Keringő daganatsejtek kimutatása vastagbéldaganatos betegek mintáiból digitális fluoreszcens mikroszkópiával és képalkotó citometriával

Keringő daganatsejtek kimutatása vastagbéldaganatos betegek mintáiból digitális fluoreszcens mikroszkópiával és képalkotó citometriával Doktori értekezés tézisei Varga Viktor Sebestyén M.Sc. Semmelweis Egyetem, II. Belgyógyászati Klinika Semmelweis Egyetem, Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Gasztroenterológia PhD program Programvezető: Prof. Tulassay Zsolt egyetemi tanár, az orvostudományok doktora. Témavezető: Dr. Molnár Béla, az orvostudományok doktora. Budapest 2009 1

BEVEZETÉS Az utóbbi időkben az emberi szervezet ritka sejtjeire fokozott figyelem irányul (keringő daganat sejtek, fiziológiás és patológiás őssejtek, magzati sejtek). A keringő daganatsejtek citometria segítségével mutathatók ki perifériás vérmintákban. A két legelterjedtebb citometria technika az áramlási és a képalkotó citometria. A tárgylemez képalkotó citométerek nagyfelbontású mikroszkóp optikát használnak fluoreszcens megvilágítással kiegészítve. A sejtek képeinek digitális feldolgozásával hasonló mérési adatokat szolgáltatnak, mint az áramlási citométerek (FCM). A keringő daganatsejtek kimutatásában a tárgylemez képalkotó citometriának több előnye is van az áramlási citometriával szemben. A képalkotás információt ad a morfológiáról és sejtek szerkezetéről. A képalkotó rendszerek rögzítik a sejtek elhelyezkedését is a tárgylemezen és a mérési adatok alapján a kiválasztott sejtek megvizsgálhatóak más képalkotási eljárással is. A tárgylemez citometria kis mintamennyiségeknél is használható és bizonyított alkalmazhatósága ritka sejt kimutatásra. A minták újrafestésével és újra digitalizálásával még több paraméter nyerhető ki és a sejt csoportok és szövetminták elemzése is lehetséges. A számítástechnika és CCD kamerák fejlődése körülbelül 20 évvel ezelőtt tette lehetővé az elfogadható sebességű tárgylemez képalkotó citometriát és az adatok megfelelő kezelését. Azóta készültek lézerpásztázó citométerek (LSC), hagyományos és továbbfejlesztett teljes látóteres fluoreszcens mikroszkópokra továbbá konfokális fluoreszcens mikroszkópokra épült rendszerek. Ezek közül a lézerpásztázó citométer a legelterjedtebb. Klinikai használatra a hagyományos fluoreszcens mikroszkóp a legígéretesebb eszköz. Széleskörűen elterjedt, alacsonyabb a költsége, mint más rendszereknek és általános mikroszkópiára is alkalmas, ami még tovább csökkenti a keringő daganatsejtek kimutatásának költségét, mert nincs szükség dedikált rendszerre. 2

Az utóbbi években megjelent egy másik nagyon gyorsan fejlődő mikroszkópos képalkotó eljárás is. Az átmenőfényes virtuális mikroszkóp vagy más néven a teljes tárgylemez képalkotó (Whole Slide Imaging, WSI) eszközök megvásárolhatóak lettek és kezdenek egyre szélesebb körben elterjedni a patológiában. A teljes tárgylemezes képalkotás azt jelenti, hogy a teljes mintákat bedigitalizálja a rendszer olyan nagy felbontással, amely alkalmas a diagnosztizálásra. CÉLKITŰZÉSEK Célkitűzéseim voltak: 1. Olyan eljárások kifejlesztése, amelyek egy fluoreszcens mikroszkópot alkalmassá tesznek kvantitatív és sztöchiometrikus citometria mérések elvégzésére. Ezeket az eljárásokat és programot Pásztázó Fluoreszcens Mikroszkópnak neveztem el (Scanning Fluorescent Microscopy, SFM). 2. Annak megmutatása, hogy az SFM rendszer alkalmas és megbízható a ritka sejtek kimutatásra. Ehhez a kifejlesztett SFM eljárás analitikai pontosságát hasonlítottam össze áramlási és lézerpásztázó citometriával mesterséges és klinikai, magas és alacsony sejtkoncentrációkban. 3. Az SFM eljárás továbbfejlesztése és egy teljes tárgylemez képalkotó rendszer alkalmassá tétele kvantitatív és sztöchiometrikus citometriai mérésekre mely lehetővé teszi a vastagbél-daganatos betegek mintáinak rutinszerű klinikai szűrését. MÓDSZEREK Pásztázó Fluoreszcens Mikroszkópia (SFM) Mintaelőkészítés 3

A rendszer teszteléséhez és kalibrációjához 10 µm átmérőjű citometriás kalibrációs gyöngyöket használtam. Klinikai minta kiértékelésére maradék mintákat használtam daganatmentes fiatal betegekből. A mononukleáris sejtek Hoechst 33258-cal voltak megfestve. A higanygőz lámpa egyenetlenségének a kompenzálására, egy FITC festékkel egyenletesen bevont tárgylemezt használtam. Pásztázó Fluoreszcens Mikroszkóp (SFM) hardver Az SFM rendszer hardver és szoftver összetevőkből áll. Egy Carl Zeiss AxioPlan 2 imaging MOT motorizált mikroszkópot használtam Carl Zeiss Plan-Neofluar 20x / NA 0,5 objektívvel és AxioCam HRc camerával. SFM szoftver komponensek Az autófókusz modul megkeresi egy látómező legjobb fókusz pozícióját digitalizálás közben. A tárgylemez megjelenítő modul egy virtuális mikroszkóp funkcióit biztosítja és megjeleníti a digitalizált tárgylemez összes járulékos adatát. A digitalizált tárgylemez a képfeldolgozó modul segítségével értékelhető ki. A képfeldolgozás első lépése a megvilágítás egyenetlenségének kompenzációja. A rendszer minden látómezőt az alábbi képlet szerint kompenzál. I jelöli a kompenzált látómező képét, I jelöli az eredetit, B a fekete és W a fehér referenciaképet. I x, y ( I x, y B x, y W ) W max u, v x, y B B u, v x, y Ezután a rendszer küszöböléssel szegmentálja a látómezőket és minden sejtnek kiszámolja a következő morfometriai paramétereit: legkisebb, legnagyobb és átlagos átmérő, terület és kerület. Továbbá a következő fluoreszcencia paramétereket: integrált fluoreszcencia, minimum, maximum és átlagos fluoreszcencia és fluoreszcencia tartomány. 4

A képfeldolgozás által kinyert citometriai adatok szóródási diagram, hisztogram és galéria funkciók segítségével értékelhetők ki. Linearitásmérések A rendszer linearitásának mérésére egy homogén fluoreszcens kalibráló gyöngy mintát szkenneltem be többször 1000 és 4000 ms közötti expozíciós időkkel 500 ms-os lépésekben. Ezután kiszámoltam az integrált fluoreszcenciák átlaga és az expozíciós idők közötti korrelációt. Különböző intenzitású kalibráló gyöngyöket szkenneltem be az SFM rendszerrel és mértem meg áramlási citométerrel. Összehasonlítottam a két rendszer által mért fluoreszcencia arányokat. Pásztázó Fluoreszcens Mikroszkópia (SFM), áramlási (FCM) és lézerpásztázó citometria (LSC) összehasonlítása Magas koncentrációjú minták relatív sejt gyakoriság meghatározáshoz Fiatal daganatmentes betegek perifériális véréből izolált mononukleáris sejteket használtam. HT29-es és a mononukleáris sejtek kézzel lettek leszámolva és három példányban keverve a következő arányban: 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:20, 1:50, 1:100, 1:500, 1:1000. A keverékek 100.000 200.000 sejtet tartalmaztak. Anti humán CD45 ECD és CAM 5.2-FITC antitesteket és DNS specifikus TOTO-3 és Hoechst 33258 fluoreszcens festékeket használtam. A minták ketté lettek osztva áramlási és tárgylemez képalkotó citometriai mérésekhez. A tárgylemezes vizsgálatokhoz 5-6 mm átmérőjű keneteket készültek hagyományos tárgylemezek közepén. Alacsony koncentrációjú minták abszolút sejt gyakoriság meghatározáshoz (tárgylemez citometria) CAM 5.2-FITC-cel jelölt HT29-es sejtek mikro manipulátorral lettek a tárgylemezre helyezve a perifériás vérből szeparált CD45-ECD-vel jelölt mononukleáris sejtek közé. 5

Daganatos betegek véréből készült tárgylemezek Különböző Dukes stádiumú (B:2, C:3, D:5) vastagbél-daganatos betegek perifériás vérmintái kerültek elemzésre. HEA-125-öt expresszáló daganat sejtek lettek mágneses sejt szeparációval dúsítva. A mágneses izoláció után a sejttöredékek CD45-ECD-vel, CAM 5.2 FITC-cel és DNS magfestéssel lettek jelölve. Áramlási citometria A mérések egy FACScan áramlási citométeren 488 nm argon-ion lézer gerjesztéssel lettek elvégezve. A fluoreszcens jeleket 530 nm-en (FITC) és 650 nm-en(ecd) érzékelte a rendszer. Lézerpásztázó citometria A lézerpásztázó citométer egy Olympus UPLANFL 20x / NA 0,5 objektívvel volt felszerelve. A fluoreszcens festékek gerjesztésére egy 488 nm-es és egy 633 nm-es lézer állt rendelkezésre. A fluoreszcens jeleket 530 nm-en (FITC), 625 nm-en (ECD) és 670 nm-en (TOTO-3) érzékelte a rendszer. Pásztázó fluoreszcens mikroszkópia (SFM) A fluoreszcens képeket festésenként a következő Carl Zeiss szűrőkészletekkel vettük fel: Hoechst 33258-öt a 02-es, FITC-et a 10-es és az ECD-t a 20-as készlettel. Ritka sejtek fluoreszcens mikroszkópos vizuális kiértékelése Az alacsony koncentrációjú minták kézi szűrését és kiértékelését két független vizsgáló végezte egy Carl Zeiss AxioPlan 2 Imaging mikroszkópon amely egy- és háromszínű szűrőkkel volt ellátva a Hoechst 33258, FITC és ECD festésekhez. A dokumentáció AxioCam HRc kamerával történt. Kvantitatív és sztöchiometrikus fluoreszcens teljes tárgylemezes képalkotás Minták 6

A rendszer teszteléséhez és kalibrációjához ugyanolyan citometriai kalibrációs gyöngyöket használtam, mint az SFM rendszer esetében. Klinikai minta kiértékelésére maradék mintákat használtam daganatmentes fiatal betegekből. A megvilágítás egyenletességének kompenzálására egy speciális tárgylemezt használtam, amit külön e célra készített a Fraunhofer Alkalmazott Optikai és Finommechanikai Intézet (Fraunhofer Institut Angewandte Optik und Feinmechanik, Jéna, Németország). Egy üveg tárgylemezre 1,45 µm vastag plexi (polimetil-metakrilát) réteget vittek fel és a plexiben a következő lézer festékeket oldották fel: Coumarin 2, Coumarin 545, Rhodamine 6G, Rhodamine 101, Oxazin 4, Nile Blue, Rhodamine 800. Hardver Egy MIRAX MIDI automatikus átmenőfényes digitális mikroszkópot használtam, amely a tézisben leírt továbbfejlesztésekkel fluoreszcens módban is használhatóvá vált. A készülék 12 tárgylemezes adagolóval és Carl Zeiss Plan-Apochromat 20x/ NA 0,8 objektívvel rendelkezik. A következő Carl Zeiss szűrőblokkokat használtam a különböző festékekhez: DAPI-hoz a 49-es, FITC-hez a 38HE és Rhodamine-hoz a 43HE blokkot. A kvantitatív fluoreszcens mérésekhez Carl Zeiss Colibri LED fényforrást használtam 365 és 470 nm-es LED modulokkal. Az általános szkenneléseknél Carl Zeiss HXP 120 metal-halid ívlámpát használtam amelyet folyadék fényvezető kábellel lehet a Colibri lámpához vagy közvetlenül a mikroszkóphoz csatlakoztatni. A képek felvételére egy Carl Zeiss AxioCam MRm Rev.3 kamerát használtam. Algoritmusok A minta és a minta helyének megtalálása A MIRAX MIDI egy kisfelbontású előnézeti kamerával van felszerelve, amely érzékeli a nagyfelbontással digitalizálandó területeket. A fluoreszcens képalkotáshoz a mintát egy folytonos vonallal kell körberajzolni fekete filctollal. Minta feltérképezés 7

A képalkotás előtt a mintát fel kell térképezni. A rendszer egy előre meghatározott sűrűségű rács csomópontjain fókuszálja a mintát és megméri az expozíciós időket minden csatornában. A fókuszálás megbízhatóságát 100 látómező automatikus fókuszálásával majd kézi ellenőrzősével teszteltem. Fókuszálás A változó fényintenzitáshoz alkalmazkodva az algoritmus az expozíciós időt folyamatosan változtatja fókuszálás közben. Élesség számítás Az élesség számítás képpont érték különbség hisztogramon alapszik. A hisztogram értékeit az algoritmus az oszlop számának ötödik hatványával szorozza meg. Képkompenzálás A digitális tárgylemez felvétele során minden egyes kép a következő képlet alapján kerül kompenzálásra: I xy = I xy C max uv C xy I jelöli a kompenzált képet, I jelöli az eredeti képet és C jelöli a kompenzáló képet. Az x és y indexek a kép egy pontját jelölik, és az u és v indexek a kompenzáló kép legfényesebb pontjának koordinátáját. A kompenzálás kiértékelésére a legfényesebb gyöngyökből 1200-at szkenneltem be kompenzálás nélkül 20 ms-os expozíciós idővel. Az így szkennelt populáció CV értékét hasonlítottam össze az ugyanezekkel a gyöngyökkel elvégzett linearitás mérés eredményeivel. Képszegmentálás 8

A rendszer küszöböléssel szegmentálja a képeket. A szegmentáláshoz külön lehet alsó és felső küszöbértéket meghatározni. A program az ezeken kívül eső képpontokat figyelmen kívül hagyja. Kvantitatív és sztöchiometrikus mérés Minden egyes objektumnak a következő paramétereit méri meg a rendszer: terület, kerület, legrövidebb és leghosszabb átmérő, forma faktor, átlagos pixel intenzitás és integrált fluoreszcencia (IF). Rendszer linearitási mérések A rendszer linearitását 3 különböző módszerrel igazoltam. A expozíciós linearitás méréséhez gyöngyöket szkenneltem 5, 10, 15, 20 és 25 ms-os expozíciós idővel. Az egy expozíciós idővel történő mérések linearitásának vizsgálatához egyszerre szkenneltem 5 különböző intenzitású gyöngyöt. A területi linearitás méréséhez gyöngyöket és gyöngy fürtöket szkenneltem be és a különböző gyöngy számokat korreláltam a mért területek átlagával. A rendszer klinikai mintákon való használhatóságának igazolásához Hoechsttel jelölt limfociták CV értékét mértem meg. Fluoreszcens virtuális mikroszkópia A tárgylemezek megjelenítésére a MIRAX Viewert használtam. A Viewernek a következő fő funkciói vannak: tetszőleges nagyítás választás, mozgatás, jelölők kezelése, mérés és tárgylemezek megnyitása telekonzultációs szerverről az Interneten. Mérés kiértékelő eszközök A mérések eredményeit a HistoQuant csomag szóródási diagram, hisztogram, galéria és adat export funkcióival értékeltem ki. Eredmények 9

Pástázó Fluoreszcens Mikroszkópia (SFM) Szkennelés Egy látómező átlagos felvételi ideje, amely magában foglalta a tárgyasztalmozgatást, fókuszálást és képfelvételt 5±0,5 másodperc volt. A 430 µm * 320 µm-es látómező átlagosan 975 KB tárolókapacitást igényelt. Egy 3,7 x 3,7 mm-es citocentrifugált terület 3 csatornában 100 kép volt és tömörítetlenül 285 MB-ot foglalt. Kompenzáció Megvilágítási kompenzáció nélkül a gyöngyök CV értéke 24,3% volt, ami 3,9%-ra csökkent a kompenzációval. Linearitás A mért fluoreszcencia értékek átlaga és az expozíciós idő közötti korreláció 0,999963 (p < 0,0001) volt. A két legfényesebb gyöngy populáció aránya 4,11 volt áramlási citométerrel mérve és 4,00 SFM-mel. A második és harmadik populáció aránya 3,84 volt az áramlási citométerrel mérve és 10,67 az SFM-mel. Tömörítés Méréseim szerint standard JPEG-et használva egészen 1:150-es tömörítési arányig a CV érték nem változik lényegesen. A veszteséges tömörítéseknek mint amilyen a JPEG is általános tulajdonsága, hogy a képeknek a felbontásából veszik el az információ, de ez nem érinti az átlagos intenzitást. Mivel jelen esetben a mérés az integrált fluoreszcencián vagyis az intenzitáson alapszik, a CV érték jó lesz nagy tömörítési arányoknál is, de a képminőség nem lesz elfogadható. A legjobb kompromisszum az 1:50 és 1:100-as tömörítés között van. Ebben a tartományban a CV érték és a képminőség még nagyon jó, de a fájl méret már sokkal kisebb. Fókuszálási pontosság 10

Egy 20-as 0,5-ös apertúrájú objektívnek 1,914 µm a számított mélységélessége. Egyedülálló gyöngyök CV értékét 2,8-nak mértem az ideális fókuszsíkban és ugyan ennyi maradt a CV érték egy 2 µm-es tartományban, ami megegyezik a számított mélységélességgel. Ahogy a gyöngyök egyre jobban kikerülnek a fókuszból a CV érték is növekedett. 10 µm-ig a CV érték 4 alatt marad, ami mérésekhez elfogadható. Klinikai minta A Hoechsttel festett limfociták CV értéket 5,6-nak mértem. Pásztázó Fluoreszcens Mikroszkópia (SFM), áramlási (FCM) és lézerpásztázó citometria (LSC) összehasonlítása Az volt a célom, hogy az összehasonlításhoz mind a három rendszeren ugyan azt a mintát lehessen használni. Ezért két különböző DNS festéket és ECD jelölést használtam széles gerjesztési (460-600nm) és emissziós (555-680nm) spektrummal, hogy a 3 rendszer különböző gerjesztési és emissziós spektrumai ne okozzonak problémát. A FITC és ECD jelölést mind három rendszerrel használható. A TOTO-3 és Hoechst 33258 magfestés az LSC (CV tartomány 12-14) és az SFM (CV tartomány 6-8) rendszeren is használható volt. A TOTO-3 jelölés relatív magas CV értéke nem gátolta meg a sejtek megtalálását az LSC-vel. A kísérleteimben nem használtam permeabilizációt és RNS-se kezelést, így a DNS festés heterogén lehetett és a TOTO-3 hozzá tudott kötődni az RNS-hez is növelve ezzel a TOTO-3 fluoreszcenciájának varianciáját. Magas koncentrációjú minták relatív sejt gyakoriság mérése áramlási és tárgylemez képalkotó citometriával A mérések során a sejtfelszíni markerek fluoreszcens kimutatására az áramlási citométer bizonyult a legalkalmasabbnak majd ezt követte az SFM és végül az LSC. Az áramlási citométeres mérések szóródási diagramjain tisztán elkülönülnek a sejtpopulációk, amelyek kevésbé különülnek el az SFM és az LSC méréseknél. 11

Alacsony koncentrációjú minták abszolút sejt gyakoriság mérése tárgylemez citometriával A korreláció a mintára helyezett és a megtalált daganat sejtek között nagyon magas volt az SFM-mel (r 2 =0.96, p<0.001) és az LSC-vel (r 2 =0.95, p<0.01). Hét keringő daganatsejtes beteg mintáin a két rendszer hasonló eredményeket mutatott. Másik három beteg esetében az LSC több sejtet talált meg, mint az SFM (749/166, 355/43, 61/5). Ezekben az esetekben az LSC túlbecsülte a daganatsejtek számát. Kvantitatív és sztöchiometrikus fluoreszcens teljes tárgylemezes képalkotás Fókuszálás A látómezők 93%-nál nem volt eltérés vagy az eltérés kisebb volt, mint a mélység élesség az automatikus és kézzel ellenőrzött fókuszértékek között. Az esetek 7%-ában az eltérés 0,8 µm volt. Szkennelési eredmények A filctollal segített minta megtalálás megbízhatóan működött, ha a jelölés legalább 1 mm széles és folytonos volt az előnézeti kamera képén. A rendszer sztöchiometrikus linearitásának mérése kompenzáció után Az expozíciós idő és az integrált fluoreszcencia között számított korreláció 0,999491 volt. A gyártó által meghatározott intenzitás arányok és a mért integrált fluoreszcencia közötti korreláció 0,999548 volt. Az egy, két és három gyöngyöt tartalmazó fürt populációk átlagos területe és a fürtökben lévő gyöngyök száma között a korreláció 0,999998 volt. A Hoechsttel jelölt kontrol minta CV értéke 6,4 volt. Következtetés 12

Egy motorizált fluoreszcens mikroszkóp kompenzáló tárgylemezzel és speciális képfeldolgozó algoritmusokkal alkalmas kvantitatív és sztöchiometrikus citometriai mérések elvégzésére. Egy ilyen rendszer a jól ismert áramlási és lézerpásztázó citometriával összemérhető eredményeket ad, hasonló szenzitivitással és specificitással. A tárgylemez citometria alkalmasabb ritka sejt kimutatásra, mint az áramlási citometria. Az eljárás továbbfejlesztésével egy fluoreszcens teljes tárgylemez képalkotó készülék is használható kvantitatív és sztöchiometrikus citometriai mérésekre. A teljes tárgylemez képalkotás technikai előnyei a hagyományos mikroszkópiával szemben a klinikai munkafolyamatot hatékonyabbá teszi megbízhatóság, sebesség, emberi erőforrás és költségek szempontjából. Ezekkel a módszerekkel lehetségessé válik a vastagbéldaganatos betegek klinikai szűrése. Publikációs jegyzék ELSŐSZERZŐS KÖZLEMÉNYEK A TÉZIS TÉMÁJÁBAN Varga VS, Bocsi J, Sipos F, Csendes G, Tulassay Z, Molnár B. Scanning fluorescent microscopy is an alternative for quantitative fluorescent cell analysis. Cytometry A. 2004;60:53-62. IF: 1.061 Varga VS, Ficsor L, Kamarás V, Jónás V, Virág T, Tulassay Z, Molnár B. Automated multichannel fluorescent whole slide imaging and its application for cytometry. In print by Cytometry A. IF (2008): 3.259 TÁRSZERZŐS KÖZLEMÉNYEK A TÉZIS TÉMÁJÁBAN Bocsi J, Varga VS, Molnár B, Sipos F, Tulassay Z, Tarnok A. Scanning fluorescent microscopy analysis is applicable for absolute and relative cell frequency determinations. Cytometry A. 2004;61:1-8. IF: 1.061 13

Bocsi J, Lenz D, Mittag A, Varga VS, Molnar B, Tulassay Z, Sack U, Tarnok A. Automated four-color analysis of leukocytes by scanning fluorescence microscopy using quantum dots. Cytometry A. 2006;69:131-134. IF: 3.293 A TÉZIS TÉMÁJÁTÓL FÜGGETLEN TÁRSSZERZŐS KÖZLEMÉNYEK Wu ML, Varga VS, Kamaras V, Ficsor L, Tagscherer A, Tulassay Z, Molnar B. Threedimensional virtual microscopy of colorectal biopsies. Arch Pathol Lab Med. 2005;129:507-510. IF: 1.587 Ficsor L, Varga V, Berczi L, Miheller P, Tagscherer A, Wu ML, Tulassay Z, Molnar B. Automated virtual microscopy of gastric biopsies. Cytometry B Clin Cytom. 2006;70:423-431. IF: 2.065 Ficsor L, Varga VS, Tagscherer A, Tulassay Z, Molnar B. Automated classification of inflammation in colon histological sections based on digital microscopy and advanced image analysis. Cytometry A. 2008;73:230-237. IF: 3.259 Molnar B, Berczi L, Diczhazy C, Tagscherer A, Varga SV, Szende B, Tulassay Z Digital slide and virtual microscopy based routine and telepathology evaluation of routine gastrointestinal biopsy specimens. J Clin Pathol. 2003;56:433-438. IF: 2.966 Krenacs T, Zsakovics I, Diczhazi C, Ficsor L, Varga VS, Molnar B. The Potential of Digital Microscopy in Breast Pathology. Pathol Oncol Res. 2009;15:55-58. IF (2008): 1.260 ABSZTRAKTOK A TÉZIS TÉMÁJÁBAN Varga VS, Ficsor L, Galamb B, Kamarás V, Molnár B, Tulassay Z. Speed improvement of automated fluorescent digital slide scanning. 2008., 9th European Congress on Telepathology / 3rd International Congress on Virtual Microscopy, Toledo, Spain Varga VS, Ficsor L, Kamarás V, Monár B, Tulassay Z. Automated fluorescent slide scanning. 2007., 21th European Congress of Pathology, Istanbul, Turkey 14

Varga V. The advances in scanning fluorescent microscopy, (automated slide handling, metal-halide illumination, software features) means significant advantage for routine applications. 2006., 8th European Congress on Telepathology and 2nd International Congress on Virtual Microscopy, Budapest, Hungary Varga VS, Ficsor L, Kamarás V, Molnár B, Tulassay Z. Automated fluorescent digital slide scanning. 2006., 4th European Congress of Toxicologic Pathology, La Grande Motte, France Varga VS, Bocsi J, Sipos F, Csendes G, Tulassay Z, Molnár B. Scanning Fluorescent Microscopy is an alternative for quantitative fluorescent cell analysis. 2003., Slide Based Cytometry Conference, Lepzig, Germany Varga VS, Bocsi J, Sipos F, Csendes G, Tulassay Z, Molnár B. Development and standardization of a Scanning Fluorescent Microscope system for cytometric measurements using digital slides. 2002., ISAC XXI International Congress, San Diego, California Varga VS, Molnár B, Tagscherer A, Mahoney W, Tulassay Z. Detection of Circulating Fetal Cells Using Automated Fluorescent Microscopy. 1999., Magyar Gasztroenterológiai Társaság, 41. Nagygyűlés Varga VS, Molnár B, Tagscherer A, Mahoney W, Tulassay Z. Detection of Circulating Fetal Cells Using Automated Fluorescent Microscopy. 1999., Future Trends in Quantitative Cytology, Hortobágy-EPONA V.S. Varga, B. Molnar, G. Csendes, R. Schafer, W. Mahoney. Automated Fluorescent Scanning Microscopy: Cell Classification by Fuzzy Functions. 1999., 6. Fuzzy Days, Dortmund, Germany Varga VS, Molnár B, Kármán J, Tagscherer A, Schafer R, Mahoney W, Tulassay Z. Detection of Cytokeratin Positive Colon Cancer Cells in Blood Using Automated Fluorescent Microscopy. 1999., Magyar Gasztroenterológiai Társaság, 41. Nagygyűlés, Balatonaliga 15

Varga VS, Molnár B, Tagscherer A, Mahoney W, Tulassay Z. Detection of Circulating Fetal Cells Using Automated Fluorescent Microscopy. 1998., 11 th Heidelberg Cytometry Symposium, Heidelberg, Germany Bocsi J, Varga VS, Molnar B. Equally Valuable Results of Fluorescent Cell Analysis by Scanning Fluorescent Microscopy compared to Flow Cytometry and Laser Scanning Cytometry. 2003., Slide Based Cytometry Conference, Lepzig, Germany Molnár B, Varga VS, Bocsi J, Csendes G. Development And Standardization of A Scanning Fluorescent Microscope System For Cytometric Measurements Using Digital Slides. 2002., ISAC XXI International Congress, San Diego, California Bocsi J, Varga VS, Sipos F, Tulassay Z, Molnár B, Tárnok A. Comparison of Scanning Fluorescent Microscopy (SFM), Laser Scannin Cytometer (LSC) and Flow Cytometer (FCM) for rare cell detection and analytical cytology. 2002., ISAC XXI International Congress, San Diego, California Molnár B, Bocsi J, Varga VS, Tulassay Z. Application of Scanning Fluorescent Microscopy For The Evaluation Of Magnetic Isolated,Fluorescent Labeled Circulating Tumor Cells In Colorectal Cancer Patients. 2002., ISAC XXI International Congress, San Diego, California Bocsi J, Luther E, Mittag A, Jensen I, Sack U, Lenz D, Trezl L, Varga VS, Molnar B, Tarnok A. Clinical and laboratory applications of slide-based cytometry with the LSC, SFM, and the icyte imaging cytometer instruments. Optical Biopsy V, SPIE, 2004;5328:30-40. A TÉZIS TÉMÁJÁTÓL FÜGGETLEN ABSZTRAKTOK Molnár B, Kis R, Fonyad L, Krenacs T, Gerely L, Varga V, Ficsor L, Matolcsy A. Digitalisation of routine histology laboratory processes: sign-out, immunohistochemistry, education. 2008., 9th European Congress on Telepathology and 3rd International Congress on Virtual Microscopy, Toledo, Spain 16

Varga VS, Ficsor L, Galamb B, Kamarás V, Molnár B, Tulassay Z. Speed improvement of automated fluorescent digital slide scanning. 2008., 9th European Congress on Telepathology and 3rd International Congress on Virtual Microscopy, Toledo, Spain Ficsor L, Varga V, Tagscherer A, Molnár B. Automated classification of inflammation in colon histological sections based on digital microscopy and advanced image analysis. 2008., 9th European Congress on Telepathology / 3rd International Congress on Virtual Microscopy, Toledo, Spain Molnár B, Papik K, Tagscherer A, Csendes G, Varga VS, Tulassay Z, Schaefer R, Mahoney W. Three-dimensional reconstruction and analysis of gastric malignancies by electronic slides of consecutive sections and virtual microscopy. 1999., SPIE Vol. 3605: 190-199, San Jose, California, USA Wu ML, Varga VS, Kamaras V, Ficsor L, Tagscherer A, Tulassay Z, Molnar B. Three- Dimensional Microscopy of Colorectal Biopsies. 2005., Advancing Practice, Instruction, and Innovation Through Informatics (APIII), Lake Tahoe, California, USA Molnar B, Varga V, Tagscherer A, Ficsor L, Virag T. Applications of Digital Histology in a Routine Environment: New Integrated Tools for Diagnosis, Teleconsultation, Training, Quantification and 3D Reconstruction. 2005., Advancing Practice, Instruction, and Innovation Through Informatics (APIII), Lake Tahoe, California, USA Gombás P, Molnár B, Varga S, Tagscherer A, Csendes G, Kamarás V, Virág T. Development and routine evaluation of digital histology laboratory. 2003., 19 th European Congress of Pathology, Ljubljana, Slovenia Molnár B, Varga V, Virág T, Tagscherer A. Experiences in the production of digital slides by an automated high-resolution scanner system after automated slide preparation. 2003., 19 th European Congress of Pathology, Ljubljana, Slovenia Berczi L, Diczházy C, Varga V, Tagscherer A, Molnár B, Szende B, Tulassay Z, Kopper L. Digital slide and virtual microscopy based routine and telepathology evaluation of routine gastrointestinal biopsy specimen. 2003., 19 th European Congress of Pathology, Ljubljana, Slovenia 17

Ficsor L, Varga V, Jonás V, Micsik T, Fonyad L, Petak I, Kopper L, Monar B, Krenács T. Validation of automated image analysis (Histoquant) in colon cancer using digital slides of EGFR, COX-2, BETA-CATENIN, and cyclin D1 immunostainings. 2007., 21th European Congress of Pathology, Istanbul, Turkey Molnár B, Varga VS, Tagscherer A, Papik K, Csendes G, Tulassay Z. Threedimensional (3D) reconstruction and analysis of gastric malignancies by virtual microscopy of electronic slides from consecutive histological sections. 1999., Magyar Gasztroenterológiai Társaság, 41. Nagygyűlés, Balatonaliga A TÉZIS TÉMÁJÁTÓL FÜGGETLEN KÖNYVFEJEZET Molnar B, Berczi L, Ficsor L, Varga V, Tagscherer A, Tulassay Z. Digital slide and virtual microscopy-based routine and telepathology evaluation of gastrointestinal biopsy specimen. In: Telepathology, Ed.: Kumar S, Dunn BE, Springer-Verlag GmbH, Heidelberg, Chapter 2, 2009 18