I. Strukturális Genomika II. Funkcionális Genomika III. Integratív Genomika
A genomika főbb területei Strukturális (szerkezeti ) genomika Funkcionális (működési) genomika Transzkriptomika Proteomika Integratív genomika Komparatív (összehasonlító) genomika Metabolomika In silico genomika Farmakogenomika Pszichogenomika
Strukturális genomika DNS szekvenálás
DNS szekvenálás A Sanger módszer Templát: 3 Primer : 5 CCGGTAGCAACT 5 GG 3 datp + ddatp dctp dgtp dttp datp dctp + ddctp dgtp dttp datp dctp dgtp + ddgtp dttp datp dctp dgtp dttp + ddttp GGCCA GGCCATCGTTGA GGC GGCC GGCCATC GGCCATCG GGCCATCGTTG GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT n A C G T 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 A3 G T T G C T A C C5 A templát DNS-sel komplementer szekvencia
Automatizált Sanger-módszer
Nagy-volumenű, újgenerációs szekvenálási módszerek MULTIPLEX DNS SZEKVENÁLÁS Hibridizáció alapú SBH DNS szintézisen alapuló Piroszekvenálás tsms SMRT Nanopórusos technikák Második generációs szekvenátorok Harmadik generációs szekvenátorok
Hibridizáláson alapuló szekvenálás (SBH) Ismert DNS szekvenciához képest kis eltérések kimutatására SNP-analízis Microarray alapú Nem enzimatikus
DNS szintézisen alapuló szekvenálási módszerek Közös jellemzőik DNS polimeráz (enzimatikus) Fénydetekció Parallel, multiplex módszerek Piroszekvenálás tsms: valódi egymolekulás szekvenálás SMRT: egymolekulás real-time technológia
Piroszekvenálás (DNS) n + dntp DNS polimeráz (DNS) n+1 + PP i szulfuriláz luciferáz APS + PP i ATP fény dntp ATP apiráz dndp + dnmp + P i ADP + AMP + P i T/G polimorfizmus pirogramja
Valódi egymolekulás szekvenálás tsms 100-200bp-os DNS szálak szekvenálása 100 milliós nagyságrendben, egyidőben Naponta több milliárd bázis megszekvenálása
Egymolekulás real-time technológia SMRT 2013: a 100$-os genom 15 perc alatt
Nanopórusos szekvenálás ultragyors (többszáz kb (kilobázis) megszekvenálása néhány perc alatt) olcsó (a teljes genom megszekvenálásának költségeit kb 4 nagyságrenddel csökkenti) Nem enzimatikus Nem fényt, hanem áramerősséget detektál
Nanopórusos szekvenálás I. Exonukleáz szekvenálás Jelölésmentes Nem szintézis alapú Molekulánkénti szekvenálás Áramerősség detekció d=1nm Oxford Nanopore Technologies α-hemolizin nanopórus α-hemolizin nanopórus + ciklodextrin
Nanopórusos szekvenálás II.
A DNS szekvencia ismeretében lehetővé válik genetikai hátterű betegségekre való hajlam kimutatása fertőzések diagnosztikája (kórokozók azonosítása) rokonsági fok meghatározására (apasági vizsgálatok ) személyazonosítás (bűnüldözés) génváltozatok összehasonlítása törzsfák készítése biológiai folyamatok kutatása betegségek genetikai hátterének elemzése új terápiás lehetőségek felfedezése SZEMÉLYRE SZABOTT GYÓGYMÓDOK
Kromoszóma séta 1. lépés 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H Próba: A1 klónból származó inszert Pozitív jelek: A1, E7, F6 klónok E7 A1 F6 2. lépés 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H Próba:F6 klónból származó inszert Pozitív jelek: A1, B12, F6 klónok E7 A1 F6 B12
Kromoszóma séta PCR-ral 1. fragment primerek Klónok sorszáma Eredmény: az 1. és 14. klónok átfednek
Strukturális genomika GENOM - szekvencia megállapítása - mutációk felderítése - egy nukleotid eltérések (SNP) - deléció inszerció - metilációs mintázat DNS chip-ek CITOPLAZMA DNS Funkcionális genomika TRANSZKRIPTOM - gén expresszió megváltozása, - splice-variánsok kimutatása - szabályozó RNS-ek (mirns) kimutatása transzkripció SEJTMAG pre-mrns protein transzláció mrns riboszóma trns Fehérje chip-ek PROTEOM - kifejeződés - módosítások - kölcsönhatások
A DNS chip (microarray) DNS-chipen több ezer gén aktivitását nyomon tudjuk követni. Minden pont egy génre jellemző szekvenciát tartalmaz. A biológiai mintából kinyert, fluoreszcensen megjelölt RNS a gén aktivitásával arányos fluoreszcens jelet ad. -Működés alapja: DNS-DNS vagy DNS-RNS hibridizáció - Nagyszámú gén expressziós mintázatának egyidejű meghatározására szolgál. Valójában fordított Southern blot: az ismert próbák kovalens kötéssel rögzítettek az üvegfelületen. - Egy chip 6-10,000 gén vizsgálatára alkalmas. -cdns chipek -oligonukleotid chip-ek
1. Chip elkészítése: - nyomtatás kontrol 2. Szövetminták begyűjtése kezelt 3. RNS tisztítás 4. Reverz transzkripció (fluoreszcens jelölés) 5. Hibridizálás 6. Detektálás
Chipek felhasználása Fertőzések felismerése mikroorganizmusok azonosítása Rákdiagnosztika diffúz nagy B-sejtes limfóma (DLBLC) típusok megkülönbözetése alkalmas kezelés SNP-k detektálása mirns microarray különböző ráktípusokban megfigyelhető, hogy bizonyos mirns-ek alul/túlexpresszálódnak
Chipek felhasználása mikroorganizmusok azonosítása
Chipek felhasználása - rákdiagnosztika DLBLC: diffúz nagy B-sejtes limfóma (nem-hodgkin-limfóma) 2 típus: - aktivált B-sejtszerű - GC-szerű Markergének (sejttípus azonosítás) Cél: betegek génexpresszió alapján való besorolása megfelelő kezelés
SNP-k & fenotípus SNP Single Nucleotide Polymorphism Biológiai markerek Association study SNP-profilok megállapítása
SNP-k & fenotípus gén ApoE Nos2 Betegség, vagy egyéb fenotípusos jelleg Alzheimer-kór NO, malária ellen jobban ellenálló BRCA1 Alternatív splicing bizonyos ráktípusok esélye nő Mc1R Pheomelanin, eumelanin, vörös haj + midazolam rezisztencia
ApoE & Alzheimer-kór Alzheimer-kór: poligénes Apolipoprotein E 2 SNP 3 allél: E2, E3, E4 1-1 AS különbség
Nos2 Plasmodium fajok okozzák Anopheles szúnyog a vektor Nos2 gén promóterében T -> C csere Több NO a vérben - > csökken a malária esélye Kenya&Tanzánia 25%
BRCA1 BRCA1 mutáció esetén 85% esély a mellrák kialakulására ESE: exonic splicing enhancher->snp->exon nem épül be ESS: exonoc splicing silencer -> SNP -> exon beépül, nem kellene Változások: fehérje struktúrájában és funkciójában
Mc1R melanocortin 1 receptor
Fehérje chip
Fehérje chip Jelölési stratégiák 1. Direkt jelölés 2. Szendvics módszer
WGT Whole Genome Tiling új típusú microarray gének transzkripciójának vizsgálata alternatív-splicing analízise transzkripciós faktor kötő helyek, DNS metilációs helyek feltérképezése polimorfizmusok vizsgálata genotipizálás PRÓBÁK (25-60 bp) szabályosan elrendezett átfedő szeparált step : az egymást követő próbák centrumainak távolsága
WGT Whole Genome Tiling A próbák szintézise: oligonukleotid, v. PCR termék spot direkt az üveglap felületére a próbák fluoreszcensen jelölt crns-hez, vagy cdns-hez kötnek Tiling próbák fluoreszcencia intenzitás próba intenzitása transzkripciós aktivitás 30 kb-os régió
PCR - ismétlés 4.ciklus 1 kiindulási kópia Target DNS 2.ciklus 1.ciklus 3.ciklus 35 PCR ciklus Ideális reakció: 2 n kópia/ciklus Exponenciális növekedés 2 35 =34 milliárd kópia
PCR DNS-templát tartalmazza a DNS-szakasz amplifikálandó régióját 2 primer meghatározza az amplifikálandó szakasz elejét és végét DNS-polimeráz lemásolja az amplifikálandó szakaszt Nukleotidok amelyekből a DNS-polimeráz felépíti az új DNS-t Puffer biztosítja az enzim számára megfelelő kémiai környezetet
Real-Time-PCR alapja: fluoreszcencia detektálása a PCR reakció mindenegyes ciklusában REAL TIME A fluoreszcencia intenzitása arányos a PCR termék mennyiségével a reakció végén nincs szükség gél-alapú kiértékelésre analízis: szoftver alapú
Real-Time vs. End Point
RT2-PCR (reverz transzkripción alapuló Real-Time PCR) mrns expresszió vizsgálata lépések: RNS tisztítás (totál RNS, mrns; sejtből, szövetből) reverz transzkripció (RNS cdns) Real-Time PCR Fogalmak Real-Time PCR = qpcr (quantitative) RT2-PCR = qrt-pcr RT-PCR = reverz transzkripciót követő PCR
Detektálás Nem-specifikus SYBR Green Specifikus TaqMan próba
SYBR Green interkalálódó molekula (~ etidium-bromid) dsdns-hez köt (kis árok) monokróm fénnyel indukálva 530nm hullámhosszú fényt emittál a fluoreszcens jel nagysága arányos a PCR során keletkező DNS mennyiségével ssdns dsdns
TaqMan próba 20-30 bp hosszú, módosított oligonukleotid az amplifikálandó régió középső szakaszával komplementer 5 vég: fluoreszcens festék molekulával jelölt reporter (R) 3 vég: a reporter fluoreszcenciáját kioltó, nem fluoreszcens quencher (NFQ) molekulát tartalmaz a próba intakt állapotában a kioltó molekula elnyeli a reporter fluoreszcens emisszióját energiaátadás: fluoreszcens rezonancia energia transzferrel (FRET) a két molekula fizikai közelségén alapul
amplifikációhoz három oligonukleotid egyidejű bekötődése szükséges nagyfokú specificitás a termék szintézisének megkezdése után a DNS polimeráz (P) 5 -exonukleáz aktivitásának megfelelően hasítja a próbát a reporter molekula távolabb kerül a quencher molekulától a reporter molekula egyre növekvő fluoreszcens emissziójának detekciója arányos a termék exponenciálisan növekvő mennyiségével, (a minta kiindulási RNS tartalmával)
Analízis I. (melting curve) primer dimer specifikus termék
log Analízis II. (Ct: threshold cycle) plató threshold (küszöb) exponenciális fázis minták összehasonlítása az exponenciális fázisban háttér fluoreszcencia(zaj)
Real-Time PCR a gyakorlatban - SNP detektálás - allél-specifikus Real-Time PCR TaqMan próbával az egyik primer 3 - vége az SNP-re kell, hogy essen a DNS szintézis, azaz a PCR reakció működik, ha a használt primer 3 -vége az SNP-vel komplementer ebben az esetben detektálható a reporter fluoreszcenciája
fluoreszcencia Real-Time PCR a gyakorlatban - expresszió vizsgálat - kezelt-kezeletlen egészséges-beteg érzékenyebb a DNS chipeknél kevesebb minta egyidejű analízise Relatív kópiaszám meghatározás: Ct tumor ciklusszám
Összehasonlító genomika
MYH16 a gondolat szobája
FOXP2 a beszéd génje
HAR Human accelerated region
Genom és komplexitás Mus musculus Fugu sp. FAJ GÉNEK SZÁMA A. thaliana 25.000 C. elegans 19.000 F. rubripes 24.000 M. musculus 24.000 H. sapiens sapiens 24.000
Humán genom J. Craig Venter, a yachtja és a genom szekvenciája A böngészhető szekvencia külön file-ként feltöltve
Eukarióta genomok Sejtmagi, mitokondriális (és kloroplasztisz) genom Ismétlődések, mozgó genetikai elemek, stb.