2.6.13. NEM STERIL TERMÉKEK MIKROBIOLÓGIAI VIZSGÁLATA: VIZSGÁLAT MEGHATÁROZOTT MIKROORGANIZMUSOKRA

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 1 01/2008:20613 javított 6.0 2.6.13. NEM STERIL TERMÉKEK MIKROBIOLÓGIAI VIZSGÁLATA: VIZSGÁLAT MEGHATÁROZOTT MIKROORGANIZMUSOKRA Ez az általános fejezet két vizsgálatcsoportot foglal magában. Az 1. csoport a cikkelyeknek való megfelelés meghatározására szolgáló referenciamódszereket tartalmazza. Ezért amennyiben egy cikkely jelen fejezetre hivatkozik, úgy a hivatkozás az 1. csoport követelményeinek való megfelelésre vonatkozik, hacsak a 2. csoport vizsgálatait nem engedélyezték. A 2. csoportban közölt vizsgálatok szintén az Európai Gyógyszerkönyv részét képezik, tehát ilyen értelemben lehet rájuk hivatkozni, különösen forgalomba hozatali engedéllyel kapcsolatos eljárás esetén. A tervek szerint az érintett cikkelyek felülvizsgálata során az 1. csoport vizsgálatai helyébe a 2. csoport vizsgálatai lépnek. A 2. csoport vizsgálati módszereit a Japán Gygyszerkönyvvel és az Egyesült Államok Gyógyszerkönyvével (USP) együttműködésben fejlesztették ki, a követelményrendszer harmonizálása céljából. A. AZ EURÓPAI GYÓGYSZERKÖNYV MÓDSZERE Ebben az általános módszerben bizonyos szelektív táptalajok használata javasolt. Szelektív táptalajok felhasználásával általában szubletálisan károsodott mikroorganizmusok nem mutathatók ki. Minthogy a szubletálisan károsodott mikroorganizmusok jelentősen befolyásolják a termékek minőségét, a szelektív táptalajokon végzett vizsgálatoknak reaktiválási eljárást is kell tartalmazniuk. Amennyiben a vizsgálandó termék antimikrobás hatással rendelkezik, ezt megfelelő módon semlegesíteni kell. Enterobaktériumok és néhány más Gram-negatív baktérium Noha a vizsgálatot az Enterobacteriaceae családba tartozó baktériumok kimutatására dolgozták ki, ismeretes, hogy a vizsgálattal más típusú mikroorganizmusok (pl. Aeromonas, Pseudomonas) is kimutathatók. A baktériumok kimutatása. A vizsgálandó terméket a 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint készítjük elő, azzal a különbséggel, hogy nátrium-klorid pepton tompítóoldat (ph 7,0) helyett D folyékony táptalajt használunk. A keveréket homogenizáljuk, majd 35 37 C-on annyi ideig inkubáljuk, amennyi a

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 2 baktériumok reaktiválásához elegendő, de szaporodásukhoz nem (ez általában 2 óra, de legfeljebb 5 óra). A keveréket tartalmazó tartályt felrázzuk ( A homogenizátum), kiveszünk belőle a termék 1 g-jának (vagy 1 ml-ének) megfelelő részletet, ezt 100 ml E dúsító táptalajba visszük és 18-48 órán keresztül 35 37 C-on inkubáljuk. A dúsító táptalajból ezután F agar táptalaj-lemezekre oltunk. Az inkubálás 18-24 órán keresztül 35-37 C-on történik. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha egyetlen lemezen sem fejlődnek ki Gram-negatív baktériumtelepek. Mennyiségi értékelés. Az E folyékony dúsító táptalaj megfelelő mennyiségeit beoltjuk A homogenizátummal és/vagy ennek hígításaival, amelyek 0,1, 0,01, ill. 0,001 g-ot (vagy 0,1, 0,01, ill. 0,001 ml-t) tartalmaznak a vizsgálandó termékből. A beoltott táptalajokat 24-48 órán keresztül 35-37 C-on inkubáljuk. A szelektív izoláció érdekében mindegyik tenyészetet átoltjuk F agar táptalaj-lemezre, és 18-24 órán keresztül 35-37 C-on inkubáljuk. Jól kifejlett, általában vörös vagy vöröses Gram-negatív baktériumtelepek megjelenése pozitív eredményt jelent. A terméknek azt a legkisebb mennyiségét, amely pozitív eredményt ad és azt a legnagyobb mennyiségét, amely negatív eredményt ad, feljegyezzük. A 2.6.13.-1. táblázat alapján megállapítjuk a valószínű baktériumokszámot. 2.6.13.-1. táblázat Az egyes termékmennyiségek esetén kapott eredmények 0,1 g vagy 0,1 ml 0,01 g vagy 0,01 ml 0,001 g vagy 0,001 ml Valószínű baktériumszám 1 g termékre vonatkoztatva + + + >10 3 + + >10 2 és <10 3 + >10 és <10 2 <10 Transzdermális tapaszok vizsgálatakor 50 ml B-kivonatot (amelyet a 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint készítettünk elő) steril membránszűrőn megszűrünk, a membránt 100 ml E folyékony dúsító táptalajba helyezzük és 18-24 órán keresztül 35-37 C-on inkubáljuk. Inkubálás után enterobaktériumok és más Gram-negatív mikroorganizmusok kimutatása céljából F agar táptalajon szélesztjük.

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 3 Escherichia coli A 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint előkészített vizsgálandó termék 10 ml-ével vagy 1 g-jának (ill. 1 ml-ének) megfelelő mennyiséggel beoltunk 100 ml A folyékony táptalajt. A beoltott táptalajt homogenizáljuk és 18-48 órán keresztül 35-37 C-on inkubáljuk. A tartályt összerázzuk, tartalmából 1 ml-t 100 ml G folyékony táptalajba oltunk át és 18-24 órán keresztül 43-45 C-on inkubáljuk. H agar táptalaj-lemezekre átoltva 18-72 órán keresztül 35-37 C-on folytatjuk a tenyésztést. Vörös, nem-mukoid Gram-negatív pálcákból álló baktériumtelepek keletkezése E. coli jelenlétére utal, amit megfelelő biokémiai vizsgálatokkal, pl. indol-reakcióval megerősítünk. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha az említett telepek nem láthatók, vagy ha a megerősítő biokémiai reakciók negatívak. Salmonella A vizsgálandó terméket a 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint készítjük elő, azzal a különbséggel, hogy nátrium-klorid pepton tompítóoldat (ph 7,0) helyett A folyékony táptalajt használunk. A beoltott táptalajt homogenizáljuk, majd 18-24 órán keresztül 35-37 C-on inkubáljuk. A dúsított tenyészet 1 ml-ét 10 ml I folyékony táptalajba oltjuk át és 18-24 órán keresztül 41-43 C-on inkubáljuk. Három agar-táptalaj ( J, K és L ) közül legalább két különbözőre továbboltunk és ezeket 18-72 órán keresztül 35-37 C-on inkubáljuk. Salmonellabaktériumok valószínű jelenlétére utal a következő telepek megjelenése: J agar-táptalajon: jól kifejlődött, színtelen telepek, K agar-táptalajon: jól kifejlődött, vörös telepek, fekete középponttal vagy anélkül, L agar-táptalajon: kicsi, áttetsző, színtelen vagy rózsaszínű, máskor átlátszatlan, fehér telepek, melyeket gyakran rózsaszínű vagy vörös zóna övez. Néhány gyanús telepet, felületi és mély beoltást alkalmazva, külön-külön átoltunk kémcsövekben lévő M agar-táptalajra. szalmonellák jelenlétének gyanúját ideiglenesen megerősíti, ha a szín a mélykultúrában vörösről sárgára változik (a felületi tenyészetben azonban nem), miközben az agarban rendszerint gázfejlődés tapasztalható, hidrogén-szulfid képződésével vagy anélkül. Biztos igazolást megfelelő biokémiai és szerológiai vizsgálatokkal nyerhetünk. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha a fent leírt típusnak megfelelő telepek nem jelennek meg, vagy ha az igazoló biokémiai és szerológiai próbák negatívak. Pseudomonas aeruginosa

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 4 A 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint előkészített vizsgálandó termék 10 ml-ével vagy 1 g-jának (ill. 1 ml-ének) megfelelő mennyiséggel beoltunk 100 ml A folyékony táptalajt. A beoltott táptalajt homogenizáljuk, majd 18-48 órán keresztül 35-37 C-on inkubáljuk. Ezután átoltjuk N agar-táptalaj-lemezre, és 18-72 órán keresztül 35-37 C-on tovább inkubáljuk. Amennyiben mikroorganizmusnövekedés nem észlelhető, a termék megfelel a vizsgálat követelményének. Ha Gram-negatív pálcák szaporodását észleljük, néhány morfológiailag eltérő izolált telepet átoltunk A folyékony táptalajba és 18-24 órán keresztül 41-43 C-on inkubáljuk. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha 41-43 C-on a baktériumtelepek nem észlelhetők. Transzdermális tapaszok vizsgálatakor a 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint előkészített A-kivonat 50 ml-ét steril membránszűrőn megszűrjük, a membránt 100 ml A folyékony táptalajba helyezzük és 18-48 órán keresztül 35-37 C-on inkubáljuk. Inkubálás után N agar táptalajon szélesztjük. Staphylococcus aureus A 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint előkészített vizsgálandó termék 10 ml-ével vagy 1 g-jának (ill. 1 ml-ének) megfelelő mennyiséggel beoltunk 100 ml A folyékony táptalajt. A beoltott táptalajt homogenizáljuk és 18-48 órán keresztül 35-37 C-on inkubáljuk. Ezután átoltjuk O agar táptalaj-lemezre és 18-72 órán keresztül 35-37 C-on tovább inkubáljuk. Jól látható zónával körülvett, Gram-pozitív coccusokból álló fekete telepek S. aureus jelenlétére utalnak. Ezt megfelelő biokémiai próbákkal, pl. koaguláz- és dezoxiribonukleáz-próbával erősíthetjük meg. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha a leírt típusú telepek O agar-táptalajon nem észlelhetők, vagy ha az igazoló biokémiai próbák negatívak. Transzdermális tapaszok vizsgálatakor a 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint előkészített A-kivonat 50 ml-ét steril membránszűrőn megszűrjük, a membránt 100 ml A folyékony táptalajba helyezzük és 18-48 órán keresztül 35-37 C-on inkubáljuk. Inkubálás után O agar táptalajon szélesztjük. A táptalajok mikroorganizmus-növekedést elősegítő képessége és szelektív tulajdonságai; a vizsgálat érvényessége A dehidratált táptalaj-készítmények minden egyes gyártási tételét alá kell vetni a következőkben leírt vizsgálatoknak. A következőképpen járunk el: az alább felsorolt referenciatörzseket a megfelelő (pl. az itt megadott) táptalajt tartalmazó kémcsövekben külön-külön 18-24 órán át 30-35 C-on inkubáljuk.

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 5 Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa pl. ATCC 6538 (NCIMB 9518, CIP 4.83): A folyékony táptalajban, pl. ATCC 9027 (NCIMB 8626, CIP 82.118): A folyékony táptalajban, Escherichia coli pl. ATCC 8739 (NCIMB 8545, CIP 53.126): A folyékony táptalajban, Salmonella typhimurium nincs ajánlott referencia-törzsszám (emberre ártalmatlan Salmonella, pl. Salmonella abony [NCTC 6017, CIP 80.39] is használható): A folyékony táptalajban. pepton tompítóoldattal (ph 7,0) hígítva mindegyik tenyészetből milliliterenként kb. 1000 életképes mikroorganizmust tartalmazó referenciaszuszpenziót készítünk. A S. aureus, P. aeruginosa, E.coli és Salmonella baktérium- szuszpenziók azonos térfogatú részleteiből keveréket készítünk, melynek 0,4 ml-ét használjuk inokulumként (törzsenként kb. 100 mikroorganizmus) a vizsgálandó termék jelenlétében és anélkül is. A megfelelő mikroorganizmusokra pozitív eredményt kell kapnunk. Clostridiumok Az alább leírt vizsgálatok célja különböző. Az első módszer olyan termékek ellenőrzésére szolgál, amelyeknél a patogén clostridiumokat feltétlenül ki kell zárni, és ellenőrizni kell, hogy a termék mentes-e ezektől. Az ilyen termékekben általában alacsony az összes mikroorganizmus-szám. A második módszer félkvantitatív vizsgálat Clostridium perfringensre, és olyan termékek vizsgálatára szolgál, amelyeknél az e fajhoz tartozó mikroorganizmusok száma minőségi követelmény. 1. Vizsgálat Clostridiumokra A 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint előkészített vizsgálandó termék két egyenlő (1-1 g-jának vagy 1-1 ml-ének megfelelő) részletét vizsgáljuk. Az egyik részletet 10 percig 80 C-on melegítjük, majd gyorsan lehűtjük. A másik részletet nem melegítjük. A két homogenizált részlet 10-10 ml-ét két olyan 38 200 mm-es tartályba vagy más alkalmas edénybe töltjük, amelyek mindegyike 100 ml P táptalajt tartalmaz; ezeket 48 órán át 35-37 C-on anaerob körülmények között inkubáljuk. Inkubálás után mindegyik edényből Q táptalajra oltunk át, amelyhez előzetesen gentamicint adtunk, majd a táptalajt 48 órán át 35-37 C-on anaerob körülmények között inkubáljuk. A termék megfelel a vizsgálatnak, ha mikroorganizmus-növekedés nem észlelhető. Ha mikroorganizmus-növekedés észlelhető, minden eltérő formájú telepből gentamicint nem tartalmazó Q táptalajra oltunk át, és ezeket mind aerob, mind anaerob körülmények között inkubáljuk. A csak anaerob körülmények között

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 6 növekedő, negatív kataláz-próbát adó Gram-pozitív bacillusok megjelenése (endospórával vagy anélkül) Clostridium fajok jelenlétére utal. Szükség esetén összehasonlítjuk a két lemezen kialakult telep morfológiáját és kataláz-próbát végzünk, hogy kizárjuk a pozitív kataláz-próbát adó aerob és fakultatív anaerob Bacillus fajokat. A kataláz-próba amelyet egy csepp R hígított hidrogén-peroxid oldat hozzáadásával végzünk alkalmas különálló telepek vizsgálatára közvetlenül az agar-lemezen vagy indirekt módon, tárgylemezre vitel után. Gázbuborékok képződése pozitív kataláz-próbát jelez. 2. Clostridium perfringens-szám A 2.6.12 fejezetben leírt általános módszer szerint előkészített vizsgálandó termékből nátrium-klorid pepton tompítóoldattal (ph 7,0) 1:100 és 1:1000 hígításokat készítünk. Az összes életképes aerob mikroorganizmus-számot tárgyaló 2.6.12 fejezetben leírtak szerint, kis Durham-csövekkel ellátott kémcsövekbe vagy más alkalmas edényekbe töltött R táptalajon meghatározzuk a legvalószínűbb baktériumszámot. A keverést a lehető legkevesebb rázással, az inkubálást 24-48 órán át 45,5-46,5 C-on végezzük. Ha vas-szulfidtól eredő feketedés mutatkozik és a Durham-csövekben bőséges (a térfogat legalább tizedrészének megfelelő) gázfejlődést észlelünk, ez Cl. perfringens jelenlétére utal. A legvalószínűbb Cl. perfringens számot a 2.6.13.-2. táblázat segítségével állapítjuk meg. Ellenőrzés. A következő törzseket használjuk: Az 1. módszerhez: Clostridium sporogenes, pl. ATCC 19404 (NCTC 532) vagy CIP 79.3; A 2. módszerhez: Clostridium perfringens, pl. ATCC 13124 (NCIMB 6125, NCTC 8237, CIP 103409). Szükség esetén Cl. sporogenesszel együtt alkalmazzuk, a szelektivitás és az anaerob körülmények ellenőrzésére. 2.6.13.-2. táblázat A legvalószínűbb mikroorganizmusszámok (Most-probablenumber MPN)

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 7 Minden hígításhoz 3 kémcső Pozitív kémcsövek száma Besorolás * 95%-os MPN/g konfidenciahatárok 0,1 g 0,01 g 0,001 g 1 2 0 0 0 <3 0 1 0 3 x <1 17 1 0 0 3 x 1 21 1 0 1 7 x 2 27 1 1 0 7 x 2 28 1 2 0 11 x 4 35 2 0 0 9 x 2 38 2 0 1 14 x 5 48 2 1 0 15 x 5 50 2 1 1 20 x 8 61 2 2 0 21 x 8 63 3 0 0 23 x 7 129 3 0 1 38 x 10 180 3 1 0 43 x 20 210 3 1 1 75 x 20 280 3 2 0 93 x 30 390 3 2 1 150 x 50 510 3 2 2 210 x 80 640 3 3 0 240 x 100 1400 3 3 1 460 x 200 2400 3 3 2 1100 x 300 4800 3 3 3 >1100 * 1. kategória: normálisnak tekinthető (elfogadható) eredmények; az esetek 95%-ában fordulnak elő. 2. kategória: kevésbé valószínű (kevésbé elfogadható) eredmények; mindössze az esetk 4%-ában fordulnak elő. Fontos döntéseknél nem használhatók! A 2. kategóriánál kevésbé valószínű eredmények a táblázatban nem szerepelnek és soha nem tekinthetők elfogadhatónak. A fejezet következő része tájékoztató jellegű.

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 8 AJÁNLOTT OLDAT ÉS TÁPTALAJOK A következő oldat és táptalajok bizonyultak alkalmasnak a mikrobiológiai szennyezésekre előírt gyógyszerkönyvi vizsgálatokhoz. Más táptalajok is használhatók, ha a vizsgálandó mikroorganizmusokra nézve hasonló növekedést elősegítő és szelektív tulajdonságokkal rendelkeznek. pepton tompítóoldat (ph 7,0) Kálium-dihidrogén-foszfát Dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát Pepton (hús- vagy kazeinpepton) 3,6 g 7,2 g; 0,067 M foszfáttal egyenértékű 4,3 g 1,0 g Az oldathoz felületaktív anyagokat vagy antimikrobás szereket semlegesítő inaktivátorokat adhatunk, mint pl.: Poliszorbát 80 Az oldatot autoklávban 121 C-on 15 percen át sterilezzük. A folyékony táptalaj (szója-kazein folyékony táptalaj) Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum) Szójapepton (papain-hidrolizátum) Dikálium-hidrogén-foszfát Glükóz-monohidrát 1 10 g/l 17,0 g 2,5 g 2,5 g A táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 7,3 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban 121 C-on 15 percen át sterilezzük. B agar-táptalaj (szója-kazein agar-táptalaj) Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum) Szójapepton (papain-hidrolizátum) 1 1

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 9 A táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 7,3 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban 121 C-on 15 percen át sterilezzük. C agar-táptalaj (antibiotikum-tartalmú Sabouraud-glükóz-agar) Pepton (hús- és kazeinpepton) Glükóz-monohidrát 40,0 g 1 A táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 5,6 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban 121 C-on 15 percen át sterilezzük. Közvetlenül felhasználás előtt a táptalajhoz literenként 0,10 g benzilpenicillin-nátrium és 0,10 g tetraciklin steril oldatát elegyítjük, vagy a sterilezés előtt literenként 50 mg klóramfenikolt keverünk a táptalajhoz. D folyékony táptalaj (laktóz-tartalmú folyékony táptalaj) Marhahúskivonat Zselatin (pankreász-hidrolizátum) Laktóz-monohidrát A táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 6,9 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban 121 C-on 15 percen át sterilezzük, majd azonnal lehűtjük. E folyékony dúsító táptalaj (Mossel-féle folyékony dúsító táptalaj enterobaktériumok vizsgálatához) Zselatin (pankreász-hidrolizátum) Glükóz-monohidrát Szárított marhaepe Kálium-dihidrogén-foszfát Dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát Brillantzöld 20,0 g 2,0 g 8,0 g 15 mg A táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke a melegítés után 7,2 ± 0,2 legyen. A táptalajt 100 C-on 30 percen át melegítjük, majd azonnal lehűtjük.

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 10 F agar-táptalaj (kristályibolya-neutrálvörös-epesavas-agar glükózzal) Élesztőkivonat Zselatin (pankreász-hidrolizátum) Epesavas sók Laktóz-monohidrát Glükóz-monohidrát Neutrálvörös Kristályibolya 7,0 g 1,5 g 1 30 mg 2 mg A táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke melegítés után 7,4 ± 0,2 legyen. A táptalajt forrásig melegítjük. Autoklávban nem szabad hevíteni. G folyékony táptalaj (MacConkey folyékony táptalaj) Zselatin (pankreász-hidrolizátum) Laktóz-monohidrát Szárított marhaepe Brómkrezolbíbor 20,0 g 10 mg A táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 7,3 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban 121 C-on 15 percen át sterilezzük. H agar-táptalaj (MacConkey agar) Zselatin (pankreász-hidrolizátum) Pepton (hús- és kazeinpepton) Laktóz-monohidrát Epesavas sók Neutrálvörös Kristályibolya 17,0 g 1,5 g 13,5 g 30,0 mg 1 mg

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 11 A táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 7,1 ± 0,2 legyen. A táptalajt állandó rázogatás közben 1 percen át forraljuk, majd autoklávban 121 Con 15 percen át sterilezzük. I folyékony táptalaj (tetrationát-epe-brillantzöld-táptalaj) Pepton Szárított marhaepe Kalcium-karbonát Kálium-tetrationát Brillantzöld 8,6 g 8,0 g 6,4 g 20,0 g 20,0 g 70 mg A táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke melegítés után 7,0 ± 0,2 legyen. A táptalajt forrásig melegítjük. Újramelegíteni nem szabad. J agar-táptalaj (dezoxikolát-citrát-agar) Marhahúskivonat Húspepton Laktóz-monohidrát Nátrium-citrát Vas(III)-citrát Nátrium-dezoxikolát Neutrálvörös 20,0 g 1,0 g 13,5 g 20 mg A táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke melegítés után 7,3 ± 0,2 legyen. A táptalajt óvatosan forrásig melegítjük, 1 percen át forraljuk, majd 50 C-ra lehűtve Petri-csészékbe osztjuk szét. Autoklávban nem szabad melegíteni. K agar-táptalaj (xilóz-lizin-dezoxikolát-agar) Xilóz L-lizin 3,5 g

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 12 Laktóz-monohidrát Szacharóz Élesztőkivonat Fenolvörös Nátrium-dezoxikolát Nátrium-tioszulfát Ammónium-vas(III)-citrát 7,5 g 7,5 g 80 mg 13,5 g 2,5 g 6,8 g 0,8 g A táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke melegítés után 7,4 ± 0,2 legyen. A táptalajt forrásig melegítjük, majd 50 C-ra lehűtve Petri-csészékbe osztjuk szét. Autoklávban nem szabad melegíteni. L agar-táptalaj (brillantzöld-fenolvörös-laktóz-szacharóz-agar) Pepton (hús- és kazeinpepton) Élesztőkivonat Laktóz-monohidrát 10,0g Szacharóz 20,0 g Fenolvörös 80 mg Brillantzöld 12,5 mg A táptalajt forrásig melegítjük és egy percig ezen a hőmérsékleten tartjuk; ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 6,9 ± 0,2 legyen. Közvetlenül felhasználás előtt autoklávban 121 C-on 15 percen át sterilezzük, majd 50 C-ra lehűtve Petri-csészékbe osztjuk szét. M agar-táptalaj (vas(iii)-három cukor-agar) Marhahúskivonat Élesztőkivonat Pepton (kazein- és marhahús-pepton) 20,0 g

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 13 Laktóz-monohidrát Szacharóz Glükóz-monohidrát Vas(III)-ammónium-citrát Nátrium-tioszulfát Fenolvörös 1,0 g 0,3 g 0,3 g 25 mg 12,0 g Rázogatás közben a táptalajt forrásig melegítjük és egy percig ezen a hőmérsékleten tartjuk; ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 7,4 ± 0,2 legyen. A kémcsöveket magasságuk egyharmadáig töltjük táptalajjal, autoklávban 121 C-on 15 percen át sterilezzük, majd olyan helyzetben hagyjuk lehűlni, hogy mély réteg és ferde felszín keletkezzék. N agar-táptalaj (cetrimid-agar) Zselatin (pankreász-hidrolizátum) Magnézium-klorid Kálium-szulfát Cetrimid Glicerin 20,0 g 1,4 g 0,3 g 13,6 g 10,0 ml Rázogatás közben a táptalajt forrásig melegítjük és egy percig ezen a hőmérsékleten tartjuk; ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 7,2 ± 0,2 legyen. A táptalajt végül autoklávban 121 C-on 15 percen át sterilezzük. O agar-táptalaj (Baird-Parker-agar) Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum) Marhahúskivonat Élesztőkivonat 1,0 g Lítium-klorid 5,0g 20,0 g

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 14 Glicin Nátrium-piruvát 12,0 g 950 ml Rázogatás közben a táptalajt forrásig melegítjük és egy percig ezen a hőmérsékleten tartjuk; ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 6,8 ± 0,2 legyen. A táptalajt ezután autoklávban 121 C-on 15 percen át sterilezzük, majd 45-50 C-ra lehűtjük és 10 ml steril, 10 g/l töménységű kálium-tellurit oldatot, valamint 50 ml tojássárgája-emulziót elegyítünk hozzá. P táptalaj (folyékony megerősített táptalaj clostridiumokhoz) Marhahúskivonat Pepton Élesztőkivonat Oldható keményítő Glükóz-monohidrát Cisztein-hidroklorid Nátrium-acetát 1,0 g 0,5 g 0,5 g Az agart duzzasztjuk, majd folyamatos keverés közben forrásig melegítve oldjuk. Amennyiben szükséges, a táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után kb. 6,8 legyen. A táptalajt autoklávban 121 C-on 15 percen át sterilezzük. Q táptalaj (Columbia-agar) Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum) Húspepton (pepszin-hidrolizátum) Szívpepton (pankreász-hidrolizátum) Élesztőkivonat Kukoricakeményítő (gélképző-képességtől függően) 1,0 g 10,0 1

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 15 Az agart duzzasztjuk, majd folyamatos keverés közben forrásig melegítve oldjuk. Amennyiben szükséges, a táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 7,3 ± 0,2 legyen. Autoklávban 121 C-on 15 percen át sterilezzük, majd 45-50 C-ig hagyjuk lehűlni. A táptalajhoz szükség esetén 20 mg gentamicinbázisnak megfelelő mennyiségű gentamicin-szulfátot adunk, majd Petri-csészékbe osztjuk szét. R táptalaj (folyékony laktóz szulfit táptalaj) Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum) Élesztőkivonat Laktóz-monohidrát Cisztein-hidroklorid 2,5 g 2,5 g 0,3 g Az alkotórészek oldása után az oldat ph-ját 7,1 ± 0,1 értékre beállítjuk. A táptalaj 8 ml-es részleteit kis Durham-csövet tartalmazó, 16 160 mm méretű kémcsövekbe töltjük, majd autoklávban 121 C-on 15 percen át sterilezzük és 4 C-on tároljuk. A táptalajt felhasználás előtt 5 percig vízfürdőben melegítjük, majd lehűtjük. Mindegyik kémcsőbe 0,5 ml-t mérünk R nátrium-diszulfit 12 g/l töménységű oldatából és 0,5 ml-t ammónium-vas(iii)-citrát 10 g/l töménységű oldatából. Mindkét oldatot frissen készítjük és membránszűrőn szűrjük (pórusméret: 0,45 µm). S agar-táptalaj (R2A-táptalaj)) Élesztőkivonat Proteáz pepton Kazein-hidrolizátum Glükóz Keményítő Dikálium-hidrogén-foszfát Magnézium-szulfát (vízmentes) Nátrium-piruvát 0,5 g 0,5 g 0,5 g 0,5 g 0,5 g 0,3 g 0,024 g 0,3 g 1

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 16 A táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke a sterilezés után 7,4 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban 121 C-on 15 percen át sterilezzük. SEMLEGESÍTŐSZEREK A semlegesítőszereket antimikrobás szerek hatásának semlegesítésére használhatjuk. Ezeket, célszerűen még a sterilezés előtt, a nátrium-klorid pepton tompítóoldathoz (ph 7,0) keverjük. Használatuk esetén bizonyítani kell hatékonyságukat és azt, hogy a mikroorganizmusokkal szemben nem toxikusak. Egy tipikus semlegesítő folyadék összetétele a következő: Poliszorbát 80 Lecitin (tojásból) Hisztidin-hidroklorid Pepton (hús- vagy kazeinpepton) Kálium-dihidrogén-foszfát Dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát 30 g 3 g 1 g 1 g 4,3 g 3,6 g 7,2 g A keveréket autoklávban 121 C-on 15 percig sterilezzük. Amennyiben az oldat semlegesítő hatékonysága nem kielégítő, megnövelhetjük a poliszorbát 80 vagy a lecitin koncentrációját. Úgy is eljárhatunk, hogy a 2.6.13.-3. táblázatban feltüntetett semlegesítőszereket használjuk. 2.6.13.-3. táblázat Antimikrobás szerek hatását megszüntető szerek (inaktivátorok), amelyeket a nátrium-klorid pepton tompítóoldathoz (ph 7,0) adunk Az antimikrobás szer típusa Inaktivátor Koncentráció Megjegyzés fenolok szerves higanyvegyületek nátrium-lauril-szulfát poliszorbát 80 és lecitin tojássárgája nátrium-tioglikolát 4 g/l 30 g/l és 3 g/l 5 50 ml/l 0,5 5 g/l halogének nátrium-tioszulfát 5 g/l A nátrium-klorid pepton tompítóoldat (ph 7,0) sterilezése után adjuk az oldathoz

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 17 kvaterner ammóniumvegyületek tojássárgája 5 50 ml/l A nátrium-klorid pepton tompítóoldat (ph 7,0) sterilezése után adjuk az oldathoz B. A HARMONIZÁLT MÓDSZER 1. BEVEZETÉS Az alábbiakban leírt vizsgálatok lehetővé teszik az adott körülmények között kimutatható, meghatározott mikroorganizmusok távollétének vagy korlátozott jelenlétének megállapítását. A vizsgálatok kialakításának fő szempontja az volt, hogy egy adott anyagról vagy termékről megállapítható legyen: megfelel-e a mikrobiológiai minőségre megállapított követelménynek. Amennyiben a vizsgálatokat ebből a célból végezzük, az alábbi útmutatások szerint járjunk el, az előírt mintaszámot is figyelembe véve, és az eredményeket a következők szerint értelmezzük. Más mikrobiológiai eljárások, például automatizált módszerek is használhatók, amennyiben igazolták, hogy egyenértékűek a Gyógyszerkönyvben leírt módszerrel. 2. ÁLTALÁNOS ELJÁRÁSOK A mintákat a 2.6.12 általános fejezetben ( B. A harmonizált módszer ) leírtak szerint készítjük elő. A termék esetleges antimikrobás hatását adott esetben amennyire lehetséges meg kell szüntetni vagy semlegesíteni kell, a 2.6.12. általános fejezetben ( B. A harmonizált módszer ) leírtak szerint. Amennyiben a mintaelőkészítésnél felületaktív anyagokat használunk, úgy a 2.6.12 általános fejezetben ( B. A harmonizált módszer ) leírtak szerint igazolni kell, hogy a mikroorganizusokra nem toxikusak és az inaktiválószerekkel nem összeférhetetlenek. 3. A TÁPTALAJOK MIKROORGANIZMUS-NÖVEKEDÉST ELŐSEGÍTŐ ÉS GÁTLÓ TULAJDONSÁGAI ÉS A VIZSGÁLAT ALKALMASSÁGA Meg kell állapítani, hogy a vizsgálat alkalmas-e mikroorganizmusok kimutatására a vizsgálandó termék jelenlétében. A módszer alkalmasságát újra igazolni kell, ha a módszerben vagy a termékben olyan változás történik, amely befolyásolhatja a vizsgálat eredményét.

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 18 3-1. REFERENCIATÖRZSEK KÉSZÍTÉSE A referenciatörzsek stabilizált szuszpenzióit használjuk, illetve az alábbiak szerint referenciatörzseket készítünk. Oltócsíra-tenyészetet fenntartó módszereket (oltócsíra-rendszerek) alkalmazunk, oly módon, hogy a beoltáshoz használt életképes mikroorganizmusok az oltócsíra-törzstételhez képest legfeljebb 5 átoltásból származzanak. 3-1-1. Aerob mikroorganizmusok. Az egyes baktérium referenciatörzseket különkülön folyékony szója-kazein táptalajon vagy szója-kazein-agar táptalajon 30 35 C-on 18 24 órán át inkubáljuk. A Candida albicans referenciatörzset külön Sabouraud-glükóz-agar táptalajon vagy folyékony Sabouraud-glükóz táptalajon 20 25 C-on 2 3 napig inkubáljuk. Staphylococcus aureus pl. ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83 vagy NBRC 13276; Pseudomonas aeruginosa pl. ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118 vagy NBRC 13275; Escherichia coli pl. ATCC 8739, NCIMB 8545, CIP 53.126 vagy NBRC 3972; Salmonella enterica ssp. enterica typhimurium szerotípus, pl. ATCC 14028, vagy más lehetőségként Salmonella enterica ssp. enterica abony szerotípus, pl. NBRC 100797, NCTC 6017 vagy CIP 80.39; Candida albicans pl. ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72 vagy NBRC 1594. A szuszpenziók készítéséhez nátrium-klorid pepton tompítóoldatot (ph 7,0) vagy foszfát tompítóoldatot (ph 7,2) használunk. A szuszpenziókat 2 órán belül, illetve ha 2 8 C-on tároltuk 24 órán belül felhasználjuk. 3-1-2. Clostridiumok. A Clostridium sporogenes következő törzseit használjuk: pl. ATCC 11473 (NBRC 14293, NCIMB 12343, CIP 100651) vagy ATCC 19404 (NCTC 532 vagy CIP 79.03) vagy NBRC 14293. A clostridium-referenciatörzset anaerob körülmények között, clostridiumokhoz készült megerősített táptalajon 30 35 C-on 24 48 órán át szaporítjuk. A vizsgálati beoltásra a Cl. sporogenes vegetatív sejtjei friss szuszpenziójának készítése és azt követő hígítása alternatívájaként stabil spóraszuszpenzió is használható. A stabil szuszpenzió 2 8 C-on egy validált időtartamig eltartható. 3-2. NEGATÍV KONTROLL

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 19 A vizsgálati körülmények ellenőrzésére negatív kontroll vizsgálatot végzünk, melynek során a vizsgálandó készítmény helyett a választott hígítófolyadékot alkalmazzuk. Ebben mikroorganizmus-növekedés nem következhet be. 3-3. TÁPTALAJOK MIKROORGANIZMUS-NÖVEKEDÉST ELŐSEGÍTŐ ÉS GÁTLÓ TULAJDONSÁGAI A kész táptalajok, valamint a szárított táptalajból vagy az összetevőiből készített táptalajok minden gyártási tételét vizsgáljuk. A 2.6.13.-4. táblázat szerint ellenőrizzük a releváns táptalajok megfelelő tulajdonságait. 2.6.13.-4. táblázat A táptalajok mikroorganizmus-növekedést elősegítő, gátló és jelző tulajdonságai Táptalaj Tulajdonság Referenciatörzs Vizsgálat epeálló Gram-negatív baktériumokra Vizsgálat Escherichia coli-ra Vizsgálat Salmonella-ra Mossel-féle folyékony dúsító táptalaj enterobaktériumokhoz kristályibolya-neutrálvörösepesavas-agar táptalaj glükózzal Szaporodás-serkentő Gátló Szaporodás-serkentő + jelző E. coli P. aeruginosa S. aureus E. coli P. aeruginosa MacConkey-féle folyékony Szaporodás-serkentő E. coli táptalaj Gátló S. aureus MacConkey-féle agartáptalaj Rappaport Vassiliadis-féle folyékony Salmonella-dúsító táptalaj Xilóz-lizin-dezoxikolát-agar táptalaj Szaporodás-serkentő + jelző Szaporodás-serkentő Gátló Szaporodás-serkentő + jelző Jelző E. coli Salmonella enterica ssp. enterica typhimurium szerotípus vagy Salmonella enterica ssp. enterica abony szerotípus S. aureus Salmonella enterica ssp. enterica typhimurium szerotípus vagy Salmonella enterica ssp. enterica abony szerotípus E. coli

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 20 Vizsgálat Pseudomonas aeruginosa-ra Cetrimid-agar táptalaj Szaporodás-serkentő Gátló P. aeruginosa E. coli Vizsgálat Staphylococcus aureus-ra Vizsgálat clostridiumokra Vizsgálat Candida albicans-ra Mannit-nátrium-klorid táptalaj Megerősített táptalaj clostridiumokhoz Szaporodás-serkentő + jelző Gátló Szaporodás-serkentő S. aureus E. coli Cl. sporogenes Columbia-agar táptalaj Szaporodás-serkentő Cl. sporogenes Sabouraud-glükóz folyékony táptalaj Sabouraud-glükóz-agar táptalaj Szaporodás-serkentő Szaporodás-serkentő + jelző C. albicans C. albicans A mikroorganizmus-növekedést elősegítő tulajdonság vizsgálata folyékony táptalajok esetén: a megfelelő táptalaj adott mennyiségét kisszámú (legfeljebb 100 CFU) megfelelő mikroorganizmussal beoltjuk. A beoltott táptalajt a megadott hőmérsékleten legfeljebb a vizsgálatban megadott legrövidebb időtartamig inkubáljuk. A mikroorganizmus-növekedés tisztán látható legyen, és mértéke hasonló legyen a táptalaj egy korábban vizsgált és előzetesen jóváhagyott gyártási tételéhez. A mikroorganizmus-növekedést elősegítő tulajdonság vizsgálata szilárd táptalajok esetén: a felszíni szélesztéses módszert alkalmazzuk. A lemezeket kisszámú megfelelő mikroorganizmussal (legfeljebb 100 CFU) oltjuk be. A lemezeket a megadott hőmérsékleten legfeljebb a vizsgálatban megadott legrövidebb időtartamig inkubáljuk. A mikroorganizmus-növekedés hasonló mértékű legyen a táptalaj egy korábban vizsgált és előzetesen jóváhagyott gyártási tételéhez. A gátló tulajdonság vizsgálata folyékony vagy szilárd táptalajok esetén: a megfelelő táptalajt a megfelelő mikroorganizmus legalább 100 CFU mennyiségével beoltjuk. A táptalajokat a megadott hőmérsékleten legalább a vizsgálatban megadott leghosszabb időtartamig inkubáljuk. Mikroorganizmusszaporodás ne legyen megfigyelhető. A jelző tulajdonság vizsgálata: a felszíni szélesztéses módszert alkalmazzuk. A lemezeket kisszámú megfelelő mikroorganizmussal (legfeljebb 100 CFU) oltjuk be. A lemezeket a megadott hőmérsékleten annyi ideig inkubáljuk, ami a vizsgálatban megadott legrövidebb és leghosszabb időtartam közé esik. A mikroorganizmus-telepeknek küllemüket és jelző reakciójukat tekintve hasonlónak kell lenniük a táptalaj egy korábban vizsgált és előzetesen jóváhagyott gyártási tételéhez.

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 21 3-4. A VIZSGÁLATI MÓDSZER ALKALMASSÁGA A mintaelőkészítést minden egyes vizsgálandó termék esetében a 4. rész megfelelő pontjában előírtak szerint végezzük el. Az egyes referenciatörzseket keverés közben adjuk az előírt táptalajhoz. A referenciatörzseket egyenként oltjuk be. A beoltott vizsgálati készítményben a mikroorganizmusok legfeljebb 100 CFU-nak megfelelő mennyiségét alkalmazzuk. A vizsgálatot a 4. rész megfelelő pontja szerint végezzük; a legrövidebb előírt inkubálási időt alkalmazzuk. A megadott mikroorganizmusokat a 4. részben előírt jelző reakciókkal kell kimutatni. A termék bármilyen antimikrobás hatása a vizsgálati módszer változtatását teszi szükségessé [lásd a 2.6.12 általános cikkely 4-5-3. pontját ( B. A harmonizált módszer )]. Amennyiben nem semlegesíthető az adott termék antimikrobás aktivitása a vizsgálandó mirkoorganizmussal szemben, úgy azt kell feltételezni, hogy a gátolt mikroorganizmus nem lesz jelen a termékben. 4. A TERMÉKEK VIZSGÁLATA 4-1. EPEÁLLÓ GRAM-NEGATÍV BAKTÉRIUMOK 4-1-1. Mintaelőkészítés és inkubálás. A 2.6.12 általános cikkelyben ( B. A harmonizált módszer ) leírtak alapján a vizsgálandó termék legalább 1 g-jának tízszeres hígításából mintát készítünk, azzal az eltéréssel, hogy hígítófolyadékként szója-kazein folyékony táptalajt használunk. Az összekeverést követően a mintát 20 25 C-on annyi ideig inkubáljuk, amely elegendő a baktériumok újraélesztéséhez, szaporodásukhoz azonban nem (általában 2, de legfeljebb 5 óra). 4-1-2. Vizsgálat mikroorganizmus távollétére. Hacsak nincs más előírás. A termék 4-1-1. szerint készített, 1 g-nak megfelelő térfogatát enterobaktériumok dúsítására szánt Mossel-féle táptalajba oltjuk. A beoltott táptalajt 30 35 C-on 18 24 órán át inkubáljuk. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha telepek nem fejlődnek ki. 4-1-3. Kvantitatív vizsgálat. 4-1-3-1. Kiválasztás és átoltás. A 4-1-1. szerint készített terméket és/vagy annak rendre 0,1, 0,01 és 0,001 g (vagy 0,1, 0,01 és 0,001 ml) terméket tartalmazó hígításait megfelelő mennyiségű enterobaktériumok dúsítására szánt Mossel-féle táptalajba oltjuk. A beoltott táptalajt 30 35 C-on 24 48 órán át inkubáljuk. Ezt

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 22 követően a tenyészeteket egyenként glükóztartalmú kristályibolya-neutrálvörösepesavas-agar táptalaj lemezre oltjuk át. A lemezeket 30 35 C-on 18 24 órán át inkubáljuk. 4-1-3-2. Értékelés. A telepek megjelenése pozitív eredményt jelent. Feljegyezzük a termék legkisebb pozitív és a legnagyobb negatív eredményt adó mennyiségét. A 2.6.13.-5. táblázat alapján meghatározzuk a valószínű baktériumszámot. 2.6.13.-5. táblázat Az eredmények értékelése Az egyes termékmennyiségek esetén kapott eredmények 0,1 g vagy 0,1 ml 0,01 g vagy 0,01 ml 0,001 g vagy 0,001 ml Valószínű baktériumszám 1 g termékre vonatkoztatva + + + >10 3 + + >10 2 és <10 3 + >10 és <10 2 <10 4-2. ESCHERICHIA COLI 4-2-1. Mintaelőkészítés és inkubálás. A 2.6.12 általános cikkelyben ( B. A harmonizált módszer ) leírtak alapján a vizsgálandó termék legalább 1 g-jának tízszeres hígításából mintát készítünk. A minta 10 ml-ét vagy 1 g, ill. 1 ml terméknek megfelelő mennyiségét megfelelő mennyiségű (a 3-4. pont szerint vizsgált) szója-kazein folyékony táptalajba oltjuk. Az összekeverést követően a beoltott táptalajt 30 35 C-on 18 24 órán át inkubáljuk. 4-2-2. Kiválasztás és átoltás. A tartály összerázását követően 1 ml szója-kazein folyékony táptalajt 100 ml MacConkey-táptalajba viszünk át, és a keveréket 42 44 C-on 24 48 órán át inkubáljuk. Ezt követően Mac Conkey-agar-lemezre átoltva a lemezt 30 35 C-on 18 72 órán át inkubáljuk. 4-2-3. Értékelés. A telepek megjelenése E. coli lehetséges jelenlétére utal. Az eredmény azonosítási vizsgálatokkal erősíthető meg. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha telepek nem jelennek meg, vagy ha az azonosítási vizsgálatok negatív eredményt adnak. 4-3. SALMONELLA

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 23 4-3-1. Mintaelőkészítés és inkubálás. A 2.6.12 általános cikkelyben ( B. A harmonizált módszer ) leírtak alapján a vizsgálandó termékből mintát készítünk. A minta 10 g, ill. 10 ml terméknek megfelelő mennyiségét megfelelő mennyiségű (a 3-4. pont szerint vizsgált) szója-kazein folyékony táptalajba oltjuk. Az összekeverést követően a beoltott táptalajt 30 35 C-on 18 24 órán át inkubáljuk. 4-3-2. Kiválasztás és átoltás. 10 ml szója-kazein folyékony táptalajt 10 ml Salmonella dúsítására szánt Rappaport Vassiliadis-táptalajba viszünk át, és a keveréket 30 35 C-on 18 24 órán át inkubáljuk. Ezt követően xilóz-lizindezoxikolát-agar táptalajra átoltást végzünk, majd a lemezeket 30 35 C-on 18 48 órán át inkubáljuk. 4-3-3. Értékelés. Jól fejlett, vörös, esetleg fekete centrummal rendelkező telepek megjelenése Salmonella lehetséges jelenlétére utal. Az eredmény azonosítási vizsgálatokkal erősíthető meg. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha a leírt küllemű telepek nem jelennek meg, vagy ha az azonosítási vizsgálatok negatív eredményt adnak. 4-4. PSEUDOMONAS AERUGINOSA 4-4-1. Mintaelőkészítés és inkubálás. A 2.6.12 általános cikkelyben ( B. A harmonizált módszer ) leírtak alapján a vizsgálandó termék legalább 1 g-jának tízszeres hígításából mintát készítünk. A minta 10 ml-ét vagy 1 g, ill. 1 ml terméknek megfelelő mennyiségét megfelelő mennyiségű (a 3-4. pont szerint vizsgált) szója-kazein folyékony táptalajba oltjuk. Amennyiben transzdermális tapaszokat vizsgálunk, a minta 2.6.12 általános cikkelyben ( B. A harmonizált módszer 4-5-1. pont) leírtak alapján készült 1 tapasznak megfelelő térfogatát steril membránszűrőn szűrjük, majd 100 ml szója-kazein folyékony táptalajba visszük. Az összekeverést követően a beoltott táptalajt 30 35 C-on 18 24 órán át inkubáljuk. 4-4-2. Kiválasztás és átoltás. Az átoltás cetrimid-agar-lemezre történik. Az inkubálás hőmérséklete 30 35 C, időtartama 18 72 óra. 4-4-3. Értékelés. A telepek megjelenése P. aeruginosa lehetséges jelenlétére utal. Az eredmény azonosítási vizsgálatokkal erősíthető meg. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha a telepek nem jelennek meg, vagy ha az azonosítási vizsgálatok negatív eredményt adnak. 4-5. STAPHYLOCOCCUS AUREUS

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 24 4-5-1. Mintaelőkészítés és inkubálás. A 2.6.12 általános cikkelyben ( B. A harmonizált módszer ) leírtak alapján a vizsgálandó termék legalább 1 g-jának tízszeres hígításából mintát készítünk. A minta 10 ml-ét vagy 1 g, ill. 1 ml terméknek megfelelő mennyiségét megfelelő mennyiségű (a 3-4. pont szerint vizsgált) szója-kazein folyékony táptalajba oltjuk. Amennyiben transzdermális tapaszokat vizsgálunk, a minta 2.6.12 általános cikkelyben ( B. A harmonizált módszer 4-5-1. pont) leírtak alapján készült 1 tapasznak megfelelő térfogatát steril membránszűrőn szűrjük, majd 100 ml szója-kazein folyékony táptalajba visszük. Az összekeverést követően a beoltott táptalajt 30 35 C-on 18 24 órán át inkubáljuk. 4-5-2. Kiválasztás és átoltás. Az átoltás mannit-nátrium-klorid-agar-lemezre történik. Az inkubálás hőmérséklete 30 35 C, időtartama 18 72 óra. 4-5-3. Értékelés. Sárga/fehér, sárga zónával körülvett telepek megjelenése S. aureus lehetséges jelenlétére utal. Az eredmény azonosítási vizsgálatokkal erősíthető meg. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha a leírt küllemű telepek nem jelennek meg, vagy ha az azonosítási vizsgálatok negatív eredményt adnak. 4-6. CLOSTRIDIUMOK 4-6-1. Mintaelőkészítés és hőkezelés. A 2.6.12 általános cikkelyben ( B. A harmonizált módszer ) leírtak alapján a vizsgálandó termékből mintát készítünk. A mintából 2 egyenlő, a vizsgálandó termék 1 g-jának vagy 1 ml-ének megfelelő mennyiségű adagot veszünk., amelyek közül az egyiket 10 percig 80 C-on melegítjük, majd gyorsan lehűtjük, a másikat viszont nem melegítjük. 4-6-2. Kiválasztás és átoltás. A homogenizált aliquotok 10 10 ml-ét két, egyenként 100 ml clostridiumokhoz készült megerősített táptalajt tartalmazó (38 200 mm-es vagy más alkalmas méretű) tartályba visszük. A tartályokat anaerob körülmények között 30 35 C-on 48 órán át inkubáljuk, majd mindkét edényből Columbia-agar táptalajra átoltást végzünk, amelyet ismét 30 35 C-on 48 órán át inkubálunk. 4-6-3. Értékelés. Endospórás vagy endospóráktól mentes, negatív kataláz-reakciót adó anaerob pálcák telepeinek megjelenése clostridiumok jelenlétére utal. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha a Columbia-agaron nem fejlődnek ki anaerob telepek, vagy ha a kataláz-reakció pozitív. 4-7. CANDIDA ALBICANS

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 25 4-7-1. Mintaelőkészítés és inkubálás. A 2.6.12 általános cikkelyben ( B. A harmonizált módszer ) leírtak alapján a vizsgálandó termékből mintát készítünk. A minta 10 ml-ét vagy legalább 1 g, ill. 1 ml terméknek megfelelő mennyiségét 100 ml Sabouraud-glükóz folyékony táptalajba oltjuk. Az összekeverést követően a beoltott táptalajt 30 35 C-on 3 5 napig inkubáljuk. 4-7-2. Kiválasztás és átoltás. Az átoltás Sabouraud-glükóz-agar-lemezre történik. Az inkubálás hőmérséklete 30 35 C, időtartama 24 48 óra. 4-5-3. Értékelés. Fehér telepek megjelenése C. albicans lehetséges jelenlétére utal. Az eredmény azonosítási vizsgálatokkal erősíthető meg. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha a leírt küllemű telepek nem jelennek meg, vagy ha az azonosítási vizsgálatok negatív eredményt adnak. A fejezet következő része tájékoztató jellegű. 5. AJÁNLOTT OLDATOK ÉS TÁPTALAJOK A következő oldatok és táptalajok bizonyultak alkalmasnak a mikrobiológiai szennyezésekre előírt gyógyszerkönyvi vizsgálatokhoz. Más táptalajok is használhatók, ha a vizsgálandó mikroorganizmusokra nézve hasonló növekedéselősegítő és gátló tulajdonságokkal rendelkeznek. Tompító törzsoldat. Egy -es mérőlombikban 34 g kálium-dihidrogénfoszfátot 500 ml tisztított vízben oldunk. Az oldat ph-ját nátrium-hidroxiddal 7,2 ± 0,2-re állítjuk be, majd térfogatát tisztított vízzel -re egészítjük ki. Homogenizálást követően a tompítóoldatot tartályokba töltjük, sterilezzük és 2 8 C-on tároljuk. Foszfát tompítóoldat (ph 7,2). A tompító törzsoldatot tisztított vízzel 1:800 V/V arányban elegyítjük. Az oldatot sterilezzük. pepton tompítóoldat (ph 7,0) Kálium-dihidrogén-foszfát Dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát Pepton (hús- vagy kazeinpepton) Az oldatot autoklávban validált ciklust alkalmazva sterilezzük. 3,6 g 7,2 g; 0,067 M foszfáttal egyenértékű 4,3 g 1,0 g

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 26 Szója-kazein folyékony táptalaj Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum) Szójapepton (papain-hidrolizátum) Dikálium-hidrogén-foszfát Glükóz-monohidrát 17,0 g 2,5 g 2,5 g A táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 C-on 7,3 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Szója-kazein-agar táptalaj Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum) Szójapepton (papain-hidrolizátum) 1 1 A táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 C-on 7,3 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Sabouraud-glükóz-agar táptalaj Glükóz Állati szövet (pepszin-hidrolizátum) és kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum) 1:1 arányú elegye 40,0 g 1 A táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 C-on 5,6 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Burgonya-glükóz-agar táptalaj Burgonyafőzet Glükóz 200 g 20,0 g 1

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 27 A táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 C-on 5,6 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Sabouraud-glükóz folyékony táptalaj Glükóz Állati szövet (pepszin-hidrolizátum) és kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum) 1:1 arányú elegye 20,0 g A táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 C-on 5,6 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Mossel-féle folyékony dúsító táptalaj enterobaktériumok vizsgálatához Zselatin (pankreász-hidrolizátum) Glükóz-monohidrát Szárított marhaepe Kálium-dihidrogén-foszfát Dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát Brillantzöld 20,0 g 2,0 g 8,0 g 15 mg A táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 C-on 7,2 ± 0,2 legyen. A táptalajt 100 C-on 30 percig melegítjük, majd késedelem nélkül lehűtjük. Kristályibolya-neutrálvörös-epesavas-agar táptalaj glükózzal Élesztőkivonat Zselatin (pankreász-hidrolizátum) Epesavas sók Glükóz-monohidrát Neutrálvörös 7,0 g 1,5 g 1 30 mg

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 28 Kristályibolya 2 mg A táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy melegítés után 25 C-on mért értéke 7,4 ± 0,2 legyen. A táptalajt forrásig melegítjük. Autoklávban nem szabad hevíteni. MacConkey-féle folyékony táptalaj Zselatin (pankreász-hidrolizátum) Laktóz-monohidrát Szárított marhaepe Brómkrezolbíbor 20,0 g 10 mg A táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 C-on 7,3 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. MacConkey-agar táptalaj Zselatin (pankreász-hidrolizátum) Pepton (hús- és kazeinpepton) Laktóz-monohidrát Epesavas sók Neutrálvörös Kristályibolya 17,0 g 1,5 g 13,5 g 30,0 mg 1 mg A táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 C-on 7,1 ± 0,2 legyen. A táptalajt állandó rázogatás közben 1 percen át forraljuk, majd autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Rappaport Vassiliadis folyékony dúsító táptalaj Salmonella-hoz Szójapepton Magnézium-klorid-hexahidrát Dikálium-foszfát 4,5 g 29,0 g 8,0 g 0,4 g

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 29 Kálium-dihidrogén-foszfát Malachitzöld 0,6 g 0,036 g Az oldást enyhe melegítés mellett végezzük. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük, 115 C-ot meg nem haladó hőmérsékleten. A melegítést és az autoklávozást követően a táptalaj ph-ja 25 C-on mérve 5,2 ± 0,2 legyen. Xilóz-lizin-dezoxikolát-agar táptalaj Xilóz L-lizin Laktóz-monohidrát Szacharóz Élesztőkivonat Fenolvörös Nátrium-dezoxikolát Nátrium-tioszulfát Ammónium-vas(III)-citrát 3,5 g 7,5 g 7,5 g 80 mg 13,5 g 2,5 g 6,8 g 0,8 g A táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy melegítés után 25 C-on mért értéke 7,4 ± 0,2 legyen. A táptalajt forrásig melegítjük, majd 50 C-ra lehűtve Petri-csészékbe osztjuk szét. Autoklávban nem szabad melegíteni. Cetrimid-agar táptalaj Zselatin (pankreász-hidrolizátum) Magnézium-klorid Kálium-szulfát Cetrimid Glicerin 20,0 g 1,4 g 0,3 g 13,6 g 10,0 ml

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 30 A táptalajt rázogatás közben forrásig melegítjük és egy percig ezen a hőmérsékleten tartjuk; ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 C-on mérve 7,2 ± 0,2 legyen. A táptalajt végül autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Mannit-nátrium-klorid-agar táptalaj Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum) Állati szövet (pepszin-hidrolizátum) Marhahúskivonat D-mannit Fenolvörös 1,0 g 7 1 0,025 g A táptalajt rázogatás közben forrásig melegítjük és egy percig ezen a hőmérsékleten tartjuk; ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 C-on mérve 7,4 ± 0,2 legyen. A táptalajt végül autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük. Folyékony megerősített táptalaj clostridiumokhoz Marhahúskivonat Pepton Élesztőkivonat Oldható keményítő Glükóz-monohidrát Cisztein-hidroklorid Nátrium-acetát 1,0 g 0,5 g 0,5 g Az agart duzzasztjuk, majd folyamatos keverés közben forrásig melegítve oldjuk. Amennyiben szükséges, a táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 C-on mérve 6,8 ± 0,2 legyen. A táptalajt autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük.

2.6.13. Nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálata Ph.Hg.VIII. - Ph.Eur.6.0. 31 Columbia-agar táptalaj Kazeinpepton (pankreász-hidrolizátum) Húspepton (pepszin-hidrolizátum) Szívpepton (pankreász-hidrolizátum) Élesztőkivonat Kukoricakeményítő (gélképző-képességtől függően) 1,0 g 10,0 1 Az agart duzzasztjuk, majd folyamatos keverés közben forrásig melegítve oldjuk. Amennyiben szükséges, a táptalaj ph-ját úgy állítjuk be, hogy értéke sterilezés után 25 C-on mérve 7,3 ± 0,2 legyen. Autoklávban validált ciklus alkalmazásával sterilezzük, majd 45-50 C-ig hagyjuk lehűlni. A táptalajhoz szükség esetén 20 mg gentamicinbázisnak megfelelő mennyiségű gentamicin-szulfátot adunk, majd Petricsészékbe osztjuk szét.