A MATRILIN- 2 EXPRESSZIÓJÁNAK VIZSGÁLATA MÁJREGENERÁCIÓBAN KÍSÉRLETESEN ÉS HEPATOCELLULÁRIS CARCINOMÁBAN Doktori tézisek Szabó Erzsébet Semmelweis Egyetem Patológiai Doktori Iskola Témavezető: Prof. Dr. Schaff Zsuzsa, egyetemi tanár Hivatalos bírálók: Dr. Mózes Miklós, egyetemi docens Dr. Tóvári József, tudományos munkatárs Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Dr. Jeney András, egyetemi tanár Szigorlati bizottság tagjai: Prof Dr. Kovalszky Ilona, egyetemi tanár Dr. Simon Károly, osztályvezető főorvos Budapest 2007
1. BEVEZETÉS A hepatocelluláris carcinoma (HCC) világviszonylatban az ötödik leggyakoribb malignus daganat, a mortalitás tekintetében pedig a harmadik helyen áll. Az elmúlt évtizedek kutatásai alapján már számos adat áll rendelkezésünkre a primer májtumorok hátterében álló molekuláris és genetikai alapokról. Természetesen a betegség kialakulásában résztvevő összes tényező korántsem ismert. A HCC carcinogenesise többtényezős, többlépcsős és összetett folyamat, amely elsősorban a hepatitis vírusok (HBV és HCV) krónikus és perzisztens jelenlétével van összefüggésben. Egyre több adat szól a HCC progenitorsejt-eredete mellett. Az ezzel kapcsolatos bizonyítékok mind a sejt-sejt kölcsönhatások, mind az extracelluláris mátrix (ECM)-sejt kölcsönhatások szintjén hiányosak. Ismeretes azonban az a tény, hogy a májregeneráció és a cirrhotikus preneopláziás állapothoz vezető átalakulások során a mátrixban végbemenő változások hasonló jelleget mutatnak. Több ECM komponensről igazolódott azok elsődleges szerepe a daganat érújdonképződésének szabályozásában. Érzékeny pontja a daganatszövetnek a megfelelő érellátottság, ezért egyre több olyan irányú kutatásokat vesz célba a tumorbiológia, amely ezen molekulák expressziójával és a kapillarizációban betöltött szerepével foglalkozik. Ezek közt említendők elsősorban a bazális membrán (BM) alkotói, mint a kollagének, a laminin, a proteoglikánok stb. A mátrix biológia csak az utóbbi évtizedben kezdett el foglalkozni a matrilineknek nevezett fehérjecsaláddal. Ezen újonnan leírt fehérjecsaládnak ez idáig négy ismert tagja van. A matrilin-1, matrilin-3 elsősorban porc-, csont, - és izomszövetben jelenik meg. A matrilin-2 és matrilin-4 elterjedése sokkal szélesebbkörű, szinte minden szerv BM szerkezetében leírták jelenlétüket. Noha ismert, hogy ezek a fehérjék feltehetőleg ún. adaptor jellegű szerepet tölthetnek be az ECM-ben, funkciójuk és a bazális membránokban betöltött szerepük még korántsem tisztázott. A matrilin-2-ről, a család legszélesebb körben előforduló tagjáról, több kísérletben igazolódott néhány szövetben, pl. porc- és kötőszövet regenerációjában betöltött szerepe. Újabb közlemények alapján pedig néhány humán daganatban (agytumor, vese carcinoma) is fokozott expressziót mutatott. Mindezek alapján merült fel munkacsoportunkban az érdeklődés e fehérje irányában: a cirrrhosis, a HCC és a májregeneráció vonatkozásában vetődött fel elsősorban a matrilin-2 szerepe. 2
2. CÉLKITŰZÉSEK Munkám során az alábbi kérdésekre kerestem a választ: 1. Kimutatható-e matrilin-2 mrns és fehérje expresszió normális patkány és humán májban? 2. Milyen mértékben és hol expresszálódik a matrilin-2 a májregeneráció során? 3. Milyen jelentősége lehet a matrilin-2-nek a májregenerációban? 4. Milyen sejteknek lehet szerepe a matrilin-2 termelésében a májregeneráció során? 5. Hogyan változik mennyiségében és lokalizációjában a matrilin-2 expressziója a cirrhotikus májban, összehasonlítva normál májszövettel? 6. Van-e eltérés a matrilin-2 expressziójában a tumoros májszövetben a normál májakhoz képest? 7. Milyen különbség figyelhető meg a matrilin-2 expresszió szempontjából az eltérő eredetű (cirrhotikus és nem cirrhotikus talajon létrejött) hepatocelluláris carcinomákban? 8. Van-e eltérés a matrilin-2 expressziójában a különböző differenciáltságú tumorokban? 3
3. MÓDSZEREK 3.1. Alkalmazott állatkísérleti modellek 3.1.1. Parciális hepatectomia (PH) A beavatkozás 180-200 g súlyú hím Fisher 344 (F- 344) patkányokon történt Higgins és Anderson klasszikus módszere szerint az SE I. sz Patológia és Kísérletes Rákkutató Intézetében. A vizsgálatokat a parciális hepatectomiát követően 24, 48, és 72 órával a műtét után vett szövemintákon végeztük. Az altatás dietil-éterrel történt. A májminták egy részét formalinban fixáltuk, más részét folyékony nitrogénben fagyasztottuk. Kontrollként normál kezeletlen állatok májmintái szolgáltak. 3.1.2. Parciális hepatectomia/acetylaminofluorén (PH/AAF) modell Az állatok az 1 %-os dimethylcellulózban 2mg/ml koncentrációban oldott acetylaminofluorént (AAF) 5 mg/kg dózisban kapták hat egymást követő napon át. Ezt követően parciális hepatectomia történt a 7. napon, amit ezután még hat AAF-es kezelés követett. Az állatok leölése a kezelés során különböző időpontokban történt (a PH-t követő 9., 11. és 13. napokon) az ovális sejt proliferáció csúcspontjának meghatározása végett. Az állatkísérleteket a Nemzetközi Állategészségügyi Intézet kísérleti protokolljaival megegyező módon végeztük el. 3.2. Humán vizsgálati anyag A Semmelweis Egyetem II. sz. Patológiai Intézetében archivált, valamint újonnan gyűjtött humán májmintákat használtuk fel vizsgálatainkhoz, amelyeket formalinban, illetve RNAlaterben fixáltunk vagy folyékony nitrogénben történt fagyasztás után -80 C-on tároltunk. A sebészileg rezekált anyagok az SE I. sz. Sebészeti Klinikáról, a kontrollként használt egészséges normál májak pedig balesetben elhunyt személyekből származtak, az SE Igazságügyi Orvostani Intézetéből. A vizsgálatokhoz TUKEB engedéllyel rendelkezünk (#172/2003, # 2/2004). Vizsgálatainkhoz 10 normál májat, 35 HCC-t és annak tumormentes környezetét használtunk. A vizsgált HCC-k csoportosítása az Edmonson-Steiner féle klasszifikáció alapján történt (G1-4
G3). A nemek szerinti megoszlás a következő volt: 27 férfi, 8 nő. Az átlag életkor 65 év (44-82). A 35 eset közül 15 esetben a HCC cirrhosis talaján fejlődött ki. A többi esetben enyhe és igen mérsékelt mértékű fibrosis volt jellemző a tumort környező májszövetre, de sem nodulus képződés, sem pedig a cirrhosisra jellemző duktuláris reakció nem volt megfigyelhető. A 15 eset közül 7 minta volt HCV-vel fertőzött. 3.3. Morfológiai vizsgálatok 3.3.1. Hisztológia A patkány máj, valamint a sebészetileg eltávolított tumor mintákat a környező, nem tumoros szövetekkel együtt, valamint a normál máj mintákat 10%-os neutrálisan pufferolt formalinban fixáltuk 24 órán keresztül, utána dehidráltuk és paraffinba ágyaztuk be. A morfológiai elváltozások kimutatása és a tumor grade megítélése 3-4 µm-os hematoxilin-eozinnal (HE) festett metszeteken történt. Kiegészítő PAS, Shikata-féle orcein, Picrosirius-vörös festéseket rutinszerűen elvégeztük. 3.3.2. Immunhisztokémiai vizsgálatok A vizsgálatok formalinba fixált, paraffinba ágyazott mintákból készült metszeteken peroxidáz-antiperoxidáz módszert használva vagy fagyasztott, illetve paraffinba ágyazott anyagból immunfluoreszcens módszerrel történtek. Az immunhisztokémiai vizsgálatokhoz használt antitestek a következők voltak: ELSŐDLEGES ANTITESTEK poliklonális nyúl anti - matrilin-2 (ajándék dr Deák Ferenc munkacsoportjától, Szeged, SZBK, Piecha és mtsai, 1999) monoklonális egér anti-laminin (Novocastra, Newcastle, UK) poliklonalis nyúl anti-laminin (DAKO, Dánia) monoklonális anti-egér OV-6 (R&D, Minneapolis, USA) monoklonális CD34 (clone QBEnd/10, DAKO, Dánia) MÁSODLAGOS ANTITESTEK biotinilált anti-nyúl IgG (ABC kit, Novocastra, Newcastle, UK) biotinilált anti-egér IgG (ABC kit, Novocastra, Newcastle, UK) 5
Alexa Fluor-488-konjugált anti-egér IgG (Molecular Probes, Oregon, USA) Alexa fluor-568-konjugált anti-nyúl IgG (Molecular Probes, Oregon, USA) A matrilin-2 kimutatása során az immunreakció érzékenységét egy nagy érzékenységű jelamplifikációs immuntechnika alkalmazásával, biotinilált tiraminnal fokoztuk (ABC-BT módszer). Az immunreakciókat 3-amino-9-ethyl-carbazol (AEC) illetve 3, 3 - diaminobenzidin-tetrahidroklorid (DAB) kromogénekkel hívtuk elő. A háttérfestés Mayerféle hematoxilinnal történt. A negatív kontroll metszeteknél az elsődleges antitesttel való inkubálást elhagytuk. A fotókat Olympus BX mikroszkóphoz (Tokyo, Japán) rögzített kamera segítségével készítettük. Az immunfluoreszcenciás képeket konfokális lézer-szcanning mikroszkóppal elemeztük és a hozzá tartozó programmal fotóztuk (Bio-Rad MRC-1024 system, Bio-Rad, Richmond, CA, USA). A matrilin-2 immunreakciót mutató digitális képek intenzitásának meghatározására a Leica QWin (Leica Microsystems Imaging Solutions Ltd., Cambridge, UK) programot használtuk fel. 3.3.3. Statisztikai kiértékelés A statisztikai kiértékelést a GraphPad Prism 2.01 (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA) program segítségével végeztük. A csoportok közötti összehasonlításra a Mann-Whitney U tesztet alkalmaztuk. A különbséget p <0,05 esetén tartottuk szignifikánsnak. 3.4. Molekuláris biológiai módszerek 3.4.1. mrns expresszió vizsgálata a) Szöveti lézer mikrodisszekció és RNS izolálás patkány szövetekből AAF/PH kezelt és a kontroll normál májakból 10 µm vastag HE-al festett metszetekből a kiválasztott területeket lézer katapult technikával vágtuk ki a metszetekből RNS izolálás és PCR vizsgálat céljából. A mikrodisszekciót a PALM lézer mikrodisszekciós rendszer segítségével végeztük a Semmelweis Egyetem II. Belgyógyászati Klinika kutatólaboratóriumában. Az RNS izolálást RNeasy Mini Kit-tel (Qiagen) végeztük el, a gyártó utasítása szerint. 6
b) RNS izolálás humán mintákból: RNA laterben fixált anyagból Trizol módszerrel 13 HCC-t, ugyanennyi környező mintát és 10 normál májat használtunk fel RNS izoláláshoz. Egyenként kb. 20 mg RNA laterben (Sigma) fixált szövetből Trizol módszerrel RNS-t izoláltunk, DN-ázzal emésztettük, majd tovább tisztítottuk. További felhasználásig a tisztított RNS-t -80 C-on tároltuk. Az RNS-ek integritását 1%-os agaróz gélen történt futtatással ellenőriztük. d) Real-time RT-PCR Az RT-PCR reakcióban cdns-t állítottunk elő. A reakcióhoz random hexamert és M-Mulv reverz transzkriptázt használtunk. A rendelkezésre álló szekvenciák alapján a Primer Expressz 2 program (ABI) segítségével megterveztük a lehetőségek szerinti legideálisabb primereket a kísérletek elvégzéséhez. A real-time RT-PCR-hez mintánként 12,5 µl Sybr Green Master Mixet (BIO-RAD 1708882), illetve az általunk megtervezett primerekből 500nM koncentrációban 0,5-0,5 µl-t és a korábban előállított cdns-ből 2 µl-t, valamint 9,5 µl desztillált vizet használtuk fel. A reakció paraméterei: 95 C 2 perc, 95 C 20 másodperc, 63 C 30 másodperc, 72 C 30 másodperc, ciklusszám: 40. A kapott adatokat a REST (Relative Expression Software Tool) néven ismert relatív kvantifikálására alkalmas számítógépes program segítségével értékeltük ki. A relatív kvantifikáláshoz a GAPDH háztartási gént használtuk. e) mrns in situ hibridizáció AAF/PH kezelt patkányokból vett mintákon A 644 bp hosszú patkány matrilin-2 fragmentet RT-PCR-el amplifikáltunk a következő primerekkel (5 cctaccccaacggcataca 3 ), (5 tgtgtgaacagtggcgaatc 3 ). Az amplifikált fragmentnek pbluescript IISK vektorba történt a klónozása. A sense és antisense matrilin-2 riboprobákat digoxigenin-utp-vel jelöltük (Roche, Mannheim, Germany). A megfelelő előkezeléseket követően a próbákkal együtt hibridizáltuk a metszeteket ( 94 C-on 4 perc, majd 53 C-on 12-16 órán át történő inkubálás követte). Negatív kontrollként, párhuzamos metszeteken az antiszenz RNS próba helyett szenz próbát hibridizáltunk. A reakció detektálása anti-digoxygenin- alkalikus-foszfatáz- IgG-Fab-ellenes 7
fragmenttel történt. Az alkalikus-foszfatáz reakció detektálását NTB (nitro-tetrazolium-blue chloride) (Sigma) és BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate) (Sigma) elegyével végeztük. A metszeteket Kaiser- féle glicerin-zselatinnal fedtük le. 3.4.2. Fehérje expresszió vizsgálata Western blot módszerrel A humán és patkány májmintákból a Western blotthoz fehérjét izoláltunk. A kapott homogenizátumot 8000 rpm-en 15 percig 4 C centrifugáltuk, majd a felülúszót összegyűjtöttük és a fehérjekoncentráció mérése után az izolált fehérjék szeparálása SDSpoliakrilamid gélelektroforézissel történt. Minden mintából 40 µg fehérjét futtattunk azonos térfogatban nem redukáló körülmények között. A minták kihígítása és gélre történő felvitele mintapufferben történt. A patkány mintákat 4-8 %-os grádiens gélen, a humán mintákat pedig 4-12%-os grádiens gélen futtattuk előrefestett molekulasúly markerekkel párhuzamosan (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, United Kingdom és PageRulerTM Prestained Protein Ledder, Fermentas). A blottolást és a megfelelő blokkolást követően a filtert nyúlban termelt anti-matrilin-2 antitesttel (1: 500 hígítva a blokkoló pufferben) 1 órán keresztül inkubáltuk. TBS-Tweennel történő alapos mosás után a membránt ezen antitest ellen termelt, peroxidáz konjugált kecske anti-nyúl IgG ellenanyaggal 1: 1000 hígítva ugyancsak a blokkoló oldatban inkubáltuk 1 órán át, végül a jelet erősített kemilumineszcenciával (ECL, Amersham Pharmacia Biotech) mutattuk ki. 8
4. EREDMÉNYEK 4.1. Matrilin-2 fehérje expresszió vizsgálata patkány májban 4.1.1. Matrilin-2 vizsgálata immunhisztokémiai módszerrel normál patkány májban Normál, kezeletlen patkány májban immunhisztokémiai reakcióval a matrilin-2 a portális térben, az erek és az epeutak BM-jában, valamint az azt körülvevő kötőszöveti rétegben volt kimutatható. Az ereket erős pozitivitás jellemezte, míg az epeutak BM-ja nem mutatott intenzív reakciót. A májparenchymában a szinuszoidok mentén nem volt matrilin-2 expresszió. A centrális vénákban sem detektáltunk matrilin-2-t. 4. 1.2. Matrilin-2 immunhisztokémiai kimutatása májregenerációban Parciális hepatectomiát (PH) követően a matrilin-2 ellenes antitesttel végzett immunreakciót összehasonlítva a kezeletlen normál májakból nyert mintákkal, a matrilin-2 hasonló lokalizációt mutatott mint a normál májakban, azaz minden esetben detektálható volt a matrilin-2 jelenléte a portális térben: az epeutak és az erek BM zónájában. A máj szinuszoidjaiban és a centrális vénákban ezekben az esetekben sem volt immunhisztokémi módszerrel kimutatható matrilin-2 fehérjeexpresszió. Az AAF/PH kezelést követően vizsgáltuk a matrilin-2 expresszióját ovális sejt indukálta májregenerációban. A matrilin-2 fehérje kifejeződése ez esetben erősen követte az ovális sejtekre jellemző OV-6 marker festődését. A normál és PH- kezelt májakhoz hasonlóan, az AAF/PH regenerációs modellben is pozitív reakció jellemezte a portális tereket, amelynek intenzitása sokkal erősebb volt, mint a hepatociták osztódásával történő májregeneráció során és a normál májban. Továbbá matrilin-2 reakció volt megfigyelhető a szinuszoidok egy részében (a lebenyek külső 2/3-ban) és az ovális sejt képződményekben, a duktuszokban. Míg a májparenchyma centrális zónájában - amelyik területen ovális sejtek nem jelentek meg a matrilin-2 expressziója nem volt kimutatható. 9
Párhuzamos metszeteken, laminin ellenes antitesttel kimutatható volt a laminin és a matrilin-2 koexpressziója. 4.1.3. Emelkedett matrilin-2 fehérje expresszió detektálása AAF/PH kezelést követően Western blot technikával Azonos mennyiségű normál patkány, PH kezelt és AAF/PH kezelt patkány májszövet homogenizátumot 4-8%-os poliakrilamid gélen futtattuk. Jelentős mennyiségű matrilin- 2 volt detektálható az AAF/PH kezelt májakban, míg a normál májakban illetve a PHkezelt patkány májakban a matrilin-2 fehérje igen jelentéktelen mennyiségben volt jelen, vagy egyáltalán nem volt kimutatható. A patkány májmintákból a detektált jel mindegyik mintában megközelítőleg 100 kda-nál volt látható, amely megegyezik a matrilin-2 monomer molsúlyával. A Western blottal nyert eredmények alátámasztották az immunhisztokémiával nyert eredményeket: a matrilin-2 fehérje nagy mennyiségben detektálható az ovális sejtek proliferációjával történő májregeneráció során, míg a normál májban és a hepatociták részvételével történő májregenerációban nem vagy csak alig mutatható ki. 4.1.4. Matrilin-2-t termelő sejtek detektálása májregenerációban A matrilin-2 fehérjét termelő sejtek azonosítását nem radioaktív in situ hibridizációval végeztük és a reakciót alkalikus foszfatáz-rendszerrel detektáltuk. Az in situ hibridizációs kísérletek alapján pozitív jelet csak az ovális sejtek citoplazmájában láttunk, míg az érett hepatociták nem mutattak pozitivitást. Ennek alapján úgy tűnik, hogy az ovális sejtek termelik és szekretálják a matrilin-2-t. 4.1.5. A matrilin-2 expresszió vizsgálata real-time RT-PCR analízissel A real-time RT-PCR-el kapott adatok alapján egyik hepatocita frakcióban sem volt detektálható a matrilin-2 expressziója mrns szinten (a matrilin-2 mrns a 40. ciklusnál sem volt detektálható). mrns expressziót csak az ovális sejtekben detektáltunk. A PCR reakció eredménye is az in situ hibridizációval nyert eredményeket támasztja alá, miszerint detektáható matrilin-2 mrns expresszió csak az ovális sejtekben volt. 10
4.2. Matrilin-2 expresszió vizsgálata humán májban 4.2.1. Matrilin-2 fehérje expresszió vizsgálata ép és cirrhotikus humán májszövetben immunhisztokémiai módszerrel A normál májban illetve a tumor melleti nem cirrhotikus ép szövetben a matrilin-2 csak a portális térben, az erek és az epeutak BM-jában mutatott erősen pozitív reakciót. Nem volt azonban kimutatható matrilin-2 fehérje expresszió sem a centrális vénák körül, sem pedig a szinuszoidokban és hepatocitákban sem. Ezek az eredmények megegyeznek a patkány normál májmintákban kapott immunhisztokémiai eredményekkel. A tumor környéki cirrhotikus májszövetben a matrilin-2 expresszió fokozott mértékben volt jelen a cirrhotikus nodulusok széli részén, valamint a szinuszoidok mentén. Különösen erős pozitív reakciót észleltünk a cirrhosisra jellemző kötőszöveti sövényekben, az itt előforduló erekben és a proliferáló epeutak BM zónájában. 4.2.2. Matrilin-2 fehérje expresszió vizsgálata HCC-ben Az immunhisztokémiával detektált matrilin-2 megjelenési mintázata a HCC-ben jelentősen eltért a normál májszövetéhez képest. Igen intenzív matrilin-2 fehérje expresszió volt megfigyelhető az újonnan képződő erek BM-jában, a tumor neovaszkulatúra mentén. A matrilin-2 neovaszkuláris BM-ban történő lokalizációjának a megerősítse végett elemeztük a CD34, mint endothel markert ezeken a tumor mintákon. A CD34 lokalizációban nagy mértékű hasonlóságot mutatott a matrilin-2 expressziójával a HCCben. 4.2.3. A matrilin-2 immunhisztokémiai reakciók morfometriai elemzése és statisztikai analízise Az immunhisztokémiai reakciók morfometriai értékelése során a matrilin-2 pozitív területek eloszlására százalékos arányban a következő eredményeket kaptuk: 0,57 % a normál májakra, 0,59 % a környező nem cirrhotikus májakra, 3,97 % a cirrhotikus 11
környező májakra, 4,26 % a cirrhotikus talajon képződött HCC-re és 3,03 % a nem cirrhotikus talajon képződött HCC-re vonatkoztatva. Szignifikánsan több matrilin-2 fehérje volt tehát detektálható a HCC-ben és a cirrhotikus májakban, mint a nem cirrhotikus környező májakban és az ép szövetekben ( p< 0.0001). A cirrhotikus talajon kialakult HCC-k és a nem cirrhotikus talajon képződött HCC-k matrilin-2 fehérje expressziója között nem volt szignifikáns eltérés. Továbbá, a jól és közepesen differenciált tumorok sem mutattak szignifikáns eltérést a fehérje expressziójában a rosszul differenciált tumorokhoz képest. A tumorok differenciáltságának megfelelően az immunpozitív területek százalékos eloszlására a következő értékeket kaptuk 3, 78 % G1, 4,62% G2, 4,33 % a G3 HCC-re. 4.2.4. A matrilin-2 fehérjeexpresszió kimutatása Western blot technikával humán májakon A Western blot detektálás eredménye megerősítette a patkány májban nyert eredményeinket. A pozitív jelet minden mintában kb 95 kda nál észleltük. Ez a mobilitás és a molekulatömeg megfelel a matrilin-2 monomernek (~100 kda), de kis mennyiségben a matrilin-2 fehérjére jellemző nagyobb molekulasúlyú oligomer frakció is jelen volt a humán májakban. A patkány májakban, ezt nem tapasztaltuk, ott csak a matrilin-2 monomert tudtuk detektálni. A normál humán májban, a tumor környéki szövetben és a tumoros májakban, az általunk alkalmazott módszerrel, hasonló intenzitású és azonos mennyiségű matrilin-2 fehérje volt detektálható. 4.2.5. A matrilin-2 mrns expressziójának real-time RT-PCR analízise humán májmintákon A real-time RT-PCR során kapott eredmények azt mutatják, hogy szignifikánsnak mondható mrns expressziós eltérés a tumorokban és a tumormentes környező szövetben normál májakhoz képest nem volt detektálható. Összevetve a HCV vírussal fertőzött környező cirrhotikus májak matrilin-2 mrns expresszióját a nem fertőzött környező cirrhotikus májak matrilin-2 mrns expressziójával, csak jelentéktelen, szignifikánsnak nem mondható eltérést detektáltunk 12
5. KÖVETKEZTETÉSEK 1. A normál patkány májszövetben a matrilin-2 fehérje a portális terek ereinek és epeútjainak BM-ban fordul elő, míg a májszinuszoidokban a matrilin-2 expressziója nem mutatható ki. 2. Az ovális sejtekkel történő májregeneráció során patkányban a matrilin-2 expresszió megnő a normál májban detektált expresszióhoz képest és kimutatható a szinuszoidokban valamint az ovális sejt képezte duktuszokban is. A matrilin-2 mrns expresszióját az ovális sejtekben az RT-PCR és az in situ hibridizáció is igazolta, tehát a matrilin-2 termelésben az ovális sejtek részt vesznek, mely eredményt elsőként közöltük az irodalomban. 3. A matrilin-2 az ovális sejt duktuszok mentén kolokalizációt mutat a lamininnal, tehát a lamininhoz hasonlóan fontos komponens lehet az ECM-ben a májregeneráció során. 4. Humán májban elsőként mutattuk ki a matrilin-2 expressziót mind mrns, mind fehérje szinten. 5. Normál humán májban fehérje szinten a matrilin-2 az epeutak, a portális tér ereinek BM zónájában detektálható, míg a szinuszoidok mentén nem volt megfigyelhető matrilin-2 fehérje pozitivitás. 6. A cirrhotikus májszövetben a matrilin-2 fehérje expressziót a proliferáló epeutak és az erek BM zónájában, valamint a szinuszoidokban azonosítottuk. 7. A hepatocellularis carcinomákban (HCC) erős matrilin-2 expresszió figyelhető meg az újonnan képződött erek BM-jában, mely azonban nem mutat szignifikáns eltérést a különböző differenciáltságú tumorokban. 8. Az endothelt jellemző CD34 fehérje expresszió a HCC-ben részben kolokalizál a matrilin-2 expresszióval. 13
6. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE Megjelent, illetve elfogadott in extensio közlemények impakt faktora összesen: 16, 026 Az értekezés alapjául szolgáló elsőszerzős közlemények jegyzéke: Szabó E., Lódi C., Korpos E., Batmunkh E., Rottenberger Z., Deák F., Kiss I, Tőkés AM., Lotz G., László V., Kiss A., Schaff Z., Nagy P. Expression of matrilin-2 in oval cells during rat liver regeneration. Matrix Biol, 2007. 26: 554-560. IF: 3,679 Szabó E., Korpos É., Batmunkh E., Lotz G., Holczbauer Á., Kovalszky I., Deák F., Kiss I., Schaff Zs., Kiss A. Expression of matrilin-2 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Pathol Oncol Res, 2007. Accepted for publication, august 2007. IF: 1,241 Szabo E., Lotz G., Paska C., Kiss A., Schaff Z. Viral hepatitis: New data on hepatits C infection. Pathol Oncol Res, 2003. 9: 215-21, Szabó E., Páska C., Kaposi Novák P., Schaff Z., Kiss A. Similarities and differences in hepatitis B and C virus induced hepatocarcinogenesis. Pathol Oncol Res, 2004. 10: 5-11. Nem az értekezés alapjául szolgáló közlemények: Paska C., Bögi K., Szilák L., Tőkés A., Szabó E, Sziller I, Rigó J Jr, Sobel G, Szabó I, Kaposi-Novák P, Kiss A, Schaff Z. Effect of formalin, acetone, and RNA later fixatives on tissue preservation and different size amplicons by real-time PCR from paraffin-embedded tissue. Diagn Mol Pathol, 2004. 13: 234-240. IF 2,292 14
Lódi C., Szabó E., Holczbauer Á., Batmunkh E., Szíjártó A., Kupcsulik P., Kovalszky I, Paku S., Illyés G., Kiss A., Schaff Z. Claudin-4 differentiates biliary tract cancers from hepatocellular carcinomas. Mod Pathol, 2006. 19: 460-469. IF 3,753 Batmunkh E., Tátrai P., Szabó E., Lódi C., Holczbauer A., Páska C., Kupcsulik P., Kiss A., Schaff Z., Kovalszky I. Comparison of the expression of agrin, a basement membrane heparan sulfate proteoglycan, in cholangiocarcinoma and hepatocellular carcinoma. Hum Pathol, 2007. 38: 1508-1515. IF: 2,81 Borka K., Kaliszky P., Szabó E., Lotz G., Kupcsulik P., Schaff Z., Kiss A. Claudin expression in pancreatic endocrine tumors as compared with ductal adenocarcinomas. Virchows Arch, 2007. 450: 549-557. IF 2,251 Az értekezéssel összefüggő, lektorált folyóiratban megjelent idézhető abstractok: Szabó E., Nagy P., Paku S., Korpos E., Kiss I., Deak F., Lódi C., Páska C., Kiss A., Schaff Z. High expression of matrilin-2 by stem cells in liver regeneration. 40 th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver, April 13-17, 2005, Paris, France. J Hepatol, 42. S2, 2005. Szabó E., Páska C., Deák F., Kiss I., Batmunkh E., Lódi C., Holczbauer Á., Kiss A., Kovalszky I., Schaff Z. Matrilin-2, a novel extracellular matrix component in cirrhosis and hepatocellular carcinoma. 40 th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver, April 13-17, 2005, Paris, France. J Hepatol, 42. S2, 2005. 15
Szabó E., Páska C., Lódi C., Batmunkh E., Holczbauer Á., Korpos É., Deák F., Kiss I., Kiss A., Schaff Z. Expression of matrilin-2 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. 47 th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology, Balatonaliga, June 07-11, 2005, Z. Gastroenterol, Issue 5. Volume 43. 2005. Egyéb kutatási témákból, lektorált folyóiratban megjelent idézhető abstractok: Szabó E., Kaposi Novák P., Kiss A., Páska Cs., Lotz G., Schaff Zs. Activation of beta-catenin pathway in human hepatocellular carcinoma negatively correlates to AFP and CD-44 expression. 46th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology, Balatonaliga, June 1-5, 2004, Z. Gastroenterol, 42: 438, 2004. Batmunkh E., Lódi C., Holczbauer Á., Szabó E., Tátrai P., Páska C., Kiss A., Kupcsulik P., Kovalszky I, Schaff Z. High expression of agrin in hepatocellular and cholangiocellular carcinoma. 40 th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver, April 13-17, 2005, Paris, France, J Hepatol, 42. S2, 2005. Batmunkh E., Lódi C., Holczbauer Á., Szabó E., Tátrai P., Páska C., Kiss A., Kovalszky I., Schaff Z. High expression of agrin in hepatocellular and cholangiocellular carcinoma. 47 th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology, Balatonaliga, June 7-11, 2005. Gastroenterol, 43, 2005. Lódi Cs., Szabó E., Batmunkh E., Holczbauer Á., Paku S., Kiss A., Kupcsulik P., Illyés Gy., Schaff Zs. High expression of claudin-4 in biliary carcinomas. 20th European Congress of Pathology, Paris, France, September 3-8, 2005, Virchows Arch, 447: 404, 2005. Lódi C., Szabó E., Batmunkh E., Holczbauer Á., Kiss A., Illyés G., Paku S., Schaff Z., Nagy P. High expression of claudin-7 during liver regeneration. 41 th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver, Viena, Austria, April 26-27, 2006, J Hepatol, 44. S2, 2006 Lódi C., Szabó E., Batmunkh E., Holczbauer Á., Paku S., Kupcsulik P., Illyés G., Kiss A., Schaff Z. Different claudin-4 expression on biliary and hepatocellular carcinomas. 41 th 16
Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver, Vienna, Austria, April 26-27, 2006, J Hepatol, 44. S2, 2006. Egyéb kutatási témákból készült, nem idézhető abstractok: Kiss A., Páska C., Szabó E., Holczbauer Á., Szíjártó A., Kupcsulik P., Schaff Z. Markedly downregulated claudin-4 expression differentiates human hepatocellular carcinomas from metastatic liver tumors. Falk Symposium, Freiburg, Germany, October 16-17, 2004. Batmunkh E., Lódi C., Holczbauer Á., Szabó E., Tátrai P, Páska C., Kiss A., Kupcsulik P., Kovalszky I., Schaff Z. High expression of agrin in hepatocellular and cholangiocellular carcinoma. Falk Symposium, Berlin, Germany, October 3-4, 2005. Lódi C., Szabó E., Holczbauer Á., Batmunkh E., Kiss A., Illyés G., Paku S., Schaff Z., Nagy P. High expression of claudin-7 during liver regeneration. Falk Symposium, Berlin Germany, October 3-4, 2005. Batmunkh E., Tátrai P., Lódi C., Holczbauer Á., Szabó E., Páska C., Kiss A., Kupcsulik P., Kovalszky I., Schaff Z. High expression of agrin in cholangiocarcinoma. Falk Symposium, Freiburg, Germany, October 10-11, 2006. Lódi C., Szíjártó A., Holczbauer Á., Szabó E., Batmunkh E., Kiss A., Illyés G., Schaff Z., Kupcsulik P. High expression of claudin-4 in human cholangiocarcinomas. 6th Congress of the European Hepato-Pancreato-Biliary Association, Heidelberg, Germany, May 25-28, 2005. Holczbauer Á., Halász J., Lódi C., Szabó E., Batmunkh E., Benyó G., Galántai I., Kiss A., Schaff Zs. Expression of claudins in human hepatoblastoma. 7 th Ph.D. Conference at Semmelweis University, Budapest, Hungary, April 14-15, 2005. Szabó E., Orbán E., Lódi C., Batmunkh E., Holczbauer Á., Korpos E., Deak F., Kiss I., Kiss A., Schaff Z. Expression of matrilin-2 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. 1st Central European Regional Meeting, Liver and Pancreas Pathology, Eger, Hungary, june 1-3, 2006. 17