Alu-inszerciós polimorfizmus saját hajszálból izolált DNS mintákbon A kisérlet 60 perces előkészitő fázisra + 2 gyakorlati alkalomra tervezett. Előkészités: hajhagymák kiszedése, sejtek lizise, előkészités DNS izolálásra (60 perc) 1. gyakorlat: DNS izolálás Micro-Spin genomiális DNS kit segitségével. PCR összeállitása specifikus Alu primérekkel. PCR futása a gyakorlatot követő éjjelen. 2. gyakorlat: PCR-al amplifikált DNS fragmentek agaróz gélen történő szétválasztása, a fragmentek láthatóvá tétele nem toxikus Gel-star festékkel. A fragmentumok eltérő hosszúsága alapján az Alu polimorfizmus értékelése a különböző egyedekben. Az Alu szekvenciák olyan ismétlődő (repetitiv) DNS szakaszok, amelyek nagy számban és szétszórva találhatók a genomban. A szétszórt ismétlődő szekvenciákat az ismétlődési egységek hossza alapján osztályozzák, a SINE (short interspersed nuclear element = rövid közbeiktatott szakasz) jellemzője az ismétlődési egységek igen nagy száma. A legismertebb SINE az Alu szekvencia (nevét a felderítésére használt Alu I restrikciós enzimről kapta) mely kb. 300 bázispár hosszú, de az evolució során már több mint 1 000 000 kópiában halmozódott fel a humán genomban és ezzel becslések szerint a genom közel 10%-át alkotja. A LINE (long interspersed nuclear element = hosszú közbeiktatott szakasz) 1,4-6,1 kilobázis hosszú, és sokkal kisebb a kópiaszáma. Mindkét típus áthelyeződésre képes elem, azaz olyan instabil DNS szakasz, transzpozon, amely képes a genomon belüli helyváltoztatásra. Ennek módja retrotranszpozíció, vagyis először egy RNS szintetizálódik az ugráló elemről, amelyről reverz transzkripcióval DNS készül, és ez épül be valahova a genomiális DNS-be, akár mutációt is okozva ezzel. Mind a SINE, mind a LINE általában nem kódoló DNS szakaszokban fordul elő (de nem feltétlenül), a kromoszómán belüli megoszlásuk eltérő. Az evolució során beépült Alu szekvenciák mintegy fosszilis leletet képeznek a genomban, legtöbb szekvencia megtalálható a megfelelő helyen a főemlősök genomjában is, de kb. 2000 beépült Alu szekvencia specifikus az emberre, utalva az időben közeli integrációra (1. ábra).
1. ábra: Az Alu elemek expanziója főemlősökben. A különböző Alu családok (J,Sx,Sg1,Y,Yb8,Yb9,Ya5a2,Yc1) szuperponálódnak a főemlősök evolúciója során. A fiatal (young) Alu alcsaládok az afrikai majmoktól történt elágazás után épültek be a humán genomba. Néhány Y alcsaládhoz tartozó Alu elem időben annyira közel épült be a humán genomba, hogy kétféle előfordulásuk lehetséges: vagy történt inszerció, vagy nem, ezért alkalmasak genomiális polimorfizmus vizsgálatra. Mya:million years ago. Bár az Alu elemek kópiaszáma millió felett van, ennek csak kevesebb mint 0,55%-a polimorf. Az Alu-inszerciós polimorfizmus analizis egyedülállóan alkalmas filogenetikai vizsgálatokra, a származás részleteinek tisztázására a populációgenetikában. Mivel az Alu inszerciós polimorfizmus elég ritka, az evoluciós idő hosszú, a retrotranszpozició sebessége jelenleg nagyon alacsony, igy elég nagy valószinüséggel mondható, hogy különböző egyedekben csak akkor található meg ugyanaz a közbeiktatott Alu szekvencia, ha az egyedeknek van közös ősük. Az afrikai majmoktól való szétválás óta a humán genomba beépült többezer Alu elem közül néhányról (igen kevés: 0,1%) ismert, hogy káros mutációt okoz, megváltoztatja bizonyos gének expresszióját és ezáltal öröklött megbetegedésekhez vezethet (2.ábra), mint pl. neurofibromatózis, mellrák, hemofilia, kolinészteráz deficiencia, komplement hiány. Más öröklött megbetegedéseket mint pl. az inzulin-rezisztens diabetesz, Lesch-Nyhan szindróma, komplement C3 deficiencia, familiáris hiperkoleszterinémia, az Alu szekvencia által mediált rekombinációval hoztak kapcsolatba.
2. ábra Alu-inszerció által indukált károsodási lehetőségek A sötétebb boxok exonokat jelölnek. A fekete nyilak már meglévő Alu elemeket mutatnak, amelyek különböző irányban épülhetnek be az intronokba. További Alu elem beépülését szürke vastag Alu nyilak jelzik, a genomra való lehetséges hatás a vékony szürke nyilak alatt. Szerencsére azonban a legtöbb egyedi Alu-inszerciós polimorfizmus teljesen ártalmatlan, meglétük a genetikai variancia alapját képezi, kapcsoltsági és fizikai térképek készitésére valamint populációs tanulmányokra alkalmazhatók. Gyakorlat leirása: (Termenként 3 munkacsoport) 1. DNS izolálás A gyakorlaton a DNS izolálása az E.Z.N.A micro-spin genomic kit felhasználásával (Omega- Biotek) történik. A kit genomiális DNS izolálására alkalmas, különösen abban az esetben, amikor a minta csak igen kis mennyiségben áll rendelkezésre, mint pl. hajszál, vérnyomok, cigaretta csikk, körömdarab, nyál stb. A kit fő egysége egy szilikagél alapú nukleinsav kötő oszlop (HiBind microspin-oszlop), amely specifikusan, de reverzibilisen köti a DNS-t. Továbbá tartalmaz olyan speciális reagenseket is, amelyek a mintában található sejteket lizálják, az RNS-t enzimatikusan degradálják, hogy megelőzzék a DNS RNS-el való elszennyeződését. A microspin oszlopot alkalmazó módszer előnye, hogy az oszlop nagyon hatékonyan köti a DNS-t, majd a gyors izolálási folyamat végén neutrális közegben eluálható a tiszta DNS. Ezzel szemben a szerves oldószerekkel extrahált DNS tartalmazhat szerves oldószer maradványokat amelyek igen toxikusak, továbbá gátolhatják az izolálást követő amplifikációt. A kitben rendelkezésre áll egy detergens (TL puffer), amely a mintában található kevés számu sejt hatékony lizisére szolgál, valamint egy hőstabil proteáz (OB proteáz) amely a mintában lévő fehérjéket bontja. A kit még további két puffert tartalmaz, amely egyrészt DNS szelektiv megkötéséhez szükséges sókoncentrációt biztositja (BL puffer), másrészt a DNS-en kivüli egyéb szennyeződések eltávolitására szogál (HB puffer), valamint egy DNS mosó folyadékot (DNS
wash puffer) és egy DNS eluáló puffert. 2. Polimeráz láncreakció (PCR) Az eluált tiszta DNS-ből specifikus primerek segitségével amplifikáljuk a kérdéses Alu polimorf szekvenciát tartalmazó génszakaszokat. Az AluYg6 alcsalád két tagját azonositjuk: az Yg6AH98-t és az Yg6AH133-t, PCR technikát alkalmazva. Az AluYg6 alcsaládnak 160 tagja van, kb.1,65 millió évvel ezelőtt épült be a humán genomba, Y: young. A polimorfizmus előfordulása mindkét kiválasztott elemnél közepes frekvenciáju, ami azt jelenti, hogy az Alu inszerció megjelenése változó volt legalább egy eddig mért populációban, ellentétben az alacsony frekvenciával, ahol nem volt polimorfizmus és a magas frekvenciával, ahol a polimorfizmus mindenkinél kimutataható. A PCR összeállitásához 2xtömény reakció keveréket használunk, amely 200μM dntp-t, 1.25 unit Taq polimerázt tartalmaz a megfelelő TRIS-HCl pufferben. Ehhez adjuk hozzá a specifikus forward és reverse primereket (10pM) valamint az izolált DNS templátot. Yg6AH98 5 primer szekvencia ( forward ): GCACCATCGATGAAATAAT 3 primer szekvencia ( reverse ): ATGGTCAGAGAGCAGACATT Yg6AH133 5 primer szekvenca ( forward ): GAAAGAATCGTATGCTGAGG 3 primer szekvencia ( reverse ): CAGACCCACTTGCTGTCTAT 3. Horizontális agaróz gélelektroforézis Az amplifikált DNS-t 1,5%-os agaróz gélen (a gélbe már előzőleg oldva van a Gel-Star DNS festék) DNS létra és pozitiv kontrolok jelenlétében megfuttatjuk, megállapitjuk a pozitiv kontrollok valamint a hajszálból származó amplifikált DNS termékek molekulasúlyát. Lehetséges PCR termékek hossza Yg6AH98 primert használva: 181bp (Alu inszert nélkül) 497bp (Alu inszerttel) Yg6AH133 primert használva: 229bp (Alu inszert nélkül) 553bp (Alu inszerttel)
Értékelés: Sikeres volt-e a PCR? A hajszálból származó amplifikált DNS termékek molekulasúlyanak megállapitása, összehasonlitása a pozitiv kontrollokkal. Kinél találunk Alu-inszerciót? Gyakorlat kivitelezése. Előkészités: - Csoportonként 1 kiválasztott emberből tépjen ki minimum 5 hajszálat ugy, hogy a hajhagyma ép, erős maradjon. - Vágja le a hajszálakat, és a hajhagymákat gyüjtse az előkészitett Eppendorf csőbe. - +300µl TL puffer, vortex, potterezés, homogenizálás, sejtek lizálása - +20µl OB proteáz - Inkubáció 60 o C-on minimum 60 percig, közben egy-kétszer vortexelve potterezve. - Számozott minták tárolása -20 o C-on, a mintákat a 1. gyakorlati héten kapja vissza 1. Gyakorlat: DNS izolálás az előző gyakorlaton előkészitett, proteázzal emésztett hajszál follikulus sejtekből: - minták gyors centrifugálása 13000 rpm-en 1 percig - + 320µl BL puffer, intenziv vortex 20 sec. - inkubáció 70 o C-on 20 percig, közben párszor vortex 10 sec-ig, centrifugálás 13 000. rpmen 5 percig, a maradék sejttörmelék eltávolitása, DNS kötődés megfelelő puffere. Pipettázza át a teljes felülúszót uj Eppendorf csőbe. - + 0,5ml etanol, intenziv vortexelés 20 sec-ig. - Állitsa össze a Micro-spin oszlopot egy előkészitett 2ml-es gyüjtőcsőbe. Pipettázzon át 600µl-t a DNS mintából az oszlopba. Centrifugálás 8000rpm-n 1 percig, a DNS kötődik, öntse ki a csőből a folyadékot és használja újra a csövet. - Ismét állitsa a Micro-spin oszlopot az Eppendorf csőbe (használt) és pipettázza át a maradék DNS mintát, ismét centrifugálás 8000 rpm-en 1 percig, tartsa meg az oszlopot
dobja el a csövet benne a folyadékkal. - Állitsa az oszlopot egy új gyüjtőcsőbe. - + 500µl HB puffer, a puffer biztositja a DNS-en kivüli anyagok eltávolitását az oszlopról. Centrifugálás 8000 rpm-en 1 percig, dobja el a folyadékot és a csövet. - Állitsa az oszlopot egy új 2ml-es csőbe és mossa a DNS-t 650ul DNS mosófolyadékkal. Centrifugálja 8000 rpm-en 1 percig, dobja el a folyadékot és tartsa meg a csövet. Mosás és centrifugálás még egyszer 650µl DNS mosófolyadékkal, dobja el a végén a folyadékot, a csövet használja újra. - Centrifugálja az üres csövet az oszlopon a DNS-el 13000 rpm-en 3 percig, membrán kiszáritása. - Állitsa az oszlopot egy uj 1,5 ml-es csőbe + 50µl előmelegitett (70 o C) eluáló puffer, inkubálás 70 o C-on 3 percig. DNS elúciója: centrifugálás 13000 rpm-en 2 percig, az elució megismétlése ugyanazzal az 50µl-el növeli az elució hatásfokát. Fontos! Inkubációs időket, térfogatokat, hőmérsékleteket valamint a centrifugálási lépések idejét, rpm-ét, csövek ujrahasználatát és eldobását pontosan be kell tartani, mivel az izolálandó DNS mennyisége igen kicsi! PCR összeállitása az eluált DNS mintákból (30µl-ben) 1.minta 2.minta 2x tömény PCR mix 15µl 15µl primer98 forward 5 - primer98 reverse 5 - primer133 forward - 5 primer133 reverse - 5 templát DNS 5 5 PCR kondiciók: kezdeti denaturáció 95 o C-on 5 percig
denaturáció 95 o C, 30 sec 45 ciklus összekapcsolódás 50 o C, (primer specifikus hőmérséklet) 1 perc szintézis 72 o C, 2 perc végső szintézis: 7 perc 2. Gyakorlat Amplifikált minták agaróz gélelektroforézise, átvilágitása, értékelése DNS festéket tartalmazó gél készitése (előkészitőben): 20ml agaróz készitéséhez 300mg agarózt oldunk elektroforézis pufferben 100 o C-on, 55-65 o C-ra való visszahütés után hozzáadunk 2µl Gel-Star DNS festéket. A Gel-Star egy fényérzékeny fluoreszcens festék, nem toxikus, amely már 10ng koncentrációban is láthatóvá teszi a DNS-t kék fény átvilágitással. A gelet kiöntés után a dermedésig sötétben hütőszekrényben kell tárolni. Mintakezelés (pozitiv kontrollok és a hajszálból amplifikált DNS minták): A filled (Alu inszertet tartalmazó) és az empty (inszertet nem tartalmazó) genotipusok megállapitásának megkönnyitése érdekében pozitiv kontrollokat is alkalmazhatunk, amelyek korábban izolált DNS mintákból származnak. Pozitiv kontrollok: Yg6AH98 empty Yg6AH98 filled Yg6AH133 empty Yg6AH133 filled 5μl minta+ 1μl 6x tömény orange mintakezelő festék. Mindhárom csoport együttesen 1 sorozat pozitiv kontrollt visz fel a gélre. Amplifikált DNS minták: 10µl minta+ 2µl 6x tömény orange mintakezelő festék. 5µl DNS létrát viszünk fel gelenként a DNS hosszúságának megállapitásához. 1 DNS létra/gél. Futtatás paraméterei: idő: 40 perc, 100mA. A futtatás ideje alatt a fényérzékeny festék miatt a futtatókádat le kell takarni. Értékelés: UV átvilágitás mellett.