6. Előadás Oligonukleotidok szintézise, koenzimek, vitaminok

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "6. Előadás Oligonukleotidok szintézise, koenzimek, vitaminok"

Tibor Mészáros
5 évvel ezelőtt
Látták:

1 6. Előadás ligonukleotidok szintézise, koenzimek, vitaminok

2 ligonukleotidok szintézise Elv: ( ) 1. Kondenzáció 3 5 ( ) (3 ) 2. Vízmentes közeg 3. Védőcsoportok Módszerek 1. Karbodiimid módszer, oldatban (1955) Tood (obel díj 1957), Khorana (obel díj 1975) Kapcsoló szer: DCC/iridin 8-12 tagszám 2. Foszfit módszer, szilárd hordozón Beaucage, Caruthers; (1981) (Merrifield obel dij, 1984)

3 1. Szintézis oldatban Kapcsoló szer: Védőcsoportok: DCC/iridin acetil, tritil 1. lépés: Védett komponensek kapcsolása C Sir Alexander R. Todd ( ) -acetil (Ac) C 6 4 C Tritil (Tr) C C, diciklohexil-karbodiimid (DCC) -acetil (Ac)

4 2. lépés: A védőcsoportok eltávolítása Tr Ac A Ac C 1. Lúg 2. Sav (80% Ac) A C Ac Lúg Tr A C + T Ac 3. lépés: Láncnövekedés

5 Megjegyzések: (alkalmas a ribooligonukleotid sorban is) Védőcsoportok MMTr A Bz 2 Bz védelem (MMTr) védelem (Bz) C Me C MMTr = monometoxi-tritil

6 2. Szintézis szilárd fázison Foszfit módszer Beaucage, Caruthers (1981) 2.1 Szilárd hordozó: szilika, üveggyöngy, műanyag, cellulóz, papir 3-aminopropanol szilika Si szilika Si (C2) borostyánkősavanhidrid 2. védett nukleotid savérzékeny DMTr Bz A 2 szilika Si (C2)3 C (C2)2 C bázis érzékeny + Bz A szilika Si (C2)3 C (C2)2 C + DMTr + l= 498 nm (karbokation)

7 2.2 Védőcsoportok DMTr + DMTr A Bz 2 Si (C 2 ) 3 C (C 2 ) 2 C C + szilika 2 C C benzoil -6-benzoil adenin [A Bz ] -4-benzoli citozin [C Bz ] 4,4 -dimetoxitritil (DMtr) -2-isobutil guanin [G IBu ] a) C 3 - b) b-c-c 2 -C 2 - (b-cianoetil) C izopropioil, diizopropil

8 2.3 Aktiválás A DMTr 3C A DMTr 3C tetrazol Bz Bz diizopropil foszforamidát 2.4 Kapcsolás A DMTr 3C Bz G Szilika IBu A DMTr 3C G Szilika IBu Bz + tetrazol

9 2.5 xidáció: foszforos sav (foszfonsav) foszforsav DMTr A Bz DMTr A Bz I 2, 2 3C G IBu kollidin* 1 3 G IBu Szilika 2 Szilika *trimetil-piridin 2.6 asítás 1. C 3 eltávolítása (tiofenol) helyette 2. ligonukleotid lehasítása a (szilika) hordozóról ( 3 ) 3. ukleozid bázis védőcsoport (Bz, i Bu) eltávolítása ( 4 + hő) 2.7 Tisztítás LC Elektroforézis

10 Foszforsavak R R2 R1 R R monoészter foszfodiészter - lineáris - ciklusos >300 o C metafoszforsav difoszforsav 160 o C foszforsav (ortofoszforsav) trifoszforsav difoszforsav-észter trifoszforsav-észter

11 hosphoramidite chemistry bázis 2 bázis 1 Kezdés bázis 1 bázis 2 bázis 1 Következő ciklus bázis 2 bázis 1 Sapkázás (capping): reakció ecetsavanhidriddel, a szabad acetilezése bázis 1 dna-oligonucleotide-synthesis.html

12 DS/oligonukleotid szintetizátor

13 DS/oligonukleotid chip (csip)

14 Koenzimek, vitaminok

15 Koenzimek Enzim = apoenzim (fehérje) + koenzim (nem-fehérje) Szubsztrátspecifitás Reakciótípus Típusai ukleotid Fémion (példa) Egyéb Fe (citokróm oxidáz) AD Cu (aszkorbinsav oxidáz) B1 FAD Zn (alkohol dehidrogenáz) B6 AT Mn (hisztidin ammónia-liáz) B12 Koenzim A Co (glutamát mutáz) folsav i (ureáz) pantoténsav Mo (xantin oxidáz) biotin V (nitrát reduktáz) Koenzim Q Se (glutation peroxidáz)

16 ukleotid koenzimek 1. Adenozin mono-, di- és trifoszfát felfedezés: Lohmann, Fiske (1929) észterkötés D-ribóz b--glikozid Adenozin-monofoszfát (AM) 2 ciklusos AM AT AD foszforsav D = -31 kj/mol

17 2. AD/AD: oxidáció 2 5 nikotinamid D-ribóz 2 5 adenin élda: nikotinamid-adenin-dinukleotid (AD + ) C 3 -C AD enzim C 3 -C + AD + AD = alkohol dehidrogenáz acetaldehid AD Mechanizmus e R R AD + AD

18 3. FAD/FAD 2 : oxidáció oxidált /enzimkötődés/ redukált Flavin-adenin-dinukleotid (FAD) Flavus (latin), sárga

19 4. Koenzim-A (CoA) felfedezés: Lipmann, 1946 adenozin-3,5 -difoszfát észter kötés 5 észter kötés 3 savamid kötés 2,4-dihidroxi-3,3- dimetil-vajsav b-alanin ciszteamin pantoténsav (vitamin) savamid kötés S-acetil koenzim-a (Ac-CoA) - (C 2 ) 2 - S - (C 2 ) 2 - S C C 3

20 VITAMIK 1912: vitamin = vita amines (Casimir Funk) Kis mennyiségben kívülről kell felvenni. em vitaminok: esszenciális aminosavak esszenciális zsírsavak rovitaminok Antropocentrikus pl. C-vitamin: ember (tengeri malac) igen patkány nem p-amino-benzoesav: baktérium igen ember nem Kémiai szerkezet: heterogén Felosztás (oldékonyság alapján) Vízoldékony Zsírban oldódó B, C, és vitaminok A, D, E és K vitaminok - koenzimek is - bélből szívódnak fel - felesleg kiürül - májban raktározódnak 1958: féle vitamin

21 B1 vitamin (tiamin) szerkezet 1934, szintézis 1936 Beriberi piroszőlősav nem bomlik le pirimidin tiazol észter kötés - - 3C 2 + tiamin S C2C2 AT 3C C2C2 tiamin-pirofoszfát (koenzim) S 1 piroszőlősav: + 3C C piroszőlősav-dekarboxiláz C2C2-3C S C 3C aktív piruvát brit tengerészek (1747) Ch. Eijkman (1897), F. G. opkins [orvosi obel-díj (1929)] C. Funk vita amin (1912)

B 2 -vitamin (riboflavin) (1900-1967) for his work on carotenoids and vitamins obel-díj, 1938 izolálás: Richard Kuhn (1933), 4500 liter tejsavóból 1g (természetben 1-foszfát-észter) D-ribóz

22 B 2 -vitamin (riboflavin) ( ) for his work on carotenoids and vitamins obel-díj, 1938 izolálás: Richard Kuhn (1933), 4500 liter tejsavóból 1g (természetben 1-foszfát-észter) D-ribóz bőrbántalom növekedés 3C 3C Izo-alloxazin váz 1,3,5,8-tetraazanaftalin (pteridin) B 6 -vitamin (piridoxál, piridoxin) izolálás: Euler (1937) C C2 C C C 3C piridoxál (- C) piridoxin (- ) Bőrbántalmak, élesztő 5 -foszfát - észter (koenzim)

23 rof. D. odgkin, ational ortrait Galery, London

24 B 12 -vitamin (kobalamin) korrinváz C - vagy - vagy 2 0 5,6-dimetilbenzimidazol Szerkezet: D. odgkin, xford, obel díj, 1964 (penicillin is)

25 Folsav (pteroil-glutaminsav) izolálás: eterson (1940) vérszegénység (anémia, leukopénia) p-amino-benzoesav 2 pteridin glutaminsav C 7 5-formil-5,6,7,8-tetrahidrofolsav, folinsav (koenzim) methotrexat 2 2 C 3

26 ikotinsav(niacin)/ B 3 vitamin és a nikotinsavamid hiánya: pellagra (pelle agra = durva bőr) nikotinsavamid 2 niacin AD + (koenzim) Koleszterin szint szabályozó (?) antoténsav/b 5 vitamin 3C pantothen (πάντοθεν): mindenfelől koenzim A élesztő b-alanin a,g - dihidroxi b,b- dimetil-vajsav Roger J. Williams 1933 stressz ellenes vitamin

27 -vitamin (biotin) izolálás: Kögl (1936) 2800 kg tojássárgája 390 mg 1 tojás 50 g, ebből 17 g sárgája 390 mg = db tojás imidazolidin * * * tetrahidrotiofén Avidin biotin K d = C-vitamin (L-aszkorbinsav) felfedezés: 1928 izolálás: Szentgyörgyi A. (1932) skorbut keto-L-gulonsav g-laktám = 6 1 C 2 L-aszkorbinsav)

Mitchell, 1961 (obel díj, kémia, 1978) for his contribution to the understanding of biological energy transfer

28 Koenzim-Q (ubikinon, CoQ) (eukarióta sejtekben, mitokondriumok) szemikinon (Izoprén egységek) ubikinon Koenzim Q 4, n = 4 Koenzim Q 9, n = 9 Koenzim Q 10, n = 10 ubikinol eter D. Mitchell, 1961 (obel díj, kémia, 1978) for his contribution to the understanding of biological energy transfer through the formulation of the chemiosmotic theory". Később: elektrontranszport lánc koncepció CoQ10 protonvonzó

29 C 3 A-vitamin C 2 =C-C=C 2 provitamin: b-karotin Kuhn, 1931 halak májából növekedési A vitamin világos sárga olaj fp.: 136 C (vákuum) A 1 = retinol A 2 = dehidroretinol faktor, farkasvakság all-transz retinal 0,5-1 mg/nap cisz-retinal 1 E = 0,6 mg 2 -protein opszin rodopszin hn -protein -protein 2 2 -protein +

30 2 3 1 A 4 R B 6 19 R C R D 3C 7-dehidrokoleszterin 20 Állati eredetű élelmiszerek alolaj, máj, tojás, tejtermék D-vitaminok napfény hn l = nm 3C C2 D 3 -vitamin (kolekalciferol) op.: C 3C 3C hn 3C C2 ergoszterol övényi eredetű élelmiszerek Sörélesztő, gombák D 2 -vitamin op.: C (ergo)kalciferol 1 E = 0,025 mg Szerepe: Ca 2+ - és foszfát felszívódás, csontképződés sziv- és érrendszer védelme, immunhiányos állapot, osztódás iánya: angolkór (rickets), csontritkulás, csontosodási zavar ipervitamiózis: Csontszövet Ca2+- lerakódás, vesekőképződés

31 E-vitamin (tokoferol) τόκος [tókos], φέρειν [phérein] = születés, hordozni izolálás 1936 felfedezés 1927 szintézis 1938 R3 R2 7 3C 5 R1 kromán váz C16 lánc halványsárga olaj R 1 =R 2 =R 3 =C 3 R 1 =R 3 =C 3, R 2 = R 2 =R 3 =C 3, R 1 = a-tokoferol (5,7,8-trimetil) b-tokoferol (5,8-dimetil) g-tokoferol (7,8-dimetil) Előfordulás: növényi olajok, napraforgó, oliva, tökmag hús, máj, tojás, tejtermék Szerepe: antioxidáns, gyulladásgátló iánya: vérszegénység, izomsorvadás, meddőség (embernél ritka) ipervitamiózis: Csontszövet Ca2+- lerakódás, vesekőképződés E-vitamin (tokotrienol) R3 R2 3C R1 antisterilitás (patkány)

32 K 1 -vitamin (fillokinon) sárga olaj C naftokinon fitil-csoport 2-metil-3-fitil-1,4-naftokinon Előfordulás: spenót, káposztafélék, saláta, brokkoli tejtermék, máj Szerepe: antioxidáns, gyulladásgátló, koaguláció iánya: vérzékenység (a koaguláció hiánya miatt) Bomlás: fény, hő (100 o C felett)

Hasonló dokumentumok

P O O O. OAc A O. OAc

P O O O. OAc A O. OAc 6. Előadás ligonukleotidok szintézise, koenzimek, vitaminok ligonukleotidok szintézise Elv: ( ) 1. Kondenzáció ( ) 5 - + (3 ) 2. Vízmentes közeg 3. Védőcsoportok Módszerek 1. Karbodiimid módszer, oldatban