Sample & Assay Technologies

Átírás

1 2008 július EZ1 DSP Virus Kit Használati utasítás verzió Az EZ1 DSP Virus Kit a QIAGEN BioRobot EZ1 DSP-vel vagy az EZ1 Advanced DSPvel együtt egy olyan rendszer, amely mágneses gyöngy technológiát használ virális nukleinsavak izolálására és tisztítására humán plazma, szérum vagy agy-gerincvelői folyadék mintából diagnosztikai eljárásokban való felhasználáshoz. In vitro diagnosztikai felhasználásra HU QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden R HU Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN Sample and Assay Technologies A QIAGEN vezető gyártója különböző innovatív minta és analízis technológiának, mely lehetővé teszi bármilyen biológiai mintából azok összetevőinek izolálását és detektálását. A fejlett technológiát tartalmazó, kitűnő minőségű termékek és szolgáltatások biztosítják a sikert a mintától az eredményig. A QIAGEN etalon a következő technológiákban: DNS, RNS és fehérjék tisztítása Nukleinsav és fehérje assay-k microrns kutatás és RNSi Minta és analízis technikák automatizálása Küldetésünk, hogy lehetővé tegyük a felhasználóink számára kiemelkedő sikerek és áttörő eredmények elérését. További információért kérjük, látogassa meg a honlapot.

3 Tartalomjegyzék Kit összetevõk 4 Jelölések 4 Tárolás 5 A felhasználás célja 6 A felhasználás korlátai 6 Termék és elégedettségi garancia 7 Technikai segítségnyújtás 7 Biztonsági információk 7 Minőségbiztosítás 9 Bevezetés 10 Elv és módszer 10 Teljesítményjellemzők 13 Eszközök és Reagensek, amelyeket a felhasználónak kell biztosítania 22 Fontos megjegyzések 23 Szérum, plazma és CSF minták előkészítése 23 Carrier RNS elkészítése (CARRIER) 23 Belső kontroll (IC) használata 24 Az EZ1 munkaállomásokkal történő munka 25 Virális nukleinsavak tárolása 31 Protokoll: Virális DNS és RNS tisztítása szérumból, plazmából vagy CSF-ből 32 Hibakeresési útmutató 35 A Függelék: Kijelzett üzenetek 39 B Függelék: A belső kontroll (IC) mennyiségének kiszámítása 53 C Függelék: Minta adatlap a BioRobot EZ1 DSP használatához 56 D Függelék: Példa egy EZ1 Advanced Riport file-ra 57 Referenciák 58 Rendelési információk 59 EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/2008 3

4 Kit összetevõk EZ1 DSP Virus Kit (48) Katalógusszám Tesztek száma 48 RCV Reagent Cartridges, Virus* (Reagens kazetta) 48 DTH DFT ST ET Disposable Tip Holders (Eldobható pipettahegy tartó) Disposable Filter-Tips (Eldobható pipettahegyek) Sample Tubes (2 ml) (Minta csövek) Elution Tubes (1.5 ml) (Elúciós csövek) CARRIER Carrier RNA (hordozó RNS) AVE Elution Buffer (elúciós puffer) 310 µg 3 x 2 ml Q-Card 1 Handbook (Kézikönyv) 1 *Guanidin sókat tartalmaz. Nem kompatibilis fehérítőszereket tartalmazó fertőtlenítőkkel. További információért lásd a 7. oldalt. Tartósítószerként nátrium-azidot tartalmaz. A Q-Card-on található vonalkóddal kódolt információ szükséges a reagens adatkövetéshez az EZ1 Advanced munkaállomással történő használathoz. Jelölések Összesen 48 minta kezeléséhez szükséges reagenst tartalmaz Felhasználásra. által Orvosi eszköz in vitro diagnosztikához Katalógusszám 4 EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/2008

5 Tétel szám Anyag szám Összetevők Szám Térfogat Hőmérséklet határértékek Jogos gyártó Fontos figyelmeztetés Csak..-tal/val való használatra Tartalmaz Guanidin-izotiocianát Guanidin-hidroklorid Etanol Izopropanol Proteináz K A doboz felnyitásakor ez az oldal legyen lefele Tárolás A reagens kazettát (RCV) szobahőmérsékleten (15-25 C) tároljuk. A reagens kazettában (RCV) lévő mágneses szemcsék aktívak maradnak, amennyiben ezen a hőmérsékleten történik a tárolás. Ne fagyasszuk le a reagens tartókat (RCV). Amennyiben megfelelő körülmények között tároljuk a reagens kazettákat (RCV), akkor azok a cimkén, a Q-card-on és a dobozon feltüntetett lejárati ideig stabilak maradnak. A liofilizált hordozó RNS (CARRIER RNA) szobahőmérsékleten tárolva a dobozon feltüntetett lejárati ideig stabil marad. EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/2008 5

6 A felhasználás célja Az EZ1 DSP Virus Kit a QIAGEN BioRobot EZ1 DSP-vel vagy az EZ1 Advanced DSP-vel együtt egy olyan rendszer, amely mágneses gyöngy technológiát használ virális nukleinsavak izolálására és tisztítására humán plazma, szérum vagy agy-gerincvelői folyadék mintából diagnosztikai eljárásokban való felhasználáshoz. EDTÁ-val és citráttal (mint antikoaguláns) kezelt vérminták használhatók a plazma preparációhoz. Friss és fagyasztott minta egyaránt használható, feltéve, hogy felolvasztás után nem lett újrafagyasztva a minta. A terméket csak képzett felhasználók használhatják, technikusok, orvosok, akik a molekuláris biológiai technikákban járatosak. Bármilyen a mintafeldolgozással kapcsolatos diagnosztikai eredmény a további alkalmazások eredményeivel egyetemben, csak az egyéb klinikai és laboratóriumi eredmények figyelembevételével történhet. A felhasználás korlátai A rendszer nem alkalmas RNS és DNS izolálására és tisztítására humán teljes vér mintákból, szövetből, csontvelőből baktériumokból és tenyésztett sejtekből. A rendszer légzőszervi mintákból, vizeletből és széklet szuszpenzióból történő virális, bakteriális és parazita nukleinsav izolálásának hatékonyságát nem vizsgálták. Anyai eredetű plazmából történő magzati DNS izolálásának és tisztításának hatékonyságát nem vizsgálták. Az EZ1 DSP Virus rendszer teljesítményét HIV-1, HCV, HBV, CMV és parvovírus B19-cel határozták meg a kézikönyvben (később) leírtak szerint. A felhasználó felelős azért, hogy megfelelő EZ1 DSP Virus működési feltételeket állapítson meg a további DNS és RNS alapú vírus kimutatásokhoz. A diagnosztikai eredményt negatívan befolyásoló körülmények minimalizálása érdekében, belső kontrollok (IC) használata ajánlott a mintaelőkészítés, amplifikáció és detektálás (a használt downstream alkalmazásnak megfelelően) során. Továbbá javasolt a pozitív és negatív kontrollok használata, hogy a negatív hatásokat a lehető legnagyobb mértékben ki lehessen küszöbölni. További validáláshoz az International Conference on Harmonization of Technical Requirements (ICH) megjelent: ICH Q2A: Validation of analytical methods: Definitions and terminology and ICH Q2B: Validation of analytical methods: Methodology által meghatározott vezérfonal használata javasolt. A termék használata során a lehető legnagyobb figyelemmel járjunk el. Javasoljuk minden QIAGEN terméket használó részére az NIH rekombináns DNS kísérletekhez kifejlesztett vezérfonalához való ragaszkodást, vagy bármilyen vonatkozó szabvány betartását. 6 EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/2008

7 Termék és elégedettségi garancia A QIAGEN garantálja az összes termék működését úgy, ahogyan az a termék leírásában szerepel. A vásárló feladata meghatározni, hogy a termék egy bizonyos alkalmazásra megfelelő-e. Bármelyik termék nem megfelelő működése esetén kivéve, ha nem a kézikönyvben leírtaknak megfelelő módon használták azt a QIAGEN ellenszolgáltatás nélkül kicseréli vagy a vásárlási árat visszatéríti. A QIAGEN fenntartja a jogát arra, hogy lecserélje, megváltoztassa vagy módosítsa bármelyik termékét annak érdekében, hogy azok minősége javuljon (akár kit működés, akár készülék tervezés). Ha egy QIAGEN termék nem felel meg az igényeknek, egyszerűen hívja a helyi technikai segítségnyújtó helyet vagy forgalmazót (Biomarker Kft.). A termék árát döntésétől függően jóváírjuk számláján vagy kicseréljük a terméket. Más feltételek vonatkoznak a QIAGEN tudományos műszereire, szervíz termékeire és azokra a reagensekre, amelyeket szárazjégen szállítanak. További információért kérjük, érdeklődjön a helyi QIAGEN képviseletnél (Biomarker Kft.). A QIAGEN kondíciós lista másolata elérhető külön kérésre illetve szerepel számláink hátoldalán. Amennyiben a termék specifikációkkal és minőséggel kapcsolatos kérdései merülnek fel, hívja a QIAGEN technikai segítségnyújtás számát vagy a helyi forgalmazót (Biomarker Kft., valamint a kézikönyv hátoldala és a honlap). Technikai segítségnyújtás A QIAGEN-nél büszkék vagyunk az általunk nyújtott technikai segítségnyújtás elérhetőségére és minőségére. A technikai segítségnyújtási osztályokon a mintakezelési és analízis technikákban kiterjedt gyakorlati és elméleti ismeretekkel rendelkező tapasztalt tudósok állnak rendelkezésre. Ha bármilyen kérdése merülne fel, az EZ1 DSP Virus Kit-tel kapcsolatos probléma esetén vagy a QIAGEN termékekkel kapcsolatban lenne általános kérdése, észrevétele kérjük, vegye fel a kapcsolatot velünk. A QIAGEN felhasználók köre a legfőbb információs forrás termékeink fejlett szintű vagy speciális felhasználására. Ez az információ segítség más tudósok számára is éppúgy, mint a QIAGEN kutatói részére. Ezért mindenképp bátorítjuk felhasználóinkat arra, hogy bármilyen a termék felhasználásával, teljesítményével kapcsolatos tapasztalatát illetve termékeink új alkalmazásokra és technikákra való használatát, javaslataikat osszák meg velünk, azokat köszönettel fogadjuk. Technikai segítségnyújtáshoz kérjük keresse a QIAGEN technikai támogatási központot a oldalon vagy hívja a QIAGEN egyik technikai szerviz osztályát vagy a helyi forgalmazót (Biomarker Kft., lásd a hátoldalt vagy a honlapot). Biztonsági információk Amennyiben kémiai anyagokkal dolgoznak, mindig viseljenek megfelelő védőköpenyt, egyszerhasználatos védőkesztyűt és védőszemüveget. További információért kérjük, tanulmányozza a megfelelő biztonsági adatlapot EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/2008 7

8 (MSDS). Ezek online elérhetők kényelmes és tömör PDF formátumban a oldalról, ahol minden QIAGEN Kit és kit összetevő biztonsági lapját (MSDS) letöltheti. FIGYELMEZTETÉS: NE ADJUNK fehérítőszert vagy savas oldatokat közvetlenül a mintakezelés után maradt hulladékhoz. A reagens kazettában (RCV) lévő pufferek guanidin-hidrokloridot/guanidinizotiocianátot tartalmaznak, amelyek veszélyes és nagymértékben reaktív elegyet képezhetnek a fehérítőszerekkel. Ha olyan folyadékot öntünk ki, amely ezeket a puffereket is tartalmazza, akkor a kiömlés helyét alkalmas laboratóriumi detergenssel és vízzel tisztítsuk fel. Ha fertőző ágenst tartalmazó folyadék kerül az EZ1 munkaállomásra, akkor fertőtlenítsük a készüléket az EZ1 készülékhez kapott kézikönyvben található fertőtlenítőszerek egyikével. A törött vagy szivárgó reagens kazettát (RCV) a helyi biztonsági előírásnak megfelelően kell kezelni és hulladékként eltávolítani. Ne használjunk sérült reagens kazettát (RCV) vagy más kit összetevőt, mert ezek használata rossz és megbízhatatlan eredményhez vezethet. A QIAGEN nem ellenőrizte az EZ1 DSP Virus eljárás használatakor hulladékként keletkező folyadékokat a maradék fertőző ágens tekintetében. A visszamaradt hulladékban lévő fertőző anyag jelenléte nagyon valószínűtlen, azonban az ilyen folyadékokat, mindig fertőző folyadékként kezeljük és a helyi eljárási szabályok szerint kezeljük és távolítsuk el. A következő veszélyességi és biztonsági jelzések vonatkoznak az EZ1 DSP Virus Kit összetevőire: 8 EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/2008

9 Reagens kazetta, Virus (RCV) F, Xn Etanolt, guanidin-hidrokloridot, guanidin-izotiocianátot, izopropanolt és proteináz K-t tartalmaz: erősen gyúlékony, ártalmas, irritáló és túlérzékenységet kiváltó. Veszélyességi és biztonsági jelzők*: R11-20/21/ /38-42/43, S /37/ órás elsősegély információ Sürgősségi orvosi információ Angolul, Franciául és Németül napi 24 órában érhető el a következő helyről: Mérgezési Információs Központ, Mainz, Németország T: Minőségbiztosítás A QIAGEN ISO-minősített minőségellenőrzési rendszerének megfelelően az EZ1 DSP Virus Kit minden egyes gyártási tételét leellenőrzik, hogy az megfelel-e az előírt paramétereknek, ezzel biztosítják a kit egyenletes és kifogástalan minőségét. R11: Nagyon gyúlékony; R20/21/22: Ártalmas belélegzéssel, bőrre kerülve és lenyelve; R32: savakkal érintkezve nagyon erősen mérgező gázok keletkeznek; R36/38: szemre és bőrre irritáló hatású; R42/43: Érzékenységet válthat ki belélegzéssel és bőrrel való érintkezéskor; S13: Tartsuk távol élelmiszertől, italtól és állati takarmányoktól; S26: Szembe jutás esetén azonnal bő vízzel öblítsük a szemet, majd forduljunk orvoshoz; S36/37/39: Viseljünk megfelelő védőköpenyt, védőszemüveget és arc/szemvédő szemüveget/maszkot; S46: ha lenyeltük azonnal forduljunk orvoshoz és mutassuk meg a doboz feliratát vagy a címkéjét az orvosnak. EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/2008 9

10 Bevezetés Az EZ1 DSP Virus Kit teljesen automatizált módszert szolgáltat virális DNS és RNS szimultán tisztítására szérumból, plazmából és agy-gerincvelői folyadékból (cerebro-spinális folyadék, CSF) az EZ1 Advanced vagy BioRobot EZ1 DSP munkaállomással. A kit alkalmas nukleinsavak tisztítására DNS és RNS vírusok széles köréből. A kit teljesítménye azonban nem garantálható minden vírus fajra. A kit alkalmasságát egy bizonyos fajra a felhasználónak kell meghatároznia. A mágneses gyöngy technológia jó minőségű nukleinsavakat szolgáltat, amelyek mentesek proteinektől, nukleázoktól és más szennyeződésektől. A tisztított nukleinsavak alkalmasak nagy érzékenységű detektáló rendszerekhez, mint pl. amplifikáció vagy más enzimes reakció. Az EZ1 Advanced vagy BioRobot EZ1 DSP a mintakezelés összes lépését végrehajtja, egyszerre maximum 6 mintán. Elv és módszer A mágneses gyöngy technológia kombinálja a hatékony szilika bázisú DNS tisztítást és a gyors és kényelmes mágneses elválasztást. A módszert úgy tervezték, hogy potenciálisan fertőző mintákat biztonságosan és reprodukálhatóan lehessen kezelni és a nukleinsav izoláláshoz felhasználni. A tisztítási lépés 4 lépésből áll: lízis, kötés, mosás és eluálás (lásd alább, valamint a folyamatábrát a 12. oldalon). Lízis Proteináz K-val A szérum, plazma vagy CSF mintában a proteolízis erősen denaturáló körülmények között magas hőmérsékleten történik. A lízis proteináz K jelenlétében, lízis pufferben megy végbe, mely együttesen biztosítja a virális köpenyfehérje emésztését és az RNázok inaktiválását. Kötés a mágneses részecskékhez A lizált mintához kötőpuffer kerül, amely a kötéshez megfelelő körülményeket hozza létre. A lizátum alaposan összekeveredik a mágneses részecskékkel, ezzel biztosítva a hatékony virális DNS és RNS kötését a szilika felszínhez. A pufferben található sók (koncentráció) és a megfelelő ph biztosítja, hogy proteinek és más szennyezőanyagok amelyek a PCR reakciót vagy további enzimes reakciókat gátolhatnák ne kötődjenek a mágneses részecskékhez. Kötött nukleinsavak mosása Míg a virális DNS és RNS a mágneses részecskékhez kapcsolódik, a szennyezőanyagok hatékonyan lemoshatók az egymás után következő mosási lépésekben. A mosás mosópuffer 1-gyel, mosópuffer 2-vel majd etanollal történik. 10 EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/2008

11 Tiszta nukleinsav leoldás (elúció) A nagytisztaságú virális DNS és RNS egy lépésben kerül leoldásra az elúciós pufferben (AVE). A leoldott, tisztított nukleinsavak közvetlenül használhatók a további reakciókhoz illetve tárolhatók későbbi felhasználás esetén. EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/

12 Az EZ1 DSP Virus procedúra Szérum, plazma vagy CSF Lízis proteináz K-val lízis pufferben Mágneses részecskék és kötőpuffer kerülnek a mintába A nukleinsavak kötnek a mágnesesrészecskékhez Mágneses elválasztás Mosás mosópuffer 1-gyel, mosópuffer 2-vel, majd etanollal Mágneses elválasztás Leoldás elúciós pufferrel (AVE) Tiszta, jó minőségű virális nukleinsavak 12 EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/2008

13 Teljesítményjellemzők Lineáris tartomány Az EZ1 DSP Virus Kit lineáris tartományát HCV és HIV-1 RNS és HBV DNS vírusokkal határozták meg. A teszteket a mennyiségileg jellemzett víruspanelek higításával határozták meg HBV, HCV és HIV-1 negatív humán plazmában. Hat különböző vírus titert teszteltek mindegyiket 12 ismétlésben. Az EZ1 DSP Virus Kit módszer lineáris tartományát HBV, HCV és HIV-1 vírusra az Abbott RealTime virális terhelési vizsgálattal határozták meg (1. táblázat, 1. ábra). RealTime belső kontrollokat (IC) adtak (17 µl egyenként) minden egyes HIV-1 vagy HCV mintához az extrakció előtt. A RealTime HBV esetén 3,4 µl RealTime HBV belső kontroll (IC) hordozó RNS-sel (carrier RNS) kombinálva került az egyes mintákba. A virális nukleinsavakat 400 µl mintából, 90 µl elúciós pufferben (AVE) vették fel. A PCR-t az Abbot m200rt-n végezték el. 1. táblázat. Minta forrás és downstream vizsgálatok az EZ1 DSP Virus protokoll hozam lineáris tartományának megállapításához Vírus HIV-1 Forrás BBI (Boston Biomedica, Inc., Boston, USA) defektív HIV, BBI rekalcifikált plazma Downstream vizsgálat Vizsgálati kézikönyv Abbott RealTime HIV-1 (Abbott Molecular Inc.) Abbott RealTime HIV-1 HCV ProMedDx (ProMedDx LLC Norton, MA, USA) páciens minta, pool-ozott normál humán szérum Abbott RealTime HCV (Abbott Molecular Inc.) Abbott RealTime HCV HBV Teragenix (Teragenix Coporate, Ft. Lauderdale, FL, USA) páciens minta, rekalcifikált humán plazma Abbott RealTime HBV (Abbott Molecular Inc.) Abbott RealTime HBV EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/

14 A Tapasztalt (log kópia/ml) Tapasztalt (log kópia/ml) Tapasztalt (log kópia/ml) B C Várt (log kópia/ml) Várt (log kópia/ml) Várt (log kópia/ml) 1. ábra. A hozamok lineáris tartománya az EZ1 DSP Virus protokollal. Az EZ1 DSP Virus protokoll lineáris tartományát vírus higítási sorokkal határozták meg az Abbott RealTime vizsgálattal (1. táblázat) A HIV-1, B HCV és C HBV. 14 EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/2008

15 Precizitás A HIV-1, HCV és HBV higítási sorok standard deviációja (SD) és variancia koefficiense (VK) került meghatározásra a megfelelő downstream alkalmazás lineáris tartományában. A precíziós vizsgálathoz, ugyanazt a downstream alkalmazást használták, mint a lineáris tartomány meghatározásához (1. táblázat, 13. oldal). Az egyes vizsgálatok közötti precíziós adatokat a 2-4. táblázatokban tüntettük fel. Minden panelből 12 ismétlésben történt az izolálás, 12 különböző BioRobot EZ1 DSP futtatás során. A PCR-t 2 futtatásban végeztük el (6-6 ismétlés eredményének vizsgálatához) az Abbott m2000rt készüléken. 2. táblázat. Az EZ1 DSP Virus protokoll vizsgálatok közötti pontossága az Abbott RealTime HIV-1 vizsgálattal SD (log Panel tag n Kópia/ml VK (%) log kópia/ml kópia/ml) ,17 0, ,63 0, ,03 0, ,06 0, ,07 0, ,11 0,08 3. táblázat. Az EZ1 DSP Virus Protokoll vizsgálatok közötti pontossága az Abbott RealTime HCV vizsgálattal Panel tag n IU/ml VK (%) log IU/ml SD (log IU/ml) ,59 0, ,09 0, ,37 0, ,71 0, ,55 0, ,74 0,10 EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/

16 4. táblázat. Az EZ1 DSP Virus Protokoll vizsgálatok közötti pontossága az Abbott RealTime HBV vizsgálattal SD (log Panel tag n Kópia/ml VK (%) log kópia/ml kópia/ml) ,34 0, ,55 0, ,45 0, ,45 0, ,52 0, ,60 0,06 A detektálási határérték Az EZ1 DSP Virus rendszer detektálási határértékét a 95%-os probit érték alapján határozták meg a 97/656-as HIV-1 WHO nemzetközi vírus standard, a 97/746-os HBV WHO nemzetközi vírus standard és a kvantifikált CMV sejtkultúra alapján. A detektálási küszöbérték meghatározása a megfelelő vírus higítási sorából történő izolálással történt. A vírusok higítása HIV negatív, HBV negatív és CMV negatív normál humán EDTA kezelt és poolozott plazmában történt. Minden egyes higítás legalább 3 független futtatásban és legalább 6 ismétlésben történt higításonként. 400 µl plazmát használtak kiindulási anyagként a BioRobot EZ1 DSP készüléken az izoláláshoz, amelyben az eluáció 60 µl-ben történt. A HBV DNS kimutatásához az artus HBV, a CMV DNS kimutatáshoz az artus CMV PCR kitet használták. A mintákat a LightCycler 1.2 készüléken (Roche), Rotor-Gene 3000 (Corbett-Research) és az ABI PRISM 7000 SDS (Applied Biosystems) készüléken analizálták. A COBAS Amplicor HIV- 1Monitor Test (1.5 verzió) felhasználásával detektálták a HIV-1 RNS-t a COBAS Amplicor Analyzer készüléken. Minden minta kombinált adatát probit anlízissel értékelték ki. Az adatok az 5-6. táblázatban találhatók a jellemző probit grafikonokkal együtt 2-3. ábra. 16 EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/2008

17 5. táblázat. A HBV és CMV DNS detektálási határétékei az EZ1 DSP Virus rendszerrel és az artus PCR Kit használatával Vírus HBV CMV Bevitt titer 95% probit érték (IU/ml) Megbízhatósági intervallum (IU/ml) 95% probit érték (kópia/ml) Megbízhatósági intervallum (kópia/ml) Találatok (LightCycler) Találatok (Rotor-Gene) Találatok (ABI PRISM) 45,7 14,4 13, ,5 26,5 9,0 23,1 67,2 21,8 38,3 41, ,5 44,1 21,5 89,8 2. ábra. Probit vizsgálat a CMV DNS detektálására az EZ1 DSP Virus rendszerrel és az artus CMV RG PCR Kit-tel. A virális nukleinsav tisztítása az EZ1 DSP Virus rendszerrel történt. A CMV DNS detektálását az artus CMV PCR RG Kit-tel végezték a Rotor-Gene 3000-rel. A 95%-os probit érték 21,8 kópia/ml. EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/

18 6. táblázat. A HIV DNS detektálási határétéke az EZ1 DSP Virus rendszerrel és a COBAS Amplicor HIV-1 Monitor Teszttel, 1.5-ös verzió Bevitt titer (IU/ml) Találatok 95% probit érték (IU/ml) 114,5 Megbízhatósági intervallum (IU/ml) 82,9 194,3 3. ábra. Probit vizsgálat a HIV RNS detektálására az EZ1 DSP Virus rendszerrel és a COBAS Amplicor HIV-1 Monitor Teszt, 1.5-ös verziójával. A virális nukleinsav tisztítása az EZ1 DSP Virus rendszerrel történt 400 µl mintával 60 µl elúciós térfogatban. A HIV RNS detektálása a COBAS Amplicor HIV-1 Monitor Teszt használatával a COBAS Amplicor Analyzer gépen történt. A 95%-os probit érték 114,5 IU/ml. Minta kereszt-kontamináció kizárása Annak kiértékelésére, hogy az EZ1 DSP Virus rendszerben (az izolálás során és az izolálások között) milyen veszélye lehet a minta keresztkontaminációnak 9 futtatást végeztek a BioRobot EZ1 DSP munkaállomáson. A tesztet egy kvantifikált B19 parvovírusos beteg mintájával végezték el. A pozitív mintákban a vírus titer 1,0x10 8 IU/ml volt. A pozitív minták higításához és negatív kontrollnak humán B19 parvovírus negatív, EDTÁ-val kezelt plazma pool-t használtak fel. A minta keresztfertőzés detektálásához 2 futtatást végeztek el váltakozó sakktábla elrendezésben negatív és erősen pozitív mintákkal. Minden 3. futtatásban csak negatív mintát használtak a lehetséges futások közötti keresztfertőzések kimutatásához. Ez a minta összeállítás 3 ismétlésben került végrehajtásra, amelynek eredménye a 9 futtatás. A B19 parvovírus DNS kvantitatív meghatározásához a CE-IVD jelöléssel rendelkező artus Parvo B19 RG PCR Kit-et használták a Rotor-Gene 3000-rel. Az artus Parvo B19 RG PCR Kit analitikai detektálási küszöbértéke 0,2 IU/µl-nek adódott az 18 EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/2008

19 eluátumban (p = 0,05). Ez azt jelzi, hogy 95% annak a valószínűsége, hogy az eluátumban 0,2 IU/µl vírus detektálásra kerül. Minden erősen pozitív minta pozitív volt az artus Parvo B19 RG PCR Kit-tel. Minden negatív minta a sakktábla elrendezésben és a csak negatív minták futtatásakor negatívnak adódott (7. táblázat). Ezek a kísérletek azt demonstrálják, hogy az EZ1 DSP Virus protokoll használata nem eredményez minta keresztfertőződést a fenti kisérleti elrendezésben. 7. táblázat. Kereszt-kontamináció kísérleti elrendezés és a C T értékek a B19 parvovírus DNS detektálására Pozíció Futtatás ,47 X 15,41 X 15,36 X 2 X 15,48 X 15,53 X 15,32 3 X X X X X X 4 15,35 X 15,2 X 15,27 X 5 X 15,21 X 15,13 X 15,43 6 X X X X X X 7 15,62 X 15,48 X 15,23 X 8 X 15,31 X 15,83 X 15,62 9 X X X X X X C T középérték minden mintára = 15,40 ± 0,18 (VK = 1,14%) X: 45 PCR ciklusig nincs jel Stabilitás Az EZ1 DSP Virus Kit-tel izolált virális RNS és DNS stabilitását meghatározták. Humán EDTÁ-val kezelt plazmát fertőztek 1x10 3 IU/ml HCV AcroMetrix OptiQuant HCV RNS-sel és Parvo B19 VQC standard anyaggal. Tesztenkénti inkubációs idők és körülmények: 18 ismétlésben nukleinsavat izoláltak az EZ1 DSP Virus rendszerrel. A Parvo B19 DNS-t és HCV RNS-t tartalmazó eluátumokat különböző körülmények között inkubálták: legalább 6 óráig 30 C-on, 14 napig 4 C-on, 12 hétig -20 C-on és 9 hónapig -80 C-on. A vizsgálat jelenleg is tart. Az eluátumokat validált házon belüli HCV RT-PCRrel és az artus Parvo B19 RG PCR kit-tel tesztelték. A 18 ismétlésből egy RT- PCR hiba fordult elő HCV RNS-sel 14 napos 4 C-on történő inkubálás után (4. ábra). EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/

20 A HCV RNS (log IU/ml) Óra 30 C-on Nap 4 C-on Hét -20 C Hónap -80 C-on B Tárolási körülmények Parvo B19 DNS (log IU/ml) Óra 30 C-on Nap 4 C-on Hét -20 C Hónap -80 C-on Tárolási körülmények 4. ábra. Virális nukleinsavak stabilitása. Az EZ1 DSP Virus Kit-tel izolált virális RNS és DNS stabilitása A HCV RNS és B Parvo B19 DNS esetén. 20 EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/2008

21 Reprodukálhatóság Az eredmények reprodukálhatóságának meghatározásához 3 BioRobot EZ1 DSP munkaállomást használtak, melyeket 3 különböző napon futtattak (lásd a 8. táblázatot). Minden egyes teszthez (A-G), 12 ismétlést kezeltek 2 futtatásban a BioRobot EZ1 DSP készüléken. Humán EDTÁ-val kezelt plazmát használtak, melyet 1x10 4 IU/ml AcroMetrix OptiQuant HCV RNS-sel és 1x10 3 IU/ml AcroMetrix OptiQuant HBV DNS-sel fertőztek. A HBV DNS-t az artus HBV RG PCR Kit-tel, a HCV RNS-t egy validált házon belüli HCV RT- PCR vizsgálattal határozták meg. Az automatizált módszer nagymértékben reprodukálhatónak bizonyult, amelyet 3 különböző napon és 3 különböző BioRobot EZ1 DSP munkaállomással végzett virális nukleinsav tisztítás során kapott hasonló eredmény bizonyít. 8. táblázat. Reprodukálhatósági kisérleti összeállítás Teszt elrendezés 1. nap 2. nap 3. nap BioRobot EZ1 DSP I A teszt D teszt F teszt BioRobot EZ1 DSP II B teszt E teszt BioRobot EZ1 DSP III C teszt G teszt 5 ábra. Reprodukálhatóság. A reprodukálhatóság három különböző BioRobot EZ1 DSP munkaállomáson, 3 különböző napon meghatározva. EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/

22 Eszközök és Reagensek, amelyeket a felhasználónak kell biztosítania Amennyiben kémiai anyagokkal dolgoznak mindig viseljenek megfelelő laboratóriumi védőköpenyt, egyszer használatos védőkesztyűt és védőszemüveget. További információért tanulmányozza a megfelelő biztonsági adatlapot (MSDS), amelyet a gyártótól vagy forgalmazótól szerezhet be. Minden protokollhoz Pipetták* és steril, RNáz-mentes pipettahegyek Lágy törlőpapír Víz 70% etanol Opcionális: Keverő* (ha a fagyasztott szérum vagy plazma keverése szükséges) Az EZ1 Advanced felhasználóknak EZ1 Advanced munkaállomás * (kat. szám ) EZ1 Advanced DSP Virus Card (kat. szám ) Minta követéshez az alábbiak közül az egyik szükséges: PC (monitorral) az EZ1 Advanced Communicator szoftverrel felszerelve (kat. szám ) EZ1 Advanced Communicator szoftver (kat. szám ) saját PC-vel való használatra Nyomtató (kat. szám ) és nyomtató kiegészítők (kat. szám ) BioRobot EZ1 felhasználóknak BioRobot EZ1 DSP munkaállomás* (kat. szám ) EZ1 DSP Virus Card (kat. szám ) * Biztosítsuk, hogy a készülékeket rendszeresen ellenőrzik, karbantartják és kalibrálják a gyártó utasításai alapján. 22 EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/2008

23 Fontos megjegyzések Szérum, plazma és CSF minták előkészítése A tisztítási folyamatot 100 µl, 200 µl vagy 400 µl szérum, plazma vagy CSF mintára optimalizálták. EDTA-val vagy citráttal, mint antikoagulánssal kezelt vérminták használhatók plazma készítésére. A minták lehetnek frissek vagy fagyasztottak, feltéve, hogy nem lettek visszafagyasztva a felolvasztás után. Az összegyűjtés és centrifugálás után a plazma, szérum vagy CSF minták 2-8 C-on akár 6 órán keresztül tárolhatók. Hosszabb tárolás esetén az alikvótok lefagyasztását ajánljuk -20 C-on vagy -80 C-on. A mintákat szobahőmérsékleten (15-25 C) olvasszuk fel és rögtön dolgozzuk fel, amint szobahőmérsékletre melegedtek. A felolvasztás után ne fagyasszuk vissza az alikvótokat. Az ismételt fagyasztás-felolvasztás a fehérjék denaturálásához és kicsapódásához vezet, amely csökkenti a vírus titert, és ezáltal a virális nukleinsavak kinyerését. Ha a mintákban fagyasztás hatására keletkező csapadék látható, centrifugáljuk le 6800 x g fordulaton 3 percig, a csapadék felzavarása nélkül vigyük át a felülúszót új csőbe és azonnal kezdjük meg a tisztítási folyamatot. Carrier RNS elkészítése (CARRIER) A Carrier RNS (CARRIER) két célt szolgál a tisztítási folyamat során. Az első, hogy megnöveli a virális nukleinsavak megkötődését a mágneses részecskék szilika felületére, különösen akkor, ha a minta nagyon kevés célmolekulát tartalmaz. A második, hogy a nagy mennyiségű carrier RNS (CARRIER) hozzáadása csökkenti annak az esélyét, hogy a virális nukleinsavak degradálódjanak abban a ritka esetben ha az RNázok nem denaturálódnának a lízis pufferben lévő kaotróp sóktól és detergenstől. Ha nem adunk carrier RNS-t (CARRIER) a reakcióhoz, a virális DNS vagy RNS kinyerése csökkenhet. A kitben található liofilizált carrier RNS (CARRIER) 48 minta elkészítésére elégséges. A tisztítási folyamatban használt carrier RNS (CARRIER) koncentrációja lehetővé teszi, hogy az EZ1 DSP Virus kitet, mint általános tisztítási rendszert használjuk, amely sok különböző amplifikációs rendszerrel kompatibilis, és sokféle DNS és RNS vírusból történő nukleinsav tisztításra nyújt lehetőséget. Ugyanakkor az amplifikációs rendszerek hatékonyságukban különböznek a reakcióban jelen lévő teljes nukleinsav mennyiség alapján. Az EZ1 DSP Virus kittel kinyert eluátumok virális nukleinsavat és carrier RNS-t (CARRIER) is tartalmaznak, és a carrier RNS (CARRIER) mennyisége minden egyes eluátumban jóval meghaladja a virális nukleinsavak mennyiségét. Az amplifikációs reakcióhoz szükséges eluátum mennyisége ezért az eluátumban lévő carrier RNS (CARRIER) mennyiségétől kell, hogy függjön. Hogy az amplifikációs reakciókban a legnagyobb érzékenységet érjük el, szükséges lehet a carrier RNS (CARRIER) oldat mennyiségének beállítása. EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/

24 Oldja fel a carrier RNS-t (CARRIER) 310 µl elúciós (AVE) pufferben, ossza szét kényelmes mennyiségű alikvótokba, és -20 C-on tárolja. Ne olvasszafagyassza vissza az alikvótokat kettőnél többször. Minden egyes feldolgozandó mintához 3,6 µl carrier RNS (CARRIER) törzsoldatot higítson ki 60 µl végtérfogatra elúciós (AVE) pufferrel (és/vagy belső kontroll oldattal). Ebből a carrier RNS-elúciós puffer (CARRIER-AVE) oldatból 50 µl-t vigyen át a lízis keverékbe, amelyben így a carrier RNS (CARRIER) mennyisége 3 µg-nak felel meg. Ha belső kontrollt (IC) szeretne használni, nézze meg a Belső kontroll (IC) használata részt lejjebb. A tisztítási folyamat úgy optimalizált, ha fejenként 3 µg carrier RNS-t (CARRIER) adunk a mintákhoz. Amennyiben egy specifikus amplifikációs rendszer esetén jobb eredményt hozott más mennyiségű carrier RNS (CARRIER) használata, változtassa meg az elúciós (AVE) pufferrel kevert carrier RNS (CARRIER) oldat mennyiségét, vagy használjon más koncentrációjú oldatot. A carrier RNS-elúciós puffer (CARRIER-AVE) oldat össztérfogata 60 µl kell, hogy legyen, amelyből 50 µl-t viszünk át a lízis keverékbe. A különböző mennyiségű carrier RNS (CARRIER) használatát minden egyes mintatípusra és analízisre validálni kell. Belső kontroll (IC) használata Az EZ1 DSP Virus Kit különböző, a piacon elérhető amplifikációs rendszerekkel történő kombinált használata megkövetelheti egy belső kontroll (IC) bevezetését a tisztítási folyamatba annak érdekében, hogy a minta elkészítésének hatékonyságát ellenőrizzük. A belső DNS vagy RNS kontrollt a carrier RNS (CARRIER) oldattal kell vegyíteni egy keverékben. Mintánként a carrier RNS-belső kontroll (CARRIER-belső kontroll) keveréknek 60 µl-nek kell lennie, amelyből 50 µl-t visz át a készülék a lízis keverékbe. Ez a mennyiség 3 µl carrier RNS (CARRIER) oldatnak és 47 µl elúciós (AVE) puffernek és/vagy belső kontroll oldatnak felel meg. Ha a belső kontroll (IC) stabil a plazmában, szérumban vagy CSF-ben (pl. armored RNS), akár a mintához is adhatjuk közvetlenül a minta előkészítése előtt. Hivatkozzon a gyártó utasításaira a belső kontroll (IC) optimális mennyiségének megállapításához a specifikus alkalmazásokban. Az ajánlottnál kevesebb mennyiség használata csökkentheti az amplifikálás hatékonyságát. Hogy az EZ1 DSP Virus protokollhoz szükséges belső kontroll (IC) mennyiségét meghatározza, az eluátum térfogatát kell figyelembe vennie. Nézze meg a B Függelék: A Belső kontroll mennyiségének kiszámítása részt a 53. oldalon a részletes utasításokért a belső kontroll (IC) helyes mennyiségének kiszámításához. A belső kontrollok (IC) nincsenek benne az EZ1 DSP Virus Kitben. 24 EZ1 DSP Virus Kit Kézikönyv 07/2008