Szedimentáció, elektroforézis Biofizika előadás Talián Csaba Gábor 2012.03.20.
szedimentáció = ülepedés Sedeo2, sedi, sessum ül Sedimento 1 - ülepít Cél: 1 - elválasztás 2 - a részecskék méretének vagy tömegének a meghatározása
Ülepedés gravitációs erőtérben F felhajtó = ρ k Vg F = F + g felhajtó F súrl F F = g felhajtó F súrl F súrl = fv ρvg ρk Vg = fv v = állandó ρ k m, ρ gömbszerű részecskékre V = 4 3 r3 π F súrl = 6πη 0 rv (η 0 : a közeg viszkozitása) v F g = mg számolható mérhető v sed = 2r 2 ( ρ ρ ) 9η 0 k g ρ k : a közeg sűrűsége; a mozgó gömbszerű részecske m:tömege, ρ:sűrűsége, v:sebessége, r: sugara
Ülepedés centrifugális erőtérben: 1. Szedimentációs sebességi módszer Célja: molekulatömeg meghatározása (r nm) a gravitáción alapuló módszerek nem hatékonyak Hogyan számoljuk az erőket? Forgó rendszer: a = rω 2 F súrl = fv 2 F centrifug = mrω Ffelhajtó = ρkva = ρ k m 2 rω ρ
Mi az a centrifugális erő? F cf = -mrω 2 nincs gyorsulás van gyorsulás
F súrl = fv 2 F centrifug = mrω F felhajtó = ρ k m 2 rω ρ = 2 m 2 = 2 ρ ω ω k fv mrω ρk r mr 1 ρ ρ de a = rω 2 Ülepedés esetén a részecske sebessége a tengelytől távolodva növekszik! (v konstans)
S = v 2 rω = m 1 f ρ k ρ S = ülepedési állandó Egység: 1 Sv = 10-13 s Ülepedési sebesség egységnyi térerőre Theodore Svedberg svéd vegyész (1884-1971) Nobel-díj 1926-ban számolható mérhető alaki faktor! Összefüggés van az alaki faktor (f) és a diffúziós állandó (D) között: k T f = = D R T N D A k: Boltzmann állandó R: egyetemes gázállandó N : Avogadro-szám. A tömeg meghatározásához az ülepedési módszert és a diffúziós méréseket kell kombinálni. = ( )
Centrifuga Normál centrifuga Szupercentrifuga: 20-50 ezer rpm (rotation per minute) Ultracentrifuga: 50 ezer rpm fölött Analitikai centrifuga: molekulák méretének és moláris tömegének meghatározása Preparatív centrifuga: molekulák elválasztása méretük és molekulatömegük alapján szögrotor kilendülőrotor
Sebességi határszedimentációs módszer A: határzóna (boundary) B: plató : diffúziómentes konc. profil
2. Ülepedési egyensúlyi módszer kis sebességű centrifugálás diffúzió Jean Baptiste Perrin francia fizikus (1870-1942) Nobel-díj 1926-ban ülepedés
energia E 2 E 1 c 2 c 1 c c 1 2 = e E E 1 kt m 2 ρk E1 E2 = ω 1 2 2 ρ 2 ( ) 2 2 r r 1 számolható ln c c 2 1 = 2 mω 1 2kT ρk ρ ( ) 2 2 r r 2 1 mérhető Molekula alakja nem befolyásol!
Az analitikai ultracentrifuga előnyei Nincs szükség standardra Érzékeny, pontos és robusztus Nincs kölcsönhatás állófázissal Széles molekulatömeg-tartomány vizsgálható egy kísérleten belül (peptidektől vírusokig) Nem igényel fehérjemódosítást A fehérje bármely alkalmas oldószerben (mobil fázis) vizsgálható, azt nem szükséges lecserélni a méréshez A szedimentáció elmélete és fizikai alapjai jól ismertek
3. Sűrűséggrádiens módszer 2 F centrifug = mrω F felhajtó = ρ k m 2 rω ρ Ha ρ= ρ k akkor F f = mrω 2 = F f és v = 0! Nagy molekulatömeg, kis méret: CsCl, CsBr, glicerin, szukróz (szacharóz); fikoll Vér lipoproteinek
Differenciálcentrifugálás/ sejtfrakcionálás Albert Claude belga biológus (1899-1983) Nobel-díj 1974-ben mitokondrium mikroszóma lizoszóma
Elektroforézis ion-kettősréteg Arne Tiselius svéd biokémikus (1902-1971) Nobel-díj 1948-ban
Coulomb-erő : Súrlódási erő : F c = QE = ZeE E= elektromos térerősség e=elemi töltés Z= töltésszám F f = fv v = sebesség f= alaki faktor Meddig gyorsul a részecske? amíg : F c = F f elektroforetikus mobilitás ZeE = fv Gömbszerű molekulára: ZeE = 6πηrv (Stokes-törvény) u el = v E = Ze f Ze 6πηr = A molekula sugara számolható
Agaróz gélelektroforézis
SYBR green
SDS poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) nátrium-dodecil-szulfát (sodium-dodecyl-sulphate) TEMED (tetrametil-etilén-diamin) ammónium-perszulfát
Coomassie Brillant Blue + fehérje
Natív ELFO
Izoelektromos fókuszálás
2D elektroforézis
ph 3 ph 10 biotech.szbk.u-szeged.hu/kk_jegyzet/.../5_downstream_1.ppt
biotech.szbk.u-szeged.hu/kk_jegyzet/.../5_downstream_1.ppt
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!