Kalmodulin és az ér-reaktivitásban fontos enos és MLCK enzimek kölcsönhatásának szabályozása szfingolipid mediátorokkal

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "Kalmodulin és az ér-reaktivitásban fontos enos és MLCK enzimek kölcsönhatásának szabályozása szfingolipid mediátorokkal"

Amanda Szekeresné
5 évvel ezelőtt
Látták:

szfingolipid mediátorokkal Benyó Zoltán SE Klinikai

Károly MTA TTK Enzimológiai Intézet MedInProt

1 Kalmodulin és az ér-reaktivitásban fontos enos és MLCK enzimek kölcsönhatásának szabályozása szfingolipid mediátorokkal Benyó Zoltán SE Klinikai Kísérleti Kutatóés Humán Élettani Intézet Liliom Károly MTA TTK Enzimológiai Intézet MedInProt Fehérjetudományi Kiválósági Együttműködési Program Budapest, 215. november 14.

2 Szfingolipid mediátorok S1P Sph szerkezeti lipid SMase ceramidase SMaseD SM Cer SPC Membránalkotó szfingolipidekből (elsősorban szfingomielinből) keletkeznek a jelátvitelben aktiválódó foszfolipázok hatására. A sejtek növekedési, túlélési/apoptózis, differenciációs és migrációs folyamatainak fontos élettani és patológiás szabályozó molekulái.

Szfingolipid mediátorok: elsődleges és másodlagos hírvivők Fluo-4 fluorescence Fluo-4 fluorescence 3 No caged-s1p 25 HepG2 S1P S1P 1 2 1 5

Bautista DL, Van Brocklyn JR, Lorincz Z, Fischer DJ, Baker DL, Liliom K, Spiegel S, Tigyi G (2) J Biol Chem 275(5):39379-84.

, Fujiwara Y, Osborne DA, Walker MD, Wang DA, Bautista DA, Liliom K, Van Brocklyn JR, Parrill AL, Tigyi G (27) J Biol Chem 282(4):2374-85

3 Szfingolipid mediátorok: elsődleges és másodlagos hírvivők Fluo-4 fluorescence Fluo-4 fluorescence 3 No caged-s1p 25 HepG2 S1P S1P µm S1P ARG12 GLU 121 ARG mm ATP UV flash 4 µm caged-s1p 15 1 S1P-specfikus GPCR: S1P 1-5 Parrill AL, Wang D, Bautista DL, Van Brocklyn JR, Lorincz Z, Fischer DJ, Baker DL, Liliom K, Spiegel S, Tigyi G (2) J Biol Chem 275(5): , Wang DA, Lorincz Z, Bautista DL, Liliom K, Tigyi G, Parrill AL (21) J Biol Chem 276(52): , Fujiwara Y, Osborne DA, Walker MD, Wang DA, Bautista DA, Liliom K, Van Brocklyn JR, Parrill AL, Tigyi G (27) J Biol Chem 282(4): Time (s) A HepG2 sejtek plazmamembránján nincsenek S1P receptorok. Meyer zu Heringdorf D, Liliom K, Schaefer M, Danneberg K, Jaggar JH, Tigyi G, Jakobs KH (23) FEBS Lett 554(3):443-9

az ER thapsigarginszenzitív tartályaiból szabadítja fel a Ca 2+ -ionokat.

4 Melyik fehérje közvetíti a receptor-független hatást? SPC ER G IP 3 S1P G Ca 2+ SPC S1P Sph SphK G GPCR FceRI RTK Az S1P és az SPC az IP 3 -receptortól függetlenül az ER thapsigarginszenzitív tartályaiból szabadítja fel a Ca 2+ -ionokat. A kalmodulinról ismert, hogy szabályozza az IP 3 -receptort. Hipotézisünk: az S1P és/vagy az SPC a kalmodulinra hatva mobilizálhatja intracellulárisan a Ca 2+ -ionokat. 4 Ca 2+ apokalmodulin Ca 2+ -kalmodulin

Az SPC a kalmodulin kompetitív gátlószere Kovacs E, Tóth J, Vértessy BG, Liliom K (21) Dissociation of calmodulin-target peptide complexes by the lipid mediator

5 Az SPC a kalmodulin kompetitív gátlószere Kovacs E, Tóth J, Vértessy BG, Liliom K (21) Dissociation of calmodulin-target peptide complexes by the lipid mediator sphingosylphosphorylcholine: implications in calcium signaling. J Biol Chem 285(3): Kovacs E, Liliom K (28) Sphingosylphosphorylcholine as a novel calmodulin inhibitor. Biochem J 41(2):427-37

kcal / mol of injectant (CaM) kcal / mol of injectant (CaM) Kalmodulin kölcsönhatása szfingozinnal Normalized calcineurin activity Affinitás + sztöchiometria Sph Ca 2+ -CaM kristályszerkezete

6 kcal / mol of injectant (CaM) kcal / mol of injectant (CaM) Kalmodulin kölcsönhatása szfingozinnal Normalized calcineurin activity Affinitás + sztöchiometria Sph Ca 2+ -CaM kristályszerkezete Funkcionális esszék Sph+apoCaM Molar ratio 4 3 B no Sph 15 M Sph 2 1 Sph+Ca 2+ -CaM Molar ratio. 1E-6 1E-5 1E-4 1E Calmodulin ( M) A szfingozin is kötődik mind az apo-, mind a Ca 2+ -kalmodulinhoz és gátolja azok funkcióját.

7 A kalmodulin SPC és Sph kötődésére zárt inhibitorikus konformációt vesz fel Sph SPC M13 target peptid Kovacs E, Harmat V, Tóth J, Vértessy BG, Módos K, Kardos J, Liliom K (21) Structure and mechanism of calmodulin binding to a signaling sphingolipid reveal new aspects of lipid-protein interactions. FASEB J 24 (1):

Kerék M, Németh T, Faragó B, Balogh A, Patil R, Jennings BL, Liliom K, Malik KU, Smrcka AV, Tigyi G, Benyó Z

8 enos és MLCK az értónus szabályozásában? szfingozin in vivo? GPCR endotélsejt? PLC Ca 2+ CaM enos NO GPCR sgc MLCK Ca 2+ CaM PLC simaizomsejt Relaxáció Kontrakció Ruisanchez É, Dancs P, Kerék M, Németh T, Faragó B, Balogh A, Patil R, Jennings BL, Liliom K, Malik KU, Smrcka AV, Tigyi G, Benyó Z (214) Lysophosphatidic acid induces vasodilation mediated by LPA1 receptors, phospholipase C, and endothelial nitric oxide synthase. FASEB J 28(2):88-9

9 A projekt előző fázisában elért eredmények A szfingozin kalmodulin-függő módon gátolja az enos aktivitását in vitro és az enos által közvetített vazorelaxációt ex vivo egér aorta-gyűrűkön Sph GPCR PLC Ca 2+ CaM enos NO GPCR sgc MLCK Ca 2+ CaM PLC Relaxáció Kontrakció

10 Gátolják-e a szfingozin és analógjai az enos és az MLCK kalmodulin-függő aktivitását in vitro és ex vivo? ceramid szfingozin GPCR? C2-ceramid dimetil-szfingozin dihidro-szfingozin PLC Ca 2+ CaM enos NO GPCR sgc MLCK Ca 2+ CaM PLC Relaxáció Kontrakció

11 Danzil-CaM fluoreszcencia A dimetil-szfingozin és a dihidro-szfingozin is kötődnek a kalmodulinhoz Danzil-CaM fluoreszcencia 5 apo-cam no lipid 1 um Sph 1 um DMS 1 um dih-sph treo 1 um dih-sph treo/eritro 75 Ca 2+ CaM no lipid 1 um Sph 1 um DMS 1 um dih-sph treo 1 um dih-sph treo/eritro Hullámhossz (nm) Hullámhossz (nm) A szfingozin, dimetil-szfingozin és dihidro-szfingozin kötődésének hatására a danzil-jelölő fluoreszcencia intenzitása megnő és a maximális emisszió hullámhossza kék-eltolódást mutat. A ceramidok kötődését nem tudtuk kimutatni a danzil-fluoreszcenciás mérésben.

12 MLCK activity (AU) A szfingozin és analógjai gátolják az MLCK kalmodulin-függő aktivitását in vitro MLCK activity (AU) 7 6 no lipid 25 um Sph 4 DMS Sph dih-sph treo/eritro EC 5 = 7 nm EC 5 = 1,4 M CaM ( M) Lipid (um) Az MLCK enzimet növekvő koncentrációjú kalmodulinnal aktiváltuk, illetve közepes kalmodulin mellett növekvő koncentrációjú lipidekkel inkubáltuk. Már 25 M szfingozin jelenlétében az MLCK aktivitás nagymértékben gátlódik, illetve a dimetil-szfingozin és a dihidro-szfingozin gátlási hatékonysága azonos a szfingozinéval. (C.M.C ~ 1-15 M) A ceramid vegyületek nem gátolták az MLCK kalmodulin-függő aktivitását.

13 Gátolja-e a szfingozin és a dimetil-szfingozin az MLCK által közvetített vazokonstrikciót? szfingozin dimetil-szfingozin GPCR PLC Ca 2+ CaM enos NO?? GPCR sgc MLCK Ca 2+ CaM PLC Relaxáció Kontrakció?

14 Szfingozin (B panel, 1 M), dimetil-szfingozin (DMS, D panel, 1 M) ill. vehikulumaik (A és C panelek) hatásai a fenilefrin (PE) okozta vazokonstrikcióra K o n tra k c ió (% ± S E M ) K o n tra k c ió (% ± S E M ) K o n tra k c ió (% ± S E M ) K o n tra k c ió (% ± S E M ) A D M S O e lő tt D M S O u tá n B C -1 8 s z fin g o z in e lő tt C -1 8 s z fin g o z in u tá n * * * * * * lo g [P E ], M lo g [P E ], M C C h lo ro fo rm e lő tt C h lo ro fo rm u tá n D D M S e lő tt D M S u tá n * * * * * lo g [P E ], M lo g [P E ], M MedInProt Fehérjetudományi Kiválósági Együttműködési Program, Budapest 215. március 21. Benyó-Liliom

15 Feltételezett magyarázat: Szfingozin, ill. dimetil-szfingozin gátolja az enos-függő vazorelaxációt és ezáltal közvetve fokozza a vazokonstrikciót PE szfingozin dimetil-szfingozin α1 PE PLC Ca 2+ CaM enos NO α1 sgc MLCK Ca 2+ CaM PLC Relaxáció Kontrakció

16 Szfingozin (B panel, 1 M), dimetil-szfingozin (DMS, D panel, 1 M) ill. vehikulumaik (A és C panelek) hatásai az acetilkolin (ACh) okozta enos-függő vazodilatációra R e la x á c ió (% S E M ) R e la x á c ió (% S E M ) R e la x á c ió (% S E M ) R e la x á c ió (% S E M ) A D M S O e lő tt 8 D M S O u tá n B C -1 8 s z fin g o z in e lő tt 8 C -1 8 s z fin g o z in u tá n * lo g [A C h ], M 2 * * lo g [A C h ], M C C h lo ro fo rm e lő tt D D M S e lő tt 8 C h lo ro fo rm u tá n 8 D M S u tá n * * 2 2 * lo g [A C h ], M lo g [A C h ], M MedInProt Fehérjetudományi Kiválósági Együttműködési Program, Budapest 215. március 21. Benyó-Liliom

17 A hipotézis tesztelése enos-ko erek vizsgálatával PE szfingozin dimetil-szfingozin α1 PE X PLC Ca 2+ CaM enos NO α1 sgc MLCK Ca 2+ CaM PLC X Relaxáció X X Kontrakció

18 Szfingozin (B panel, 1 M), dimetil-szfingozin (DMS, D panel, 1 M) ill. vehikulumaik (A és C panelek) hatásai a fenilefrin (PE) okozta vazokonstrikcióra enos-ko erekben K o n tra k c ió (% ± S E M ) K o n tra k c ió (% ± S E M ) K o n tra k c ió (% ± S E M ) K o n tra k c ió (% ± S E M ) A D M S O e lő tt 1 4 D M S O u tá n lo g [P E ], M B C -1 8 s z fin g o z in e lő tt 1 4 C -1 8 s z fin g o z in u tá n lo g [P E ], M C C h lo ro fo rm e lő tt C h lo ro fo rm u tá n D D M S e lő tt D M S u tá n lo g [P E ], M lo g [P E ], M MedInProt Fehérjetudományi Kiválósági Együttműködési Program, Budapest 215. március 21. Benyó-Liliom

19 Konklúzió PE szfingozin dimetil-szfingozin α1 PLC Ca 2+ CaM enos NO penetráció lassú? metabolizmus? PE α1 sgc MLCK Ca 2+ CaM PLC Relaxáció Kontrakció

20 Konklúzió Megmutattuk, hogy a kalmodulin-antagonista hatású szfingozin gátolja az enos kalmodulin-függő aktivitását in vitro és egér aorta szegmenseken ex vivo Megmutattuk, hogy a szfingozin és analógjai gátolják az MLCK kalmodulin-függő aktivitását in vitro A ceramidok kötődését és hatását a kalmodulinon nem tudtuk kimutatni A dimetil-szfingozin a szfingozinnal azonos aktivitású egér aorta szegmenseken ex vivo MedInProt Fehérjetudományi Kiválósági Együttműködési Program, Budapest 215. március 21. Benyó-Liliom

21 Köszönetnyilvánítás Juhász Tünde Ruisanchez Éva Dancs Péter, Hricisák László, Kerék Margit Köszönjük a MedInProt támogatását!

Hasonló dokumentumok

A MASP-1 dózis-függő módon vazorelaxációt. okoz egér aortában

A MASP-1 dózis-függő módon vazorelaxációt. okoz egér aortában Analog input Analog input 157.34272 167.83224 178.32175 188.81127 Relaxáció (prekontrakció %) Channel 8 Channel 8 Analog input Volts Volts Channel 12 A dózis-függő módon vazorelaxációt Vehikulum 15.80