Molekuláris biológiai diagnosztika alkalmazása (HIV, HCV, HBV szabad vírus mennyiség meghatározás) a napi rutin diagnosztikában Reichenberger Anna Mária, Dr. Sárvári Csilla Dr. Ujhelyi Eszter Fıvárosi Önkormányzat Egyesített Szent István és Szent László Kórház Rendelıintézet V. Fertızı Belgyógyászat, Immunológiai Laboratórium
PCR Polymerase Chain Reaction Polimeráz Lánc Reakció alig több mint egy évtizede fedezték fel és azóta széles kırben elterjedt vizsgálat
2007-tıl COBAS Amplicor real-time rendszer
Vizsgálati palettánk 2008-ban tovább bıvült A HIV-PCR-en kívül, 2008 februárjában a HCV, 2008 májusában a HBV szabad vírus mennyiség meghatározás is HIV bevezetésre került a napi HBV HCV diagnosztikába.
1 nagy csı vagy 2 kis csı EDTA-s vér szükséges
A mintákat 6 órán belül centrifugálni kell (1600 g, 20 perc)
1100 1200 µl-enként csavaros kupakos mőanyag csövekben -70 C on tároljuk
HIV, HBV HCV szobahı : maximum 1 nap nem tárolható 2-8 C : 5 nap 3 nap -20 - -80 C : tartósan tárolható tartósan tárolható olvasztható : 5x 2x! RNS/DNS veszteség nélkül Az eredmény szempontjából legideálisabb 2 órán n belül lefagyasztani a centrifugált mintát
Ha a mintát t más m s intézm zménybıl l küldik, k a vérvv rvétel elıtt mindenképpen konzultáljanak ljanak a vizsgálatot végzı laboratóriummal! riummal! Mikor, hogyan történjen a minta levétele, szállítása
A PCR vizsgálatok eredményét nagyban befolyásolják: Mintavételi módszer Szállítás Feldolgozás Tárolás Betegfaktorok (kor/tünet megléte, a fertızés stádiuma )
Human Immunodeficiency Virus sejtmentes gömb alakú 100 nm átmérıjő RNS tartalmú vírus. Az AIDS kórokozója 100 nm
HIV Szerzett Immunhiányos tünetegyüttes HIV AIDS A fertızés átvihetı szexuális kontaktussal, fertızött vérrel vagy vérkészítményekkel, fertızött anyáról magzatra valamint anyatejjel.
٠a vírus szaporodása és kiürülése dinamikus folyamat ٠a plazma viraemia szintje stabil
- HIV mennyiségi PCR (egyéb labor. Markerekkel együtt) a HIV-1 pozitív betegek progressziójára és antivirális monitorozására - Ferttızött anyák újszülötteinek vizsgálatára HIV AIDS
Hepatitisek 10 x könnyebben terjed, mint a HIV Második leggyakoribb májbetegségi halál ok Minden 12-dik ember hepatitis fertızött Fıleg fertızött vér útján terjed (i.v. drog, szex, tetoválás, piercing)
DNS vírus 42 nm
Hepatitis B vírus A 60-as évek óta lehet kimutatni 1981 óta van ellene oltás Nálunk 1999. Július óta kötelezı (14 éves korban oltanak) Vírushordozók aránya 0,5 1 % Krónikus májbetegségek legfıbb okozója 300-350 millió krónikus beteg világszerte Évente 6 millió ember hal meg HBV szövıdményben
Egy szálú RNS vírus
HEPATITIS C vírus 1989-ben regisztrálták Poszt transzfúziós Hepatitisek 90-95 %-áért felelıs 1992 óta szőrik a véradókat 70 %-ban alakul ki májbetegség a fertızötteknél Magyarországon 160.000 embert regisztráltak Világszerte 170 millió fertızött Tünetmentes hosszú lappangási idı
A fertızöttek 70%-ánál alakul ki májbetegség Súlyos esetben májzsugor vagy akár májcarcinoma
20 hepatitis centrumban Folyamatosak a szőrések
A kétféle hepatitis évente több, mint másfél millió ember halálát okozza világszerte Védekezés: Hepatitis B ellen védıoltás Hepatitis C ellen odafigyelés
HBV és HCV PCR vizsgálatok: Egyéb vírusspecifikus markerekkel együtt - segít a diagnózis felállításában - krónikus betegek terápiás gondozásában
Kvantitatív HCV PCR Interferon (IF) terápia monitorozása Monogram 1. vizsg. 2. vizsg. 3. vizsg. megjegyzés V. A. 2.980.000 IU/ml RNS nem detektálható Eredményes E. A. 24.600 IU/ml 48 RNS nem detektálható terápia G. K. 1.510.000 3.990.000 Interferon (IF) IU/ml IU/ml Kezelés Cs. B. 352.000 214.000 372.000 a PCR alapján IU/ml IU/ml IU/ml eredménytelen G. L. 4.530.000 IU/ml M.H.A. Méréshatár alatt Elviekben abba kéne B. Z. 601.000 IU/ml 23.700 IU/ml 914 IU/ml hagyni az IF terápiát
A PCR vizsgálat
AmpliPrep feltöltése reagensekkel és egyéb kellékekkel
Az automata 3 fı lépése Minta DNS/RNS izolálása AmpliPrep reverz transzkripció TaqMan48 Amplifikálás, jelölt próba mérése TaqMan48
AmpliPrep/TaqMan teszt Valós idejő PCR technológia Adott számú ciklus Ciklusonként növekvı jelzıfesték intenzitás Vizsgált vírus független azonosítása Qualitatív és quantitatív eredmény egyszerre
Target Not Detected - RNS/DNS nem kimutatható Méréshatár alatt - van kimutatható, de nem mérhetı vírusmennyiség a mintában Mért érték A méréstartomány : HIV esetében 40 10.000.000 cp/ml HCV esetében 15 69.000.000 IU/ml HBV esetében 12 110.000.000 IU/ml Méréshatár felett - Az adott értékhatár feletti vírusmennyiség
A vizsgálatok gyakoriságát protokoll írja elı, amelyet a minden évben megtartott consensus meeting határoz meg. (lsd Infektológia 2008 decemberi száma)
2000-2006 összesen 6079 PCR a Real-time rendszer bevezetése - óta: 2007-ben összesen: 1211 2008 HIV 1290 2008 (februártól) HCV 615 2008 (májustól) HBV 220 2008-ban Összesen: 2125 2009 HIV 971 2009 HCV 833 2009 HBV 225 2009-ben Összesen: 2029 (augusztus 25-ig)
A negatív szerológiai eredményt adó minták aránya a kért PCR vizsgálatokhoz képest 800 763 700 600 500 400 300 200 100 200 HCV PCR kérés HCV szerológia negatív HBV PCR kérés HBV szerológia negatív 0 14 = 7% HBV HCV 38 = 5%
Rutinszerően elvégezzük a konfirmáló ELISA vizsgálatot az igen költséges PCR vizsgálat elıtt
Vizsgálat kérések emelkedése havi lebontásban 160 140 120 100 80 60 40 2008 2009 HIV PCR 20 140 120 100 2008 2009 HCV PCR 0 40 35 30 I. III. V. VII. IX. XI. 2008 2009 HBV PCR 80 60 40 20 0 I. III. V. VII. IX. XI. 25 20 15 10 5 0 I. III. V. VII. IX. XI.