Tudományos Diákköri Dolgozat SENDULA RÓBERT Modellpeptidek szintézise Hg(II) ion által katalizált bomlás vizsgálatához Témavezető: Süliné Dr. Vargha Helga Készült a ELTE - MTA Peptidkémiai Kutatócsoportjában Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2005.
TARTALOMJEGYZÉK Tartalomjegyzék 2 Rövidítések jegyzéke 3 1. Bevezető 4 2. Célkitűzések 5 3. Peptidszintézis 7 3.1. Szilárdfázisú peptidszintézis 3.1.1. Stratégiák a szilárdfázisú peptidszintézisben 3.2. Modellpeptidek szintézise és tisztítása 3.2.1. Anyagok és berendezések 3.2.2. Lineáris peptidek szintézise 10 3.2.3. Ciklopeptidek szintézise 14 3.2.4. Peptidek tisztítása 14 3.2.5. Peptidek azonosítása 14 4. Előzetes bomlásvizsgálatok 15 4.1. A dipeptidek bomlásvizsgálata VRK-n 4.2. Lineáris és gyűrűs oligopeptidek bomlásának vizsgálata analítikai HPLC-vel 15 16 5. Eredmények összefoglalása 20 6. Köszönetnyilvánítás 22 7. Hivatkozások 23 8 9 10 10 2
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE Aaa Ac Boc Bzl DCM DCC DIC DIEA DMF Dnp DMS Fmoc HOBt HPLC MBHA Mob MS OAc TFA TEA TIMP-1 Tos VRK - Tetszőleges aminosav - Acetil - terc-butiloxi-karbonil - Benzil - Diklórmetán - Diciklohexil-karbodiimid - Diizopropil-karbodiimid - Diizopropil-etilamin - N,N-dimetil-formamid - Dinitrofenil -Dimetil-szulfon - Fluorenil-metoxi-karbonil - N-hidroxi-benztriazol - Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia - 4-metil-benzhidrilamin - p-metoxi-benzil - Tömegspektrométer - Acetát - Trifluorecetsav - Trietil-amin - Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinases - Tozil - Vékonyréteg-kromatográfia 3
1. BEVEZETŐ A TIMP-1 fehérje C-terminális doménjének szintézisekor a teljesen védett peptidről cseppfolyós hidrogén-fluoriddal, az acetamidometil-csoportokat kivéve, az összes védőcsoportot eltávolították. S G Q L K P I C S L C P F V I C T L L Q D T W L H A C C L P R E P G L C T Q L G H S E K G F Q S R E NH 2 W Q S L R S Q I A COOH 1.ábra. TIMP-1 fehérje C-terminális doménje A cisztein acetamidometil védőcsoportjának eltávolításához használt Hg(II) ionokat atomabszorpciós mérések tanúsága szerint többszörös kromatográfiás tisztítás után sem sikerült eltávolítani [1]. Modellkísérletekkel kimutatták, hogy ez a Hg(II) ion szennyeződés mind a HPLC-s tisztítás, mind a ciklizálás körülményei között a peptid bomlását idézi elő [1]. A nyomokban jelentkező bomlásterméket csak a fejlett MS technikának köszönhetően lehetett észrevenni. Hasonló bomlást ciszteintartalmú peptid esetében Garzotti és munkatársai észleltek [2]. Ennek a mellékreakciónak a tanulmányozása nemcsak azért bír jelentőséggel, mert megnehezíti bizonyos szintézis körülmények között előállított peptidek tisztaságának a biztosítását, hanem azért is, mert a reakciónak lehetnek élettani vonatkozási is. Mint az már közismert, a nehézfémek enzimgátló, és ezáltal egészségkárosító hatásúak, amelyre például szolgál a szerinproteázt gátló hatás [3], a neutrofil granulociták aktivitásának gátlása [4], idegsejtek maradandó károsítása [5]. Tanulmányozták a ciszteinre koordinálódó higany (II) ion peptid/fehérje harmadlagos szerkezetmódosító hatását is [3, 6]. Így elképzelhető, hogy ennek a reakciónak a tanulmányozásával egy újabb, nehézfémionok hatásának betudható molekuláris szintű fehérjekárosító mechanizmusra is fény derül. 4
2. CÉLKITŰZÉSEK TDK munkám célja olyan modellpeptidek szintézise volt, amelyek alkalmasak lehetnek a Hg(II) acetát hatására végbemenő peptidkötés hasadásnak tanulmányozására. Az eredeti megfigyelés szerint, a szintetikusan előállított TIMP-1 C-terminális domén tömegspektrumában azonosított szennyeződés az Arg 162 -His 163 közötti peptidkötés hasadásával jött létre [1], ezért elsősorban Arg-His szekvenciát tartalmazó peptidek szintézise volt a célom. Az irodalom szerint, a peptideket illetve fehérjéket alkotó aminosavak közül a hisztidin, a cisztein, a glutaminsav illetve az aszparaginsav képes, oldalláncainak funkciós csoportja révén, fémkomplexek képzésére [7, 8, 9]. Így feltételezhető, hogy a fent észlelt Arg-His peptidkötés hasadásában a hisztidin imidazol oldalláncának szerepe van, de nem zárható ki a diszulfidkötés jelenlétének hatása sem, hiszen a TIMP-1 fehérje C-terminális doménje diszulfidhidakat is tartalmaz (1. ábra). A Hg(II) ion által katalizált bomlás tanulmányozásához olyan modellpeptidek előállítására volt szükség, amelyeknek vizsgálatával mind a hisztidin, mind a diszulfidkötés szerepe tisztázható. A modellpeptidek tervezésekor a következő szempontokat vettük figyelembe: 1. H-Arg-His-NH 2 csak a hasadó kötést tartalmazó szabad N-terminálisú dipeptid 2. Ac-Arg-His-NH 2 csak a hasadó kötést tartalmazó védett N-terminálisú dipeptid 3. Arg-His szekvenciát tartalmazó lineáris peptid 4. Arg-His szekvenciát tartalmazó, diszulfidhidas ciklopeptid a TIMP-1 C-terminális egyszerűsített modellje, tartalmazza a bomlásban szerepet játszható Arg-His peptidet és diszulfidhidat 5. Ala-His szekvenciát tartalmazó, diszulfidhidas ciklopeptid a hisztidint megelőző aminosav szerepének vizsgálatára 6. Arg-His szekvenciát nem tartalmazó diszulfidhidas ciklopeptid diszulfidhíd szerepének vizsgálatára Ezeknek a szempontoknak megfelelően az alábbi peptidek bomlását kívántam vizsgálni: H-Arg-His-NH 2 Ac-Arg-His-NH 2 H-Phe-Gln-Ser-Arg-His-OH Az itt felsorolt peptidek közül a kutatócsoportban korábban elkészült: H-Phe-Gln-Ser-Arg-His-OH 5
Az én feladatom pedig a következő vegyületek szintézise volt: H-Arg-His-NH 2 Ac-Arg-His-NH 2 Ezután olyan próba kísérlet elvégezése volt a célom, mellyel azt kívántam megvizsgálni, hogy a tervezett peptidek alkalmasak-e az említett bomlásjelenség reprodukálására. Mivel a TIMP-1 lúgos ph-n (ciklizáláskor) és savas ph-n (kromatográfiás körülmények között) is bomlik, mindkét ph tartományban terveztem próba kísérletet. A savas ph tartományban reakcióközegként a kromatográfiás tisztításban használt A eluens, trifluorecetsav 0,1% -os vizes oldata (ph~2) szolgált. A lúgos ph tartományban reakcióközegnek a ciklizáláshoz használt ammónium-acetát puffert választottam (ph=7,92). 6
3. PEPTIDSZINTÉZIS A peptideket felépítő aminosavrészek savamídkötéssel kapcsolódnak egymáshoz. A savamídkötés az egyik aminosav karboxilcsoportja és a másik aminosav aminocsoportja között alakul ki (2. ábra). 2. ábra. A peptidkötés kialakítása (X, Y védőcsoportok) A peptideket alkotó aminosavak száma szerint megkülönböztetünk dipeptideket, tripeptideket, tetrapeptideket és így tovább. A kettőnél több aminosavat tartalmazó peptideket oligopeptideknek is szokták nevezni. A kisebb tagszámú peptidek oldatfázisú előállítására általában lépésenkénti szintézist használnak [10, 11]. Ez magába foglalja a peptidkötés kialakításában nem szereplő funkciós csoportok (az oldallánc funkciós csoportjai) átmeneti megvédését, a peptidkötést létesítő karboxilcsoport előzetes aktiválását, majd a kapcsolást, azaz a peptidkötés kialakítását két aminosav között, végül pedig a védőcsoportok eltávolítását. Az acilező aminosav karboxilcsoportjának aktiválása azt jelenti, hogy az N-védett aminosavat reakcióképes karbonsavszármazékká alakítjuk át. Ennek megfelelően az alábbi peptidszintetikus módszerek ismeretesek: Karbonsavazidos Karbonsavkloridos Vegyes anhidrides Szimmetrikus anhidrides Aktív észteres - in situ aktívészter ( HOBt + DCC ) Karbodiimides Oldatfázisú szintézis esetén az acilezendő aminosav karboxilcsoportját is átmenetileg védeni kell. Erre kiválóan alkalmas az észteresítés, melyet metanolban, hidrogén-klorid jelenlétében lehet kialakitani. A kapcsolás a két aminosav-származék közötti peptidkötés (savamídkötés) kialakítását jelenti. Az acilező ágens, bázis jelenlétében acilezi a szabad N-terminálissal rendelkező aminosavat és védett dipeptid keletkezik. A védőcsoportok eltávolítása a védett peptid C-terminálisáról, ha azt észteresítéssel védtük, híg lúgos hidrolízissel történik. Az N-terminális és a többi, oldallánc funkciós csoportok védőcsoportjának eltávolítása, az alkalmazott védőcsoportok tulajdonságaitól függően történhet egyszerre, vagy szelektíven, a megfelelő reagensek alkalmazásával. 7
3.1. Szilárdfázisú peptidszintézis 3. ábra. A szilárdfázisú peptidszintézis elve A peptidek szilárdfázisú szintézisében lényegében két műveletet ismételünk minden lánchosszabbítási ciklusban. Az egyik a védőcsoport eltávolítása a védett peptid aminocsoportjáról, a másik az N- védett és aktivált aminosav hozzákapcsolása a szabaddá vált aminocsoporthoz. Merrifield 1962-ben olyan módszert dolgozott ki, amely később lehetővé tette a folyamat automatizálását. A Merrifield-féle módszer esetében a hordozóként használt gyanta 98% sztirolból és 2% 1,4-divinil-benzolból készült térhálós kopolimer, amely vízben és szerves oldószerekben oldhatatlan. A 20-70 mikrométer átmérőjű szemcsékből álló műgyanta klórmetilezés után hozzávetőleg 1-2 mmol klórt (aktív helyet) tartalmaz grammonként. Az első N-védett aminosavat a hordozóhoz kapcsolják a karboxilcsoporton keresztül. Ezután következnek a ciklusok: lehasítják az N-terminálisról a védőcsoportot, majd a felszabaduló aminocsoporthoz újabb N-védett aminosavat kapcsolnak. Ezután szükség szerint újabb aminosavak felkapcsolása következhet. A szintézis végén a peptidről lehasítják a védőcsoportokat illetve maga a peptid is lehasad a gyantáról. Az eljárás előnyei közé tartozik, hogy a szintézis közben a reagensek feleslege a melléktermékekkel együtt egyszerűen lemosható a szilárd hordozóra kapcsolt peptid mellől. 8
3.1.1. Stratégiák a szilárdfázisú peptidszintézisben A szilárdfázisú peptidszintézis két stratégia szerint történik. A Boc-technika esetén a szintézishez használt védett aminosav N- terminálisát Boc-csoport védi. Innen származik az eljárás neve. Az aminosav oldalláncainak védésére benzil típusú csoportot használnak. A Boc-csoport eltávolítása 30%-os TFA oldattal történik, míg a peptid védőcsoportjainak, és magának a peptidnek a gyantáról való eltávolításához hidrogén-fluoridot használnak. A Fmoc-technika esetén a szintézishez használt védett aminosav N- terminálisát Fmoc-csoport védi. Innen származik az eljárás neve. Az aminosav oldalláncainak védésére terc-butil típusú csoport használnak. A Fmoc-csoport eltávolítása szekunder bázissal, például 20%-os piperidin oldattal történik, míg a peptid védőcsoportjainak, és magának a peptidnek a gyantáról való eltávolításához 95%-os TFA-t használnak. A két stratégia közül az Fmoc-technikával lehet a kíméletesebben előállítani a peptideket. A Boc-technika viszont jóval olcsóbb eljárás. 4.ábra. Szilárdfázisú peptidszintézishez általam használt eszköz 9
3.2. Modellpeptidek szintézise és tisztítása 3.2.1. Anyagok és berendezések Szintézishez használt anyagok A Boc-aminosavakat és a szintézishez szükséges analitikai tisztaságú oldószereket, reagenseket a Reanal Finomvegyszergyár Rt.-től szereztük be. A kísérletekben használt szilikagél vékonyréteget (TLC Aluminium Sheets Silica Gel 60 Merck Art. 1.05553 ) a Merck től vásároltuk. Analitikai HPLC Az analitikai HPLC-berendezés Knauer modell, oszlop: Phenomenex márkájú, Jupiter tipusú (4µ, C18, 300Å, 250 x 4,6 mm). Félpreparativ HPLC A szemipreparatív HPLC-berendezés Knauer modell, oszlop: Phenomenex márkájú, Jupiter tipusú (10 µ, C18, 300Å, 250 x 10 mm). Tömegspektrométer Bruker Daltonics márkájú Esquire 3000 plus modell. 3.2.2. Lineáris peptidek szintézise A peptidek előállítását szilárdfázisú peptidszintézissel [12] végeztem BOC stratégiát alkalmazva [13]. A szintéziseknél 1 gramm MBHA (0,7 mmol/g névleses kapacitású) gyantából indultam ki. A kapcsoláshoz a gyanta névleges kapacitásával számolt 3 ekvivalens HOBt és DIC DMF-os oldatából és 3 ekvivalens védett aminosav DCM-os oldatából létrehozott aktív észter oldatot használtam. Az 1 óra kapcsolási idő elteltével a gyantát 5 x DMF-dal majd 3 x DCM-nal mostam. Ninhidrin-teszttel ellenőriztem, hogy teljes mértékben végbement-e a reakció. Ha a tesztoldat bekékül, meg kell ismételni a kapcsolást (pozitív ninhidrin teszt). Viszont, ha az oldat színe citromsárga marad (negatív ninhidrin teszt) eltávolítható a Boc védőcsoport, és felkapcsolható a következő aminosav. A ninhidrin tesztet a következőképpen végeztem: A reakcióedényből kivett 5-10 szem gyantát, krómkénsavazott kémcsőbe tettem, majd sorban hozzácseppentettem a következő reagensek mindegyikéből 1-1 cseppet: 1. 40 g fenol-10 ml absz. etanol, 2. 65 mg KCN 100 ml deszt. víz, 3. 25 g ninhidrin 50 ml absz. etanol A Boc védőcsoport eltávolításához 30% TFA-DCM oldatát használtam 2 perc majd 20 perc reakcióidővel. Ezután 5 x DCM-nal és 3 x DMF-dal való mosás következett. A közömbösítést 5% TEA-DMF oldattal végeztem 3 x 1.5 percig. Újabb mosás következett, 5 x DMF-dal, majd kezdődhetett az újabb aminosav felkapcsolása. A szintézis végeztével a végső hasítást 0 o C-on cseppfolyós HF-dal végeztem 2 órán keresztül gyökfogó elegy jelenlétében (HF:anizol:DMS: p-tiokrezol=10:1:1:0.2 ). Ennek során a peptidről lehasadtak a védőcsoportok illetve maga a peptid is lehasadt a gyantáról. Hasítás után a HF-ot vákuumban ledesztilláltam, majd a visszamaradt anyagot üvegszűrőre öntve éterrel eldörzsöltem. Mostam újabb adag éterrel. Ezután a peptidet 10%-os ecetsavval mostam le a szűrőről. Az így nyert ecetsavas peptid oldatot liofilizáltam. A termelés átlagosan 80-90% volt, a nyerstermékre vonatkoztatva. 10
5.ábra. H-Arg-His-NH 2 és Ac- Arg-His-NH 2 szintézise 11
6. ábra. Ac-Cys-Ser-Ala-His-Leu-Cys-NH 2 szintézise 12
7. ábra. Ac-Cys-Ser-Arg-His-Leu-Cys-NH 2 szintézise 13
3.2.3. Ciklopeptidek szintézise A peptidek ciklizálására, ami jelen esetben a diszulfidkötés kialakítását jelenti, az irodalomban több lehetőséget találtam [14]. Ezt áttanulmányozva a levegőn való oxidálás mellett döntöttem. Részben azért, mert ebben az esetben csak a puffert kell eltávolítani a ciklopeptid mellől, részben pedig azért mert viszonylag kis mennyiségű peptid esetében ez a módszer is megfelelő hatékonyságú. A peptidek oxidálását ammónium-acetát pufferben, ph=7,92-en 48 órán át levegőn való kevertetéssel végeztem. A reakcióelegy koncentrációja 1mg peptid /cm 3. A ciklizálás előrehaladását analitikai HPLC-vel követtem. A termelés általában 90-95% volt a nyerstermékre vonatkoztatva. 8. ábra. A diszulfidhíd kialakítása oxidálással 3.2.4. Peptidek tisztítása A peptidek tisztítását fordított fázisú szemipreparatív HPLC oszlopon, gradiens elúciós programmal végeztem. Gradiens: a B eluens aránya 1% -ról 40%-ra lineárisan növekedett 30 perc alatt. A eluens 0,1% TFA vizes oldat, B eluens acetonitril:víz = 80:20 elegye, amely 0,1%TFA-t tartalmazott. Az így nyert, tisztított peptidek tisztaságát analitikai HPLC-n, azonosítását tömegspektrum alapján végeztem. Az analitikai méréseket is gradiens elúciós programmal végeztem. Gradiens: a B eluens aránya 1% -ról 40%-ra lineárisan növekedett 30 perc alatt. A eluens 0,1% TFA vizes oldat, B eluens acetonitril:víz = 80:20 elegye amely 0,1%TFA-t tartalmazott. A tisztított peptid általában 70-80%-a volt a nyersterméknek. 3.2.5. Peptidek azonosítása A szemipreparatív HPLC oszlopról begyűjtött, tisztitott peptidet tartalmazó frakciót liofilizáltam, tömegspektroszkópiával mért tömeg alapján azonosítottam a molekulát (1. táblázat), majd a tisztaságát analitikai HPLC-n ellenőriztem (ld. 10-13. ábra A-val jelzett kromatogammjai). 1. táblázat. A peptidek azonosítása tömegspektrum alapján. PEPTID ÖSSZEGKÉPLET SZÁMOLT MÉRT M [M+H] + H-Arg-His-NH 2 C 12 H 22 N 8 O 2 310,0 311,2 Ac-Arg-His-NH 2 C 14 H 25 N 8 O 3 352,0 353,2 C 26 H 41 N 8 O 8 S 2 673,3 674,0 C 29 H 48 N 11 O 8 S 2 757,3 758,0 14
4. ELŐZETES BOMLÁSVIZSGÁLATOK A megszintetizált, HPLC-n megtisztított peptidekkel próba kísérleteket végeztem. Az eredeti megfigyelés szerint a peptid ciklizálásakor (lúgos ph) és kromatográfiás körülmények között (savas ph) is bomlik. Ezért mindkét ph tartományban meg terveztem vizsgálni, reprodukáljáke az említett bomlás jelenséget, az általam készített modellpeptidek. A savas ph tartományban reakcióközegnek a kromatográfiás tisztításban használt A eluenst használtam (továbbiakban savas oldat), amely trifluorecetsav 0,1%-os vizes oldata (ph~ 2). A lúgos ph tartományban reakcióközegnek a ciklizáláshoz használt ammónium-acetát puffert (továbbiakban lúgos oldat) használtam. (ph=7,92). A vizsgált peptidekből 1-1 mg-ot oldottam fel 1 cm 3, savas illetve lúgos reakcióközegben. Ezután 5 ekvivalens Hg(II) acetátot adtam az oldatokhoz. A reakcióelegyeket 20 órát állni hagytam. Az oldatokból általában a reakció folyamán fehér csapadék vált ki. A reakcióidő elteltével a reakcióelegyeket lecentrifugáltam, majd a felülúszóból mintát vettem és analitikai HPLC-n megnéztem, történt-e változás a peptidekkel. A H-Arg-His-NH 2 és az Ac-Arg-His-NH 2 esetében a HPLC helyett szilikagél vékonyrétegen követtem a reakciót, mert az ilyen kisméretű peptidek az általam alkalmazott HPLC eluensben az oldószer fronttól megegyező retenciós idővel bírnak. A bomlásvizsgálatokhoz kontrollként a peptidek savas és lúgos oldatát használtam Hg(II) acetát hozzáadása nélkül 20 óra reakció idő eltelte után. Az oldatok esetleges betöményedése, illetve a ph változás elkerülése érdekében, kupakkal zárható üvegedényeket használtam. 4.1. A dipeptidek bomlásvizsgálata VRK-val: A dipeptidek előzetes bomlásvizsgálatának eredménye a 9. ábrán látható. 9. ábra H-Arg-His-NH 2 és Ac- Arg-His-NH 2 bomlásvizsgálata VRK-val. 15
4.2. Lineáris és gyűrűs oligopeptidek bomlásának vizsgálata analítikai HPLC-vel 10. ábra. H-Phe-Gln-Ser-Arg-His-OH HPLC kromatogramjai A. kindulási peptid, B. kindulási peptid, C. reakcióelegy összetétele TFA-ban, 24 óra után 5 ekv. Hg(II) ion jelenlétében (a, kiindulási anyag, b, higany komplex), D. reakcióelegy összetétele pufferben, 24 óra után 5 eki. Hg(II) ion jelenlétében (a, kiindulási anyag, b, higany komplex ) Megfigyelések: savas közegben: elfogyott a kiindulási anyag, nem történt bomlás, viszont keletkezett Hg tartalmú komplex. lúgos közegben: maradt egy kevés kiindulási anyag, nem történt bomlás, viszont itt is keletkezett Hg tartalmú komplex. A Hg-t nem tartalmazó kontroll oldatokban, egyik esetben sem tapasztaltam változást. 16
11. ábra HPLC kromatogramjai A. kindulási peptid, B. kindulási peptid C. reakcióelegy összetétele TFA-ban, 24 óra után 5 ekv. Hg(II) ion jelenlétében (nem értékelhető a kromatogramm) D. reakcióelegy összetétele pufferben, 24 óra után 5 ekv. Hg(II) ion jelenlétében (b, kiindulási anyag, d, higany tartalmú komplex, a,c, azonosításra váró bomlástermékek) Megfigyelések: savas közegben: nem értékelhető a HPLC kromatogramm. lúgos közegben: elfogyott a kiindulási anyag, megfigyelhető bomlás, keletkezett Hg tartalmú komplex. A Hg-t nem tartalmazó kontroll oldatokban, egyik esetben sem tapasztaltam változást. 17
12. ábra HPLC kromatogramjai A. kindulási peptid, B. kindulási peptid, C. reakcióelegy összetétele TFA-ban, 24 óra után 5 ekv. Hg(II) ion jelenlétében (c, kiindulási anyag, b, higany tartalmú komplex, a,d, azonosításra váró bomlástermékek) D. reakcióelegy összetétele pufferben, 24 óra után 5 ekv. Hg(II) ion jelenlétében (c, kiindulási anyag, b, higany tartalmú komplex, a,d azonosításra váró bomlástermékek) Megfigyelések: savas közegben: maradt egy kevés kiindulási anyag, nagymértékű bomlás figyelhető meg, keletkezett egy kevés Hg tartalmú komplex. lúgos közegben: maradt egy kevés kiindulási anyag, nagymértékű bomlás figyelhető meg, keletkezett Hg tartalmú komplex. A Hg-t nem tartalmazó kontroll oldatokban, egyik esetben sem tapasztaltam változást. 18
13. ábra HPLC kromatogramjai A. kindulási peptid, B. kindulási peptid C. reakcióelegy összetétele TFA-ban, 24 óra után 5 ekv. Hg(II) ion jelenlétében (c- kiindulási anyag, a,b,d, azonosításra váró bomlástermékek) D. reakcióelegy összetétele pufferben, 24 óra után 5 ekv. Hg(II) ion jelenlétében (a, higany komplex, c, kiindulási anyag, b,d azonosításra váró bomlástermékek) Megfigyelések: savas közegben: maradt egy kevés kiindulási anyag, nagymértékű bomlás figyelhető meg, keletkezett Hg tartalmú komplex. lúgos közegben: maradt egy kevés kiindulási anyag, nagymértékű bomlás figyelhető meg, keletkezett Hg tartalmú komplex. A Hg-t nem tartalmazó kontroll oldatokban, egyik esetben sem tapasztaltam változást. 19
EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA A Hg(II) ionok által katalizált peptidbomlás vizsgálatára szilárd fázisú peptidszintézissal, Bocstratégia alkalmazásával lineáris, majd esetenként diszulfidhíd kialakításával ciklusos modellpeptideket állítottam elő. A megszintetizált peptidek tisztítását szemipreparatív HPLCvel, fordítot fázisú oszlopon, gradiens programmal végeztem. Az így nyert peptidek azonosítása tömegspektrométeriával történt, tisztaságukat analitikai HPLC-vel ellenőriztem. A peptidek bomlásvizsgálatára két ph-n, savas illetve lúgos reakciókörülmények között 5 ekvivalens Hg(II) ionok jelenlétében előkísérleteket végeztem. A reakcióelegy felülúszójából 20 óra eltelte után vettem mintát. A bomlást H-Arg-His-NH 2 és Ac-Arg-His- NH 2 esetében vékonyrétegen, a többi peptidnél analitikai HPLC-vel követtem. Az analitikai HPLC diagramon megjelenő csúcsokat szemipreparatív HPLC-vel elválasztottam. Az így elkülönített frakciók egy részét liofilizálás után tömegspektrometriás vizsgálatoknak vetettem alá. Az előzetes bomlásvizsgálat eredményeit a 2. táblázat tartalmazza. 2. táblázat. A peptidek 5ekv Hg(II) jelenlétében végzett előzetes bomlásvizsgálatának eredményei. Peptidek ph Maradt-e Csapadék Komplex Bomlás kiind.anyag képződés képződés H-Arg-His-NH 2 ~2 - - + - 7,92 + - + - Ac-Arg-His-NH 2 ~2 - - + - 7,92 + - + - H-Phe-Glu-Ser-Arg-His-OH ~2 - + + + 7,92 - + + + ~2 - ++ - + 7,92 - ++ - + ~2 - + + + 7,92 - + + + ~2 - ++ + + 7,92 - ++ + + Az előállított peptidek közül: a. komplexet képezett a Hg(II) ionokkal, de nem bomlott: H-Arg-His-NH 2, Ac-Arg-His-NH 2 és H-Phe-Gln-Ser-Arg-His-OH b. komplexet képezett a Hg(II) ionokkal és bomlást is mutatott: és c. bizonyos mértékű higany komplexképződés mellett bomlás is megfigyelhető volt. 20
Az fenti bomlásvizsgálatok eredményei alapján a következő következtetéseket vontam le: 1. A hisztidin aminosavat tartalmazó peptidek komplexet képeznek a higany ionokkal, mint ahogy arra már korábbi irodalomban is rámutattak [8]. 2. Az Arg-His szekvenciától függetlenül, csak a diszulfidhidat tartalmazó peptidek esetében volt bomlás megfigyelhető. Az előzetes bomlásvizsgálatok eredményei arra utalnak, hogy az általunk tervezett modellpeptidek alkalmasak a peptidek Hg(II) ion által katalizált bomlás további részletes tanulmányozásához. 21
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Süliné Dr. Vargha Helga tanárnőnek a témavezetésért Továbbá: Dr. Schlosser Gittának a tömegspektrumok felvételéért Dr. Mező Gábornak, Bai Katalinnak, Szabó Ildikónak és Gali Irénnek a HPLC készüléken végzett munkában nyújtott segítségért 22
HIVATKOZÁSOK [1] Bódi J, Mihala N, Hajnal A, Medzihradszky KF, Süli-Vargha H : Synthesis of the C- terminal domain of the tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1), J. Pep. Sci. 9 (7): 430-441 JUL 2003 [2] Garzotti M, Rovatti L, Hamdan M : Investigation of bombolitin complexes with mercury by liquid chromatography tandem mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectr. 12 (2): 61-68 1998 [3] Gourinath S, Degenhardt M, Eschenburg S, Moore K, Delucas LJ, Betzel C, Singh TP:Mercury induced modifications in the stereochemistry of the active site through Cys-73 in a serine protease - Crystal structure of the complex of a partially modified proteinase K with mercury at 1.8 angstrom resolution Indian J. Biochemistry & Biophysics 38 (5): 298-302 OCT 2001 [4] Worth RG, Esper RM, Warra NS, Kindzelskii AL, Rosenspire AJ, Todd RF, Petty HR: Mercury inhibition of neutrophil activity: Evidence of aberrant cellular signalling and incoherent cellular metabolism Scandinavian J. Immunology 53 (1): 49-55 JAN 2001 [5] Olivieri G, Brack C, Muller-Spahn F, Stahelin HB, Herrmann M, Renard P, Brockhaus M, Hock C: Mercury induces cell cytotoxicity and oxidative stress and increases beta-amyloid secretion and tau phosphorylation in SHSY5Y neuroblastoma cells Journal of Neurochemistry 74 (1): 231-236 JAN 2000 [6] Yamamura T, Watanabe T, Kikuchi A, Yamane T, Ushiyama M, Hirota H : Conformation control of peptides by metal ions. Coordination conformation correlation observed in a model for Cys-X-Y-Cys/M2+ in proteins Inorg. Chem. 36 (21): 4849-4859 OCT 8 1997 [7] Matzapetakis M, Farrer BT, Weng TC, Hemmingsen L, Penner-Hahn JE, Pecoraro VL: Comparison of the binding of cadmium(ii), mercury(ii), and arsenic(iii) to the de novo designed peptides TRI L12C and TRI L16C, J. Am. Chem. Soc. 124 (27): 8042-8054 JUL 10 2002 [8] Vassiliki Magafa, George Stavropoulos, Panayiotis Tsiveriotis, Nick Hadjiliaddis : Interaction of Hg (II) with tetrapeptides containing cysteinyl and histidinyl residues, Inorg. Chem. Acta 272. ( 1998 ) 7-17 [9] Yamamura T, Watanabe T, Kkikuchi A, Ushiyama M, Koba yashi T, Hiroto H : Confirmation control of model peptides by metal-ions.1. CYS-X-Y-CYS and linear coordination, J. Phys. Chem. 99 (15): 5525-5531 APR 13, 1995 [10] Medzihradszky Kálmán: A természetes peptidek szintézise (A kémia újabb eredményei 3. kötet), Akadémia Kiadó, Budapest, 1970 [11] Bajusz Sándor: Peptidszintézis (A kémia újabb eredményei 47. kötet), Akadémia Kiadó, Budapest, 1980 [12] J.M. Stewart, J.D. Young: Solid phase peptide synthesis (Freeman and Co.San Francisco, 1969), (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, 1984) [13] E. Atherton, R.C. Sheppard: Solid phase peptide synthesis: practical approach (IRL Press, Oxford, England, 1989) [14] David Andreu, Fernando Albericio, Núria A. Solé, Mark C. Munson, Marc Ferrer, and George Barany: Formacion of Disulfide Bonds in Synthetic Peptides and Proteins (Methods in Molecular Biology, Vol. 35: Synthesis Protocols, Edited by: M.W. Pennington and B.M. Dunn Copyright 1994 Humana Press Inc., Tolova NY 23