Állatkísérletek az Orvostudományban Életjelenségek speciális vizsgáló módszerei Dr. Kaszaki József Sebészeti Műtéttani Intézet SZTE ÁOK graduális oktatás 2013-2014 / 1
Mitől függ a perctérfogat? Szívfrekvencia Előterhelés (Preload) Utóterhelés (Afterload) CVP Kontraktilitás dp/dtmax Perifériás érellenállás SVR
1. A perctérfogatból számolható további paraméterek Oxigén szállítás (DO 2 ) Oxigén fogyasztás (VO 2 ) Feltétel: Az artériás és vénás oxigén szaturáció meghatározása
Oxigénnel telített hemoglobin százalékos aránya a vérben 70-80 % 95-100 % Periféria
Oxygen szállítás (DO 2 ) DO 2 : a keringés által szállított oxygén mennyiség Összetevői: Oxygén tartalom a. Hemoglobin (Hb) b. Szaturáció (SO 2 ); a teljesen szaturált hemoglobin 1.38 ml oxygént szállít (per gram) Perctérfogat (C.O.) DO 2 [ml/min] = CO x [(1,38 x Hb x SaO 2 ) + (0,003 x pao 2 )]
Oxigén fogyasztás = perctérfogat x (artériás vénás oxigén tartalom) Oxigén szállítás (delivery; DO 2 ) Oxigén fogyasztás (consumption; VO 2 ) Body/Organs VO 2 [ml/min] = CO x 1,38 x Hb x (SaO2-SvO2) Ha a Hgb, CO és az A/V szaturáció ismert, a VO2 kiszámítható anélkül, hogy a PO2 értéket ismernénk (oldott O2 = általában a teljes O2 tartalom < 0.3 Vol%-a):
2. Kis vérköri nyomás monitorozás Pulmonális artéria nyomás Pulmonary artery
Pulmonális artéria katéterezés Swan Ganz katéterrel Sárga: PA nyomás Kék: CVP és injektálás Fehér: termisztor kábel Piros: katétervég ballon felfújás
A Swan Ganz katéter pozíciója a jobb szívfélben
Artéria pulmonális nyomás és az ék (wedge) nyomás görbéje
Pulmonalis kapilláris éknyomás: Hemodinamikailag a bal kamra preloadjára utal, de a mérése körüli bizonytalanságok és a számos befolyásoló tényező miatt a volumenstátus megítélésére csak fenntartásokkal alkalmazható
3. A véráramlás mérése Elektromágneses áramlásmérés Ultrahangos flowmérés Laser-Doppler flowmérés
Lokális véráramlás mérés Transonic ultrahangos véráramlás mérő készülék és perivaszkuláris áramlás érzékelő szenzorok.
Lokális véráramlás mérés
4. A gasztrointesztinális (GI) traktus vizsgáló módszerei
A bélidegrendszer szerveződése Myentericus plexus Körkörös izomréteg Submucosus plexus Hosszanti izomréteg Nyálkahártya Muscularis mucosae Az GI traktus szekretoros, abszorpciós és motilitási funkcióinak szabályozásáért és összehangolásáért felelős struktúra a bélidegrendszer. A bélidegrendszert több kisebb, nem ganglionált, és két nagyobb, ganglionált plexus építi fel. Ezek a nyálkahártya és a körkörös izomréteg között elhelyezkedő submucosus plexus (Meissner-plexus), valamint a körkörös és hosszanti izomrétegek között található myentericus plexus (Auerbach-plexus). A bélidegrendszer önálló reflexívekkel rendelkezik, s a központi idegrendszertől való nagyfokú függetlenség jellemzi. Furness, The Enteric Nervous System, 2008. nyomán
4.1. A tápcsatorna simaizomzat elektromos aktivitása Lassú hullám Spikes A GI kontrakciók ritmusát a simaizom membránban képződő potenciál változás, a lassú hullámok (slow waves) frekvenciája határozza meg, amelyek nem tekinthetők akciós potenciálnak.
A GI SIMAIZOM MOTOROS AKTIVITÁSA 1. Izom kontrakció csak akciós potenciál (AP) megjelenésekor történik 2. Az AP (sorozat) gyakoriságát a lassú hullámok frekvenciája szabja meg 3. A kontrakciók ereje az AP sorozat frekvenciájától függ
GI motilitás monitorozás I. A bélizomzat kontrakciók mérése nyúlásmérő bélyeg (strain gauge) szenzorral V. jugularis Infúzió Strain gauge szenzor Computer
GI motilitás monitorozás I. A bélizomzat kontrakciók mérése nyúlásmérő bélyeg (strain gauge) szenzorral FSG-02 Force/displacement transducer for implantable
Original recording of colon motility in rat V 6 4 2 0-2 -4-6 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 sec
GI motilitás monitorozás II. Elektro-Miográfia (EMG) A bélizomzat elektromos aktivitásának mérése extracellularis szenzorral V. jugularis Infúzió Extracellular sensor Computer
Ag/AgCl extracellularis szenzor
Szenzor típusok testfelszíni miográfiás szenzor bélfalba implantált szenzor
Kísérleti elrendezés bélfalba implantált szenzor (1 vagy 2 pár elektródával) testfelszíni miográfiás szenzor
Elektrointesztinográfia
Mérés éber állaton. A szenzort a nyakon ejtett nyíláson át vezetjük ki, melyet az állat nem tud lerágni.
A jel: Felvétel: 0,01 0,5 Hz esemény
Gyomor Vastagbél Vékonybél PS: power spectrum, MA 2 MA: a PS-hez tarozó legnagyobb magasság érték
Vékonybél spektrumok egy bélischaemia-reperfúziós állatból
Görbe alatti területek összehasonlítása AUC - bevarrt 350 300 250 200 150 Sham-op IR IR+Met 100 50 0 baseline Ischemia1 Ischemia2 Reperfuzio1 Reperfuzio2
4.2. Az intesztinális permeábilitás vizsgáló módszerei Gravimetriás analízis Kapilláris permeabilitás Epitheliális permeabilitás Gravimetria szövet mintavétel; Nedves-súly mérése Szárítás súlyállandóságig, majd száraz-súly mérés Nedves / Száraz súly = ödéma becslése
Vasculáris/kapilláris permeabilitás Meghatározása: Evans kék (EB) festékkel, amely a plazma fehérjékhez kötődik Intravénás befecskendezés Permeábilitás fokozódás esetén, a festék-fehérje komplex a szövetekbe jut; A komplex kimosása az erekből; A festék extrahálása a szövetből, formamid-dal; Evans kék spektrofotometriás meghatározása a vérből és a szövetből; Permeabilitási index = EB szövet EB plazma Vascular permeability index 1 1 1 0 0 0 0 0 Saline Bile HCl+bile HCl Intact region of the esophagus * P<0.05 Fig. 2 * x * * x Treated region of the esophagus
Epitheliális permeabilitás lumen - plazma irányú permeábilitás változás mérése Na-fluoreszcein (NaFL) clearence módszerrel 5 mg/ml NaFL beadása a vizsgálandó GI lumenbe; Vénás vérminta vétel 10 percenként (a minta tárolása sötétben); A NaFL koncentráció meghatározása spektroflurométerrel (ex: 455 nm, em: 515 nm); lumen - plazma NaFl clearence = plazma NaFL / lumen NaFL Plasma-Na fluorescein/lumen-na fluorescein kg -1 x 10 4 10 8 6 4 2 0 * x x * * x x * * 180 190 200 210 220 230 240 x x Time (min) Fig. 3 * x * * x x * * x HCl+bile Bile x x * * * x x * * x HCl Saline x
5. Képalkotó vizsgáló módszerek a mikrokeringés in vivo monitorozására
A mikrokeringés fiziológiája Arteriolák, kapillárisok, venulák hálózata (érátmérő <100 μm) Legfőbb szerepe az oxigén átadása a szöveteknek Struktúrája, funkciója nem egységes szervenként eltérő Központi szerepet játszik a véralvadási, immunológiai folyamatokban A mikrokeringést meghatározó tényezők: Beáramlási nyomás (driving pressure) Az arteriolák tónusa és átmérője Hemorheológiai paraméterek (viszkozitás) Együttvéve: kapillárisok nyitottsága (patency) A mikroperfúzió szabályozása: Miogén (erő-mechanikai hatások) Metabolikus (O 2, CO 2, laktát, H + ) Neurohumorális (NO, endothelin, katekolaminok, stb.)
KERINGÉSI SHOCK HIPOXIA ISCHAEMIA NO-REFLOW jelenség MIKROKERINGÉSI ELÉGTEENSÉG REOXIGENIZÁCIÓ REPERFÚZIÓ
Mikro rokeringés diszfun funkció Endothel Diszfunkció Barrier, Koaguláció, Regulációs zavar Vörösvértestek Deformabilitás, Aggregáció O 2 transport zavar Koaguláció Endogén antikoagulánsok Mikrovaszkuláris trombózis Leukocita aktiváció Adhézió, Cytokinek, ROS Autoregulácios diszfunkció Mikrocirkulációs shunt Oxigén ellátás-igény mismatch Hypoxia Celluláris Distress Mitochondrium diszfunkció Apoptózis Szervi elégtelenség
A mikroperfúzió monitorozásának eszközei és jellegzetességei
A mikrocirkuláci ció monitorozása Áramlás Lézer Doppler áramlásmérő NIRS Oxigenizáció, Áramlás Perfúzió, Áramlási sebesség OPS/SDF képalkotás Fluorescence quencing microscopy Oxigén tenzió Áramlás Mikrogyöngy technikák MRI Oxigenizáció, Perfúzió
Orthogonális Polarizáci ciós Spectrális képalkotás OPS Sidestream Dark Field SDF : az OPS továbbfejlesztett verziója Groner W. Nature Med (1999) 5:1209-1212 Ince C (2005) Crit Care 9:S13-S19
Hol alkalmazható? Csak vékony, epithel réteggel fedett struktúrák esetén alkalmazható, amelyek átvilágításához elegendő a szövet mélyéről visszaérkező depolarizált fény - amely hátulról világítja meg a felszín alatti struktúrákat. 1. Ideális, nem invazív alkalmazási terület: a sublinguális régió
A szublingualisis mikrocir rocirkuláció klinikai jelentősége
Sublinguális vs intesztinális tonometria Sublinguális tonometria vs OPS videomikroszkópia Pentobarbital anaesthesia OPS mikrokeringés vizsgálat Sublingualis tonométer Artériás kanül Intestinalis tonométer CVP katéter Transzpulmonális perctérfogat mérés Vérnyomás szenzor
A nyelv alatti mucosa mikrokeringése kontroll állapotban
A nyelv alatti mucosa mikrokeringése shockos állapotban
A szublingualisis mikrocir rocirkuláció klinikai jelentősége Azok a szeptikus páciensek, akiknél a szublinguális mikroperfúzió csökkenése kismértékű (22 %-os) volt, felépültek a súlyos kórállapotból, ellentétben azokkal, akiknél ez a csökkenés jelentős (44 %-os) volt. Sakr et al. Crit Care Med (2004) 32:1825-1831 A mikrocirkulációs dysfunkció volt az egyetlen és szenzitiv tényező a végkimenetel előrejelzésében.
Mikrocirkulációs paraméterek változása a tüdő alveolusaiban Vietnámi törpesertések (átlagos testtömeg: 23±3 kg) Altatás: ketamin-xilazin indukció im., propofol fenntartó iv. Mesterséges lélegeztetés Centrális vénás nyomás Endotracheális tubus Pulzoximéte r Jobb felső lebeny OPS mikrokeringés vizsgálat Artériás vérnyomás szenzor
PEEP hatása az oxigenizációra Atelektázia megszűnése - intrapulm. shunt Parciális oxigén nyomás (PaO 2 ) Artériás oxigén szaturáció (SaO 2 ) N=6 Thoracotomia PEEP = 5 PEEP = 10 PEEP = 15 PEEP = 5 0.perc 15. perc 30. perc 45. perc = mikrokeringés felvétel Kevés adat ismert a PEEP okozta mikrocirkulációs változásokról a tüdőben
Artériás oxigén szaturáció és parciális nyomás Artériás oxigén szaturáció (%) 100 98 * * * Artériás oxigén parciális nyomása (Hgmm) 100 90 80 * * 96 70 94 92 PEEP= 15 PEEP= 10 PEEP= 5 PEEP= 5 0 15 30 45 Idő (perc) 60 50 PEEP= 15 PEEP= 10 PEEP= 5 PEEP= 5 0 15 30 45 Idő (perc) Az ábrán a medián, a 25. és a 75. percentilist tüntettük fel; * p<0.05 Friedman és Dunn próbával
TÜDŐ MIKROKERINGÉS (OPS) PEEP 5 vízcm
Tüdő mikrokeringés PEEP 15 vízcm
Tüdő mikrokeringés PEEP 5 vízcm
Alveolus terület Alveoláris terület (μm 2 ) 1100 * 1000 900 800 700 600 PEEP= 15 500 PEEP= 5 PEEP= 10 PEEP= 5 0 15 30 45 Idő (perc) Az ábrán a medián, a 25. és a 75. percentilist tüntettük fel; * p<0.05 Friedman és Dunn próbával
Alveolus kapillárisok perfúziós rátája Alveolus perfúziós ráta 0,7 0,6 * * 0,5 0,4 0,3 PEEP= 5 PEEP= 10 0 15 30 45 Idő (perc) PEEP= 15 PEEP= 5 Az ábrán a medián, a 25. és a 75. percentilist tüntettük fel; * p<0.05 Friedman és Dunn próbával
Áramlási sebesség az alveoláris és perialveoláris kapillárisokban Alveolus vvt sebesség (μm s -1 ) Perialveoláris vvt sebesség (μm s -1 ) 550 500 * * 600 550 500 * 450 450 400 400 350 300 PEEP= 15 PEEP= 10 PEEP= 5 PEEP= 5 0 15 30 45 Idő (perc) 350 300 PEEP= 15 PEEP= 10 PEEP= 5 PEEP= 5 0 15 30 45 Idő (perc) A PEEP emelése után az alveoláris és perialveoláris perfúzió eltérő dinamikájú növekedése eredményezi az artériás oxigén tenzió és szaturáció fokozódását.
A mikrokeringés és a makrokeringés kapcsolata Normál állapotban a mikrokeringés relatíve független a globális hemodinamikai változásoktól. DE mikrocirkulációs elváltozások mutathatók ki elfogadhatónak tekintett szisztémás hemodinamikai célértékek esetén is; A keringési elégtelenség megszüntetését célzó terápiás beavatkozás esetén, a mikrokeringés reakciója gyakran eltér annak globális hatásától jellemző példája az un. no-reflow jelenség
Gasztrointesztinális mikrokeringés a keringés redisztributio áldozata keringési shockban
Hgmm Artériás Középnyomás 150 120 90 60 zselatin hidroxietil-keményítő dextrán 30 Vérzéses shock Volumen resuscitatio 0 30 60 90 120 150 180 210 240 Idő (perc) * P<0.05 vs kontroll érték (0 perc) A volumen reszuszcitáció végpontja: a kontroll MAP 75%-ának elérése, max. 50 ml/kg kolloid infúzió;
Vörösvértest Áramlási Sebesség a Villusokban μm/s 800 700 600 500 400 300 200 Vérzéses shock * * * * Volumen resuscitatio Zselatin Hidroxietil-keményítő (Voluven) Dexrán (Rheomacrodex) * * # # * 0 30 60 90 120 150 180 210 240 idő (perc) P<0.05 vs konroll érték (0 perc) # P<0.05 vs Voluven csoport Kaszaki J, Wolfárd A, Szalay L, Boros M: Pathophysiology of ischemia-reperfusion injury. Transplant Proc 38:826-828, 2006.
OPS
A mikrokeringés speciális sajátossága: a heterogenitás Károsodott mikrocirkuláció esetén a mikrokeringési reakciók NEM egységes természetüek, és mértékük, kiterjedésük sem hasonló. A károsodás gyakori megnyilvánulása, a perfúzió heterogenitásának fokozódása. Az oszcilláló mikroperfúzió (flowmotion) a lokális oxigenizáció változást indukál (Tsai AG and Intaglietta M, Int J Microcirc Clin Exp (1991) 12:75-88).
Térben változó heterogenitás A funkcionális kapilláris denzitás meghatározása perfundált nem-perfundált Perfundált kapillárisok hossza terület Mikrocirkulációs shunt: amikor a µpo 2 kevesebb lesz, de a vénás po 2 változatlan marad Sinaasappel et al. J Appl Physiol (1996) 81:2297-2303.
Időbeli heterogenitás Az áramlási mintázat változv ltozása a villusban Kiindulási állapot: folyamatos áramlás Vérzéses shock: oszcilláció Újraélesztés: folyamatos áramlás / oszcilláció 700 RBCV (µm/sec) 100 v 1 v 1 v 2 v 2 v 3 v 3 v n v n Gyors áramlás Lassú áramlás t 1 T 1 t 2 T 2 t 3 T 3 t n Súlyozó faktor = az áramlási periódusok relatív időtartama T n idő A vörösvértest áramlási sebességének (RBCV) súlyozott számtani átlaga: A-RBCV = v 1 t 1 + V 1 T 1 + v 2 t 2 + V 2 T 2 + v n t n + V n T n t 1 + T 1 + t 2 + T 2 + t n + T n Szabó et al. Shock 21:320-329, 2004.
Térbeli heterogenitás A vörösvértest áramlási sebesség (RBCV) terület arányosan súlyozott átlaga hypoperfundált terület (a: relative area 40%) (lower average RBCV) Normál perfúzió, magasabb RBCV értékek (A: relative area 60%) (higher average RBCV) RBCV = A(RBCV) + a (RBCV) A + a (A + a = 1) RBCV = 0.6 RBCV + 0.4 RBCV
Heterogenitás s normál l körülmk lmények között, k Lézer Doppler flow mérésm Vasomotio (flowmotion) monitorozás a tesztiszben Termoregulációval összefüggő periodicitás Vasomotio (flowmotion) monitorozás a bőrben
A leukocyta-endothelsejt interakció monitorozásának eszközei és jellegzetességei
Leukocyta-endothel sejt interakció kapilláris lumen interstitium Rolling Adhézió Transzmigráció érendothel E-selectin P-selectin (+vérlemezke) VCAM-1 ICAM-1 (intercellularis adhéziós molekula 1) endothelialis PECAM-1 leukocyta L-selectin CD11a/CD18 CD11b/CD18 leukocyta PECAM-1
Fluoreszcens Intravitális Videomikroszkópia Videó-felvev felvevő CCD-kamera Fényforrás Tibia Objektív MONITOR - gördülő leukocita - kitapadó leukocita -funkcionális kapilláris denzitás -Vvt áramlási sebesség Kontraszt erősítés (fluoreszcens transz- és epi-illumináció) Fluoreszcens markerek: Leukocyták Vörösvértestek Permeabilitás Rhodamin 6G FITC jelölés Na-fluorescein
IVM video: Periosteális perfúzió és leukocyta adhézió végtag ischaemiában
Mikrocirkulációs paraméterek változása máj ischaemia-reperfúzió során, patkány modellben
Kontroll mikroperfúzió a májban (NaFl) Fluoreszcens Intravitális Videomikroszkópia (IVM)
Máj mikroperfúzió reperfúzió alatt (Na Fl) Fluoreszcens Intravitális Videomikroszkópia (IVM)
Leukocyta-endothel sejt interakció normál májban (IVM)
Leukocyta-endothel sejt interakció reperfúzió alatt (IVM)
Mikrocirkuláció összegzés Az első, ami sérül, és az utolsó ami felépül. A mikrocirkuláció károsodásának jele, a perfúzió heterogenitása, amely oxigén extrakciós deficitet eredményez; A mikroperfúzió állapota meghatározhatja a végkimenetelt; A mikrocirkuláció helyreállítása terápiás végpont. Microcirculation Recruitment Manoeuvres Ince C (2005) Critical Care 9:S13-S19 Rendezni kell a kóros áramlási heterogenitást Az a cél, hogy a nyissuk ki és tartsuk is nyitva a mikrokeringést a pumpafunkció támogatásával, vazopresszorok korlátozott használatával és megfelelő folyadék adásával
Köszönöm a figyelmet!