Glióma elleni hatóanyag-peptid konjugátumok in vitro biológiai aktivitása Baranyai Zsuzsa 1, Biri-Kovács Beáta 1,2, Martin Krátký 3, Szeder Bálint 4, Debreczeni Márta 5, Cervenak László 5, Méhes Előd 6, Buday László 4, Jarmila Vinšová 3, Bősze Szilvia 1 1 MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport 2 ELTE TTK, Kémiai Intézet 3 Charles University, Faculty of Pharmacy, Department of Inorganic and Organic Chemistry, Hradec Králové, Csehország 4 MTA TTK, Enzimológiai Intézet 5 SE III. Sz. Belgyógyászati Klinika Kutatólaboratóriuma 6 ELTE TTK, Fizikai Intézet, Biológiai Fizika Tanszék Peptidkémiai Munkabizottság tudományos ülése Balatonszemes, 2019. 05. 28.
Bevezetés glióma, glioblastoma multiforme (GBM): az agyban, gerincvelőben található gliasejtek (támasztósejtek) tumoros elváltozása várható túlélés alacsony (~1,5 év) tumor őssejtek: tumor kiújulása, ellenálló képesség vér-agy gát védővonal glioblastoma vér-agy gát tumor őssejt önmegújítás differenciálódás tumorképzés endotélsejt tumorsejt (nem őssejt-típusú) M. Paolillo et al., Brain Sci., 2018, 8, E15. B. D. Liebelt et al., Stem Cells Int., 2016, 2016, 7849890 1
Hatóanyagok sejtbejutásának növelése hatóanyag sok esetben korlátozott sejtbejutás (diffúzió) tumor őssejt konjugátum hordozó / irányító peptid megnövekedett sejtbejutás, szelektivitás (endocitózis, penetráció, stb.) tumorsejt (nem őssejt-típusú) endotélsejt vér-agy gát 2
Célkitűzés tumoros sejtek és tumor őssejtek ellen kiemelkedő aktivitású hatóanyagok és konjugátumok fejlesztése új hatóanyagok szalicilanilid származékok Sal hordozópeptidek receptor célzás: tuftsinszármazékok TKPPR sejtpenetráló peptidek: SynB3-származékok SynB3 = RRLSYSRRRF hatóanyag-peptid konjugátumok szalicilanilidek Sal hordozópeptid daunomicin kémiai és funkcionális jellemzés modell sejtek (2D, 3D) in vitro citosztatikus hatás, sejtbejutás, stb. Zs. Baranyai et al., Eur. J. Med. Chem., 2015, 101, 692-704. Zs. Baranyai et al., Eur. J. Med. Chem., 2017, 133, 152-173. 3
Hordozópeptidek konjugátum hordozó / irányító peptid tuftsinszármazékok pl. H-TKPPR-OH (tuftsin antagonista) glióma sejteken túltermelődő neuropilin-1 receptorhoz kötődhetnek receptor mediált endocitózis (C-end rule, CendR: R/K X X R/K) SynB3-származékok SynB3 (10 aminosav) H-RRLSYSRRRF-NH 2 + + + protegrin 1 peptid lineáris származéka (a protegrinek sertés leukocitákból izolált antimikrobiális peptidek) sejtpenetráló peptid (rövid, kationos, amfipatikus peptidek) átjutás a vér-agy gáton adszorpció mediált transzcitózis - - - + - -+ - + + + + SynB3 - tuftsin tandem konjugátumok receptor célzás megnövekedett sejtbejutás L. Chen et al., J. Biomed. Nanotechnol., 2013, 9, 559-563. Zs. Baranyai et al., Eur. J. Med. Chem., 2017, 133, 152-173. C. Rousselle et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 2001, 296, 124-131. 4
Konjugátumok előállítása konjugálható hatóanyagok: Sal szalicilanilid származék (Sal8) daunomicin hatóanyag-peptid konjugátumok: Sal8, aminooxiacetilezett peptid hatóanyag-peptid konjugátum oximkötéssel kémiai jellemzés: analitikai HPLC tömegspektrometria (ESI-MS) stabilitás vizsgálata in vitro mérések körülményei között fluoreszcens származékok fluoreszcencia tulajdonságainak vizsgálata 5
Vizsgált vegyületek hatóanyagok Sal1 Sal3 Sal8 Niklozamid TMZ lizoszomális fragmensek Aaa-OH Sal8-Aoa-Arg-OH Sal8-Aoa-Gly-OH Sal8-Aoa-Thr-OH -Aoa-Arg-OH -Aoa-Gly-OH -Aoa-Thr-OH fluoreszcensen jelzett és kontroll peptidek hordozó / irányító / Acpeptid Cf Cf/Ac-SynB3 Cf/Ac-GFLG-SynB3 Cf/Ac-SynB3K Cf/Ac-SynB3K(dec) Cf/Ac-T5 Cf/Ac-GFLG-T5 Cf/Ac-T5(4-dec) Cf/Ac-TKPPG-OT10 Cf/Ac-TKPPR-OH Cf/Ac-SynB3-T5 Cf/Ac-SynB3-TKPPR-OH konjugátumok hordozó / irányító peptid Sal8-Aoa-SynB3 Sal8-Aoa-GFLG-SynB3 Sal8-Aoa-T5 Sal8-Aoa-GFLG-T5 Sal8-Aoa-T5(4-dec) Sal8-Aoa-TKPPR-OH -Aoa-SynB3 -Aoa-GFLG-SynB3 -Aoa-SynB3K -Aoa-SynB3K(dec) -Aoa-T5 -Aoa-GFLG-T5 -Aoa-T5(4-dec) -Aoa-TKPPG-OT10 -Aoa-TKPPR-OH -Aoa-SynB3-T5 -Aoa-SynB3-TKPPR-OH TMZ-SynB3 TMZ-GFLG-SynB3 6
7 In vitro sejtbejutás glióma modell fluoreszcensen jelölt hordozópeptidek áramlási citometria (BD LSR II, λ ex = 488 nm) kezelés: 0,1-50 µm, 3 óra Cf peptid U87 humán glioblastoma Élő, Cf+ sejtek átlagos fluoreszcencia intenzitása 10 3 (a.u) 100 80 60 40 20 0 U87, 3 h Cf-SynB3 Cf-GFLG-SynB3 Cf-SynB3K Cf-SynB3K(dec) Cf-T5 Cf-GFLG-T5 Cf-T5(4-dec) Cf-TKPPG-OT10 Cf-TKPPR-OH Cf-SynB3-T5 Cf-SynB3-TKPPR-OH 10 25 50 c (mm)
Élő, Cf+ sejtek átlagos In vitro sejtbejutás glióma modell fluoreszcencia intenzitása 10 3 (a.u) 100 80 60 40 20 0 U87, 3 h Cf-SynB3 Cf-GFLG-SynB3 Cf-SynB3K Cf-SynB3K(dec) Cf-T5 Cf-GFLG-T5 Cf-T5(4-dec) Cf-TKPPG-OT10 Cf-TKPPR-OH Cf-SynB3-T5 Cf-SynB3-TKPPR-OH 10 25 50 c (mm) SynB3 származékok: hasonló sejtbejutási profil (koncentrációfüggés) Cf-SynB3K(dec) dekanoil oldallánc hatása: jobb sejtbejutás, de citotoxikus hatás jelentkezik (IC 50 : 34 μm) IC 50 : 50%-os gátló koncentráció SynB3 tuftsin tandem U87 humán glioblastoma tuftsin származékok: kisebb mértékben jutnak be Cf-T5(4-dec) dekanoil oldalláncú peptid nem citotoxikus tandem származékok: SynB3-hoz hasonló sejtbejutás 7
In vitro sejtbejutás összehasonlítás -konjugátumok Élő, + sejtek átlagos fluoreszcencia intenzitása 10 3 (a.u) Élő, + sejtek átlagos fluoreszcencia intenzitása 10 3 (a.u) 30 U87, 3 h 20 10 5 4 3 2 1 0 30 MDA-MB-435Br, 3 h 20 10 5 4 3 2 1 0 U87 humán glioblastoma Élő, + sejtek átlagos fluoreszcencia intenzitása 10 3 (a.u) 30 20 10 10 25 50 c (mm) MDA-MB-435Br emlőtumor agyi áttét 10 25 50 c (mm) 012345 U87, 3 h áramlási citometria (BD LSR II, λ ex = 488 nm) kezelés: 0,1-50 µm, 3 óra -Aoa-SynB3 -Aoa-SynB3K(dec) -Aoa-SynB3K(dec) -Aoa-TKPPR-OH -Aoa-TKPPR-OH -Aoa-SynB3-TKPPR-OH -Aoa-SynB3-TKPPR-OH : a vegyületre jellemzően nagymértékű sejtbejutás konjugátumok: bejutnak a célsejtekbe -Aoa-SynB3 > -Aoa-SynB3-TKPPR-OH >>> -Aoa-TKPPR-OH 10 HUVEC 25 humán köldökzsinór 50 30 HUVEC, 3 h c véna (mm) endotélsejt 20 -Aoa-SynB3 10 -Aoa-TKPPR-OH -Aoa-SynB3-TKPPR-OH 5 Élő, + sejtek átlagos fluoreszcencia intenzitása 10 3 (a.u) 4 3 2 1 0 10 25 50 c (mm) -Aoa -Aoa -Aoa 9
-Aoa-SynB3- TKPPR-OH -Aoa- TKPPR-OH -Aoa- SynB3 Sejtbejutás, kolokalizáció vizsgálata Hoechst 33342 LysoTracker Deep Red kompozit U87, -konjugátumok, 25 μm, 30 perc kezelés, fixált sejtek -csatornán különböző lézerintenzitást és detektorfeszültséget alkalmaztunk a különböző anyagoknál. sejtmagban sejtmagban főként, és vezikuláris lokalizáció, nincs jelentős lizoszomális lokalizáció főként lizoszómában sejtmagban és lizoszómában is 10 μm 10
IC 50 (μm) IC 50 (μm) IC 50 (μm) In vitro citosztatikus, citotoxikus hatás citosztatikus hatás: 24 óra kezelés, mosás, 72 óra továbbtenyésztés után MTT teszt citotoxikus hatás: 24 óra kezelés, mosás, MTT vagy SYBR-Green teszt 100 U87 - citosztázis 100 100 HUVEC - citotoxicitás 100 100 100 100 100 100 100 80 74,7 80 60 40 46,2 37,1 60 40 20 0 2,5 3,4 17,3 1,7 0,4 8,8 7,0 20 0 6,7 6,1 6,7 8,6 100 U87 - citotoxicitás 100 86,5 80 60 40 20 0 nd 28,0 24,6 nd 3,2 43,9 nd 28,2 nd Sal8, citosztatikus hatása megmarad a konjugátumokban szelektivitás glióma sejtek felé: Sal8, Sal8-konjugátumok, -konjugátumok 11
3D sejtkultúrák (szferoidok) Szferoidok kialakítása 3D Petri Dish, Microtissues agaróz öntés szilikon forma 9x9 agaróz (2 w/v%) sejtek betöltése (U87, MDA-MB-435Br) 10 000 sejt / µl 24-30 óra inkubálás (37 C, 5% CO 2 ) sztereomikroszkóp (YJ-T3C, Ningbo Tianyu Optoelectronic Technology Co., Ltd.) d well = 800 µm d szferoid = 300-400 µm 12
350 μm 3D sejtkultúrák (szferoidok) Szferoidok kezelése, vizsgálata peptid mosás kezelés agaróz formában 3 óra, 37 C magfestés (Hoechst 33342) fixálás (4% paraformaldehid) begyűjtés Ibidi kamra a képek információ tartalmának kvalitatív, 350 μm kvantitatív értékelése fejlesztés alatt szeletek közti előzetes eredmények távolság: 11 μm 55 μm konfokális mikroszkóp (Zeiss LSM 710) 13
z: 11 µm z: 22 µm z: 33 µm z: 44 µm z: 55 µm Hoechst 33342 Szferoidok vizsgálata bejutása U87 glióma szferoidokba z: konfokális sík távolsága a szferoid felszínétől mérve kompozit 200 µm 14
Hoechst 33342 Szferoidok vizsgálata SynB3 TKPPR-OH -Aoa-SynB3-TKPPR-OH tandem konjugátum bejutása U87 glióma szferoidokba z: konfokális sík távolsága a szferoid felszínétől mérve z: 11 µm z: 22 µm z: 33 µm z: 44 µm z: 55 µm kompozit 200 µm 15
Hoechst 33342 kompozit Szferoidok vizsgálata összehasonlítás U87 szferoid -Aoa-SynB3- TKPPR-OH MDA-MB-435Br szferoid -Aoa-SynB3- TKPPR-OH 200 µm 200 µm z: 55 µm z: 55 µm szferoid penetrációs képesség: -Aoa-SynB3-TKPPR-OH > 16
Összefoglalás hordozópeptidek in vitro sejtbejutás Cf SynB3-származékok > Cf SynB3 - tuftsin > Cf tuftsinszármazékok hatóanyag-peptid konjugátumok Sal hordozópeptid in vitro antitumor aktivitás, szelektivitás hordozópeptid szferoidok in vitro tumorpenetráció modellezése a módszer optimálása folyamatban van előzetes eredmény penetrációs képesség: hordozópeptid 17
Köszönetnyilvánítás Dr. Mező Gábor Kiskó Mária Budai Johanna (BME, MSc szakdolgozó) MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport Új Nemzeti Kiválóság Program (ÚNKP-17-3) Nemzeti Versenyképességi és Kiválósági Program (NVKP_16-1-2016-0036) Emberi Erőforrások Minisztériuma, FKIP, 1783 3/2018/ FEKUTSTRAT
Köszönöm a figyelmet!