 8 tagú panel vizsgálatával határozták meg. A panelt úgy készítették, hogy a dinamikus tartomány alsó részéhez CMV DNS-pozitív mintát használtak, a dinamikus tartomány középső és felső részéhez pedig CMV kultúrából (AD 169 törzs) való hígítást, mivel nagyon magas titerű klinikai anyag nem állt rendelkezésre. Mindkét forrásanyagot CMV-negatív EDTA-s plazmával hígították. A 8 tagú panel koncentráció tartománya 2,00E+02 CMV DNS kópia/ml 1,00E+07 CMV DNS kópia/ml volt. Mindegyik paneltagot futtatásonként 2 párhuzamos méréssel, naponta 2 futtatással tesztelték legalább 12 napig a 2 féle munkafolyamat (COBAS AmpliPrep COBAS TaqMan -hoz dokkolva és COBAS AmpliPrep COBAS TaqMan 48-hoz kapcsolva) mindegyikével, összesen 96 párhuzamos mérés történt paneltagonként úgy, hogy a mérések egyenletesen oszlottak meg a 3 sorozatszámú készlet, a 4 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan rendszer és legalább 2 vizsgáló között. Minden egyes minta keresztülment a teljes COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test eljáráson (mintaelőkészítés, amplifikálás és detektálás). Ezért az itt közölt pontosság a vizsgálati eljárás valamennyi aspektusát reprezentálja. A 3 sorozatszámú reagens külön-külön és összesített eredményeit a 3. táblázat mutatja. 3. táblázat A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test pontossága Titer (kópia/ml) N 1. tétel 2. tétel 3. tétel Teljes log 10 SD N Teljes log 10 SD N Teljes log 10 SD N A három tétel összesített eredményei Teljes log 10 SD Teljes %CV CMV kultúra (AD169 törzs) 1,00E , , , ,12 28% 1,00E , , , ,09 20% 1,00E , , , ,10 24% 2,00E , , , ,13 30% 5,00E , , , ,24 59% Minta 1,00E , , , ,12 29% 3,20E , , , ,16 39% 2,00E , , , ,21 53% HU 23 Doc Rev. 7.0

24 D. Lineáris tartomány A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test lineáris tartományát egy 10 tagú panel vizsgálatával határozták meg. A panelt úgy készítették, hogy a dinamikus tartomány alsó részéhez CMV DNS-pozitív klinikai mintát használtak, a dinamikus tartomány középső és felső részéhez pedig CMV kultúrából (AD 169 törzs) való hígítást, mivel nagyon magas titerű klinikai anyag nem állt rendelkezésre. Mindkét forrásanyagot CMV-negatív EDTA-s plazmával hígították. A 10 tagú panel egy 4,55E+01 CMV DNS IU/ml és 1,82E+07 CMV DNS IU/ml (5,0E+01 CMV DNS kópia/ml és 2,0E+07 CMV DNS kópia/ml) közötti tartományt fedett le. Mindegyik paneltagot futtatásonként 2 párhuzamos méréssel, naponta 2 futtatással tesztelték legalább 12 napig a 2 féle munkafolyamat (COBAS AmpliPrep COBAS TaqMan -hoz dokkolva és COBAS AmpliPrep COBAS TaqMan 48-hoz kapcsolva) mindegyikével, összesen 96 párhuzamos mérés történt paneltagonként úgy, hogy a mérések egyenletesen oszlottak meg a 3 sorozatszámú készlet, a 4 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan rendszer és legalább 2 vizsgáló között. Minden egyes minta keresztülment a teljes COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test eljáráson (minta-előkészítés, amplifikálás és detektálás). Ahogy a 7. ábrán látható, a CLSI EP6-A alapján a COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test lineáris volt a 4,55E+01 CMV DNS IU/ml 1,82E+07 CMV DNS IU/ml (5,0E+01 CMV DNS kópia/ml 2,0E+07 CMV DNS kópia/ml) tartományon. A mennyiségi meghatározás alsó határa: 1,37E+02 CMV DNS IU/ml (1,5E+02 CMV DNS kópia/ml) alapján, a lineáris tartomány 1,37E+02 CMV DNS IU/ml és 9,10E+06 CMV DNS IU/ml (1,5E+02 CMV DNS kópia/ml és 1,0E+07 CMV DNS kópia/ml) között helyezkedik el. 7. ábra A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test linearitása COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Teszt eredményei Átlag log 10 (CMV DNS IU/ml) y = 1,0574x - 0,3892 R 2 = 0,9987 Hibatartomány = 1 standard deviáció (szórás) Névleges koncentráció Log 10 (CMV DNS IU/ml) Megjegyzés: Az üres pontok klinikai mintából, a teli pontok CMV kultúrából (AD169 törzs) készült hígítások átlagos log 10 titer értékeit reprezentálják HU 24 Doc Rev. 7.0

25 E. A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test teljesítménye anti-cmv IgG negatív mintákkal A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test teljesítményét olyan vese allograft recipiensekből származó anti- CMV IgG negatív EDTA-s plazmák vizsgálatával határozták meg 2 eltérő sorozatszámú reagenst használva, akiknél a vesetranszplantációt megelőző CMV szerológia eredménye donor (+) / recipiens ( ) volt. 156 betegből származó 157 EDTA-s plazma mintából százötvenegy (151) negatív eredményt adott CMV DNS-re a COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test során. A 6 CMV DNS pozitív minta esetén ugyanazon betegekből longitudinálisan gyűjtött minták kiegészítő vizsgálata azt mutatta, hogy a betegeknek a transzplantációt megelőzően vagy utána CMV fertőzése volt. Ezen kívül a 6 eltérő eredményt adó mintából 5-ben egy független CMV PCR teszt megerősítette a CMV DNS jelenlétét. A megerősítő vizsgálat eredményét figyelembe véve 152 CMV IgG szeronegatív mintából 151 bizonyult a vizsgálat során negatívnak CMV DNS jelenlétére, ez 99,3%-os specificitásnak felel meg (95%-os konfidenciaintervallum: 96,4% 100,0%). F. Analitikai specificitás A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test analitikai specificitását tenyésztett organizmusok (vírusok, baktériumok, sarjadzógomba) CMV-negatív humán EDTA-s plazmához és 7,5E+02 kópia/ml CMV tartalmú CMV-pozitív EDTA-s plazmához 1,0E+06 partikulum/ml beviteli koncentrációban való hozzáadásával tesztelték (4. táblázat). A vizsgált organizmusok egyike sem mutatott keresztreakciót a COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Testtel. A CMV-pozitív minták visszanyert titer eredményei a CMV-pozitív kontrollhoz képest ± 0,3 log 10 tartományon belül estek. 4. táblázat Analitikai specificitás minták Humán herpes vírusok Herpes simplex vírus 1 Herpes simplex vírus 2 Varicella-zoster vírus Epstein-Barr vírus Humán herpesvírus 6 Humán herpesvírus 7 Humán herpesvírus 8 Egyéb vírusok BK Polyomavírus JC Polyomavírus Hepatitis A vírus Hepatitis B vírus Hepatitis C vírus HIV 1 Adenovírus 5 Parvovírus B19 Baktériumok Mycoplasma pneumoniae Propionibacterium acnes Salmonella typhimurium Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Aspergillus niger Candida albicans Cryptococcus Gombák G. A COBAS AMPLICOR CMV MONITOR Test és a LightCycler CMV Quant Test módszerek összehasonlítása A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test teljesítményét a COBAS AMPLICOR CMV MONITOR Teszttel hasonlították össze 111 hígítatlan CMV-pozitív klinikai mintát vizsgálva. Csak a két vizsgálat összehasonlításában, mindkét lineáris tartományon érvényes titerpárokat vettek be a Deming-regresszióanalízisbe (lásd 8. ábra). A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test teljesítményét a LightCycler 480 rendszer segítségével a LightCycler CMV Quant Test vizsgálattal is összehasonlították, 90 hígítatlan CMV-pozitív klinikai mintát vizsgálva. Csak a két vizsgálat összehasonlításában, mindkét lineáris tartományon érvényes titerpárokat vettek be a Demingregresszióanalízisbe (lásd 9. ábra) HU 25 Doc Rev. 7.0

26 8. ábra A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test és a COBAS AMPLICOR CMV MONITOR Test közötti korreláció 6,0 CAP/CTM CMV Teszt, log10 titer (CMV DNS kópia/ml) 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 Y = 1,193 X - 0,848 R 2 = 0,9218 N = 111 0,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 COBAS AMPLICOR CMV MONITOR Teszt, log 10 titer (CMV DNS kópia/ml) 9. ábra A COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test és a LightCycler CMV Quant Test vizsgálat közötti korreláció 7,0 CAP/CTM CMV Teszt, log10 titer (CMV DNS kópia/ml) 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 Y = 0,904 X - 0,072 R 2 = 0,8446 N = 90 0,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 LightCycler CMV Quant Teszt, log 10 titer (CMV DNS kópia/ml) HU 26 Doc Rev. 7.0

27 HIVATKOZÁSOK 1. Griffiths PD Cytomegalovirus. In Principles and Practice of Clinical Virology. eds. Zuckerman, A.J., Banatvala, J.E. and Pattison, J.R. John Wiley and Sons, London Pass R.F Cytomegalovirus. In: Fields Virology. eds. Knipe, D., Howley, P. Lippincott, Williams and Wilkins, Philadelphia Kapranos N., Petrakou E, Anastasiadou C, Kotronias D Detection of herpes simplex virus, cytomegalovirus, and Epstein-Barr virus in the semen of men attending an infertility clinic. Fertility and Sterility 79: Forbes BA Acquisition of cytomegalovirus infection: an update. Clinical Microbiological Reviews 2: Numazaki, K Human cytomegalovirus infection of breast milk. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 18:2: Vochem M, Hamprecht K, Jahn G, Speer CP Transmission of cytomegalovirus to preterm infants through breast milk. Pediatric Infectious Disease Journal. 17: Souza IE, Nicholson D, Matthey S, et al Detection of human cytomegalovirus in peripheral blood leukocytes by polymerase chain reaction and a nonradioactive probe. Diagnostic Microbiology Infectious Disease 20: Alford CA, Brill WJ Cytomegalovirus. In: Virology, Vol. 2, 2nd ed., eds. Fields, B.N. Knipe, D.M. Raven Press, New York, NY Yasuda A, Kimura H, Hayakawa M, Ohshiro M, et al Evaluation of cytomegalovirus infections transmitted via breast milk in preterm infants with a real-time polymerase chain reaction assay. Pediatrics. 111: Jordan MC Latent infection and the elusive cytomegalovirus. Reviews in Infectious Diseases 5: Drew WL Other virus infections in AIDS: I: Cytomegalovirus. Immunology and Serology 44: Drew WL Nonpulmonary manifestations of Cytomegalovirus infection in immunocompromised patients. Clinical Microbiology Review 5: Mocarski ES, Courcelle CT Cytomegaloviruses and their replication. In: Fields Virology. eds. Knipe D and Howley P. Lippincott, Williams and Wilkins, Philadelphia Fedorko DP,Yan SS Recent advances in laboratory diagnosis of human Cytomegalovirus infection. Clinical and Immunological Reviews 2: Schafer P, Tenschert W, Gutensohn K, Laufs R. Minimal effect of delayed sample processing on results of quantitative PCR for cytomegalovirus DNA in leukocytes compared to results of an antigenemia assay. Journal of Clinical Microbiology : Bowen EF, Sabin CA, Wilson P, et al Cytomegalovirus (CMV) viraemia detected by polymerase chain reaction identifies a group of HIV-positive patients at high risk of CMV disease. AIDS 11: Gor D, Sabin C, Prentice HG, et al Longitudinal fluctuations in cytomegalovirus load in bone marrow transplant patients: relationship between peak virus load, donor/recipient serostatus, acute GVHD and CMV disease. Bone Marrow Transplantation 21: Hassan-Walker AF, Kidd IM, Sabin C, et al Quantity of human cytomegalovirus (CMV) DNAemia as a risk factor for CMV disease in renal allograft recipients: Relationship with donor/recipient CMV serostatus, receipt of augmented methylprednisolone and antithymocyte globulin (ATG). Journal of Medical Virology 58: Sanchez JL, Kruger RM, Paranjothi S, et al Relationship of cytomegalovirus viral load in blood to pneumonitis in lung transplant recipients. Transplantation : Humar A, Mazzulli T, Moussa G, Razonable RR, Paya CV, Pescovitz MD, Covington E, Alecock E; Valganciclovir Solid Organ Transplant Study Group. Clinical utility of cytomegalovirus (CMV) serology testing in high-risk CMV D+/Rtransplant recipients. Am J Transplant May; 5(5): Griffiths P, Whitley R, Snydman DR, Singh N, Boeckh M; International Herpes Management Forum. Contemporary management of cytomegalovirus infection in transplant recipients: guidelines from an IHMF workshop, Herpes Oct; 15(1): Kotton CN, Kumar D, Caliendo AM, Asberg A, Chou S, Snydman DR, Allen U, Humar A; Transplantation Society International CMV Consensus Group. International consensus guidelines on the management of cytomegalovirus in solid organ transplantation. Transplantation Apr 15; 89(7): HU 27 Doc Rev. 7.0

28 23. Marenzi, R., Cinque, P., Ceresa, D., et. al Serum polymerase chain reaction for cytomegalovirus DNA for monitoring ganciclovir treatment in AIDS patients. Scandanavian Journal of Infectious Disease 28: Rasmussen, L., Zipeto, D., Wolitz, R.A., et al Risk for retinitis in patients with AIDS can be assessed by quantitation of threshold levels of cytomegalovirus DNAburden in blood. Journal of Infectious Disease 176: Shinkai M, Bozzette SA, Powderly W, et al Utility of urine and leucocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease. Journal of Infectious Disease 175: Spector SA, Wong R, Hsia K, et al Plasma cytomegalovirus (CMV) DNA load predicts CMV disease and survival in AIDS patients. Journal of Clinical Investigation 101: Cope AV, Sweny P, Sabin C, et al Quantity of cytomegalovirus viruria is a major risk factor for cytomegalovirus disease after renal transplantation. Journal of Medical Virology 52: Gor D, Sabin C, Prentice HG, et al Longitudinal fluctuations in cytomegalovirus load in bone marrow transplant patients: relationship between peak virus load, donor/recipient serostatus, acute GVHD and CMV disease. Bone Marrow Transplantation 21: Einsele, H., Ehninger, G., Steidle, M., et al Polymerase chain reaction to evaluate antiviral therapy for cytomegalovirus disease. Lancet 338: Bowen EF, Wilson P, Cope A. et al Cytomegalovirus retinitis in AIDS patients: influence of cytomegaloviral load on response to ganciclovir, time to recurrence and survival. AIDS 10: Lanari M, Lazzarotto T, Venturi V, Papa I, Gabrielli L, Guerra B, Landini MP, Faldella G. Neonatal cytomegalovirus blood load and risk of sequelae in symptomatic and asymptomatic congenitally infected newborns. Pediatrics Jan; 117(1):e Eid AJ, Arthurs SK, Deziel PJ, Wilhelm MP, Razonable RR. Emergence of drug-resistant cytomegalovirus in the era of valganciclovir prophylaxis: therapeutic implications and outcomes. Clin Transplant Mar-Apr; 22(2): Ljungman P, de la Camara R, Cordonnier C, Einsele H, Engelhard D, Reusser P, Styczynski J, Ward K; European Conference on Infections in Leukemia. Management of CMV, HHV-6, HHV-7 and Kaposi-sarcoma herpesvirus (HHV-8) infections in patients with hematological malignancies and after SCT. Bone Marrow Transplant Aug; 42(4): Smith ES, Li AK, Wang AM, Gelfand DH, Myers TM Amplification of RNA: High-Temperature Reverse Transcription and DNA Amplification with a Magnesium-Activated Thermostable DNA Polymerase. In PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Dieffenbach C.W. and Dveksler G.S., Eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pp Longo MC, Berninger MS, Hartley JL Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93: Higuchi R, Dollinger G, Walsh PS, Griffith R Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (N Y). 10: Heid CA, Stevens J, Livak JK, Williams PM Real time quantitative PCR. Genome Research 6: Richmond JY, McKinney RW. eds Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne, PA:CLSI, Fryer JF, Heath AB, Anderson R, Minor PD and the collaborative study group Collaborative Study to evaluate the proposed 1 st WHO International Standard for Human Cytomegalovirus (HCMV) for Nucleic Acid Amplification (NAT)- based Assays. WHO ECBS Report WHO/BS/ International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition pp. 42. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Interference Testing in Chemisty; Approved Guideline Second Edition. CLSI Document EP7-A2. CSLI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvannia USA, Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation; Approved Guideline. CLSI Document EP17-A [ISBN ]. CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvannia USA, HU 28 Doc Rev. 7.0

29 Dokumentum verzióinformációi Doc Rev /2015 Eltávolítottuk a veszély szimbólumokat, kulcsszavakat és kódokat a REAGENSEK részből. GTIN szimbólum és leírás hozzáadása a harmonizált szimbólumoldalon. A védjegyeket és szabadalmakat tartalmazó részt frissítettük, most már csak internetes hivatkozást tartalmaz. Esetleges kérdésével forduljon a Roche helyi képviselőjéhez. Roche Molecular Systems, Inc US Highway 202 South Branchburg, NJ USA Distributed by Roche Diagnostics (Schweiz) AG Roche Diagnostics Industriestrasse 7 2, Avenue du Vercors 6343 Rotkreuz, Switzerland Meylan, France Roche Diagnostics GmbH Distributore in Italia: Sandhofer Strasse 116 Roche Diagnostics S.p.A Mannheim, Germany Viale G. B. Stucchi Monza, Milano, Italy Roche Diagnostics, SL Avda. Generalitat, Distribuidor em Portugal: E Sant Cugat del Vallès Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Barcelona, Spain Estrada Nacional, Amadora, Portugal Roche Diagnostics 201, boulevard Armand-Frappier Roche Diagnostica Brasil Ltda. H7V 4A2 Laval, Québec, Canada Av. Engenheiro Billings, 1729 (For Technical Assistance call: Jaguaré, Building 10 Pour toute assistance technique, São Paulo, SP Brazil appeler le: ) Védjegyek és szabadalmak Lásd: Ó 2015 Roche Molecular Systems, Inc. 04/2015 ( ENGL) Doc Rev HU 29 Doc Rev. 7.0

30 A következő szimbólumok használatosak a Roche PCR diagnosztikai termékek jelölésére. Segédszoftver In vitro diagnosztikai felhasználásra Meghatalmazott képviselő az Európai Közösségben Megadott tartomány alsó határa Vonalkód adatlap Gyártó Lotszám Sötétben tárolandó Biológiai veszély Tartalma <n> vizsgálathoz elegendő Katalógusszám Tárolási hőmérséklet Olvassa el a használati útmutatót Vizsgálatdefiníciós fájl Készlet összetevői Megadott tartomány felső határa Terjesztő Lejárati dátum Csak IVD teljesítmény értékelésre Globális kereskedelmi cikkszám Ez a termék teljesíti az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről szóló 98/79EK irányelv előírásait. Felhasználói technikai segítségnyújtás az Egyesült Államokban HU 30 Doc Rev. 7.0