A Legionella jelenlétének kimutatása Diagnosztikai lehetőségek Kari András Budapest 2016. 04.07.
Legionella nemzetség: aerob coccoid-pálca Gram (gyengén festődik) kataláz +, oxidáz +, hippurátot hidrulizálja tenyésztéséhez speciális igények : L- cisztein, vas (BCYE) lassan növekednek
Szabványos módszerek (Környezeti Legionella vizsgálatok) ISO 11731:1998 (Water quality-detection and enumeration of Legionella) ivóvizek, ipari és természetes vizek MSZ EN ISO 11731-2:2008 (Vízminőség. Legionella kimutatása és megszámlálása 2.rész: Közvetlen membránszűréses módszer kis baktériumszámú vizek esetén) emberi fogyasztásra és használatra szánt vizek esetében kezelt fürdővizek esetében Legionella új közegészségügyi tényező mesterséges és vizes környezetben
I. ISO 11731:1998 (Water quality-detection and enumeration of Legionella) II. Koncentrálás Közvetlen szélesztés Membránszűrőn Centrifugálással III. IV. A) Savkezelés B) Hőkezelés C) Kezelés nélkül Legionella szelektív táptalajra való szélesztés (GVPC/GVPN) 0,1 ml- 0,5 ml Legionella új közegészségügyi tényező mesterséges és vizes környezetben
MSZ EN ISO 11731-2:2008 (Vízminőség. Legionella kimutatása és megszámlálása 2.rész: Közvetlen membránszűréses módszer kis baktériumszámú vizek esetén) a legtöbb hazai laboratórium alkalmaz Legionella új közegészségügyi tényező mesterséges és vizes környezetben II. Koncentrálás: membránszűrés I. III. Savkezelés IV.
Mintafeldolgozás Vizsgálati térfogatok: Ivóvíz/használati melegvíz: 10-100 ml Fertőtlenített fürdővíz: 10-100 ml Nem fertőtlenített fürdővíz: 0,1 ml szélesztés, 10 ml szűrés Hűtőtorony, klíma kondenzvíz : 0,1-0,5 ml szélesztés, 10 ml szűrés Minta feldolgozás ideális esetben 24 h belül, de maximum 48 h! Membránfilter: fekete nitrocellulóz Savkezelés: Ph 2,2 ± 0,2 ; 5 perc öblítés foszfát pufferrel, vagy Ringer oldattal Sterilitás!
Azonosítás GVPC/GVPN szelektív Telepmorfológia: táptalaj (glicin, vancomicin hidroklorid, polimixin-b szulfát, cikloheximid/natamicin) tejfehér színű( zöld, Inkubálás : 36 ± 2 C 10 napon barna, keresztül rózsaszín) Leolvasás a 3. naptól kezdődően szabályos köralakú (sztereomikroszkóp) épszélű irizáló szél UV fény alatt sok faj kékesfehéren, sárgászölden, vörösesen autofluoreszkál
Azonosítás megerősítés: 5-5 telep levétele cisztein-auxotrófia: ciszteines BCYE (pufferolt aktív szén és élesztőkivonat táptalaj) pozitív BCYE-Cys (L-cysteint nem tartlmaz)/nutrient/véres agar negatív szerotipizálás: (Legionella latex teszt kit) szerocsoport szintű azonosítás: L. pneumophila 1 L. pneumophila 2-14 L. species
Molekuláris biológiai eljárások Polimeráz láncreakció (PCR) Egy nap alatt megbízható eredményt ad (szemben a tenyésztés 10 napjával) rt-pcr (real time, vagy kvantitatív)- nem csak kvalitatív, hanem kvantitaív infromációk is. Repetitív-PCR faj alatti genotipizálás (PFGE, SBT) In situ hibridizáció (ISH) radioaktív vagy fluoreszcens (FISH) festékkel jelölt DNS / RNS próbák.
További laboratóriumi módszerek Immunfluoreszcencia DFA (direkt immunfluorszcencia) Dot-blot immunteszt Immunenzim módszer- immunperoxidázzal való festés Klinikai minták esetében ál pozitív eredmények más baktériumokkal való keresztreakció miatt (Bordatella, Francisella ).
További laboratóriumi módszerek Antigénmeghatrozás : Radioimmunesszé ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Immunkromatográfiás membránvizsgálat Latex agglutináció Nagy szenzitivitás és specificitás Legionella szerocsoportok között keresztreakció Szerológia: MAT (mikroagglutinációs teszt) IIFT (Indirekt immunfluoreszcencia ) ELISA
Köszönöm a figyelmet! 1211 Budapest Szállító u 6. Tel.: 06-1-261-29-78, 06-70-398-33-52 biologia@kviplusz.hu