Tömegspektrometriás módszerek a klinikai kémiában Szabó Eszter, Takáts Zoltán I. számú Gyermekgyógyászati Klinika, Anyagcsere Laboratórium
Intenzitás SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST Tömegspektrometria Mi az? Ionizáció Molekulák a kondenzált fázisban Töltés Tömeg Tömeganalízis Gázfázisú ionok Gázfázisú ionok Tömeg / töltés
Pozitív vagy negatív ionizáció? Pozitív ion detektálás Ha a mintának van olyan funkciós csoportja, amely kész protont felvenni (H ) pl. aminok R-NH 2 H = R-NH 3 FEHÉRJÉK vagy PEPTIDEK Negatív ion detektálás Ha a mintának van olyan funkciós csoportja, amely kész protont leadni pl. karbonsavak R-CO 2 H = R-CO 2 - alkoholok R-OH = R-O - SZACHARIDOK vagy OLIGONUKLEOTIDOK
Intenzitás SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST A tömegspektrum Egyszeres töltésű molekulaionok Kétszeres töltésű molekulaion Egyszeres töltésű adduktion Koncentráció! Izotópcsúcs Molekulatömeg! Tömeg / töltés
Tandem tömegspektrometria Első tömeganalízis Fragmentáció Második tömeganalízis A fragmentáció során keletkezett fragmens ionok m/z eloszlása szerkezeti információt hordoz, valamint alkalmas a vegyületek azonosítására is. Molekulaszerkezet felderítése Kvalitatív ill. kvantitatív analitika
Tömegspektrometria felhasználási területei Szerkezetkutatás általános szerkezetmeghatározás metabolit vizsgálatok fehérjeszekvenálás fehérjék poszttranszlációs módosításainak meghatározása Analitika Nyomnyi mennyiségben jelen levő szerves vegyületek meghatározása gyógyszerszint meghatározás anyagcseretermékek szintjének meghatározása toxikológiai alkalmazások
Tömegspektrometriásan vizsgálható minták SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST Minta elpárologtatás extrakció oldószercsere szűrés gázkromatográfia származékképzés folyadékkromatográfia elektroforézis... MS A tömegspektrometriában általában a mintaelőlészítés a szűk keresztmetszet Ha ezt tágítjuk, tágul az alkalmazhatóság köre A mintaelőkészítési eljárások minden esetben invazívak
Tömespektrométer Ionforrás Analizátor Detektor
Ionizációs módszerek I. Hagyományos technikák Vákuumban történő ionizáció Gázhalmazállapotú minta GC csatolás Elektronütköztetéses ionizáció M ionok Fragmentáció Spektrumtár alapján kvalitativ analizis lehetősége Kémiai ionizáció Csak molekulaion Molekulatömeg megállapitás MS/MS segitségével szerkezeti információ Deszorpciós technikák Kondenzált fázisú minták ionizációja Nem igényli a minták elpárologtatását Nincs keresztszennyezés! SIMS Nagy sebességű primer ionsugár Jó térbeli felbontás Gyenge érzékenység MALDI Lézer Felület ún. mátrixvegyülettel boritott Gyengébb térbeli felbontás
Hagyományos Ionizációs technikák 1. Elpárologtatás 2. Ionizáció Elektronütköztetés elektron 70 ev Fragmentáció Csak illékony molekulák Fragmentációs mintázatból azonosítás Nem illékony molekulák csak származékként, de MW < 1000!!!!
GC-MS Gázkromatográfia MS detektálással Származékképzés nélkül csak illékony és termikusan stabil anyagok Származékképzés után bármilyen kis molekula EI/CI ionizáció Nagyon jó elválasztás Alkalmazási területek Környezetanalitika Élelmiszeranalitika Lipidomika (származékképzéssel) Diagnosztika Abszolút érzékenység : fg pg tartomány Lineáris tartomány akár 5 nagyságrend EI spektrumok kvalitativ analízis lehetősége Általában bonyolult mintaelőkészítést igényel Csak illékony komponensek lehetnek a mintában Származékképzés Kromatográfia Kapilláris GC, 0,1-0,25 mm ID oszlopok
Ionizációs technikák Modern technikák Mátrix segített lézer deszorpciós ionizáció (MALDI) lézer Tetszőleges molekuláris komponens vizsgálható (vízmolekula, egész vírus) Nem kvantitatív Elsősorban kvalitatív, proteomikai analízis
MALDI-MS Matrix assisted laser desorption ionization Általában UV lézer, néha IR Mátrix általában aromás karbonsav Mintákat oldatfázisban keverjük el 1000 X 10.000 X mátrixfelesleggel Tetszőleges, a mátrix tömegénél nehezebb molekula vizsgálható Elsősorban bottom-up proteomika Nem kvantitatív Érzékenység fg pg tarományban Mintaelőkészítés automatizálható - High throughput analitics Egyéb alkalmazási területek: Intakt fehérje vizsgálat Oligoszacharid és glikopeptid vizsgálatok Oligonukleotid analízis (High throughput SNP detektálás) Kémiai képalkotás (imaging) Polimer analitika
Ionizációs módszerek II. Spray technikák Atmoszferikus nyomású ionizáció Folyadékhalmazállapotú minta LC csatolás Electrospray ionizáció Vezetőképes folyadék elektrosztatikus porlasztása Molekulaionok v. Komplexek Többszörösen töltött ionok Csak oldatban eleve ionként előforduló specieszek Sonic spray Pneumatikus porlasztás Erőteljes komplexképződés Gyenge érzékenység Atmoszferikus nyomású kémiai ionizáció Pneumatikus porlasztás Korona kisülés Spektrálisan hasonló a kémiai ionizációhoz Mérsékelten poláros, termikusan stabil vegyületek Egyéb technikák Atmoszferikus nyomású fotoionizáció Térdeszorpciós ionizáció Direkt ionizációs technikák DESI DART JeDI ASAP
Elektrospray ionizáció (ESI) Electrospray tű Csepp kialakulás Coulomb hasadás Oldószer párolgása Ion evaporáció
LC-MS HPLC elválasztás MS detektálással ESI vagy APCI ionizáció Általában kis molekulák (MW<5 kda) kvantitatív meghatározása Gyógyszeranalitika ADME TDM Proteomika Metabolomika Érzékenység : LLOQ ~ 1-10 pg általában Mintaelőkészítés SPE Oldószeres extrakció Kromatográfia: RP-HPLC (ESI, APCI) (NP-HPLC (APCI)) CE
Tömeganalizátorok SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST 3D Ion trap
Mágneses szektor analizátor B m 46 m 45 m 44 m/z = (eb 2 r 2 )/(2U) Mágnes E Gyorsítás Ionforrás ionforrás detektor
Repülési idő analizátor (TOF) Jellemzői: m/z tartomány: nincs felső határ Felbontás: ~ 20000 Tömegpontosság: ~ 3-10 ppm Szkennelés sebessége: 10 6 u/s Vákuum: 10-7 Torr Kvantitatív meghatározás: gyenge, közepes Pozitív és negatív mód Variációk: Lineáris, Reflectron, Tandem MS (Q, TOFs) 1 mv 2 eu 2
Quadrupole analizátor (Q) SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST Jellemzői: m/z tartomány: 2-4000 u Felbontás: egység Tömegpontosság: ~ /- 0.1 u Szkennelés sebessége: 4000 u/s Vákuum: 10-4 10-5 Torr Kvantitatív meghatározás: jó Pozitív és negatív mód Variációk: SingleQ, TripleQ
3D Ion csapdás analizátor SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST Jellemzői: m/z tartomány: 20-6000 u Felbontás: egység Tömegpontosság: ~ /- 0.1 u Szkennelés sebessége: 4000 u/s Vákuum: 10-3 Torr Kvantitatív meghatározás: lehetséges, nem pontos Pozitív és negatív mód
Fourier transzformációs ion ciklotron rezonancia analizátor Jellemzői: m/z tartomány: >15000 u Felbontás: nagy, 10 6 Tömegpontosság: ~ 100 ppb Szkennelés sebessége: gyors Vákuum: 10-7 -10-9 Torr Kvantitatív meghatározás: lehetséges, nem pontos Pozitív és negatív mód csapdázó elektród gerjesztő elektród detektáló elektród detektáló elektród gerjesztő elektród csapdázó elektród
Triple Quadrupole (QQQ)
Q-TOF SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST
Kvantitatív meghatározások Külső kalibráció Hígítási sor az analitból, az eredeti mátrixban A mintákkal azonos mintaelőkészítés Belső standard Kémiailag hasonló vegyület, ideálisan stabil izotóp ( 2 H, 13 C, 15 N, etc.) jelzett originális vegyület Tömegspektrométer képes szelektíven detektálni a nehéz izotóppal jelzett iont Kvantitatív meghatározásoknál mindig külső kalibráció belső standard
Tömegspektrometria klinikai kémiai alkalmazásai Gyógyszer-szintmérés Toxikológia Metabolikus komponensek meghatározása Hormonok, egyéb jelátviteli komponensek meghatározása Fehérjék azonosítása Fehérjék funkcionális és szerkezeti jellemzése
Gyógyszerszintmérés Gyógyszermolekulák mennyiségi meghatározása Szérum, vizelet, teljes vér, liquor Szűk terápiás tartomány < 1 nagyságrend Gyors metabolizmus Nagy egyéni variancia Személyreszabott orvoslás (Personalized medicine) Immunszuppresszánsok Sirolimus, Tacrolimus, Cyclosporin A Rejekció Fertőzés Tirozin kináz inhibitorok Imatinib, Dasatinib, Gefitinib Nagy dózis potenciális vese és májkárosodás
Gyógyszerszintmérés - módszertan Mintaelőkészítés Fehérjementesítés Kicsapás acetonitrillel, triklór ecetsavval, etc. Ultraszűrés 3 kda-os szűrővel SPE Lipidmentesítés (csak teljes vér esetén) Extrakció kloroformmal SPE fordított fázison Extrakció Gyakran együtt a fehérje- ill. lipidmentesítéssel Oldószeres extrakció Szilárd fázisú extrakció (fordított fázis vagy ioncsere) Oldószercsere Minta a HPLC módszernek megfelelő oldószerben kell legyen (összetétel, ph)
Gyógyszerszintmérés módszertan Gázkromatográfia tömegspektrometria Illékony vagy könnyen illékonnyá tehető gyógyszermolekulák esetén Egyes szteroidok, lipid jellegű komponensek Ritka alkalmazás, inkább doppinganalitika HPLC tömegspektrometria Általánosságban használt Lényegében bármilyen gyógyszermolekula esetében
Gyógyszerszintmérés - módszertan HPLC tömegspektrometria Általában fordított fázisú HPLC Oktadecil-szilika, oktil-szilika Gyógyszermolekulák általában alacsony polaritásúak Gradiens elúció 5% szerves oldószer - 95% szerves oldószer Metanol / víz, acetoniril / víz Illékony puffer, pl. ammónium acetát Gradiens végig kell menjen! (reziduális lipidek)
Metabolikus komponensek meghatározása Anyagcsere diagnosztika Veleszületett anyagcserebetegségek diagnosztikája Máj, ill. vesefunkció vizsgálata Kvantitatív vizsgálatok Kromatográfiával kapcsolt tömegspektrometria Általában célzott vizsgálat, pl. aminosavak meghatározása Szemi-kvantitatív vizsgálatok Közvetlen tandem tömegspektrometria Általában szűrővizsgálatok, vagy szűrővizsgálatok megerősítő vizsgálatai
In te n s ity, c p s In te n s ity, c p s aminosav profil NL (102.00): Exp 2, 0.205 to 0.482 min from Sample 90 (Sample279) of DataSET4.wiff (Turbo Spray) 8.4e4 8.0e4 7.5e4 7.0e4 6.5e4 6.0e4 5.5e4 5.0e4 4.5e4 4.0e4 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4 1.5e4 1.0e4 5000.0 146.3 162.3 172.3 150.3 174.3 186.3 188.2 191.2 acilkarnitin profil Tandem tömegspektrometriás vizsgálatok Max. 8.4e4 cps. 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 m/z, amu 228.3 222.2 173.2 160.0 212.3 238.3 158.2 189.2 176.2 244.1 134.3 192.3 227.3 Prec (85.00): Exp 1, 0.139 to 0.416 min from Sample 90 (Sample279) of DataSET4.wiff (Turbo Spray) 2.1e4 2.0e4 1.9e4 1.8e4 1.7e4 1.6e4 1.5e4 1.4e4 1.3e4 1.2e4 1.1e4 1.0e4 9000.0 8000.0 7000.0 6000.0 5000.0 4000.0 3000.0 2000.0 1000.0 202.4 205.3 218.4 227.2 260.4 263.3 311.5 347.4 437.4 Max. 2.1e4 cps. 221.3 484.6 291.4 358.3 219.3 243.6 480.3 302.0 341.3 264.5 288.3 457.9 369.5 404.4 374.4 428.4 306.4 389.7 237.1 336.7 438.9 275.4 497.7 510.5 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 m/z, amu 459.4 456.5 482.3 aminosav anyagcserezavarok fenilketonuria jávorfaszörp betegség (MSUD) tirozinémia I és II argininoszukcinát szintáz és liáz hiány homocisztinuria zsírsav oxidáció rövid szénláncú (SCAD) közép szénláncú(mcad) hosszú szénláncú hidroxiacil(lchad) nagyon hosszú szénláncú (VLCAD) többszörös (MADD vagy GAII) karnitin palmitoil transzferáz hiány I és II (CPT-I és CPT-II) karnitin transzport zavara (CT) nonketotikus hiperglicinémia ureaciklus zavarok mitokondriális defektusok 32 SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST organikus aciduriák b-ketotioláz hiány glutársav acidémia (GA-I) izovaleriánsav acidémia (IVA) metilmalonsav acidémia (MMA) propionsav acidémia (PA) 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA liáz hiány (HMG) 3-metil-krotonil-CoA karboxiláz hiány (MCC)
GC-MS módszerek 33 SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST A b u n d a n c e 1 5 0 0 0 0 0 1 4 0 0 0 0 0 1 3 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 9 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 T IC : N a g y B o g la rk a.d \ d a ta.m s mitokondriális defektusok zsírsav oxidáció aminosav anyagcsere zavarok peroxiszomális defektusok ureaciklus zavarok 2 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 T im e --> 1 0.0 01 5.0 02 0.0 02 5.0 03 0.0 03 5.0 04 0.0 04 5.0 05 0.0 05 5.0 0 trikarbonsav ciklus szteroid és koleszterin szintézis zavarok
34 SEMMELWEIS UNIVERSITY, BUDAPEST HPLC-MS módszerek Acil-karnitin kromatográfia Szérum vagy alvadásgátolt teljes vér Pentafluoro-phenacyl származékképzés Elválasztás fordított fázisú HPLC-vel, detektálás ESI-MS/MS módszerrel ~ 80 acil-karnitin kvantitatív mghatározása Aminosav kromatográfia Szérum, vizelet vagy liquor Ioncsere alapú extrakció, majd alkilálás Elválasztás fordított fázisú HPLC-vel, detektálás pozitív ion ESI-MS/MS módszerrel 24 aminosav kvantitatív meghatározása Cisztein és homocisztein meghatározása (szabad SH tart. AA) Szérum, vizelet vagy liquor Minta redukciója DTT-vel vagy TCEP-pel Elválasztás cianopropil oszlopon, detektálás pozitiv ion ESI-vel Kvantitativ meghatározási módszer
Fehérjék tömegspektrometriás vizsgálata Azonosítás Emésztés tripszinnel (Tripszin Arg és Lys után vág, tehát minden keletkező peptid tartalmaz legalább egy protonálható aminosavat) Triptikus peptidek MS és MS/MS vizsgálata Adatbázis keresés Szekvencia meghatározás Átfedő peptidfragmensek szekvenálása MS/MS módszerrel Genetikai információ felhasználása (ti. részleges aminosav szekvenciához tartozó DNS szekvencia keresése) Poszt Transzlációs Módosítások Foszforiláció, glikoziláció, etc. Ismert aminosav szekvenciájú peptidek MS és MS/MS vizsgálata Enzim assay Szubsztráttal történő inkubálás Szubsztrát vagy termék visszamérése LC-MS módszerrel
Kémiai képalkotás MS módszerrel Deszorpciós ionizációs technikák MALDI SIMS DeszorpciósESI Mikroszkópos metszetek vizsgálata Pixelenként veszünk fel spektrumot Pixel élhossza 5-50 m Elsősorban biomarker kutatás Lipid jellegű markerek Eicosanoidok Foszfolipidek Fehérjék, peptidek
Natív, illetve in-vivo vizsgálatok Probléma a műtét közbeni szövetazonosítás MS analízis szövetspekcifikus adatot szolgáltat Melyik módszer? SIMS Nagyvákuum MALDI Mátrix, lézer, geometria IR talán DESI Magas feszültség, gázáram nem kompatibilis JeDI Vízsugárvágás szórhatja a tumorsejteket
Sebészeti eszközök, mint ionforrás Diatermia Műszeres sebészeti eszközök Diatermia Lézersebészet CUSA (Vízsugárvágás) Ion források! Sebészeti CO 2 laser Vízsugár CUSA dissectron
Módszerek: Rapid Evaporative Ionization Mass Spectrometry (REIMS) Nitrogen flow Venturi air jet pump Heated capillary Tube lens Skimmer Diatermia mint ionforrás Teflon tubing p=1.5 Torr Needle cutting electrode p=1.5 10-5 Torr Szövetek gyors elpárologtatásakor keletkező aeroszol tömegspektrometriás analízisre alkalmas Sejtek és szövetek specifikus lipidtartalmát használják ki Tissue
Adatkiértékelés Főkomponens analízis (Principal Component Analysis, PCA) dimenziócsökkentésre és lineáris diszkriminancia analízis (LDA) az osztályozáshoz
Köszönöm a figyelmet!