A nukleinsavkémia koronázatlan királyai, kémiai és orvosi obel-díjak: Francis arry James Dewey ompton rick Watson Maurice ugh Frederick Wilkins 1962 DS molekuláris szerkezetének felismeréséért aul Berg 1980 rekombináns-ds Walter Gilbert Frederick Sanger ukleinsavak szekvenálásáért Kary B. 1993 Mullis olimeráz láncreakció (R) Michael Smith Irányított mutagenezis Sir James W. Black Gertrude B. Elion George. itchings 1988 urin alapú kemoterápiás gyógyszerek
UKLEISAVAK - dezoxiribonukleinsavak (DS) - ribonukleinsavak (RS) memo: nucleus = sejtmag lyan molekulák, amelyek az átörökítendő információ tárolására, annak átírására (transzkripció) és átfordítására (transzláció) alkalmasak, aminek eredményeként a sejt összes fehérjéje megszintetizálódik. (Alkalmasak továbbá reakciók katalízisére is.) Kémiai építőelemek: nukleotidok és nukleozidok 4' 5' 3' 2' heterociklusos bázis β--glikozidos kötés 1' egy nukleotid hidrolízis heterociklusos bázis: purin vagy pirimidin ötszénatomos monoszacharid: D-ribóz vagy 2-dezoxi-D-ribóz foszfátion
146 bázispár 8 histon fehérje és ezt is - hidak tartják össze. A nukleoszóma komplexet stab. a 1 linker fehérje A supercoiling 15000* kondenzációt tesz lehetővé mindig jobb menetes, antiparallel, Z-DS az egészet a -hidak tartják egyben Eukarióta sejtek génjében van nemkódoló rész; intronok. (rokarióta sejtekben tipikusan nincs intron.) Az intron a pre-mrs-be átíródik, majd az RS érés során az kivágódik.
Foszforsavészterek hidrolízise: 2 Q Q= adenozin-5'-monof oszf át Q= dezoxiadenozin-5'-monof oszf át 2 ukleinsav (polinukleotid) nukleáz nukleotidáz enyhe degradáció 1 a, 25 ukleotid (monomer) cc. 3, 180 Q= Q= Q A -glikozidkötés hidrolízise: adenozin dezoxiadenozin ukleozid (glikozid) + 3 4 purin nukleozid foszforiláz* + ukleotidbázis + pentóz (nucleobase) * Ez a foszforiláz az valójában egy hidroláz
A cukorrész: D-ribóz D-arabinóz D-xilóz D-lixóz memo: pirán furán tetrahidro-2 -pirán tetrahidrofurán iklusos félacetál képződése, avagy hogyan rajzoljuk a furanózokat: 1 2 3 4 5 2 A nyílt láncú D-fruktóz különbözö konformációi 4 3 5 2 nyílt láncú D-ribóz 2 1 2 4 5 3 nyílt láncú D-ribóz 2 1 ukleozidokban mindig 5 tagú (furanóz) gyűrű formájában van a cukor jelen. 2 4 5 3 1 β-d-ribofuranóz 2 5 2 4 3 α-d-ribof uranóz 2 1
A nukleinsavak építőelemei: a heterociklusok irimidinszármazékok: 2 3 barbitursav pirimidin-2,4,6-triol uracil pirimidin-2,4-diol citozin 4-amino-pirimidine-2-ol timin 5-methyl-pyrimidine-2,4-diol Az uracil keto-enol tautomer egyensúlyi formái: dilaktim f orma laktim-laktám forma dilaktám forma legstabilabb
urinszármazékok: 2 2 6-amino-purin adenin A guanin keto-enol tautomer egyensúlyi formái: 2-amino-6-hidroxi-purin guanin Melyik tautomerforma a stabilabb?
em-rs és -DS alkotó purinszármazékok: A purin degradációs út: áz:= urin nukleozid foszforiláz AM nukleotidáz GM Adenozin dezamináz áz purinvázas alkaloidok: di- és trimetil származékok
2 ukleozidok: A megfelelő purin- és pirimidinbázisok -glikozidjai Q= Q= Q adenozin dezoxiadenozin 2 ukleotidok: A nukleozidok foszforsavészterei Q Q= Q= adenozin-5'-monofoszf át dezoxiadenozin-5'-monofoszf át
2 2 adenozin RS építőelem adenozin 9-(β-D-ribofuranozil)-adenin op= 235 o 2 2 adenozid - - adenozin-5'-foszfát 5'-AM - - adenozin-3'-foszfát 3'-AM dezoxiadenozin 2 2 DS építőelem dezoxiadenozin 9-(2'-dezoxi-β-D-ribofuranozil)-adenin op= 190 o 2 2 dezoxiadenozid - - dezoxiadenozin-5'-foszfát 5'-dAM - - dezoxiadenozin-3'-foszfát 3'-dAM
guanozin 2 2 RS építőelem guanozin 9-(β-D-ribof uranozil)-guanin op= 240 o guanozid 2 2 - - guanozin-5'-foszfát 5'-GM - DS építőelem - guanozin-3'-foszfát 3'-GM dezoxiguanozin 2 dezoxiguanozin 9-(2'-dezoxi-β-D-ribofuranozil)-guanin 2 dezoxiguanozid 2 2 - - dezoxiguanozin-5'-foszfát 5'-dGM - - dezoxiguanozin-3'-foszfát 3'-dGM
2 citidin 2 RS építőelem citidin 3-(β-D-ribof uranozil)-citozin op= 230 o citidinf oszfátok 2 2 - - citidin-5'-foszfát 5'-M - DS építőelem - citidin-3'-f oszf át 3'-M dozoxicitidin 2 2 dezoxicitidin 3-(2'-dezoxi-β-D-ribofuranozil)-citozin dezoxicitidinfoszf átok 2 2 - - dezoxicitidin-5'-foszfát 5'-dM - - dezoxicitidin-3'-f oszfát 3'-dM
uridinn RS építőelem uridin 3-(β-D-ribofuranozil)-uracil op= 165 o uridinnfoszfátok - - uridin-5'-foszfát 5'-UM - DS építőelem - uridin-3'-foszfát 3'-UM timidin 3 3 timidin 3-(2'-dezoxi-β-D-ribofuranozil)-timin op= 183 o timidinf oszfátok 3 3 - - timidin-5'-foszfát 5'-TM - - timidin-3'-f oszfát 3'-TM
A DS kémiai szerkezete 2 citidin foszforsavdiészter típusú lineáris polimerek Az RS kémiai szerkezete guanozin 3 2 timidin adenozin 2
is G is amino-laktám forma T dilaktám, míg az A amino (aromás) forma 3 ribóz citozin oxo-f orma guanin oxo-f orma ribóz ribóz timin oxo-f orma adenin ribóz ukleotidok belső arányai a DS-ben: Σ(pur.)/Σ(pir.) G+A/(+T) 1 és A/T 1 és G/ 1 - A bázispárok miatt a DS két szála komplementer jellegű -Az intermolekuláris -hidak jelentősége -A cukor-foszforsav diészter gerinc teljesen konzervatív, míg a heterociklusok permutálódnak A heterociklusok pontos szekvenciája hordozza az információt. 1953 Francis arry James Dewey ompton rick Watson
A DS térszerkezete: jobbmenetes kettős hélix, körülbelül 10 nukleotidpárral hélix menetenként. A spirálokat -hidak tartják össze. Az adenint és a timint 2, míg a guanint és a citozint 3- híd köti össze. Ezt a téralkatot először James Watson and Francis rick becsülték (határozták) meg helyesen 1953-ban. citozin 2,8 Â guanin timin 2,8 Â adenin 3,0 Â 3,0 Â 3 ribóz citozin oxo-f orma guanin oxo-f orma ribóz ribóz timin oxo-f orma adenin ribóz
Mutáció I: ormális és abnormális bázispárok Rib guanin laktám tautomerje STABILABB Rib citozin amino-latkám f orma szülő gyerek -G- -- -G- -- -G- -- unoka -G- -- -G- -- 3 mutáció Rib guanin laktim tautomerje LABILIS Rib timin dilaktámf orma -G*- -T- -G- -- -G- -- -A- -T- -G- --
Mutáció II: Kémiai reagensek indukálta mutációk Salétromossav magyarázat: mutáció indukált mutáció: -A- -T- -A- -T- -A- -A- -T- -Tszülő gyerek unoka -*- -- -A- -T- -A- -T- -G- -- -A- -T- -A- -T-
A DS térszerkezete: A leggyakoribb forma a B-DS, amely jobbmenetes, a két szál antiparallel elhelyezkedésű nagyárok kisárok memo: Az A olyan mint a B-forma, csak tömörebb.
jobbmenetes α-hélix jobbmenetes α-hélix Az A-DS hélix tömzsibb és rövidebb, mint a B-DS, a főtengelyhez képest a bázispárok síkja döntött ( képest 19 o ). R -3' a sík felett -3' endo balmenetes α-hélix Az Z-DS hélix karcsúbb, főtengelyhez képest a bázispárok síkja döntött ( képest 9 o ). Az B-DS hélixben a főtengelyhez képest a bázispárok síkja merőleges ( képest 1 o ). R -2' a sík felett -2' endo
DS és RS hidrolízisének részletei: 1) Savas hidrolízis l. depurinálás (A v. G) memo: az RS és a DS kb. egyformán hidrolízál savban kérdés: a ribóz félacetálja savban felnyílik-e?
B R (RS) B B 3 R- R- memo: ezért az RS kevésbé, míg a DS jobban ellenáll a lúgos hidrolízisnek eredmény: lánchasadás 2) Lúgos hidrolízis (az RS lúgos hidrolízise):
DS szilárdfázisú szintézise: észter kötés kialakítása (egy S reakció foszfor centrumon) Védőcsoportok I: a bázisok védelme permanens csoportokkal él a primer aminok védelme, avagy a nukleofil csoportok álcázása, hogy a kapcsolásnál az 5 legyen már csak az egyetlen u. A G Rib Rib 4 -benzoilezés Rib 6 -benzoilezés vagy 2 -izobutiril 3 4 -acetilezés Rib T 3 nem kell védeni Rib
Védőcsoportok II: a foszfodiészter védelme permanens csoporttal B cianoetilészter formában E B Mindkét típusú permanens védőcsoport eltávolítható: memo: a szintézis végén az összes állandó védőcsoportot vizes ammóniával kvantitatíve eltávolítható vizes 3 -val
Védőcsoport: az 5 - csoport ideiglenes védelme Dmtr Me Me (enyhén savas rendszer) B 2 l 2 + 3% l 3 - Me B narancs szín Me
Szilárd hordozó: G (controlled pore glass) kontrolált pórusú üveg -kémiailag inert -nem duzzad -amino funkcionalizált G Me Si ( 2 ) n 2 Me Linker : l. borostyánkősav 2 ( 2 ) n Me Si 3 / 2 hasító hely Me G 2
DS szintézis: -szilárdfázisú szintézis 3 -től 5 irányba a aruthers -módszer Dmtr B 1 memo: a bioszintézis iránya 5 -től 3 irányba 1. Dmtr hasítás (dimetoxi-tritil) ( 2 ) n Me Si Me G 2. Aktiválás és kapcsolás B 1 enyhe savas detritilezés (3% TA) ( 2 ) n Me Si Me G
2. Aktiválás és kapcsolás B 1 memo: a bioszintézis iránya 5 -től 3 irányba ( 2 ) n Me Si Me G Dmtr foszforamidit B 2 E Me + S (5' S reakciója) tetrazol (gyenge sav)
3. Lánczárás (az elreagálatlan 5 --t acetilezzük) 4. xidálás I 2 ( 2 vagy TF) Dmtr iklus végén 4 -val: - minden permanens védőcsoport eltávolítása - gyantáról való lehasítás Legvégén: kromatográfiás tisztítás E B 2 B 1 ( 2 ) n Me Si G Me
Összefoglalás: oligonukleotidok laboratóriumi szintézisére Foszforamidit kapcsolási módszer DMTr B 3 R B 2 G B 1 DMTr R i r 2 tetrazol B 3 1. lépés Kapcsolás R R B 2 G B 1 B 1,B 2,B 3 : védett bázisok R: 2 2 β-cianoetil egy savra stabil, de bázisra érzékeny védõcsoport DMTr : tetrazol: G: "controlled pore glass" (porózus üveg) dimetoxitritil egy savra érzékeny védõcsoport
DMTr B 3 B 3 R B 2 R B 2 I 2 R B 1 A R B 1 2. lépés xidáció G 3. lépés Védõcsoport eltávolítása G 1., 2. és 3. lépés ismétlése 4 hasítás a szilárd hordozóról, a foszfát-észterek és a bázisok védõcsoportjainak egyidejû eltávolítása szintetikus uligonukleotid olimeráz láncreakció (R) egyszerű és hatékony módszer a DS-molekulák számának növelésére
Ízelítő a nukleotidok és nukleozidok laboratóriumi szintéziséből: 1) ilbert-johnson-nukleozid szintézisből -Bz: BSA: Si Si benzoilcsoport,-bisz(trimetilszilil)acetamid nukleofil - ill.-atomok szililezõ reagense
2) Ribozilaminhoz kapcsolás A reakció javasolt mechanizmusa: Bz 2 Bz Bz 2,3,5-tri--benzoil- -D-ribofuranózilamin + Michael addíció Et Et Et -etoxi--etoxikarbonil-akrilamid Rib Et gyûrûzáródás -Et Et Rib Et limináció -Et Rib Bz Bz benzoilcsoporttal védett uridin
l 3) Szubsztituált purinszármazékok továbbalakítása: 3 2 S 2 / i 2 S R R R adenozin R: β-d-ribofuranozil
4) Foszforilezés: dibenzil-foszfokloridáttal l 2 2 rvosi alkalmazások S 6-merkapto-purin Gyerekeknél akut leukémia kezelésére 80%-os gyógyulás allopurinol köszvény kezelésére 2 dibenzil-foszfokloridát aciklovir erpes virus kezelésére 2 -atom hiányzik a ribózból
A DS replikációja A genetikai kód megkettőződése: A kettőshélix az egyik vége felől letekeredik, majd a templátok mentén kialakulnak a komplemnter szálak.