A thalamus különböző eredetű extrareticularis gátló bemeneteinek összehasonlító vizsgálata

A thalamus különböző eredetű extrareticularis gátló bemeneteinek összehasonlító vizsgálata Doktori értekezés Giber Kristóf Semmelweis Egyetem, Szentágothai János Idegtudományi Doktori Iskola Témavezető: Dr. Acsády László tudományos tanácsadó, az MTA doktora Hivatalos bírálók: Dr. Kiss József tudományos tanácsadó, MTA doktora Dr. Kisvárday Zoltán egyetemi docens, MTA doktora Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Halász Béla prof. emeritus, az MTA tagja Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Takács József tud. főmunkatárs, Ph.D. Dr. Lőw Péter tud. főmunkatárs, Ph.D. Budapest 2009

TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK...3 BEVEZETÉS...5 A THALAMUS FUNKCIONÁLIS FELOSZTÁSA...5 Felosztás a kérgi visszacsatolás alapján...5 Felosztás kimenet alapján...9 A THALAMUS GÁTLÓ BEMENETEI...12 A reticularis és az extrareticularis gátlás jellemzése és különbségei...12 Hasonlóságok két extrareticularis gátlópálya közt: Az APT és a ZI...14 A motoros és az intralamináris thalamus gátlóbemenetei...19 CÉLKITŰZÉSEK...22 ANYAG ÉS MÓDSZEREK...24 ANTEROGRÁD ROSTKÖVETÉS AZ APT-BŐL A ZI-BE, FÉNY- ÉS ELEKTRONMIKROSZKÓPOS VIZSGÁLATOKHOZ...24 A pályakövető anyag (tracer) beadása az APT-be, perfúzió...24 Preembedding immuncitokémia...25 Pre- és postembedding immuncitokémia kombinálása elektronmikroszkópiához:...26 KETTŐS RETROGRÁD PÁLYAKÖVETÉS A ZI-BŐL ÉS A PO-BÓL AZ APT-BE, FÉNY- ÉS FLUORESZCENS MIKROSZKÓPOS VIZSGÁLATOKHOZ...28 A jelölőanyag beadása a ZI-be és a Po-ba, perfúzió...28 Preembedding immuncitokémia...29 Retrográd pályakövetés és in situ hibridizációs technika kombinációja...30 ANTEROGRÁD PÁLYAKÖVETÉS A SUBSTANTIA NIGRA PARS RETICULATABÓL...31 A GLICINERG BEMENET VIZSGÁLATA...31 Retrográd pályakövetés az intralaminaris thalamusból...31 Anterográd pályakövetés a hídi magvakból...33 A glicinerg terminálisok vizsgálata...33 EREDMÉNYEK...38 AZ APT VETÍTŐSEJTJEI: RETROGRÁD PÁLYAKÖVETÉSEK...38 Az APT-thalamikus vetítősejtek parvalbumin tartalma...38 Az APT ZI-vetítő sejtjeinek parvalbumin tartalma...40 Kettős vetítő sejtek...42 A PRETECTO-INCERTALIS PÁLYA TERMINÁLISAI: ANTEROGRÁD PÁLYAKÖVETÉSEK...50 A projekció innervációs mintázata...50 Az APT-ZI boutonok GABA tartalma, ultrastruktúrális jellemzői...55 1

A NIGROTHALAMIKUS PÁLYA INNERVÁCIÓS MINTÁZATA...59 A THALAMUS GLICINERG BEMENETE...63 A glicinerg bemenet innervációs mintázata és eredete...63 A glicinerg terminálisok ultrastrukturális jellemzői...71 MEGBESZÉLÉS ÉS DISZKUSSZIÓ...77 A THALAMUS DIENCEPHALIKUS EREDETŰ EXTRARETICULARIS GÁTLÓPÁLYÁI ÖSSZEFÜGGŐ, ÁM HETEROGÉN PÁLYARENDSZERT ALKOTNAK...78 A direkt és indirekt pretecto-thalamikus pályák együttműködése nem kettősvetítő sejteken alapul..78 A pretecto-incertalis pálya serkentő és gátló komponenst is tartalmaz...79 A thalamust és a ZI-t az APT heterogén sejtpopuláció révén innerválja...82 AZ EXTRADIENCEPHALIKUS THALAMIKUS GÁTLÓPÁLYÁK HASONLÓ SZERVEZŐDÉST MUTATNAK EGYMÁSSAL ÉS A KORÁBBAN TANULMÁNYOZOTT EXTRARETICULARIS GÁTLÓPÁLYÁKKAL...84 Az innervációs mintázat szorosan összefügg a calbindin sejtek eloszlásával...84 A terminálisok és célelemeik hasonlósága...86 FUNKCIONÁLIS KÖVETKEZTETÉSEK...89 ÖSSZEFOGLALÁS...92 SUMMARY...93 IRODALOMJEGYZÉK...94 A DOLGOZAT TÉMÁJÁHOZ KAPCSOLÓDÓ SAJÁT KÖZLEMÉNYEK...108 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS...109 2

RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK LDVL n. laterodorsalis ventrolateralis thalami LDDM n. laterodorsalis dorsmedialis thalami LGN corpus geniculatum lateralis LP nucleus lateralis posterior thalami LPMC nucleus lateralis posterior thalami, pars mediocaudalis LPMR nucleus lateralis posterior thalami, pars mediorostralis MDL n. mediodorsalis lateralis thalami MG corpus geniculatum MGD corpus geniculatum pars dorsalis ml lemniscus medialis MnR medián raphe Mo5 n. motorius nervi trigemini 7n nucleus nervus facialis ABC avidin-biotinilált tormaperoxidáz komplex APT anterior pretectum BDA biotinilált dextrán amin Br bregma pont CB calbindin CL n. centrolateralis thalami CM n. centromedialis thalami cp pedunculus cerebrum DAB diaminobenzidin DABNi nikkel-intenzifikált 3,3 - diaminobenzidin DLG corpus geniculatum dorsolateralis DMTg dorsomedialis tegmentum DpMe mesencephalon mély magjai DpG colliculus superior mély szürke rétege DpMe mély középagyi mag ERT elsőrendű thalamus Eth nucleus etmoidalis FG fluoro-gold fr fasciculus retroflexus GAD 67 glutaminsav decarboxiláz 67 izotípusa GlyT2 glicin transzporter 2 izotípusa Irt n. reticularis intermedialis LD nucleus lateralis dorsalis thalami MR magasabbrendű MRT magasabbrendű thalamus NBT- BCIP 5-bromo-4-kloro-3-indolilfoszfát és Nitro blue tetrazolium klorid NeuN neuronális sejtmag ellen termelt antitest nrt nucleus reticularis thalami OPC n. paracentralis ovalis thalami OPT nucleus olivaris pretectum 3

OT nucleus tractus opticus PAG periakveduktalis szürkeállomány PC n. paracentralis thalami PF n. parafascicularis thalami PHAL phaseolus vulgaris leucoagglutinin PIL posterior intralamináris thalamikus mag PMnR paramedián raphe PnO n. pontis oralis PnC n. pontis caudalis PPTg n. tegmentalis pedunculopontis Po nucleus posterior thalami PoT posterior thalamikus magcsoport, triangularis rész PPT nucleus posterior pretectum PV parvalbumin RL Round Large típusú irányító, serkentő bouton RS Round Small típusú modulátor, serkentő bouton RtTg n. tegmentalis reticularis SC colliculus superior SG nucleus suprageniculatum thalami StA 488 Alexa 488-konjugált sztreptavidin STh Subthalamikus mag SubG nucleus subgeniculatum Ts tractus tectospinalis VL n. ventrolateralis thalami VLG VLL VPL VPM VTg ZI dzi vzi xscp corpus geniculatum ventralis lateralis lemniscus lateralis ventralis VM nucleus ventralis medialis thalami nucleus ventralis posterolateralis thalami nucleus ventralis posterior medialis thalami n. tegmantalis ventralis zona incerta zona incerta pars dorsalis zona incerta pars ventralis decussatio pedunculi superior cerebellaris 4

BEVEZETÉS A thalamus funkcionális felosztása Felosztás a kérgi visszacsatolás alapján Már a 20. század elején felismerték, hogy az agykérget a szaglás kivételével minden specifikus, a környezetre vonatkozó szenzoros és motoros információ kizárólag a thalamuson keresztül éri el (Sherman és Guillery 2006). Ennek ellenére még a kilencvenes években is sokan úgy tekintettek erre az agyterületre, mint egy egyszerű információ-közvetítő reléállomásra, amely a perifériáról a kéreg felé módosítás nélkül továbbítja az üzeneteket, és csupán finomhangoló, esetleg - alvás során - szétkapcsoló funkciója van. A thalamust azonban mintegy tízszer annyi agykérgi terminális éri el, mint amennyi primer szenzoros afferens (Sherman és Guillery 2006). A jelentős visszacsatolt serkentés már önmagában indikálja, hogy a kéreg módosítani képes saját bemenetét a thalamus révén. Az utóbbi évtizedek kutatásai egyre inkább arról tanúskodnak, hogy az említett kérgi visszacsatolás a thalamusba nem csupán azt modulálja, hogy a bejövő szenzoros információból mi jusson el hozzá és mi ne, hanem egy specifikus aktivitás-mintázatok kialakítására alkalmas komponenst is tartalmaz. Ezt a legjobban az agykéreg eredetű terminálisok kategorizációja demonstrálja. A thalamus Sherman és Guillery által javasolt felosztása (Sherman és Guillery 1998) kétféle kérgi eredetű boutont különböztet ugyanis meg. A 6. rétegi piramissejtekből érkező kisméretű, kerek vezikulákat tartalmazó ( Round Small, RS) terminálisok minden thalamikus magban jelen vannak, hatásuk azonban csupán moduláló jellegű. Erre utal, hogy a relésejtek disztális dendrit szakaszán szinaptizálnak (Wilson és mtsai 1984; Weber és mtsai 1989; Montero 1991; Erisir és mtsai 1997b; Erisir és mtsai 1997a), metabotróp receptorokat is aktiválnak (McCormick és von Krosigk 1992; Godwin és mtsai 1996; Vidnyanszky és mtsai 1996), egyetlen kisméretű szinapszist képeznek, viszont a rostok átlagos denzitását összevetve a relésejtekével 10-100 axon is konvergálhat egy-egy célneuronra (Sherman és Guillery 2006). Ezek az RS terminálisok külön-külön kis amplítúdójú, elhúzódó EPSP-t váltanak ki, tömegesen hatva pedig a membránpotenciál lassú, gradált (Reichova és Sherman 2004), mégis - a topografikus vetítést nem mutató kolinerg modulátor bemenettel 5

ellentétben fokális változtatására képesek. A modulátor bemenet által indukált lassú depolarizáció alkalmas lehet arra, hogy a relésejteket egyik tüzelési módjukból, a kevés információt továbbító ún. burst módból a precíz információátvitelt végző tónusos tüzelésbe kapcsolja. Ez a visszacsatolás a kéregből a thalamus sejtek diszkriminatív képességét növeli, vagyis azt, hogy mennyire fognak különbözni a különböző perifériás stimulusokkal kiváltott válaszaik (McClurkin és mtsai 1994). Ez a relésejtek jeldetektáló képességének modulációját teszi lehetővé. Mindez tehát ideálissá teszi a 6. rétegből eredő projekciót a thalamus információfeldolgozó módjának fokális megváltoztatásaira, például a vizuális tér figyelemmel kapcsolatos monitorozására (Sillito és mtsai 1994; Godwin és mtsai 1996; Sherman és Guillery 1998). Egy elmélet szerint nem csak a thalamikus sejtek depolarizációs állapota függhet a 6. rétegi bemenet aktivitásától, hanem nagyobb ingadozás esetén fordítva is. Elalváskor ugyanis a relésejtek nagymértékben hiperpolarizálódnak. In vitro ilyen körülmények között a 6. rétegi kis amplítúdójú EPSP-ket a velük kapcsoltan érkező reticularis eredetű- IPSP-k elnyomják, tehát az információáramlás ezen a pályán megszakad (Jones 2001, 2002). Depolarizáltabb membránpotenciálon (ami ébrenlétre jellemző) érdekes módon a 6. rétegi EPSP-k kerekednek felül. E modulátor bemenet mellett azonban létezik egy másik típusú, az 5. rétegi piramissejtektől származó cortico-thalamikus vetítés is (Sherman és Guillery 1998; Sherman 2005; Sherman és Guillery 2006). Ezek a kérgi neuronok szintén kerek vezikulákat tartalmazó, de óriásméretű ( Round Large, RL) terminálisokat képeznek (Hoogland és mtsai 1991), a relésejteken kizárólag ionotróp receptorokat aktiválnak (McCormick és von Krosigk 1992; Godwin és mtsai 1996; Reichova és Sherman 2004; Groh és mtsai 2008), és mindig a dendritek proximális szakaszát innerválják, azon számos, nagyméretű szinapszist alkotva. Ezek a terminálisok nagy amplítúdójú, gyors lefutású EPSP-t indukálnak, akár egymagukban is képesek akciós potenciál sorozatot generálni célneuronjaikban (Groh és mtsai 2008) ( irányító vagy driver bemenet), egy-egy relésejtre pedig kevés axon konvergál, ami térben és időben is precíz hatást indikál. Leírták ezen terminálisok erős rövidtávú depresszióját (Groh és mtsai 2008). Ennek eredményeképpen az in vivo elvezetett 5. rétegi spontán meglehetősen nagyfrekvenciás- tüzelésmintázatokkal való in vitro stimulációt az óriásterminálisok nem tudják folyamatosan átvinni célsejtjükre, legfeljebb időszakos szüneteket követően. 6

Több RL együttes stimulálása azonban még ilyen depresszált állapotban is képes a célsejtet kisütni. Érdekes módon tehát a kérgi irányító bemenetek aktivitása csak alacsony kérgi spontán aktivitás során végzi a kérgi jel precíz átvitelét a relésejtre, ellenkező esetben a thalamikus sejtek koincidencia-detektorként funkcionálnak (Groh és mtsai 2008). Sherman és Guillery a fenti két kérgi bemenet típus eloszlása alapján a thalamus magjait is két kategóriába sorolta (Sherman és Guillery 1998; Sherman 2005; Sherman és Guillery 2006). Az ún. elsőrendű thalamus (ERT) magokban feldolgozott és a kéreg felé továbbított információ közvetlenül a perifériáról származik, első ízben jut az agykéregbe (Sherman és Guillery 2006) (bár ez az anterior thalamikus mag esetében a corpus mammillare hippocampalis befolyásoltsága miatt nem teljesen igaz). Itt a kéregből kizárólag modulátor típusú visszacsatolás létezik. A relésejtek receptív mezői egyértelműen levezethetők a primer szenzoros vagy egyéb subcorticalis - irányító afferensek közvetítette információkból. A magasabbrendű thalamus (MRT) magokba mind modulátor, mind irányító típusú kérgi terminálisok érkeznek. A relésejtek receptív mezői itt nem egyértelműen a perifériás rostok választulajdonságait tükrözik (sőt egyes alterületeken nincs is perifériás bemenet), és feltehetőleg olyan információ is feldolgozásra kerül, amit a corticalis szinten egy (vagy több) alkalommal már keresztüljutott (Sherman és Guillery 2006). Az MRT magvak károsodása humán páciensek esetében különböző kognitív képességek zavarához vezet (Kinney és mtsai 1994; Llinás és Paré 1997; Schiff és mtsai 2002). Úgy tűnik, hogy ez a dichotomia a thalamikus szinten minden modalitás esetében megfigyelhető. Az elsőrendű látómag a corpus geniculatum lateralis dorsalis (DLG), míg a magasabbrendű magok a nucleus lateralis posterior (LP) (Vidnyanszky és mtsai 1996), lateralis dorsalis (LD) (Bourassa és Deschenes 1995) és bizonyos pulvinar területek ((Mathers 1972a, b; Ogren és Hendrickson 1979b, a; Feig és Harting 1998). A hallórendszerben a corpus geniculatum medialis (MGN) ventralis / parvocellularis része kap perifériás bemenetet, míg a dorsalis / magnocellularis régió kérgi irányítót (Ojima 1994; Bartlett és mtsai 2000). A szomatoszenzoros feldolgozásban elsőrendűek a ventralis posterior magok (VPM és VPL), magasabbrendű pedig a posterior nucleus (Po) (Hoogland és mtsai 1991; Bourassa és mtsai 1995). A mediodorsalis thalamus mag (MD) egy része a szaglóinformációt feldolgozó piriform kéregből kap LR típusú 7

irányító bemeneteket (Kuroda és mtsai 1998) valamint a prefrontális kéregből (Schwartz és mtsai 1991), és csoportunk eredményei szerint itt az elsőrendű (ismeretlen eredetű subcorticalis irányító bemenettel rendelkező) és magasabbrendű területek váltakozva helyezkednek el (Rovó Z, Acsady L, előkészületben). A motoros rendszer esetében már nem egyértelműen alkalmazható ez a felosztás: Elsőrendű magnak tekinthetjük a ventrolateralis magot (VL [főemlősökben VLp]), amely valóban subcorticalis irányító bemenetet kap a cerebellumból (Sato és mtsai 1996, 1997). A nigro- és pallido-recipiens motoros magokat (VM és VA [főemlősökben VLa]) Sherman az MRT magok közé sorolja (Sherman és Guillery 2006), mivel kapnak afferentációt a motoros kéreg 5. rétegéből (Deschenes és mtsai 1994). A kérgi boutonok azonban ebben a magban a disztális dendritet innerválják (Kultas-Ilinsky és mtsai 1997). Csoportunk előzetes eredményei alapján majomban a VA nem tartalmaz nagyméretű corticalis eredetű terminálisokat (Rovó Z, Acsády L, előkészületben). Elképzelhető tehát az is, hogy ezen a területen csupán modulátor típusú serkentő bemenet érkezik a kéregből, és az aktivitásmintázatokat döntően a bazális ganglionok által gyakorolt gátlás biztosítja. Az sem kizárt azonban, hogy az 5. rétegi terminálisok kis méretük ellenére is irányító bemenetként funkcionálnak egyéb speciális tulajdonságaik révén. Az MRT magvak közé sorolja ez az elmélet a középvonali és intralamináris magvak csoportját is (Sherman és Guillery 2006). Bizonyos intralamináris magvak - így a centrolateralis (CL) és parafascicularis (PF) mag - 5. rétegi bemenetét főként a szomatoszenzoros és motoros areákból kimutatták (Deschenes és mtsai 1994; Bourassa és mtsai 1995; Jones 2001, 2002), bár azok ultrastruktúráját egyelőre nem vizsgálták. A PF MRT magként való elkönyvelése ellen szól, hogy előzetes eredményeink szerint ezen a területen majomban nincsenek RL terminálisok (Rovó Z, Acsády L, előkészületben). Sherman és Guillery elmélete szerint a magasabbrendű thalamikus területek különböző kérgi régiók közti kommunikációt is megvalósítanak (Sherman és Guillery 2006). Ez a teória mindeddig nem nyert bizonyítást, ám a szomatoszenzoros rendszer esetében ebben áttörés várható egy még nem publikált tanulmány alapján, amelyben a posterior thalamus mag léziója vagy farmakológiai blokkolása az S1 kérgia areából indukálható S2 válasz jelentős csökkenéséhez vezet in vitro (Theyel és mtsai 2008). 8

Nem igazolódott azonban egyelőre az az elmélet, miszerint a magasabbrendű magokban különböző eredetű irányító jellegű bemenetek integrációja is folyna (Sherman és Guillery 2006). A patkány szomatoszenzoros Po magjába például mind az S1, S2, M1 és insula területek küldenek 6. rétegi rosokat, azonban 5. rétegi bemenet kizárólag az S1-ből érkezik (Veinante és mtsai 2000). Arról sincs irodalmi adat, hogy perifériás és kérgi irányító bemenet az MRT magok bármelyikében átfedne, esetleg azonos sejteket innerválna, bár csoportunk előzetes adatai szerint előbbi előfordul például a majom pulvinarban (Rovó és mtsai 2008), utóbbi pedig a patkány Po-ban (Bokor H, Plattner V, Acsády L, előkészületben). A kérgi visszacsatolás alapján történő kategorizáció tehát a thalamus magjait két rész csoportba sorolja. Érdekes módon nagyon hasonló eredményre jutott egy egészen más logika szerint építkező felosztás. Felosztás kimenet alapján Egy - főleg főemlős kutatásokon alapuló - megközelítés a thalamus területeit más szempontok szerint csoportosítja, de a két fő magcsoport hasonló területeket foglal magában: Jones ún. központ-mátrix ( core-matrix ) elmélete két immuncitokémiai marker által elkülöníthető sejtcsoport szerint osztályoz (Jones és Hendry 1989; Diamond és mtsai 1993; Jones 1998, 2001, 2002). A nagyobbméretű parvalbumin (PV) pozitív sejttípus főként a primer szenzoros, Sherman és Guillery által elsőrendűnek címkézett thalamusmagvakban található meg nagy sűrűségben, így a VPM, a VPL, a ventralis MGN, az LGN principális rétegeiben, valamint a cerebellorecipiens motoros thalamusmagban (Jones és Hendry 1989; Hashikawa és mtsai 1991; Rausell és mtsai 1992b; Jones 1998; Munkle és mtsai 2000; Jones 2001, 2002; Morel és mtsai 2005). Ezeken belül is sűrű, asszociált sejttömörüléseket, központokat ( core ) alkot, amelyek általában citokróm-oxidáz pozitívak (pl. idetartoznak a VPM barreloidjai is), és erősen topografikus felszálló pályák állomásait képzik (a lemniscalis, a direkt auditoros pálya, valamint a direkt retinális bemenet főbb komponensei). Az agykéreg középső (3. és 4.) rétegeiben is fókuszáltan elvégződő rostokat adnak a 6. rétegi kérgi neuronok dendritjeit innerválva (Hashikawa és mtsai 1991; Rausell és mtsai 1992b; Jones 2002). Mivel utóbbiak mindig ugyanabba a thalamusmagba vetítenek vissza, amelyből a bemenetet kapták, a PV 9

pozitív sejtek erősen topografikus pályák révén lokális thalamocorticalis oszcillációk létrehozására alkalmasak. Jones szerint ezeken a lokális neuronkörökön inicializálódnak a tudatos, ébrenléti aktivitással kapcsolatba hozott gamma-frekvenciás oszcillációk, amelyek azonban önmagukban nem terjednének szét a kéreg és thalamus távolabbi területeire (Jones 2001, 2002). Utóbbi funkció valószínűleg egy másik, calbindin (CB) pozitív thalamikus sejttípussal kapcsolatos. A kisebbméretű calbindin (CB) pozitív sejtek általában laza mátrixot alkotnak, csaknem minden thalamikus magban megtalálhatók kisebb-nagyobb számban, ám jelenlétük a legtöbb területen komplementaritást mutat a PV sejtekével (Hashikawa és mtsai 1991; Rausell és mtsai 1992b; Jones 2002). Ennek megfelelően arányuk legnagyobb a Sherman és Guillery által a magasabbrendűnek címkézett magvakban (Jones szerint mátrix-magok ), így a Po-ban, a dorzális MGN-ben, az LD-ben és bizonyos pulvinar területeken, az intralaminaris PC-ben (Munkle és mtsai 2000) és CLben, valamint a bazális ganglion bemenettel rendelekző motoros thalamusmagban (Jones és Hendry 1989; Jones 1998; Munkle és mtsai 2000; Jones 2001, 2002; Calzavara és mtsai 2005; Morel és mtsai 2005). Ezek a - több különböző kérgi areát is innerváló sejtek (Rausell és Jones 1991a, b; Rausell és mtsai 1992a) a felszíni (1. és 2.) rétegekben végződve az 5. rétegi piramissejtek dendritjeit is innerválják (Hashikawa és mtsai 1991; Rausell és mtsai 1992b; Jones 2001, 2002). Utóbbi kérgi sejtek pedig széleskörű intracortikális projekciójuk mellett általában szintén több különböző, főként CB-pozitív thalamikus magba vetítenek (noha egy-egy thalamus magon belül a 6. rétegi sejteknél fókuszáltabb innervációt is mutathatnak). Sőt, ezek a sejtek küldenek kollaterálisokat számos egyéb diencephalikus és agytörzsi struktúrába is (Deschenes és mtsai 1994; Bourassa és Deschenes 1995; Bourassa és mtsai 1995; Jones 2002). A thalamus mátrix-területeinek azonban nem csak kimenetei szerteágazóak. A felszálló pályák közül is a kevésbé topografikus, a szenzoros receptorokkal nem közvetlenül kapcsolódó pályák futnak ide, amelyek agytörzsi neuronjai kevésbé lokalizált receptív mezővel jellemezhetők (Hashikawa és mtsai 1991; Rausell és Jones 1991a, b; Rausell és mtsai 1992b; Jones 2001, 2002). Ilyen a spinalis trigeminalis és spinothalamikus szomatoszenzoros pálya, a tegmentális auditoros pálya vagy a superior colliculus eredetű látóbemenet. Ez a diffúz felszálló bemenetekkel és kimenetekkel rendelkező mátrix rendszer Jones teóriája szerint az azonos stimulusok által aktivált távoli 10

thalamocorticalis területek szinkron-hangolását képes végezni. Ez fontos szerepet játszhat többek között az ún. összekötés ( binding ) folyamatban. Ennek során az összetartozó (pl. azonos stimulus által különböző feldolgozási útvonalakon keresztül létrehozott), de egymástól távol keletkezett kérgi gamma-oszcillációk szinkronizálódása egységes tudatos élményt hoz létre (Jones 2002). Jones kevésbé kétféle thalamikus magtípus, mint inkább kétféle relésejt típus elkülönítésére törekszik. Elmélete szerint, bár a fenti magok inkább CB vagy inkább PV sejtek dominanciáját mutatják, mindkét komponens megtalálható a legtöbb területen. A PV és CB sejtek alapján azonban nem minden mátrix-dominált mag azonos Sherman és Guillery magasabbrendű magjaival: A magasabbrendű LP mag, az intralaminaris PF, valamint a CM és az MD nem az erősen CB-pozitív magok közé tartozik főemlős tanulmányok szerint (Jones és Hendry 1989; Jones 2001, 2002). A humán vizsgálatok ezt részben megerősítik (Morel és mtsai 1997), mások a PF, az MD és az LP területén magasabb CB-pozitivitást tüntetnek fel, amely viszont nem jár együtt a PV-sejtek kiritkulásával (Munkle és mtsai 2000). A PF státusza azonban Sherman rendszerezése szerint is bizonytalan az előző fejezetben leírtak miatt. Jones elmélete az intralamináris magokat a többi thalamusmaggal egységesen tárgyalja, és jelzi, hogy ez a terület mátrix és központ-területeket vegyesen tartalmaz, jelentős mátrix komponensére utal azonban, hogy a szomatoszenzoros és motoros kérgi areák 5. rétege számos rostot küld ide (Deschenes és mtsai 1994; Bourassa és mtsai 1995; Jones 2001, 2002). Jones fontolóra veszi azt a felvetést, hogy az általa a CBsejteknek tulajdonított szinkronizációs mechanizmusért esetleg kizárólag az intralamináris thalamus lenne felelős, tekintve kiterjedt projekcióját az agykéreg 1. rétegébe. Ezt azonban elveti, az intralamináris magvak ugyanis a kéregnek csupán behatárolt részeibe vetítenek, axonjaik nem túl kiterjedtek, sokan csak a mélyebb rétegeket innerválják, és sokuk inkább a striatumba vetít, mint a kéregbe (Jones 2002). Az, hogy a kétféle elmélet Sherman és Jones teóriája nagyobbrészt ugyanazt a két magcsoportot különíti el egymástól, annak köszönhető, hogy mindkettőben a relésejteknek az 5. illetve 6. rétegi kérgi sejtekkel való kapcsolata áll osztályozásuk középpontjában. Azonban Sherman a thalamusba beérkező információra fókuszál, míg Jones a kimeneti mintázatokból indul ki, és inkább egészében vizsgálja a thalamocorticalis körök és felszálló pályák típusait. Előbbi számára az 5. réteg eredetű 11

RL terminálisok jelenléte, míg utóbbinál a CB és PV sejtek megoszlása az anatómiai azonosító jegy. Sherman a 6. rétegi afferenseknek csupán moduláló szerepet tulajdonít, ami a primer szenzoros és 5. rétegből érkező specifikus információk figyelmi kapuzásában lehet fontos. Ezzel szemben Jones elmélete mindkét bemenetet ugyanolyan típusú információk hordozójának tekinti, azonban az egyiket lokálisan generált, a másikat távolabbi területekről érkező oszcillációk forrásának. A kétféle felosztás között kevés tanulmány igyekszik kapcsolatot teremteni, ami a különböző modellállatokban (rágcsálók, macskák, főemlősök) végzett kísérletek szegregáltságának is köszönhető. A thalamus magok két csoportjának újabb jelentős különbségeire derül fény, ha nem csupán a serkentő, hanem a gátló bemeneteiket is figyelembevesszük. Egy nemrég megismert gátlóbemenet eloszlása ugyanis a kérgi irányító bemenetét szorosan követi, ami jelen dolgozat kérdéfelvetésének alapjait is szolgáltatja. A thalamus gátló bemenetei A reticularis és az extrareticularis gátlás jellemzése és különbségei Bár a thalamusmagok csoportosítása az 5. kérgi réteggel való kapcsolatuk alapján már évtizedekkel ezelőtt felvetődött, csak az utóbbi években kutatócsoportunkban - írtak le olyan további - nevezetesen gátló - bemeneteket, amelyek a kétféle magtípust megkülönböztetik (Bokor és mtsai 2005; Barthó és mtsai 2007). A caudalis diencephalon részét képező anterior pretectumból (APT) ugyanis olyan extrareticularis gátló rostok erednek, amelyek szelektíven a magasabbrendű thalamusmagokat innerválják, az elsőrendűeket nem (Bokor és mtsai 2005). Mintha csak a kérgi 5. rétegi serkentő boutonok gátló megfelelői lennének, ezek a GABAerg óriásterminálisok (továbbiakban F3 terminálisok (Wanaverbecq és mtsai 2008)) is mindig a relésejtek proximális dendritjeit innerválják, szintén számos szinapszist képezve (Wanaverbecq és mtsai 2008). Érdekes módon az F3 terminálisok esetében még a szinapszisok egymáshoz való viszonya is sztereotíp módon alakul 3-dimenziós rekonstrukciók tanúsága szerint. Ezek ugyanis körberendeződnek a terminálisok aktív felszínének peremén. Csoportunk kimutatta, hogy ezek az axonvégződések képesek posztszinaptikus célsejtjeiket hatékonyan, GABA A -receptor mediáltan gátolni in vitro, a gátlás pedig visszacsapó tüzeléssorozatot, azaz rebound burst tüzelést indukál (Bokor 12

és mtsai 2005). Nagyfrekvenciás tüzeléssorozatokat is precízen képesek közvetíteni IPSP-sorozatok formájában (Bokor és mtsai 2005; Wanaverbecq és mtsai 2008). Az MRT magok sejtjei tehát amellett, hogy hatékonyan kisüthetők az 5. rétegi agykérgi sejtek által, tüzelésük finoman időzíthető az APT révén is. Az APT thalamikus vetítésén túl kérgi és agytörzsi összeköttetésekkel is rendelkezik. Közvetlen bemenetet kap a neocortex 5. rétegéből - a szomatoszenzoros és a vizuális areából -, az agytörzsből (Foster és mtsai 1989; Cadusseau és Roger 1991; Deschenes és mtsai 1994), és masszívan vetít a colliculus superiorba, az agytörzsbe, így a hídba, valamint a nyúltvelői szenzoros magvakba (Terenzi és mtsai 1995; Zagon és mtsai 1995). Kapcsolatai egyrészt összefüggésbe hozhatók régóta ismert szomatoszenzoros funkciójával, többek között jelentős antinociceptív és antiaverzív hatásával (Foster és mtsai 1989; Terenzi és mtsai 1995; Villarreal és mtsai 2004; Masri és mtsai 2009). Másrészt pályái alapján elképzelhető, hogy az APT közvetítésével a kérgi aktivitás hatást gyakorolhat mind a perifériás szenzoros információ további sorsára a feldolgozottság korai fázisában, mind a kéregből reciklizált információra az MRT magvak szintjén. Az APT sejtek jelentős hányadának tüzeléséről in vivo elektrofiziológiai vizsgálatok ki is mutatták az EEG-vel való szoros kapcsoltságot (Bokor és mtsai 2005). A thalamus szintjén azonban már korábban is ismertünk egy erős kérgi befolyás alatt álló GABAerg bemenetet: a nucleus reticularisból (nrt) eredő gátlást. Felvetődik, hogy miben hasonlít és miben tér el egymástól ez a két gátlópálya. Az egyik fontos különbség a két gátló mag kapcsolataiban áll. Az nrt nem kap perifériás bemenetet, kizárólag az agykéreg 6. rétegétől kap axonkollaterálisokat, és csak a thalamus szintjén fejt ki gátlást, máshova nem vetít (Montero 1983; Liu és mtsai 1995; Pinault 2004), ezáltal tehát zárt hurkot képez a kéreggel és a thalamusszal. Mint azt már jóval korábban kimutatták továbbá, az nrt valamennyi dorsalis thalamikus magba vetít (Montero 1983; Liu és mtsai 1995; Pinault 2004), projekciója nem szelektív egyik magtípusra sem. Nem válogat ez a projekció egy-egy relésejt különböző dendritikus régiói között sem, terminálisainak célelemei ugyanis random eloszlást mutatnak átmérőjük tekintetében (Wanaverbecq és mtsai 2008). A másik figyelemreméltó eltérés az extrareticularis és az nrt terminálisok között a morfológiájukban van. Az nrt ugyanis kisméretű (ún. F1 típusú) GABAerg boutonokat képez, és azok minden 13

célelemen csupán egyetlen szinapszist képeznek. Ez a gátló hatás ugyan topografikusan vetülő pályákon keresztül érvényesül, a pálya morfológiai tulajdonságainak köszönhetően azonban számos terminális együttes aktiválódása képes csak a relésejtet tüzelésre bírni, és ebből következően ez a bemenet kevéssé alkalmas gyors, precízen időzített hatás indukálására. Sherman az nrt terminálisokat a 6. rétegi kérgi RS terminálisok gátló megfelelőjének tekinti, és gátló modulátor bemenetnek nevezi (Sherman és Guillery 2006). Nem csak morfológiájában és fiziológiájában párosítható az nrt bemenet a 6. rétegi inputtal, hanem viselkedési szinten kimutatott szerepében is. Leírták, hogy a reticularis aktivitás a vizuális figyelem orientáltságával lecsökken, és ezzel párhuzamosan (illetve kis latenciával) az elsőrendű látómagban a sejtaktivitás megnő (Montero 1999; McAlonan és mtsai 2008). Az nrt és az LGN egymással negatívan korreláló figyelmi modulációját lehet a Crick által felvetett Keresőfény ( Searchlight ) hipotézis egyik beigazolásának tekinteni, amely szerint az nrt a figyelem orientálását végzi a szenzoros bemenetek között (Crick 1984; McAlonan és mtsai 2008). Ki kell emelni azonban, hogy ezt a szerepet nem elsősorban az nrt, hanem inkább a kéreg 6. réteg eredetű visszacsatolása az nrt-val közreműködve tölti be (Lásd előző fejezetben, valamint (Jones 1985; McClurkin és mtsai 1994; Godwin és mtsai 1996; Sherman és Guillery 1998; Sherman 2005; Sherman és Guillery 2006)). Az nrt figyelmi modulációja a 6. kérgi réteg léziójával ugyanis megszűnik (Montero 1999). Egy elmélet szerint a vizuális figyelem fókuszálása a V1 area 6. rétegi visszacsatolása révén megnövekedett információtranszfert eredményez az LGN egy kolumnájában, ami körül pedig a diszinaptikus cortico-nrt-thalamikus gátlása az információ-továbbítást lecsökkenti (Montero 1999). Az APT-eredetű gátlástól tehát a reticularis gátlás morfofunkcionálisan nagymértékben különbözik. Érkezik azonban a diencephalon egy másik magjából, a zona incertából (ZI) is GABAerg bemenet a thalamusba. A két extrareticularis eredetű gátlópálya, amelyek kapcsolatát munkám során is vizsgáltam, csoportunk eddigi eredményei alapján összevethető. Hasonlóságok két extrareticularis gátlópálya közt: Az APT és a ZI A ZI thalamikus projekciója az APT thalamikus vetítéséhez rendkívül hasonló tulajdonságokat mutat (Barthó és mtsai 2002). Ez a mag szintén szelektíven az MRT 14

magvakba küld óriás GABAerg terminálisokat, amelyek jellemzői megegyeznek az APT terminálisokkal. Mindkét mag modalitási szektorokra osztható (Foster és mtsai 1989; Mitrofanis 2005), projekciójuk fokális, és masszív gátlást fejtenek ki a MRT magvakra (Bokor és mtsai 2005; Lavallee és mtsai 2005). Különbség azonban, hogy a ZI a motoros kéregből is kap 5. rétegi bemenetet (Deschenes és mtsai 1994; Mitrofanis és Mikuletic 1999; Veinante és mtsai 2000). A ZI esetében az is kiderült, hogy ez a gátlás a szenzoros jelfeldolgozás korai stádiumát előrecsatolt módon befolyásolja a magasabbrendű szomatoszenzoros thalamusmagban (Po) (Lavallee és mtsai 2005). Patkányok bajusz szőrének stimulálásával ugyanis normális körülmények között nem nem váltható ki a Po sejtek megbízható sejtválasza. Ennek oka, hogy a relésejtekben kiváltott EPSP-t egy nagy ampítúdójú, stimuluskapcsolt IPSP előzi meg. Ez az IPSP altatott állatban csak a ZI lézionálásával eliminálható. A ZI kikapcsolásával a stimulálással kiváltható válasz felerősödik, megbízhatóbbá válik, és a relésejtek spontán tüzelési aktivitása is nagymértékben fokozódik (Lavallee és mtsai 2005). Ez nem csak azt bizonyítja, hogy a ZI képes lehet a periféria-kéreg irányú reléfunkció kapuzására, hanem hogy a magasabbrendű thalamusban történő információfeldolgozás folytonos alakítására is képes lehet. Amennyiben ugyanis az altatásban látott magas alapaktivitásával ébrenlét során is folytonos gátlás alatt tartja a relésejteket, egy harmadik fél például az agykéreg tetszőleges téridői mintázat szerint szüneteket vihet a ZI aktivitásba, és ezáltal finoman alaktíthatja a thalamikus aktivitásmintázatokat (Barthó és mtsai 2007). A ZI terminálisainak, mint láttuk, ideális a morfológiája egy ilyen folytonos gátlás fenntartásához. A cortico-incertális hatás pedig valóban alkalmas arra, hogy egy folytonos ZI aktivitásba csendes periódusokat vigyen. Csoportunk kimutatta ugyanis, hogy a ZI sejtek tüzelése mind a lassú (1-3 Hz), mind az epileptikus állapotra jellemző 3,5 Hz körüli aberráns kérgi oszcillációval erősen szinkronizáltan, ritmikusan alakul. Továbbá olyan körülmények közt, amikor a kéreg 5-9 Hz alaposzcillációját időszakosan gyors oszcillációs periódusok szakítják meg, a ZI sejtek tüzelése az alaposzcilláció periódusaiban 5-9 Hz frekvenciatartományban erősödik fel (Barthó és mtsai 2007). A robusztus kérgi hatás olyan cortico-incertális terminálisoknak köszönhető, amelyek több, extrém nagyméretű szinapszist képeznek a ZI sejteken. 15

Mindez egy szenzoros vagy kérgi eredetű oszcillatív stimulushoz kapcsolt kapuzómechanizmusra utal a magasabbrendű thalamusmagokban. A kéreg hatásának dominanciáját a ZI-ben megerősíti, hogy a patkány motoros kérgének stimulálása a ZI sejtjeinek bajusz-szőr stimulálásra adott válaszát szupresszálja (Urbain és Deschenes 2007). A bajusz szőrök ritmikus stimulálása során egy lassan kifejlődő így feltehetőleg kérgi oszcillációs feedback hatás fokozatos érvényesülését tükröző - modulációt a Po sejtválaszban valóban megfigyeltek (Ahissar és mtsai 2000). Mivel a leírt moduláció a VPM-ben nincs jelen, a kéreg-modulált extrareticularis gátlásnak a Pora szelektív hatásával a jelenség valószínűleg összefügg. Bármilyen szerepet nyilvánítunk azonban az incerto-thalamikus gátlás kérgi kontrolljának, valószínűleg ugyanaz elmondható a pretecto-thalamikus gátlás kapcsán is. Az APT sejtjeinek több, mint 60%-át képező sejtek ugyanis - a gyors, elkülönült tüzeléssorozatokat (továbbiakban burst -ket) produkáló sejtek és a lassú, ritmikus tüzelést mutatók is - az agykérgi EEG-vel szintén erős korrelációt mutatnak (Bokor és mtsai 2005). Az APT és a ZI agytörzzsel való kapcsolatában is hasonlóságokat mutat: Mindkettő vetít a colliculus superiorba (Terenzi és mtsai 1995; Zagon és mtsai 1995) (Ficalora és Mize 1989; Kim és mtsai 1992), a hídmagvakba (Border és mtsai 1986) és az alsó agytörzsbe (Nicolelis és mtsai 1992; Terenzi és mtsai 1995; Zagon és mtsai 1995), valamint ezen területek nagy részéből bemenetet is kapnak (Foster és mtsai 1989; Cadusseau és Roger 1991; Nicolelis és mtsai 1992; Veinante és Deschenes 1999; Power és Mitrofanis 2001). Mint látható, a két ventrális thalamikus mag mindenben hasonlít egymáshoz, amiben eltérnek az nrt-tól: A bemeneti- és kimeneti pályáikban, a thalamuson belüli innervációs mintázatukban, thalamikus hatásukban, terminálisaik morfológiájában, illetve azok target szelektivitásában. Felvetődik, hogy két ilyen mértékben hasonló gátló pálya az APT-thalamikus és a ZI-thalamikus projekció hatása ugyanazon thalamikus magvakra valószínüleg összefügg. Valóban, macskában már korábban leírták, hogy az APT és a ZI között reciprok kapcsolat áll fenn (May és mtsai 1997), és APT-ZI vetítést főemlősben is kimutattak már (Paul May személyes közlése). A kölcsönös projekció pontos anatómiai részleteit azonban még nem vizsgálták, így nem állíthatunk fel 16

funkcionális hipotéziseket arról, milyen a kapcsolat e két fontos GABAerg bemeneti mag között. Jelen kutatás megkezdésekor az eddig ismertetett ismeretek alapján - a különböző eredetű extrareticularis gátló rendszerek egységes szervezőelv alapján felépülő, homogén struktúráját feltételeztük. A dolgozatban tárgyalásra kerülő munka nagyobbik része az ezzel kapcsolatos első hipotézisen alapult. Eszerint a legrészletesebben tanulmányozott extrareticularis gátlómag, az APT projekciója a thalamusba és a ZI-be homogén sejtpopuláció révén valósul meg, és az utóbbi pretecto-incertalis vetítés anatómiája összehangolt, egységes működésű gátlópályát tükröz a diencephalonból. Ezt a hipotézisünket a következőkben felvezetett 4 alhipotézisben fogalmaztunk meg. Csoportunk kimutatta, hogy a sejtek PV tartalma és in vivo tüzelési mintázata között összefüggés van az APT-ben (Bokor és mtsai 2005). Ez alapján 3 PV-kategóriát állapítottunk meg: A gyors burst tüzelésű ( fast bursting ) sejtek erősen PVpozitívak, a tónusosan tüzelő ( tonic ) sejtek gyengén PV-pozitívak, a lassan és ritmikusan tüzelő ( slow rhythmic ) sejtek pedig PV-negatívak. A háromféle sejttípus tüzelése az EEG-vel való korreláltságukba is eltér: A tónusosan tüzelő sejtek a kérgi aktivitástól független aktivitást mutatnak, míg a másik két típus tüzelése EEG-korrelált. A pretecto-thalamikus rostvégződések igen egyöntetű morfológiát és transzmitter tartalmat mutatnak (Bokor és mtsai 2005; Wanaverbecq és mtsai 2008). Első alhipotézisünk szerint ezért a rostokat adó vetítősejtekre is homogenitás jellemző, ami uniform PV tartalomban tükröződik. Ahhoz, hogy az APT-thalamikus gátlás a ZI eredetű gátlással összehangoltan működhessen, szükséges, hogy a pretecto-incertális rostok a ZI thalamus-projiciáló sejtjeire hassanak. Leírták, hogy a ZI ventralis (vzi), erősen PV-pozitív régiója felelős a thalamus beidegzéséért (Lavallee és mtsai 2005; Trageser és mtsai 2006). Második alhipotézisünk az volt tehát, hogy az APT eredetű rostok ezt a régiót innerválják. Az összehangolt működés legszorosabb módját feltételezve harmadik alhipotézisünk szerint a ZI innervációját ugyanazon APT sejtek végzik, mint a thalamusét, azaz a thalamusba futó pretectalis rostok egyöntetűen kollaterálist adnak a ZI-be (1. ábra). Mivel az APT (csakúgy, mint a vzi) sejtjeiről kimutatták, hogy rendkívül denz lokális rekurrens kollaterális-rendszert alkotnak, feltételezésünk beigazolódása azt indikálná, hogy az APT nem húz határt saját sejtjei és a vzi sejtek között, azonos szabály szerint 17

innerválja azokat és így a két mag - térbeli szeparáltságuk ellenére - egységesnek tekinthető. Előző feltevésünkből következően, utolsó idekapcsolódó alhipotézisünk az volt, hogy a pretecto-incertális pálya a pretecto-thalamikushoz hasonlóan javarészt gátló jellegű, axonvégződései pedig szintén F3 típusú óriásterminálisok. 1. ábra: A magasabb-rendű (MR) thalamus serkentő, valamint diencephalikus eredetű gátló pályái. Az MR thalamusnak két serkentő, az aktivitását domináló (ún. driver vagy irányító ) bemenete van, a cortex 5. rétegéből és a periféráról, és egy modulátor serkentő bemenete a cortex 6. rétegéből, míg az anterior pretectum (APT), a zona incerta (ZI) ventralis régiója, valamint a reticularis thalamikus mag (nrt) gátlást fejtenek ki rá (részletek a szövegben). A kérdőjelek utalnak kapcsolódó hipotézisünk 4 alpontjára: 1.) A thalamusba vetítő APT sejtpopuláció homogén; 2.) Az APT a ZI thalamus-vetítő ventrális PV-pozivitív régióját innerválja; 3.) A thalamusba és a ZI-be 18

ugyanazon APT sejtek vetítenek; 4.) Az APT-ZI vetítés az APT-thalamikushoz hasonlóan homogén gátló ( - ), óriásterminálisokon keresztül hat. A serkentő pályákat az ábrán +, a gátlópályákat - jelzi. (Az egyes magok egy-egy reprezentatív sejtje látható csoportunk korábbi munkáiból, neurolucida technikával kirajzolva.) E kérdések vizsgálatával kerestünk választ a diencephalikus eredetű extrareticularis gátló pályák egységes szerveződésének kérdésére. A kérdés azonban kiterjeszthető a diencephalon határain túlra is. Egyes thalamusmagvak ugyanis olyan extrareticularis gátlóbemeneteket kapnak, amelyek nem vagy feltehetőleg nem - az eddig tárgyalt két magból származnak. A motoros és az intralamináris thalamus gátlóbemenetei A dolgozat kisebbik részében tárgyalásra kerülő második hipotézisünk szerint az extradiencephalicus bemenetek is az eddig ismertetett extrareticularis gátlórendszer homogén anatómiai tulajdonságait mutatják. Ezt a továbbiakban felvezetésre kerülő két alhipotézisben konkretizáltuk. A motoros thalamusmagvak ugyan nem kapnak bemenetet az APT-ből és a ZI-ből, azonban régóta ismert extrareticularis gátló bemenetük a bazális ganglionokból (Uno és mtsai 1978; Yamamoto és mtsai 1988), amelyek a cerebello-recipiens motoros területtől részben elkülönült régiókat innerválják, csakúgy, mint egyes intralamináris thalamikus területeket (Kilpatrick és mtsai 1980; MacLeod és mtsai 1980; Sakai és Patton 1993). Mind a globus pallidus internalis része (Ilinsky és mtsai 1997), mind a substantia nigra reticulata (Kultas-Ilinsky és Ilinsky 1990) nagyméretű GABAerg terminálisokat képez a relésejtek proximális dendritjein. Előbbi bemenet főként a végtagmozgásokban, míg utóbbi a fej, nyak, szemmozgásokban és a proximális izomzat kontrolljában játszik szerepet (Anderson és Turner 1991a, b; Vitek és mtsai 1994a; Vitek és mtsai 1994b). Annak ellenére, hogy a törzsdúci rendszer pályáit illetve azok kóros elváltozásait régóta vizsgálják, kevés összehasonlító morfológiai tanulmány található a Parkinson-kórban érintett neurális kör egyetlen kimeneti pályájáról. Így nincs adat arról, hogy ez a gátlóbemenet innervációs mintázatában illetve morfológiájában hasonlít-e más extrareticularis thalamikus gátlópályákhoz. 19

Az intralamináris magvaknak ahogyan serkentő afferenseiket is számos agyterületről kapják (Krout és mtsai 2001; Krout és mtsai 2002) gátlórendszereik is sokfélék. Mind a ZI-ből (Barthó és mtsai 2002), mind pedig a bazális ganglionokból (Clavier és mtsai 1976; Beckstead és mtsai 1979; MacLeod és mtsai 1980; Sakai és Smith 1992; Cebrian és mtsai 2005) kapnak bemenetet. Mindemellett egy újabb közlemény egy korábban le nem írt, harmadik típusú gátlást is bemutat: Egy glicinerg bemenetet, amely majdnem kizárólag az intralaminaris magvakban van jelen (Zeilhofer és mtsai 2005). Zeilhofer és mts-i olyan transzgén egér vonalat állítottak elő, amelyben a zöld fluoreszcens protein (továbbiakban egfp) génjét inzertálták a 2-típusú glicin transzporter (GlyT-2) gén és promotere közé. A glicint tartalmazó terminálisok megbízhatóan azonosíthatók GlyT-2 ellen termelt antitesttel, de nem az inkább glutamáterg bemenetek közelében jelenlévő GlyT-1 molekula vizualizálásával (Liu és mtsai 1993; Poyatos és mtsai 1997; Spike és mtsai 1997). A glicin és a GlyT2 felismerésére szolgáló ellenanyagok azonban csak az axonok és terminálisok megjelenítésére alkalmasak, a glicinerg sejtekére nem vagy alig (Zeilhofer és mtsai 2005). A Zeilhofer laboratóriumában előállított transzgenikus egér törzsben azonban mind a glicinerg neuronok szómái, mind dendritikus és axonális nyúlványai, valamint terminálisai láthatók. A thalamusban mindeddig nem írtak le glicinerg bemenetet. Így például az itt található NMDA receptorok glicin-kötő helyének aktivációs állapotát is invariánsnak gondolták, vagy modulációjáért kizárólag az asztrocitákból származó D-szerint egy alternatív koagonistát tették felelőssé (Hashimoto és Oka 1997). Ezt az álláspontot Zeilhofer közleménye alapján az intralamináris thalamusban lehet, hogy revideálni kell majd. Az értekezés szempontjából azonban a glicin elsődleges minőségében, mint gátló transzmitter, érdekes. Zeilhofer tanulmányában az egész előagyban a legnagyobb denzitásban a három intralaminaris magban CL, PF és PC - talál GlyT-2 pozitív varikozitásokat. Hasonló denzitást mutat ki ugyan három további thalamus magban (CM, a nucleus reuniens (Re) és a nucleus paraventricularis), valamint az APT-ben és a ZI-ben. Míg a glicinerg varikozitások az előagy legnagyobb részén kisméretűek, az említett thalamikus területeken a n. paraventricularis és a ZI kivételével kis, közepes és nagyméretű varikozitások jelenlétét is leírják (Zeilhofer és mtsai 2005). 20

Az egyedülálló gátló glicinerg pálya eredete és anatómiája nem ismert. Mivel a bemenet majdnem minden thalamikus magot elkerül, amelyeket az APT innervál, és a ZI, valamint SNr innervációs mintázatával is csak részben fed át, nem valószínű, hogy e három extrareticularis gátló mag egyikéből származna. A glicinerg rostok középagyban talált lefutása alapján az előagyi bemenet hídi vagy nyúltvelői eredetét valószínűsítik (Zeilhofer és mtsai 2005). Jelen dolgozatban többek között e pálya eredetének vizsgálatára is sor kerül (lásd Célkitűzések). Közvetlen összehasonlító tanulmányok hiányában azonban az már nem zárható ki, hogy az egyes intralaminaris magokon belül az incerto-thalamikus, nigro-thalamikus és glicinerg terminálisok térbeli eloszlása azonos. Az incerto-thalamikus terminálisokról csoportunk kimutatta, hogy csaknem az egész thalamusban rendkívül precízen követik a CB-pozitív sejtek bedúsulásainak mintázatát (ez alól egyedül a PF bizonyos régiói képeznek kivételt) (Barthó és mtsai 2002). A már többször említett thalamikus mátrix -szal összefüggő innervációs mintázat az MRT magok szelektív gátlórendszerei kapcsán jól összeegyeztethető az eddigi ismeretekkel. Első alhipotézisünk tehát, hogy mind a nigrothalamikus, mind a glicinerg gátló input a CB-pozitív sejtek eloszlásához igazodik. Bár leírták, hogy kisméretű GlyT-2 pozitív varikozitások ritkásan csaknem minden thalamikus magban jelen vannak, nagyméretűeket csak kétféle magcsoportban találtak: Az LP, LD, Po, azaz a magasabbrendű szenzoros magvakban előfordultak ugyan, de csak ritkásan. Az intralaminaris thalamusban (valamint a CM-ben és a Re-ben) azonban mind kisméretű, mind nagyméretű varikozitások nagy sűrűségét írták le (Zeilhofer és mtsai 2005). Ez alapján tehát második alhipotézisünk az volt, hogy a glicinerg terminálisoknak legalább egy alpopulációja az APT-nél és ZI-nél már megismert, extrareticularis gátlóterminálisokra jellemző F3 típusú morfológiát mutatja az intralaminaris magokban, továbbá, hogy a glicinerg bemenet GABA-tartalmában és target-szelektivitásában is a többi extrareticularis gátlópályához hasonló. Összefoglalva tehát a Bevezetésben ismertetett két hipotézisünk - összesen hat alhipotézisünk - mind az APT és ZI rendszere kapcsán, mind ezeken túl egy hasonló és homogén módon szerveződött extrareticularis thalamikus gátló pályarendszert feltételez tehát az agyban. 21

CÉLKITŰZÉSEK A dolgozat célja, hogy választ adjunk a kérdésre, vajon a thalamus különböző eredetű extrareticularis gátlópályái hasonló és homogén módon szerveződnek-e, illetve a kapott morfológiai eredmények alapján funkcionális predikciókat alkossunk a fenti gátlópályák egységes működéséről. Ehhez egyrészt a két diencephalikus gátlómagból (APT és ZI) induló pálya kapcsolatát vizsgáljuk, másrészt az extrareticularis gátlás két további komponensének - a substantia nigra pars reticulata (SNr) eredetű valamint a glicin-taralmú pályáknak az anatómiáját vetjük össze. Célkitűzéseink részletesen: 1. Az APT és ZI által alkotott extrareticularis gátlórendszer kapcsolatának vizsgálata: i.) Vizsgálni kívánjuk, hogy van-e valamilyen korreláció az APT sejtek parvalbumin (PV) tartalma és vetítési mintázata (thalamus vagy ZI) között. Miután a PV tartalom és az in vivo tüzelési mintázat között összefüggés van az APT-ben (lásd a Bevezetésben), a PV tartalom vizsgálata hozzásegíthet az APT-thalamikus és az APT-ZI pálya szerveződésének megértéséhez, összevetéséhez. ii.) Megvizsgáljuk, hogy az APT rostok vajon a ZI azon, ventralis részébe (vzi) vetítenek-e, amely parvalbumin-pozitív sejteket tartalmaz. Ez utóbbi régióról ismert, hogy a thalamusba vetít (Lavallee és mtsai 2005; Trageser és mtsai 2006). Ez valószínűsítené egy közvetett APT-thalamikus pálya meglétét a vzi-n keresztül. iii.) Feltárjuk, hogy ugyanazon APT sejtek küldenek-e rostot a thalamusba és a ZI-be, illetve ha nem, a thalamusba és a ZI-be vetítő sejtpopuláció térben mennyire keveredik el (1. ábra). Ez a kérdés annak eldöntésében fontos, hogy milyen szinten történik az APT-ZI és az APT-thalamikus pálya összehangolása. iv.) Megvizsgáljuk, hogy az APT-ZI pálya gátló (GABA-pozitív), serkentő (GABAnegatív), vagy kevert-e. Ez döntően befolyásolja azt, hogy az APT-thalamikus és ZIthalamikus pálya szinergisztikusan, vagy antagonisztikusan hat a thalamusra. Ez a kérdés vizsgálható az axonterminálisok és a szómák szintjén is. Előbbiekben a GABA transzmitter kimutatásával, a sejttestek esetében pedig a GAD (glutaminsav dekarboxiláz) mrns lokalizációjával. Ez a hasítóenzim ugyanis specifikusan a glutaminsav-gaba átalakítást végzi, így mrns-ének kimutatása lehetővé teszi a GABAerg sejtek szómáinak azonosítását. 22

2. A két anatómiailag kevéssé jellemzett extrareticularis gátlópálya vizsgálata és összevetése i.) Vizsgáljuk az SNr-eredetű és a glicinerg bemenet innervációs mintázatát. Van-e olyan neurokémiai marker, amelynek térbeli eloszlása egyik vagy mindkét bemenet innervációs területét pontosan követi a thalamuson belül? Egy ilyen marker kimutatása a kétféle bemenet eloszlásának még pontosabb összehasonlítását tenné lehetővé. A legkézenfekvőbb jelölt erre a szerepre a calbindin (CB), hiszen ez már az incerto-thalamikus vetítés esetében is jó markernek bizonyult (Barthó és mtsai 2002), emellett mind az SNr által innervált ventromedialis (VM) magnak, mind az intralaminaris magvaknak egyik fő sejtmarkere. ii.) Meghatározzuk az intralamináris magvakba érkező glicinerg bemenet eredetét. iii.) Feltárjuk a glicinerg bemenet ultrastrukturális tulajdonságait, a terminálisok morfológiáját, célelem-specificitását, transzmitter-tartalmát úgy, hogy összevethessük az eddig leírt extrareticularis terminálisok hasonló adataival. 23

ANYAG ÉS MÓDSZEREK A patkány APT-ból a Po thalamikus magba, valamint a ZI-be futó pályák, a nigrothalamikus projekció, valamint az egér intralaminaris magjaiba érkező glicinerg vetítés vizsgálatához anterográd és retrográd pályakövető módszereket kombináltunk pre- és posztembedding immuncitokémiai eljárásokkal. Az APT vetítősejtjeit emellett in situ hibridizációs technikával is tanulmányoztuk. A preparátumokat fény-, konfokális-, valamint elektronmikroszkópos szinten elemeztük, utóbbi révén axonterminálisok 3- dimenziós rekonstrukcióját is végeztük. Felnőtt hím, Wistar patkányokat használtunk mind az APT efferens pályáinak (300-400 g; n=16,), mind a nigrothalamikus pálya (250-300 g; n=6) vizsgálatához. A thalamus glicinerg pályáit egfp-t GlyT2-val kapcsoltan expresszáló transzgén egerekben (BAC-GlyT2/EGFP vonal; (Zeilhofer és mtsai 2005)) figyeltük meg (25-30 g; P75-250; n=11 hím, n=2 nőstény). Az állatkísérleteket az MTA Kísérleti Orvostudományi Intézet etikai előírásai szerint végeztük, az Etikai Bizottság által jóváhagyott módon. Anterográd rostkövetés az APT-ből a ZI-be, fény- és elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz A pályakövető anyag (tracer) beadása az APT-be, perfúzió A patkányokat (n=7) Equitesin-nel mélyen altattuk (klorálhidrát, nembutal, 0.3 ml/100 g testtömeg), majd sztereotaxiás készülékben rögzítettük. A beadásokat iontoforetikusan, üvegkapillárissal (külső átmérő a csúcsnál 10-30 µm) végeztük, biotin-dextránamint (BDA; MS 10 000; 10 % fiziológiás sóoldatban, n=7; 10 perc, 2 µa, 2s/2s on/off ciklusidő) vagy Phaseolus vulgaris leuco-agglutinint (PHAL; 2.5 % 0.1 M foszfát pufferben [PB], n=7; 10 perc, 5 µa, 7s/7s on/off ciklusidő) alkalmazva, a következő beadási koordinátákkal: 4,8-5,2 mm posterior, 1,7 2,0 mm lateralisan, 4,5 5,5 mm ventralisan a Bregma ponttól, Paxinos és Watson atlasza alapján (Paxinos és Watson 1998). Mivel az APT-ZI vetítésnek gyakorlatilag nincsen kontralateralis komponense a felhasznált állatok számának csökkentése érdekében- mindkét féltekébe 24