Peptidekkel a sejtekbe: peptidek mint transzport molekulák

Átírás

1 Alkímia ma előadássorozat 2014 Február 20 Peptidekkel a sejtekbe: peptidek mint transzport molekulák Bánóczi Zoltán MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport

2 Aminosavak α-aminosavak Apoláris oldallánc N H 2 H 2 N N H 2 Gly, G H CH 3 H CH 3 H H 2 N H 3 H 2 N C H 2 N CH 3 H Ala, A H CH 3 H H 2 N H 3 C H N Val, V Leu, L Ile, I Pro, P H 2 N N H 2 H CH 3 H H * R H Poláris oldallánc N H 2 NH 2 H 2 N HS H H 2 N H N H 2 H 2 N H H H 2 N H Asn, N Gln, Q Ser, S Cys, C Thr, T H CH 3 H Phe, F NH Trp, W H 3 C S Met, M

3 Bázikus vagy savas oldallánc H 2 N H N H 2 H H 2 N H NH 2 H 2 N NH NH HN N Lys, K Arg, R His, H N H 2 H H H 2 N H H 2 N H H H Glu, E Asp, D Tyr, Y

4 Nem természetes aminosavak

5 Peptidek A peptidek aminosavakból felépülő oligomerek. N H 2 R H N H 2 R + -H 2 NH R' N H 2 H R' H H-AA 1 -AA 2 -AA 3 -AA 4 -H Alkalmazás: kutatás gyógyszeripar (inzulin, glukagon, octreotide (Sandostatin), oxicotin) édesítőszer (aszpartám: Asp-Phe-Me) szépségápolás (botox: Clostridium botulinum toxin)

6 A sejt A sejt felépítése - sejtmembrán - sejtmag - citoszol mitokondrium endoplazmatikus retikulum Golgi apparátus Bánóczi Z. et al, Bioconjugate Chem. 2010, 21,

7 A sejtmembrán Foszfolipid kettősréteg, mely tartalmaz - koleszterint -membránfehérjéket; receptorok, csatornák, transzport fehérjék - szénhidrátokat; glikoproteinek, glikolipidek H P H + R-H -H 2 H P R R: CH 2 CH 2 NH 2 foszfatidil-etanolamin (kefalin) CH 3 CH 2 CH 2 N + CH3 CH 3 foszfatidil-kolin (lecitin) H 3 C CH 3 CH 3 H 3 C CH 3 CH 3 CH 3 foszfatidsav CH 3 CH 3 H koleszterin

8 Na + Na + extracelluláris tér TM1 TM3 TM5 TM7 Na + Na + G α GDP G βγ intracelluláris tér

9 Transzport útvonalak Passzív transzport Aktív transzport - közvetlen diffúzió - transzport molekulák - csatornákon át - vezikuláris transzport - endocitóziós - makropinocitózis endocitózis diffúzió makropinocitózis Receptor mediált endocitózis lizoszóma lizoszóma transzporter fehérjék /ioncsatornák

10 Anyagok bejuttatása sejtekbe gyógyszermolekulák peptidek, oligonukleotiok polimerek közvetlen diffúzió????? vezikuláris transzport Lipinski-szabály: Ms < 500 H-kötés donor < 5 H-kötés akceptor < 10 partíciós koefficiens (lgp) < 5

11 Sejtpenetráló peptidek- az első megfigyelések Tat (transactivator of HIV transcription) Tat-86 fehérje - internalizál - sejtmagban lokalizálódik - aktiválja a transzkripciót Frankel AD, Pabo C. Cell 1988, 55, GRKKRRQRRRPPQ 60

12 A Drosophila Antennapedia fehérje homeodoménje Homeodomén - átjut az idegsejtek membránján - sejtmagban lokalizálódik - szabályozza az idegsejt fejlődését Joliot A, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1991, 88, RQIKIWFQNRRMKWKK 58

13 Sejtpenetráló peptidek Rövid peptidek, melyek bejutnak a sejtekbe, és a hozzájuk kovalensen kapcsolt molekulákat (fehérje, DN, PNS, gyógyszermolekula) szintén a sejtekbe szállítják, akár 30 kda méretig. Név Aminosavsorrend (fehérje) Származás Tat (48 60) 48 GRKKRRQRRRPPQ 60 HIV-1 Tat fehérje Penetratin 43 RQIKIWFQNRRMKWKK 58 Drosophila Antennapedia fehérje Szignálszekvencia peptidek AAVALLPAVLLALLAP EILLPNNYESYKYPGMFIALSK VQRKRQKLMP Kaposi fibroblast growth factor (K-FGF). Kaposi fibroblast growth factor (K-FGF). NF-kB p50 transzkripciós faktor Hidrofób peptidek MGLGLHLLVLAAALQGA Caïman crocodylus Ig(v) Viriális peptidek/fehérjék MGLGLHLLVLAAALQGAKKKRKV. VP22 fehérje kiméra peptid (Ig(v)-SV40 T-antigén) herpesz szimplex virus-1 1 AVGAIGALFLGFLGAAG 17 HIV gp41 glikoprotein, 8 Met Leu GLFEAIAGFIENGWEGMIDGGGYC Influenza hemaglutinin, Substance P RPKPQQFFGLM neuropeptid Transportan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL kiméra peptid, galanin-mastoparan

14 De novo tervezett peptidek ligopeptidek (Lys, Arg, rn, His) - Hexaarginin* - peptoid molekuláris transzporterek** - Arg távolságának változtatása - guanidino csoport távolsága * Mitchell DJ, et al. J. Pept. Res. 2000, 56, **Wender PA, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97,

15 ligoargininek - hexa- és oktaarginin* (Arg) n (Arg) n Lys S fluoreszcein - arginin fa** (Arg) n Lys Lys Gly-Cys (Arg) n n= 1, 2, 4 és 6 * Futaki S, et al. J. Biol. Chem. 2001, 276, **Futaki S, et al. Biochemistry 2002, 41, Modell peptidek - KLA modell peptid # KLALKLALKALKAALKLA - Modell peptid ## KETWWETWWTEWSQPKKKRKV # Scheller A, et al. J. Pept. Sci. 1999, 5, ## Morris MC, et al. Nat. Biotechnol. 2001, 19,

16 Sejtbejutás követése fluoreszcens technikákkal cf P E P T I D cf P E P T I D

17 lympus CKX41 fluoreszcens mikroszkóp BD LSR II áramlási citométer

18 Első kísérletek - fluoreszcens mikroszkóp - fixálás - 4 C - r n Újabb megfigyelések alapján - nincs fixálás - sejtmembránhoz kötött peptidek eltávolítása - tripszines emésztés - mosás heparinnal - inhibitorok alkalmazása ATP elvonás: NaN 3 és deoxiglükóz endocitozis inhibitorok: metil-β-ciklodextrin, klórpromazin, Richard P.J. et al. J. Biol. Chem. 2003, 278,

19 További módszerek a sejtbejutás követésére Funkcionális vizsgálatok - luciferáz splice korrekciós teszt Lundin P. et al. Bioconj. Chem, 2008, 19, a luciferáz expressziójának gátlása RP-HPLC fluoreszcens detektorral Palm C, et al. Peptides 2006, Tömegspektrometria alkalmazása Burlina F, et al. Angewandte Chemie 2005, 44,

20 Sejtbejutás mechanizmusa Nincs receptor? Nem csak egy folyamat a meghatározó - endocitózis - közvetlen transzlokáció Az alkalmazott körülményektől függ Kosuge M. et al. Bioconj. Chem. 2008, 19,

21 Közvetlen transzlokáció hogyan? Prochiantz, A. Curr. pin. Cell Biol. 2000, 12,

22 Kalpain aktivátor konjugátumok

23 Kalpain enzimek Ca 2+ függő intracelluláris cisztein proteázok. Ca 2+ jel beindítja a jelátviteli útvonalakban található fehérjék hasítását. Az m- és μ-kalpain az emlősök valamennyi szövetében megtalálható. Perrin J.B., et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 2002, 34, Nem aktivált m-kalpain heterodimer Strobl S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000, 97,

24 szubsztrát Szubsztrát vagy inhibitor? enzim ihibítor

25 Kalpasztatin Szervezetben megtalálható specifikus kalpain inhibitor. B Az inhibitor domének 3 régiót tartalmaznak: A, B és C. Csak a B régió rendelkezik inhibitor hatással. Az A és C régióknak megfelelő peptidek aktiválják az izolált kalpain enzimet. A leghatásosabb: A + C. Ca 2+ A Ca 2+ Ca 2+ Ca 2+ C Tompa P., et al., J. Biol. Chem., 2002, 277,

26 Penetratin-Kalpasztatin A (C) N-terminális Konjugátumok szerkezete X-RQIKIWFQQNRRMKWKKC-NH 2 S S C-terminális H-CSGKSGMDAALDDLIDTLGG-NH 2 (AcCSKPIGPDDAIDALSSDFTS-NH 2 ) X-RQIKIWFQQNRRMKWKKC-NH 2 S CH 2 -C-SGKSGMDAALDDLIDTLGG-NH 2 (SKPIGPDDAIDALSSDFTS-NH 2 ) X-RQIKIWFQQNRRMKWKKSGKSGMDAALDDLIDTLGG-NH 2 (SKPIGPDDAIDALSSDFTS-NH 2 ) X: H vagy Hca

27 Két fluorofórral jelölt konjugátum CH H H λ ex = 360 nm λ em = 480 nm λ ex. = 490 nm λ em. = 520 nm 4-(7-hidroxikumaril)-ecetsav (Hca) H 5-karboxifluoreszcein (Flu) H Hca-RQIKIWFQQNRRMKWKKC-NH 2 S S Ac-CSK(Flu)PIGPDDAIDALSSDFTS-NH 2

28 Izolált m-kalpain aktiválása A konjugálás hatása (c = 75 µm) 150 [%] aktivitás mm CaCl 2 0,1 mm CaCl 2 KalpA + KalpC (0,1 mm) PenKalpA + PenKalpC S-S (0,1 mm) 0 PenKalpA + PenKalpC amid (0,1 mm) PenKalpA + PenKalpC tio (0,1 mm) Bánóczi Z. et al. Bioconjugate Chem. 2007, 18,

29 Jelölt konjugátumok bejutása CS-7 sejtekbe A) HcaPenKalpA amid B) HcaPenKalpC tioéter C) HcaPenKalpC tioéter HcaPenCalp(Flu)C konjugátum diszulfid híddal

30 Kalpain aktivitás CS-7 sejtek lizátumában m-kalapin aktivitás, szubsztrát emésztésben megadva (mm/s) x mm CaCl mm EDTA 10 mm CaCl 2 Kontrol Konjugátum A+C Kontrol Konjugátum A+C 0 perc 30 perc Kezelés: c= 330 µm; 4 h, 37 C-on

31 Intracelluláris kalpain aktivitás mérése

32 szubsztrát Enzim aktivitás mérése

33 FRET szubsztrát (fluorescence resonance energy transfer) Flu P E P T I D Abs enzim Flu + P E P T I D Abs

34 Kalpain specifikus szubsztrát Új és optimalizált FRET (fluorescence resonance energy transfer) szubsztrát, mely a kalpain hasítási helyek preferencia mátrixán alapul. H3C N H3C N N NH TPLKSPPPSPR NH NH - Na + S DABCYL EDANS Alkalmas in vitro mérésekre: a fluoreszcencia intenzitás csak a kalpain aktivitástól függ. Tompa P., et al. J. Biol. Chem. 2004, 279,

35 Sejtpenetráló szubsztrát szintézise Rink-amid gyantán Fmoc/ t Bu stratégiával: DABCYL-TPLKSPPPSPRERRRRRRR-NH 2 1. Fmoc-Su 2. EDANS/BP/HBt/DIEA DABCYL-TPLK(Fmoc)SPPPSPRE(EDANS)RRRRRRR-NH 2 20 % piperidin/dmf DABCYL-TPLKSPPPSPRE(EDANS)RRRRRRR-NH 2 BP: benzotriazol-1-(iloxi)trisz(dimetil-amino)foszfonium-hexafluorofoszfát Bánóczi Z. et al. Bioconjugate Chem. 2008, 19,

36 Sejtpenetráló szubsztrát emésztése FInt λ gerj. Emésztés előtt Emésztés után (nm) c szubsztrát = 200 µm., c KalpainB = 0,5 µm λ gerj. =320 nm, λ em. = 480 nm Szubsztrát K M (µm) k cat (s -1 ) k cat /K M (M -1 s -1 ) DABCYL- TPLKSPPPSPR-EDANS DABCYL-TPLKPPPSPRE(EDANS)RRRRRRR-NH Bánóczi Z. et al. Bioconjugate Chem. 2008, 19,

37 Sejtpenetráló szubsztrát sejtbejutása a) b) fluorescence mean Dabcyl-TPLK(cf)SPPPSPRE-NH 2 Dabcyl-TPLK(cf)SPPPSPRERRRRRRR-NH c [µm] CS-7 sejteket 3 órán át kezeltünk CS-7 sejteket kezeltünk C= 330 mm, 4 h

38 Kalpain aktivitás sejtlizátumban di/dt 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Ca 2+ nélkül 10 mm Ca 2+ Inhibitor jelenlétében c= 20 µm 0 A B C mm Ca 2+ A) Szubsztrát S2 sejtek lizátumában B) Szubsztrát kalpaint túltermelő S2 sejtek lizátumában C) LY-AMC kalpaint túlteremelő sejtek lizátumában F int c LY-AMC = 1 mm vagy c szubsztrát = 100 µm LY-AMC: λ gerj. =380 nm, λ em. = 460 nm Szubsztrát: λ gerj. =320 nm, λ em. = 480 nm t (s) S2 sejteket kezeltünk szubsztrát oldattal (c=150 µm) C-on, 20 órán keresztül, majd lizáltuk.

39 Ex vivo vizsgálatok ktaarginin-kalpasztatin A és C konjugátumok Konjugátumok hatása a hosszútávú potancializálásra (long-term synaptic potentiation, LTP) LTP-t tetanizáló stimulálással indukáltuk: hippocampus szövetekben: stimulálás intenzitása T, frekvencia 100 Hz, időtartalma 5 s, és a cortex szövetekben 2T, frekvencia 10 Hz. 2T stimulálásra adott válaszokban bekövetkező változásokat 30 perccel az LTP indukció után mértük. (* P < 0.05, ** P < 0.001) Világi I. et al. Mol. Cell. Neurosci. 2008, 38,

40 Hipocampus szöveteket kezeltünk 5 percig a sejtpenetráló szubsztrát oldatával (c=50 µm), majd kalpasztatin A és C konjugátumot adtunk az elegyhez (c=5 μm) és a kezelést további 15 percig folytatuk. Piramidális sejtek régiója (üres nyilak) és más régiók (tele nyilak). Hipocampus szöveteket 5 percig kezeltünk a sejtpenetráló szubsztrát oldatával (c=50 µm).

41 Nem számít semmi, csak az, hogy Kérdezz! Keresd a választ! Nem fontos semmi, csak az, hogy Kérdezz! Keresd a választ! Ne higgy el mindent, de mégis Kérdezz! Keresd a választ! Bárki vagy, mindegy, a lényeg: Kérdezz! Keresd a választ! Kérdezz! Tankcsapda: Kérdezz (Connektor:567, 1997)