Gyors-kinetika módszerek módszerek jelentősége 2010. március 9. Nyitrai Miklós biológiai mechanizmusok megértése; iológiai folyamatok időskálája; Vándorló melanocita (Victor SMLL). ms skálán való mérések. Milyen módszerekről tanulunk? módszerek közös tulajdonsága - stopped-flow vagy megállított áramlású reaktor - surface plasmon resonance vagy felületi plazmon rezonancia lkalmasak gyors, pl. a milliszekundumos időskálán lezajló folyamatok követésére. - flash photolysis vagy villanófény fotolízis - módszerek és alkalmazásaik. reakciókinetikai mérési módszerek jellemző időfelbontása Kulcsszavak lombik-reakció megállított áramlás (stopped flow) villanófény-fotolízis (flash photolysis) fotonszámlálás (photon counting) 10 0 10-3 10-6 10-9 10-12 s ms μs ns ps Forrás: Keszei Ernő előadásanyaga stopped flow vagy stopped-flow, gyorskinetikai mérés, abszorpció, fluoreszcencia, fecskendő, mixer (keverő), vizsgálati cella, reakció, reagens, oldat sebességi állandó 1
Megállított áramlású reaktor ( stopped-flow ) 1. lépés: a folyadékok áramoltatása Miért ez a neve? Hogyan működik? Milyen alkalmazásai vannak? http://www.photophysics.com/sx20.php k vezérlése Nagy nyomás vagy léptető motor 2. lépés: az áramlások megállítása pl. fluoreszcencia vagy fény szórás 3. lépés: a kinetikai mérés t = 0 időpont pl. abszorbció k vezérlése STOP jel k vezérlése folyamat egybenpl. fluoreszcencia vagy fény szórás reakció elkezdődik pl. abszorbció holtidő fogalma és jelentősége folyadékok összekeverése és a hasznos mérés kezdete között eltelt idő. Tipikusan 0,5-1 ms. k megállnak! vezérlése Nagy nyomás vagy léptető motor STOP!!! 2
megállított áramlású reaktor alkalmazásai Mit mérünk? Kötődési és disszociációs kinetika vizsgálata fehérje-fehérje, vagy fehérje-ligandum kölcsönhatások esetében. Egy alkalmas spektroszkópiai jelet. Feltétel: változzon a reakció során! szokásos spektroszkópiai jelek: -Fluoreszcencia intenzitás -bszorbció -Fényszórás Vizsgálati tér Fecskendők és keverés Termosztált bszorpció és Fluoreszcencia (anizotrópia) mérés Villanófény fotolízis Hasonlóan az előbbiekhez, itt is a nulla időpont definiálása a kritikus. módszer alapelve lapállapotban nem reagáló, passzív szubsztrát alkalmazása; szubsztrát fénnyel aktiválható; Lézer villanással aktiváljuk; Mérjük a létrejövő folyamat kinetikáját. 3
z alkalmazás alapelve Nincs Létrejön reakció!! a reakció!! Felületi plazmon rezonancia Lézer villanás! Rezonancia jel (kru) kötődés disszoc. regenerálás konc. Partner, aktív Partner, is passzív aktív 0 2 4 6 8 1 0 Idő (perc) működés alapelve Áramlási cella E Partner Partner Megvilágítás Detektálás Intenzitás csökkenés! Milyen hatások befolyásolják a szöget? szenzogram z elhajlás szöge függ: 1) hullámhossztól. 2) hőmérséklettől. 3) törésmutatótól. I. II. rezonancia jel II. I. intenzitás I. II. kötődés hatására módosul. idő szög 4
Immobilizálás módszer jellemzői, előnyei vizsgált fehérjék, peptidek, lipidek, hatóanyagok jellemzése jelölés nélkül. Valós időben követhetőek a folyamatok. Kis mintaméretek, chip alapú alkalmazás. a a) Közvetlenül a molekula felülethez kapcsolása (direkt); b) Egy közvetítő kötődő molekula immobilizálása (indirekt). b Összetett folyamatok vizsgálata lkalmazások Rezonancia jel kötődés disszociáció regenerálás -affinitások meghatározása (K vagy K D ); -kinetikai mérések (k assz vagy k dissz ); -hatóanyag specificitás vizsgálata; -kötődő komponensek izolálása keverékből; konc. -fehérjék, peptidek, lipidek kötődésének vizsgálata. 0 2 4 6 8 10 Idő (perc) mérés elrendezése 5