Lumineszcencia Lumineszcencia Alapok, tulajdonságok Molekula energiája Spinállapotok Lumineszcencia típusai Lumineszcencia átmenetei A lumineszcencia paraméterei A lumineszcencia mérése Polarizáció, anizotrópia Alkalmazások, néhány specialitás Atomszerkezet Molekulaszerkezet A testek a hőmérsékleti sugárzáson felül képesek fényt kibocsátani - lumineszcencia Növekvő energiájú pályák Molekula: kovalens kötéssel összekapcsolt atomok Legegyszerűbb eset: kétatomos molekula (pl., hidrogénmolekula) Vonalas emissziós Fotonemisszió: E=hf magasabb energiájú ( gerjesztett állapotok) A molekulák vibrációs és rotációs mozgásokat végeznek! Példák a vibrációs mozgásra háromatomos (metilén) csoportban (-CH 2-): Vibráció: kovalens kötés mentén történő periodikus mozgás Rotáció: kovalens kötés tengelye körüli periodikus mozgás Aszimmetrikus nyúlás Szimmetrikus nyúlás Ollózás
Molekula energiája Energia állapotok ábrázolása Max Born (1882-1970) J. Robert Oppenheimer (1904-1967) Born-Oppenheimer - közelítés: E total = E e + E v + E r Fontos megjegyzések: Energia állapotok egymástól függetlenek (csatolás elhanyagolható) Állapotok energianívói kvantáltak Átmenetek energia csomag elnyelésével/kibocsátásával járnak Energiaszintek közötti különbségek nagyságrendje különbözik: ~100x ~100x E e > E v > E r ~3x10-19 J (~2 ev) > ~3x10-21 J > ~3x10-23 J Jabłoński-féle termséma: egy molekula elektronállapotait, és a közöttük végbemenő átmeneteket (nyilakkal) mutatja Elektron energiaszintek (vastag vonalak) Alexander Jabłoński (1898-1980) Vibrációs energiaszintek (vékony vonalak) Első gerjesztett állapot Alapállapot Wolfgang Pauli (1900-1958) Spinállapotok Pauli-elv: Minden kvantumállapotot csak egyetlen elektron tölthet be. Egy atomon belül nem létezhet két olyan elektron, amelynek mind a négy kvantumszáma megegyezik. betöltött alhéj: spin párosítás (ellentétes spinű elektronok párosodnak) Szingulett és triplett állapotok: az eredő spinállapothoz rendelt mágneses momentum orientációinak száma (mágneses térben) = 2S+1 = 1 (szingulett) vagy 3 (triplett). (S = eredő spin, pl. betöltött alhéj esetén (+1/2)+(-1/2) = 0) S: szingulett állapot: ellentétes spinű párosított elektronok, eredő spin (S) = 0, orientációk száma (2S+1) = 1. T: triplett állapot: a molekulában azonos spinállapotú elektronok vannak, eredő spin = 1 (pl. (+1/2)+(+1/2) = 1), orientációk száma (2S+1 = 2+1) = 3. gerjesztett energianívó Lumineszcencia Gerjesztett állapotból fényemisszióval járó relaxáció A hőmérsékleti sugárzáson felül kibocsátott sugárzás Hideg fény Fluoreszcencia és foszforeszcencia alap energianívó Szingulett alapállapot Gerjesztett szingulett állapot Gerjesztett triplett állapot
A lumineszcencia egyszerűsített lépései A lumineszcencia típusai (Atomi rendszer!) Abszorpció Gerjesztés (magasabb energiaszintre lépés) Gerjesztés módja szerint abszorpció Lumineszcencia típusa fotolumineszcencia Biolumineszcencia kémiai reakció kemilumineszcencia, biolumineszcencia termikusan aktivált ion-rekombináció termolumineszcencia töltés injekció elektrolumineszcencia nagyenergiájú radioaktív sugárzás radiolumineszcencia súrlódás tribolumineszcencia hanghullámok szonolumineszcencia Emisszió De-excitáció (relaxáció az alapállapotba) Gerjesztett állapot szerint első gerjesztett szingulett állapot legalsó (gerjesztet) triplett állapot Lumineszcencia típusa fluoreszencia foszforeszcencia Szentjánosbogár A lumineszcencia folyamatai Kasha-szabály Energia Jablonski diagram (termséma) Belső konverzió Vibrációs relaxáció Intersystem crossing Belső konverzió: sugárzásmentes átmenet elektron energiaállapotok között (pl. S 2 S 1) Vibrációs relaxáció: egy adott elektron energiaállapoton belüli de-excitációs folyamat Intersystem crossing : rendszerek közötti, spinátfordulással járó átmenet (pl. S 1 T 1) Fotonemisszió (fluoreszcencia vagy foszforeszcencia) a legalacsonyabb gerjesztett elektron-energiaállapot (S 1, T 1) legalacsonyabb vibrációs szintjéről történő átmenet során lép fel. S 2 S 1 Gerjesztés Fluoreszcencia Foszforeszcencia Michael Kasha (1920-) Amerikai fizikus S 0
Az átmenetek sebessége (időskálája) A lumineszcencia tulajdonságai I. gerjesztés 10-15 s fluoreszcencia 10-9 s foszforeszcencia 10-6 - 10 s Intenzitás (norm.) Fluoreszcencia gerjesztési (emisszió 340 nm-nél) Lumineszcencia ok Fluoreszcencia emissziós (gerjesztés 295 nm-nél) Foszforeszcencia emissziós (gerjesztés 295 nm-nél) Sávos színkép Gerjesztési és emissziós ok tükörszimmetrikusak Stokes shift alapállapot gerjesztett állapot relaxáció vibrációs relaxáció 10-12 s kioltás vagy energiatranszfer belső konverzió (hő) Triptofán ai Hullámhossz (nm) George Stokes (1819-1903) Fluoreszcens festékmolekulák: fluorofórok Fluorofórok célzott bekötésével nem fluoreszkáló molekulák is vizsgálhatóvá válnak ( fluoreszcens jelölés ) A lumineszcencia tulajdonságai II. A fluoreszcencia mérése Φ = Kvantumhatásfok emittált fotonok száma abszorbeált fotonok száma 1 Fluoreszcencia spektrométer ( Steady-state spektrofluoriméter) A gerjesztett állapot élettartama dn dt = ( k f + k nr ) N ( )t N = N 0 e k f +k nr 1 τ = k f + k nr knr=nem sugárzásos átmenetek sebességi állandói N=gerjesztett állapotú molekulák száma t=idő kf=fluoreszcencia sebességi állandó knr=nem-sugárzásos átmenetek sebességi állandója τ=fluoreszcencia élettartam Gerjesztési hullámhossz változtatásával felvett Gerjesztési λem= konstans (emissziós maximum) Xe-lámpa Gerjesztő monokromátor (λex változtatható) Emissziós monokromátor (λem változtatható) Küvetta (minta) Fotodetektor Emissziós hullámhossz változtatásával felvett Emissziós λex= konstans (gerjesztési maximum)
A fény elektromágneses hullám polarizálható Térben tovaterjedő elektromágneses zavar. Tranzverzális hullám. Ezért polarizálható. Polarizáció, anizotrópia J z z Mágneses tér oszcillációja abszorpciós vektor Vertikálisan síkpolarizált gerjesztő fény Fotoszelekció: random populációból az elektromos vektorral párhuzamos abszorpciós vektorú festékmolekulák kiválasztása x J x J y V polarizációs szűrő Hullámhossz Elektromos tér oszcillációja Tovaterjedés iránya Fluorofórokhoz rendelhető abszorpciós és emissziós vektor: megszabja a foton abszorpció és emisszió valószínűségét. Abszorpció maximális, ha az absz. vektor és a fény elektromos térerővektora párhuzamos. Abszorpció képessége függ cos 2 α-tól (α az absz. vektor és a fény elektromos vektora közötti szög). Polarizáció: Anizotrópia: y H J V J H additív mennyiség nevezőben a teljes gerjesztő intenzitás (JVHx=JVHy) A fluoreszcencia orvosibiológiai alkalmazásai Két-foton fluoreszcencia Fluoreszcencia mikroszkópia DNS szekvenálás (lánc terminációs módszer) DNS festés (EtBr) DNS microarray technológia Immunfluoreszcencia Fluoreszcencia-aktivált sejt válogatás (FACS) Förster rezonancia energia transzfer (FRET) Fluorescence recovery after photoleaching (FRAP) Fluoreszcens fehérjekonjugációs technikák Kvantum pontok (quantm dots) Minta Emisszió Fókuszpont EXCITED GERJESZTETT STATE ÁLLAPOT Emisszió λ=350 nm λ=700 nm Exc. Exc. Foton GROUND ALAPÁLLAPOT STATE EGYFOTON GERJESZTÉS (1P) Objektívlencse Foton KÉTFOTON GERJESZTÉS (2P) 2P 1P Vesekéreg - tubuláris rendszer (vörös: ér) Agykérgi piramissejtek
Szuperfelbontású mikroszkópia A feloldási problémát pozíciómeghatározási problémává alakítjuk Összefoglalás Feloldási probléma (Abbé-elv) d d = 0.61λ n sinα Pozíciómeghatározási probléma (pontosság a fotonszámtól függ) Sztochasztikus adatgyűjtés egyedi fluorofórokról A molekulaszerkezet és energiaállapotok fontos szerepet játszanak a lumineszcenciában. STORM: stochastic optical reconstruction microscopy Mikrotubulusok Bekapcsolt fluorofórok 1 Bekapcsolt fluorofórok 2 A lumineszcencia molekuláris de-excitáció (relaxáció) melyet fénykibocsáts követ. A fluoreszcencia ot a Stokes-féle eltolódás jellemzi. A kvantumhatásfok és fluoreszcencia élettartam fontos lumineszcencia paraméterek. Adatgyűjtési folyamat Bekapcsolt fluorofórok 3 Bekapcsolt fluorofórok 4 Pozíciókból számított kép Mikrotubuláris rendszer