Egészségtudományi Közlemények, 2. kötet, 1. szám (2012), pp. 5 10. AZ OSTEOARTHROSIS KIALAKULÁSÁBAN KÖZPONTI SZEREPET JÁTSZÓ FAKTOROK ÉS GENETIKAI ELEMEK MINT LEHETSÉGES TERÁPIÁS CÉLPONTOK DOJCSÁKNÉ KISS-TÓTH ÉVA 1, DR. PAPP MIKLÓS 2, JUHÁSZNÉ SZALAI ADRIENN 1, KOSKA PÉTER 1, DR. FODOR BERTALAN 1 Összefoglalás: Az osteoarthrosis a metabolikus egyensúly katabolikus irányú eltolódásának következében alakul ki. Poligénes betegségnek tekinthető, mely kialakulásában fő szerepe lehet növekedési faktoroknak, gyulladásos citokineknek, enzimeknek és egyéb modulátoroknak. Emellett egyre elfogadottabb a genetikai (transzkripciós faktorok) és egyéb epigenetikai faktorok (SNP, mirns) jelentősége is a betegség kialakulásában. Nagy a törekvés e fatorok terápiás célpontként történő felhasználására a genetikailag módosított sejtbeültetéses terápiákban és a géncsendesítéses terápiákban egyaránt. Kulcsszavak: osteoarthrosis, katabolikus, gyulladásos faktorok, genetikailag módosított, géncsendesítés Bevezetés Az osteoarthrosis az ízületeket érintő, többnyire idős korban megjelenő, progrediáló degeneratív betegség. Leginkább a nagy terhet viselő ízületeket (csípőízület, térd- és kézízületek) érinti. Az osteoarthrosisos elfajulásnak azonban nincs ízületen belüli elhelyezkedése, az egész ízületet, hyalinporcot, synoviát, tokot, csontot érintő kiterjedt degeneratív folyamat. A betegség következtében kialakult porctömeg veszteséggel gyakran együtt jár az ízület egyéb szöveteinek ligamentumok, synovium, subchondralis szövet elváltozása is [1]. Az osteoarthrosis patológiájának részletei pontosan még nem ismertek, de azt azonban tudjuk, hogy a porcsejtek számos stimulusra gyulladásos citokinek, mechanikai stressz, öregedés válaszolnak, esetenként akár degeneratív enzimek és a bontási folyamatokban szerepet játszó katabolikus mediátorok aktiválása révén.nem csupán az aktivált synovialis szövet, hanem az ízületet körülvevő kötőszövet (ízületet körülvevő zsírszövet) is szekretálhat gyulladási faktorokat, például citokineket, adipokineket, melyek befolyásolhatják a porc metabolizmusát. Degeneratív ízületi elváltozások a szövet metabolikus folyamatainak és a homeosztázis megbomlásának a következtében alakulnak ki. A lebontó (katabolikus) és építő (anabolikus) folyamatok egyensúlyának katabolitikus irányba történő eltolódása patológiás elváltozáshoz vezet. Az ízületi szövetek anabolikus/katabolikus egyensúlya finoman szabályozott, számos jelátviteli útvonal befolyásolja. A jelátviteli útvonalak néhány szereplőjének a 1 Miskolci Egyetem Egészségügyi Kar Nanobiotechnológiai és Regeneratív Medicina Tanszék, Miskolc 2 Borsod-Abaúj-Zemplén Megyei Kórház és Egyetemi Oktatókórház, Ortopéd Sebészeti és Képalkotó Diagnosztikai Osztály, Miskolc
6 Dojcsákné Kiss-Tóth Papp Juhászné Szalai Koska Fodor patomechanizmusban betöltött szerepe már tisztázott, de még számos összefüggés rejtve marad, melyek feltárása hozzásegítheti az orvostudományt potenciális biológiai terápiás célpontok megtalálásához [2]. Főbb katabolikus és anabolikus elemek Gyulladásos faktorok A katabolikus fenotípus kialakulásában kiemelkedő szerepe van az ízületi szövetekben a proinflammatorikus citokinek megjelenésének. Leginkább kutatott és elterjed szemlélet az IL-1β meghatározó szerepe a kórfolyamat kialakulásában. Kifejeződik az osteoarthrosisos ízületek porcsejtjeiben és a synoviális szöveteiben, illetve szekretálódik a synoviális folyadéktérbe is. Emellett receptorának (IL-1R1) mennyisége is megnövekszik az osteoarthrozisos porcban. Az IL-1β kiemelkedő hatása a mátrix-degradáló enzimek megemelkedett szintézisében és az extracelluláris mátrix proteinek szintézisének csökkentésében jelenik meg. Emellett emeli a vele szinergikus hatású IL-6 szöveti mennyiségét is. A TNF-α szintén az IL-1β-val szinergista módon viselkedő gyulladási faktor. Hatása megegyezik a fent említett mátrixbontó enzimek serkentésével és a mátrixépítő fehérjék termelődésének csökkentésével. Emellett gátolja a proteoglikán és az ízület vázát képző kollagén termelését. Mindezt alátámasztja az a tény, hogy a gyulladási faktorok gátlásával megakadályozható a mátrix bontásáért felelős metalloproteinázok (MMPs) termelése [2]. Növekedési faktorok Növekedési faktorok között kiemelkedő anabolikus szerepe van a Trasforming growth factor-β-nak (TGF-β), mely amellett, hogy elősegíti a II típusú kollagén és az aggrecan termelését, csökkenti a lebontó enzimek génexpresszióját. Ezt a tényt erősíti az a felismerés is, hogy a TGF-β receptorainak mennyisége osteoarthrosisos betegekben lecsökken, ami a szövet anabolikus faktor iránti válaszkészségének gyengülésével jár. Továbbá a kor előrehaladtával csökken a faktor mennyisége az ízületi szövetekben. A Bone morphogenic protein-ek (BMP) szintén a TGF-β nagycsaládba sorolható fehérjék, amelyek a porcképződés és mechanikai hatásra bekövetkező átépülés során kapnak jelentős szerepet. A család két tagja BMP-2 és BMP-7 kiemelkedő jelentőségű az arthrosisos megbetegedésekben. A BMP-2 az IL-1β és a TNF-α szabályozása alatt áll, osteoarthrosisban megemeli a II típusú kollagén termelését. A BMP-7 a legerősebb antidegeneratív hatású növekedési faktor. Növeli a mátrix bioszintézis mértékét, ezáltal ellensúlyozza az IL-1β hatását. Mennyisége osteoarthrosisban és a kor előrehaladtával lecsökken. Az utóbbi esetben olyan epigenetikai változások tehetőek felelőssé, mint például a BMP-7 promoter régiójában végbemenő metilációs folyamatok [1]. Az Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) fontos szereplője a porc homeosztázis szabályozásának. Megóvja a porcot az IL-1β katabolikus folyamataitól, illetve a mátrix degenerációtól, emellett serkenti az extracelluláris mátrix termelését. Anabolikus hatását gyengíthetik bizonyos mediátorok, mint például a nitrogén-monoxid (NO)[2].
Az Osteoarthrosis kialakulásában központi szerepet játszó faktorok... 7 Mediátorok és enzimek Az arthrosisos porcsejtek által termelt, kiemelkedő katabolikus mediátor a nitrogénmonoxid (NO). Termelődését egyrészt mechanikai hatások, másrészt gyulladásos faktorok (IL-β1 és TNF- α) serkentik, közvetve az indukálható Nitrogén-Oxid Szintázon keresztül (inos). Hatása részben a proteoglikán és kollagénszintézis gátlása révén, részben pedig a porcsejtek apoptózisának indukciója révén érvényesül. Egy pozitív visszacsatolás segítségével serkentheti saját termelését is, hiszen pozitív hatással van a NF-κβ jelátviteli útvonalra, amely olyan proinflammatorikus gének átírását szabályozza, mint például az IL-1β, TNF-α, inos [2]. Az osteoarthrosisban jelentkező gyulladásért és fájdalomért leginkább felelős mediátor a Prostaglandin E2. Termelődését az IL-1β serkenti, közvetve a cyclooxygenase-2 (COX- 2) és a prostaglandin E szintázon keresztül. A tüneti kezelésekben éppen ezért a nem- szteroid gyulladásgátlók hatásának célpontja a COX-2. A katabolikus folyamatok túlsúlya során megnövekszik a fehérjebontó enzimek menynyisége is a gyulladásos citokineknek köszönhetően. Az IL-1β az NF-κβ aktiválása segítségével megnöveli a Mátrix Metalloproteázok (MMP) szöveti mennyiségét. Az MMP-13 képes az ízület extracelluláris mátrixában található szerkezeti struktúrát biztosító fehérjék bontására, de különösen aktív a II típusú kollagén és aggrecan degradációjában. Ezek mellett még számos egyéb olyan faktor is létezik, melynek bizonyítottan szerepe van a betegség kialakulásában, ám dolgozatunkban csak a legfontosabbakat emeltük ki. Genetikai faktorok Transzkripciós faktorok Az epidemiológiai és genetikai elemzések mára rávilágítottak arra is, hogy az arthrosis ok-okozati összefüggéseiben szerepet kap a genetikai hajlam is. Egy egész genomra kiterjedő genetikai szűrővizsgálat (GWAS) célja az volt, hogy a főbb gének közötti kapcsolatrendszert feltérképezze. A tanulmány rámutatott arra, hogy az arthrosisban nincsenek kiemelten preferált gének, hanem egy poligénes természetű betegséggel állunk szemben. A genetikai hátterét továbbra is úgy kell szemlélnünk, mint jól körülírt gének keverékét, melyek fehérjetermékeinek a funkciója már jól ismert az ízület biológiájában [1]. A gének átíródásának elsődleges szabályozói a transzkripciós faktorok. Az embrionális porcképződés során a Sox9 szabályozza a mesenchymalis sejtek differenciálódását, anabolikus faktorként serkenti a porcspecifikus gének (II típusú kollagén és aggrecan) kifejeződését. A Sox9-el szemben ható fő katabolikus transzkripciós faktor a NF-κβ. Amellett, hogy gátolja a Sox9 kifejeződését, csökkenti a II típusú kollagéntermelést. Szerepe van a mátrixbontó enzimek (MMP-13, MMP-1) génjeinek szabályozásában is [2]. Az utóbbi években gyakran tanulmányozott transzkripciós faktor az arthrosis betegségben a HIF-2αis. A több gént is szabályozó faktor magasan expresszálódik az osteortharosis korai stádiumában. Kifejeződése a NF-κβ által közvetített, és túltermelődése progresszív porckárosodáshoz vezet, emellett számos degeneratív enzim (MMP-13) termelése megindul.
8 Dojcsákné Kiss-Tóth Papp Juhászné Szalai Koska Fodor Single Nucleotid Polymorphism (SNP) A egyetlen nukleotidot érintő polimorfizmus (SNP) vizsgálatokkal egy olyan gént sikerült kimutatni, amelyik SNP-változata kapcsolatba hozható az osteoarthrosissal. A Growth and Differentiation Factor 5 (GDF5) 3 nem transzlálódó régiójában helyezkedik el egy SNP (rs143383). A vizsgálatok szerint ez az SNP funkcionális, és a genetikai deficit leginkább idősebb korban aktív, ami csökkent GDF5-transzkripciót eredményez. Mint utóbb kiderült, ez a faktor is tagja a TGF-β családnak, és a sejten kívüli jelátvitelben van szerepe. Részt vesz a synoviális szövet fejlődésében, fenntartásában és regenerációjában [3]. Epigenetikai módosulások Az epigenetikai módosulások olyan génexpressziós változásra utalnak, melyek külső tényező hatására következnek be anélkül, hogy a gén szekvenciájában változás történne. Ilyen módosulás a már korábban említett BMP7-gén promóterének metilációja, mely következtében az anabolikus hatású fehérje termelése a kor előrehaladtával lecsökken. Ugyancsak epigenetikai módosulásnak tekinthető a mirns-ek által közvetített RNSinterferencia géncsendesítő hatásai is. A mirns-ek képesek kötődni a velük teljesen vagy részlegesen komplementer RNS-szakaszhoz és azok hatástalanítását indukálni. Létezik jó néhány mirns, ami szövetspecifikus és szöveten belüli abnormális expressziója betegséghez köthető. Ilyen szövetspecifikus humán mirns a mir-140 is, amely expressziója ugrásszerűen megemelkedik az in vitro körülmények között porcsejtekké differenciálódó mesenchymalis sejtekben. Ezzel szemben in vivo mennyisége lecsökken az osteoarthrosisos porcsejtekben [4], aminek következményeképpen bizonyos gének kikerülnek a mir-140 szabályozása alól, és növelhetik a betegség kialakulásának esélyét. Génalapú terápiás eljárások az osteoarthrosisos elfajulásokban Genetikailag módosított sejttranszplantáció A kórfolyamat kialakulásában feltételezhetően szerepet játszó genetikai, epigenetikai és egyéb faktorok megismerése, összefüggések keresése lehetőséget ad olyan terápiás célpontok behatárolására, melyekkel új szemszögből közelíthető meg az osteoarthrosis kezelése. A génalapú terápiás eljárások kifejlesztésére egyre nagyobb a törekvés, bár a rendelkezésre álló eredmények többnyire csak sejtes vizsgálatokból származnak. A génterápiával lehetőség van az anabolikus útvonalak stimulálására, így a porcképzés (sejtproliferáció, extracelluláris mátrix termelés) serkentésére vagy a katabolikus folyamatok gátlása révén a lebontási folyamatok kivédésére. Számos olyan tanulmányt olvashatunk az irodalomban, melyben virális/nemvirális rendszerekbe ültetett gént juttatnak a mesterségesen felszaporított porcsejtekbe vagy differenciáltatni kívánt mesenchymalis őssejtekbe, és ezeket a genetikailag módosított sejteket juttatják vissza a degeneratív porc területeire. Az anabolikus útvonal stimulálására alkalmazott leggyakoribb faktorok a növekedési faktorok és a chondrogén transzkripciós faktorok, melyekről fentebb már említést tettünk. A humán IGF-1 cdns-ének túltermeltetése izolált porcsejt tenyészetben a porcképzés irányába tolta el a tenyészet homeosztázisát, ami a sejtek megnövekedett proliferáló képességében és a
Az Osteoarthrosis kialakulásában központi szerepet játszó faktorok... 9 mátrix fokozott szintézisében nyilvánult meg [5]. Emellett sikerrel alkalmazták a BMP-2-, BMP-7- és TGF-β-géneket terápiás céllal, in vitro kísérletekben [6]. Osteoarthrosis korai stádiumában is történtek próbálkozások a gyulladásos és katabolikus folyamatok megakadályozására. Baragi és munkatársai adenovirális rendszer segítségével túltermeltették az IL-1Ra-gént humán osteoarthrosisos porcsejt tenyészetben, mely megóvta a tenyészetet az IL-1 indukálta extracelluláris mátrix degenerációtól [7]. Jelenleg is folyik egy I. klinikai fázisban lévő ex vivo kísérletsorozat, melyben retrovirális rendszerrel bejuttatott TGF-β gént próbálnak alkalmazni a porc újdonképződés serkentésére osteoarthrosisos betegeken [8]. A jelenleg rendelkezésre álló eredmények ellenére még nem vonható le következtetés a génmódosított sejttranszplantációs terápia arthrosisban való alkalmazhatóságával kapcsolatban. Géncsendesítés az osteoarthrosis kezelésében A másik, géneken alapuló terápiás lehetőség a géncsendesítés. Az mirns-ek hatásmechanizmusához hasonlóan, szintetikusan előállított sirns-ek (kis interferáló RNS-ek) segítségével érhető el a komplementer mrns hatástalanítása. A MAPK/ERK-útvonal részt vesz az IL-1β indukálta COX-2 és PGE2 expressziójának szabályozásában. Wang és munkatársai ERK ellen tervezett sirns segítségével csökkentették a COX-2 és PGE2 termelését humán porcsejt tenyészetben [9]. A kis interfeláló RNS-eket alkalmazva olyan központi szerepű jelátviteli molekula is blokkolható, mint például a NF-κβ. A gén csendesítése révén sikerült meggátolni a porc degeneratív folyamatait korai stádiumban. Ezáltal gátolttá vált az IL-1 és TNF-α által indukált COX2, NOS-2 és MMP-9 génexpressziója is. Tehát a NF-κβ pozitív szabályozója a gyulladás kialakulását elősegítő IL-1β és TNF-α géneknek, ezáltal fontos szerepe lehet a degeneratív porcbetegségek kialakulásában is (10). A napjainkban egyre gyakrabban tanulmányozott HIF-2α gén csendesítése a HIF-1α megemelkedett expresszióját eredményezte, mely alátámasztja a HIF-gének fent említett fontos szabályozó szerepét a gyulladásos útvonalak és egyéb gyulladásos faktorok esetében [11]. Megbeszélés Az egészséges porcszövet fiziológiás állapota finoman szabályozott homeosztázis következménye, melyet a porc anabolikus és katabolikus folyamatainak egyensúlya tart fenn. A metabolikus útvonalak számos molekulájának a szerepe tisztázott már az osteoarthrosis kialakulásában. Jelenleg még mindig erős tényként kezeli az irodalom az IL-1β és TNF-α elsődleges szabályozó szerepét a betegség progressziójában, de emellett megjelent a genetikai tényezőket, epigenetikai változásokat is figyelembe vevő globális szemléletmód. Napjainkig újabb és újabb szabályozó molekulák (például a HIF-2α) kerülnek előtérbe, melyek fontos regulátorai lehetnek egy-egy metabolikus részfolyamatnak, mely befolyásolni képes a porcszövet állapotát. Fontos ezeknek a mediátoroknak a körültekintő vizsgálata ahhoz, hogy a későbbiekben potenciális terápiás célpontként szolgálhasson akár a gyógyszer alapú, akár az újabb génmódosított porcsejt beültetés vagy a génterápiás kezelésekben.
10 Dojcsákné Kiss-Tóth Papp Juhászné Szalai Koska Fodor Köszönetnyilvánítás Jelen munka a TÁMOP-4.2.1.B-10/2/KONV-2010-0001 jelű projekt részeként az Új Magyarország Fejlesztési Terv keretében az Európai Unió résztámogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósult meg. Irodalomjegyzék [1] L. N. Reynard, J. Loughlin: Genetics and epigenetics of osteoarthritis. Maturitas, doi: 10.1016/j.maturitas. 2011.12.001, 2011. [2] M. B. Mueller, R. S. Tuan: Anabolic/Catabolic Balance in Pathogenesis of Osteoarthritis: Identifying Molecular Targets. PMR; 3: S3 S11. 2011. [3] R. Egli, L. Southam, J. M. Wilkins et al: Functional analysis of the osteoarthritis susceptibility-associated GDF5 regulatory polymorphism. Arthritis Rheum, 2009, 60, 2055 64. p. [4] S. Miyaki, T. Nakasa, S. Otsuki et al.: MicroRNA-140 is expressed in differen-tiated human articular chondrocytes and modulates interleukin-1 responses. Arthritis Rheum, 2009, 60, 2723 30. p. [5] H. Madry, D. Zurakowski, S. Trippel: Overexpression of human insulin-like growth factor-i promotes new tissue formation in an ex vivo model of articular chondrocyte transplantation. Gene Ther.;8:1443 9. Medline:11593356 doi:10.1038/sj.gt.3301535. 2001. [6] H. Madry, M. Cucchiarini: Clinical potential and challenges of using genetically modifed cells for articular cartilage repair. doi: 10.3325/cmj.2011.52.245. 2011. [7] V. M. Baragi, R. R. Renkiewicz, H. Jordan, J. Bonadio, J. W. Hartman, B. J. Roessler: Transplantation of transduced chondrocytes protects articular cartilage from interleukin 1-induced extracellular matrix degradation. J Clin Invest.;96:2454 60. Medline:7593634 doi:10.1172/jci118303. 1995. [8] C. H. Evans, S. C. Ghivizzani, P. D. Robbins: Arthritis gene therapy s first death. Arthritis Res Ther.;10:110. Medline:18510784 doi:10.1186/ar2411. 2008. [9] Xiang Wang, Fengfeng Li, Cunyi Fan, Chunyang Wang, Hongjiang Ruan: Analysis of isoform specific ERK signaling on the effects of interleukin-1b on COX-2 expression and PGE2 production in human chondrocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2010, 402, 23 29. p. [10] Chen L. X., Lin L.,Wang H. J. et al.: Suppression of early experimental osteoarthritis by in vivo delivery of the adenoviral vector-mediated NF-kappa B p65- specific sirna. Osteoarthritis Cartilage, 2008, 16, 174 184. p. [11] W. B. van den Berg: Osteoarthritis year 2010 in review: pathomechanisms. Osteoarthritis and Cartilage, 2011, 19, 338 341. p.