SALMONELLA SSP. GYORS, MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI MÓDSZEREKKEL TÖRTÉNŐ DETEKTÁLÁSA Nyirő-Fekete B., Tabajdi-Bajza N., Kovácsné Kis É., Pocklán E., Zoller L., Micsinai A., Gasparikné Reichardt J. Hungalimentaria 2015.04.22-23.
BEVEZETÉS élelmiszerekben és takarmányokban előforduló patogén mikroorganizmusok idő- és munkaigényes klasszikus eljárások igény a biztonságos, de gyorsabb, pontosabb kórokozók kimutatásárára számos új, gyors eljárás (BAX, Microseq ABI valamint legújabban a 3M Molecular Detection System készülék) Cél: - a 3M új elven működő, izotermális rendszer PCR rendszerek - készülékek kimutatási határ értékei - mesterségesen beoltott kísérő mikroflóra hatása - a kémiai fertőtlenítőszerek maradványainak hatása - teljesen vagy részlegesen inhibíciót adó minták vizsgálata
BEVEZETÉS A 3M Molecular Detection System (MDS) és a PCR összehasonlítása: 3M izotermális DNS amplifikáció PCR (polimeráz lánc reakció) Enzim Bst DNS polimeráz Taq DNS polimeráz Primerek száma 6 (+) 2 DNS denaturáció állandó hőmérséklet hő Reakció hőmérséklete izotermikus (60 C) ciklikusan ismétlődő fűtés és hűtés: DNS denaturáció (94 C) és enzimatikus DNS replikáció (55 C majd 72 C) Amplifikáció folyamatos ciklikus Detekció biolmineszencia fluoreszencia
3M MDS elve LAMP PCR loop mediated isothermal amplification Folyamatos amplifikáció izotermális körülmények között gyorsabb futás Bonyolult rendszer: 6 primer 8 célszakasz specifikusság növelése Bst DNS polimeráz letolja az előzőleg képződött szálat a komplementer szálról Robosztus: PCR inhibitorokra kevésbé érzékeny 1 2 3 1 2 3 2 3 3 2 3c 4 4c 3c 5 2c 3 4 5c 4 5 6 5c 4 4 5 6 1c 2c 3c 4c 5c 6c 4 1 2 3 4 5 6 1 1c 2c 3c 4c 5c 1 3 2 1c 2c 3c 1c 2c 3c 4c 5c 4c 2 3 4 5 6 3c 4 3 4c 4 5c 6c 6c 6c 4c 5 3 4c 5c 4 2c 3c 4 5 4c 2c 3c 4 5c
3M MDS elve
BEVEZETÉS A hagyományos Salmonella vizsgálat időigénye ISO Hagyományos vizsgálati módszer Elődúsítás 16-20 h Szelektív dúsítás 20-48 h Szelektív agar 48-72 h Biokémiai reakciók, Megerősítő vizsgálatok 72 h- 1. nap 2. nap 3. nap 4-7. nap
Minta előkészítési eljárások PCR eljárás BAX PCR eljárás ABI előkészítés/dúsítás (25g/225ml BPW) előkészítés/dúsítás (25g/225ml BPW) inkubáció 37 C 18-24±2 óra inkubáció 37 C 18-24±2 óra 3M Molecular Detection System eljárás-mds előkészítés/dúsítás (25g/225ml BPW) inkubáció 37 C 18-24±2 óra utódúsítás: BHI levesben (37 C, 3 óra) lízis reagens előkészítése lízis reakció: 37 C 20perc 95 C 10perc/hűtési idő 5perc 50 µl lizált minta Értékelés: program (automatizált) kapacitás: 96 minta detekciós idő: 3,5 óra centrifugálás majd felülúszó eltávolítása homogenizálás lízis reakció: 100 C, 10 perc homogenizálás centrifugálás DNS higítás 30 µl lizált minta Értékelés: program (automatizált) kapacitás: 96 minta detekciós idő: kb. 80 perc minta közvetlenül a lízis csőbe forgatás: 3-5X hőkezelés: 100 C-15perc hűtés 10 perc forgatás: 3-5X vízszintes mozgatás: 3X állni hagyni (5 perc) 20 µl lizált minta (liofilizált pelletet tartalmazó reagens cső) amplifikáció és detekció 15-75 percben Színkódolt valós idejű (real-time) eredmény. kapacitás: 96 minta
VIZSGÁLT MINTÁK Korábbi vizsgálatokban teljesen vagy részlegesen inhibíciót adó minták előkészített húsok fűszerek kakaópor sötét, színes gyümölcsök (valamilyen erős festékanyag) tejpor kávé aroma kémiai fertőtlenítőszerek maradványai stb. Fals pozitív előkészített húsok, nyers húsok fals pozitivitás ----holt sejtek kimutatása ---- higiéniai indikátor! kiszűrés: elődúsítás nélküli vizsgálat Enterobaktériumok (pl. Citrobacter spp.)
EREDMÉNYEK A módszerek érzékenysége/kimutatási határa EREDMÉNYEK (pozitív/negatív) Hígitási tagok BAX ABI MDS EREDMÉNYEK Hagyományos tenyésztéssel hígítási sor elődúsítás nélkül Salmonella tranoroa *10-8 - 0 *10-7 - 7 *10-6 - 50 *10-5 - 456 *10-4 + - + SZÁMLÁLHATATLAN *10-3 SZÁMLÁLHATATLAN *10-2 SZÁMLÁLHATATLAN *10-1 SZÁMLÁLHATATLAN vizsgálat: protokollok alapján MDS kimutatási határ: ~10 3 kópia/reakció
EREDMÉNYEK Salmonella tranoroa kimutatása Citrobacter freundii baktérium jelenlétében EREDMÉNYEK (pozitív/negatív) BAX ABI MDS kontroll - Salmonella (~10 2 ) Citrobacter (~10 3 ) Salmonella (~10 2 ) Citrobacter (~10 4 ) Salmonella (~10 2 ) Citrobacter (~10 5 ) Salmonella (~10 2 ) Citrobacter (~10 5 ) - ferde agar tenyészetekszuszpenzió 1:1 arány mátrix: darált sertéshús 25 g minta+225 ml előmelegített pufferelt peptonvíz - dúsítás (ISO), 37±1 C, 24 h vizsgálat: protokollok alapján 3 párhuzamos vizsgálat Nincs zavaró hatás
EREDMÉNYEK EREDMÉNYEK (pozitív/negatív) FERTŐTLENÍTŐSZER MDS BAX ABI Fertőtlenítőszer1 - Fertőtlenítöszer2 - Fertőtlenítöszer3 - Fertőtlenítöszer4? INH Fertőtlenítöszer5 - Fertőtlenítöszer6 - Fertőtlenítöszer7 - Fertőtlenítöszer8 - Fertőtlenítöszer9 - Steril alkohol - Fertőtlenítőszer1 + Salmonella (~10 7 ) Fertőtlenítőszer2 + Salmonella (~10 7 ) Fertőtlenítőszer3 + Salmonella (~10 7 ) Fertőtlenítőszer4 + Salmonella (~10 7 ) Fertőtlenítőszer5+ Salmonella (~10 7 ) Fertőtlenítőszer6+ Salmonella (~10 7 ) Fertőtlenítőszer7+ Salmonella (~10 7 ) Fertőtlenítőszer8 + Salmonella (~10 7 ) Fertőtlenítőszer9+ Salmonella (~10 7 ) Steril alkohol + Salmonella (~10 7 ) Befolyásolják-e kémiai fertőtlenítőszerek a S. tranoroa detektálhatóságát környezeti higiéniai minták esetében? 9 ml BPW (ISO) 1 ml ~10 7 Salmonella tranoroa szuszpenzió 1 ml 3%-os fertőtlenítőszer oldat dúsítás előmelegített pufferelt peptonvízben (ISO), 37±1 C, 24 h vizsgálat: protokollok alapján Nincs zavaró hatás
EREDMÉNYEK EREDMÉNYEK (pozitív/negatív) MINTA MEGNEVEZÉSE MDS BAX ABI egész szegfűszeg gyümölcsös teafű őrölt fűszerkömény kakaópor tejpor őrölt pörkölt kávé spenótpor fűszer paprika? INH? INH -? INH -? INH? INH? INH? INH? INH - - - -? INH? INH? INH? INH - - EREDMÉNYEK (pozitív/negatív) MINTA MEGNEVEZÉSE MDS BAX ABI paprika aroma dió szójaliszt karotin egész fahéj flavonoidok balzsam ecet - -? INH? INH -? INH -? INH - -? INH? INH -? INH - - -? INH - - Inhibitorokat tartalmazó minták vizsgálata 25 g minta+225 ml előmelegített pufferelt peptonvíz- dúsítás (ISO), 37±1 C, 24 h 60 vizsgált minta (abszolút negatív) 40 minta: negatív 20 minta: inhibíció MDS, BAX kíválóan teljesített
EREDMÉNYEK S. tranoroa-val kontaminált inhibitoros minták vizsgálata EREDMÉNYEK (pozitív/negatív) MINTA MEGNEVEZÉSE MDS BAX ABI egész szegfűszeg őrölt fűszerkömény kakaópor tejpor őrölt pörkölt kávé spenótpor? INH? INH EREDMÉNYEK (pozitív/negatív) MINTA MEGNEVEZÉSE MDS BAX ABI fűszerpaprika paprika aroma? INH? INH dió szója liszt karotin -? -? egész fahéj flavonoidok balzsam ecet minta + ~10 3 nagyságrendű Salmonella tranoroa 54 vizsgált minta (abszolút pozitív) 11 minta: fals negatív 30 minta: pozitív 13 minta: inhibíció
EREDMÉNYEK Salmonella spp. jelenlétének vizsgálata BAX és MDS készülékekkel valós takarmány és környezet higiéniai mintákban Összesen vizsgált minták száma: 184 BAX valamennyi minta negatív MDS 2 inhibíció/kérdéses: száraz takarmányminta 2 inhibíció/kérdéses: környezet higiéniai minta 3 pozitív: környezet higiéniai minta (nem tipikus pozitív MDS görbe)
Konklúzió 1. A 3M Molecular Detection System és a BAX rendszerrel történt vizsgálatok hasonló eredményt adtak a kimutatási határ meghatározása során. Ez az ABI eljárásnál egy nagyságrenddel nagyobb volt, mint az előbb említett két másik módszernél. 2. Mindhárom eljárás hasonlóan viselkedett a kísérő mikroflóra jelenlétében. A protokoll szerint elvégezett vizsgálatok alapján a Salmonella tranoroa detektálását a kísérő baktérium (Citrobacter freundii) nem akadályozta. 3. BAX, MDS, ABI készülékek a kémiai fertőtlenítőszerek jelenlétében is megbízható eredményt adtak. 4. MDS és BAX készülékkel az erős mátrix hatású minták esetében kiváló eredményeket kaptunk szemben az ABI módszerrel, mely több esetben is inhibíciót adott. 5. A valódi takarmány és környezet higiéniai minták vizsgálata BAX és ezzel párhuzamosan vizsgált MDS eljárással kérdéseket vetett fel. 184 mintából az MDS készülékkel elvégzett vizsgálatokból 7 kérdéses, míg ugyanezen mintákra kapott eredmény BAX eljárással valamennyi negatív volt.
Köszönöm megtisztelő figyelmüket!