AZ APOPTÓZIS SZABÁLYOZÁSA TERMÉSZETES ÉS MESTERSÉGES ANYAGOKKAL

AZ APOPTÓZIS SZABÁLYOZÁSA TERMÉSZETES ÉS MESTERSÉGES ANYAGOKKAL Barna Gábor Témavezető: Dr. Kopper László egyetemi tanár Konzulens: Dr. Sebestyén Anna tudományos munkatárs Programvezető: Dr. Kopper László egyetemi tanár Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Patológia Tudományok Doktori Iskolája Budapest 2005

TARTALOMJEGYZÉK 1. ÖSSZEFOGLALÁS Magyar 3. oldal ÖSSZEFOGLALÁS Angol 4. oldal 2. BEVEZETÉS 5. oldal 2.1. A halálreceptor út 5. oldal 2.2. Kaszpázok, mint az apoptózis központi résztvevői 10. oldal 2.3. Az apoptózis mitokondriális útja 13. oldal 2.4. Sejthalált kiváltó természetes és mesterséges anyagok 26. oldal 3. CÉLKITŰZÉSEK 29. oldal 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 30. oldal 5. EREDMÉNYEK 45. oldal 3.1. TGFβ1 hatása HT58 sejtekre 45. oldal 5.2. Retinoidok hatása HT58 sejtekre 54. oldal 5.3. A Bcl-2 család fehérjéinek konformáció és mennyiségi változása a cisplatin indukálta apoptózis során 65. oldal 6. MEGBESZÉLÉS 69. oldal 7. LEGFONTOSABB ÚJ MEGFIGYELÉSEK ÉS MEGÁLLAPÍTÁSOK 78. oldal 8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 80. oldal 9. RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK 81. oldal 10. IRODALOMJEGYZÉK 83. oldal 2

1.ÖSSZEFOGLALÁS A sejthalál program (apoptózis) az egyik legfontosabb homeosztázist fenntartó szabályozó folyamat az élőlényekben. Az apoptózis szabályozási zavarai betegségekhez vezethetnek. Az apoptózis patológiás esetekben növekedhet (pl. neurodegeneratív betegségekben) vagy csökkenhet (pl. daganatos megbetegedésekben). A sejthalál normális menetének és mértékének visszaállítása értékes eszköz lenne a daganatos betegségek gyógyítása során. Célunk az volt, hogy pontosabban megismerjük bizonyos természetes és mesterséges anyagok által kiváltott apoptózis folyamatát, fókuszálva leginkább az apoptotikus mechanizmusokra és reakciókra, beleértve a két fő apoptotikus utat. Kísérleteink során azt vizsgáltuk, hogy az exogén TGFβ1 képes apoptózist előidézni egy TGFβ1-et termelő B-lymphoma sejtvonalon, melynek sejtjei érzéketlenek a saját TGFβ-jukra. Megállapíthatjuk, hogy az exogén TGFβ1 képes apoptózist indukálni ezekben a sejtekben a mitokondriális apoptotikus út, a kaszpázok, a reaktív oxigéngyökök segítségével. Elmondhatjuk, hogy a HT58 sejtek endogén TGFβ1-re való érzéketlenségének hátterében nem az apoptotikus út működésképtelensége áll, mivel exogén TGFβ1 hatására ez a folyamat aktiválható. Kísérleteink további részében összehasonlítottuk egy természetes és egy mesterséges retinsav apoptózist kiváltó hatását B-sejt eredetű lymphoma sejtvonalakon. Összehasonlító vizsgálataink alapján megállapíthatjuk, hogy mindkét retinsav a mitokondriális jelátviteli utat használja kaszpázfüggő (természetes retinsav), illetve kaszpázfüggetlen apoptózist (mesterséges retinsav) indukálva. Végül a Bak konformáció változásait vizsgáltuk cisplatin kezelés során melanomasejtvonalakban. Megállapíthatjuk, hogy a Bak különböző mértékben aktiválódik a cisplatin hatására a vizsgált sejtvonalakban. Ezek az eredmények felhívják a figyelmünket arra, hogy hogyan használjuk megfelelően a természetes vagy mesterséges apoptózist indukáló szereket daganatos sejtek kezelése során. 3

SUMMARY The cell death programm (apoptosis) is one of the most important regulatory function to maintain the homeostasis in a living organism. In some diseases this regulation is damaged, the rate of apoptosis pathologically increased (e.g. neurodegenerative diseases) or decreased (e.g. cancer). In cancer the restoration of normal rate of cell death could be a valuable tool to manage tumor growth. Our goal was to study apoptosis induced by natural or synthetic drugs, focusing on the mechanism of actions, including the two main apoptotic pathways. The apoptotic effect of exogenous TGFβ1 was studied in a TGFβ1 producing B- lymphoma cell line (HT58) which cells were insensitive to their endogenous TGFβ1. It has been shown that exogenous TGFβ1 induces apoptosis in HT58 cells increasing mitochondrium permeability by reactive oxigen species and activating caspases. In this case the apoptotic machinery of TGFβ1 in HT58 cells was intact because exogenous TGFβ1 was able to induce apoptosis, deregulating survival signals. In another set of experiments we compared the apoptotic effect of two retinoids, a natural and its synthetic analogue in B-lymphoma cells. It is concluded that both retinoids induced apoptosis via mitochondrial pathway, in caspase-dependent or caspase-independent way, respectively. Finally we studied the conformational changes in Bak molecule during cisplatin treatment in melanoma cell lines. It turned out that Bak is activated differently in various melanoma cell lines. These results call the attention to the optimal use of apoptosis induction in tumor cells, using either physiological regulators or artificial compounds. 4

2. BEVEZETÉS A soksejtű szervezeteknek szükségük van arra, hogy megszabaduljanak az életműködésük során feleslegessé vált, az életfolyamatokat akadályozó vagy azokra veszélyes sejtektől; ez leggyakrabban a programozott sejthalál révén valósul meg. A programozott sejthalál vagy apoptózis általánosan jellemző az eukarióta élőlényekre. Mind a növényeknél, mind az állatoknál megfigyelhető jelenség, bár különböző élőlényeknél különböző morfológiával fordul elő, melynek hátterében speciális biokémiai változások állnak. Az emlős sejtekben az apoptózisnak két fő jelátviteli útja van. Az egyiknél külső jelek, halálligandok-halálreceptorok kapcsolódásának hatására indul el az eseménysor: a külső út vagy halálreceptor út. A másik a belső út, amikor külső ligand kapcsolódása nélkül - belső sejtkárosodás után - aktiválódik a mitokondriális út. 2.1. A halálreceptor út A halálreceptorok az evolúció legmagasabb szintjén jelennek meg; eddig csak az emlősökben sikerült kimutatni őket. A halálligandok specifikus receptorukkal Halálligandok Extracelluláris tér Halálreceptorok Intracelluláris tér FasL Fas/CD95/APO-1 DcR3 TRAIL DR4/TRAILR1 DR5/TRAILR2 DcR1/TRAILR3 DcR2/TRAILR4 DR3L TNF? DR3 DR6 TNFR1/CD120a Ciszteingazdag motívum haláldomén Transzmembrán régió 1. ábra Halálreceptorok és ligandok kapcsolódása (1) 5

összekapcsolódva indítják el az apoptózishoz vezető jelátviteli utat. A halálreceptorok és a halálligandok fontos szerepet játszanak a szöveti homeosztázis fenntartásában, elsősorban talán az immunrendszer működésében. A fehérjecsalád elsőként felfedezett tagja a tumornekrózis faktor (TNF) volt, melynek hatását már korábban ismerték, azonban a gént csak 1985-ben klónozták (2). Ezután következett a FAS/APO-1 receptor kimutatása (3), amit később a család többi tagjainak felfedezése követett (1. ábra). 2.1.1.A halálreceptorok szerkezete és működése A halálreceptorok a TNF-receptor családba tartoznak. Sejtfelszíni receptorok, melyek különféle szövetekben a sejtek túlélését vagy halálát szabályozzák. Fontos szerepük van az immunrendszerben, ahol a felesleges T- és B-sejtek kiszelektálása általuk jön létre. A TNF-receptorcsalád tagjai az I-es típusú transzmembrán glikoproteinek közé tartoznak, melyek ciszteinben gazdag extracelluláris doménnel rendelkeznek. Legtöbbjükben található egy homológ citoplazmatikus fehérjerész [haláldomén, (death domain, DD)] (4), ezen keresztül közvetítik az apoptotikus jelet a sejt belseje felé. (DR1-6) (5). Ehhez kapcsolódhatnak adapter fehérjék hasonló régiójukkal, így egy 1. Táblázat A halálreceptorok, ál-halálreceptorok és a hozzájuk kapcsolódó ligandok, jeltovábbító molekulák Receptorok Alternatív elnevezések Kötődő partner TNFR1 p55-r, CD120a, DR1 TNF-α, TRADD, MADD, SODD FAS CD95, Apo-1, DR2 FASL, FADD, DAXX, FAIM, FAF DR3 Apo-3, Wsl-1, TRAMP, LARD DR3L (TWEAK), FADD, SODD DR4 Apo-2, TRAIL-R1 TRAIL DR5 TRAIL-R2, TRICK2 TRAIL, FADD DR6? DcR1 TRAILR3 TRAIL DcR2 TRAILR4 TRAIL DcR3 TR6 FASL, LIGHT 6

nagy, jeltovábbító fehérje-komplex alakul ki (death inducing signaling complex, DISC) (1. Táblázat). A szabályozás részei az ál-halálreceptorok [csalétek, decoy receptorok, (DcR1-3)], melyek teljes extracelluláris doménnel rendelkeznek, de az intracelluláris doménjük csonka vagy hiányzik (6). Az ál-receptorok megkötik ugyan a ligandokat, de nem közvetítik a jelet, így csökkentik az apoptózis bekövetkezésének valószínűségét. A halálreceptorok általános jellemzője, hogy aktiválódásukhoz több receptornak kell összekapcsolódnia: homotrimerek vagy multimerek képződnek. A ligandok ugyancsak trimer formában találhatóak, ezek keresztkötik a receptorokat, és ezzel összekapcsolódásra kényszerítik őket (5). 2.1.2. A halálligandok szerkezete és működése A halálligandok a II-es típusú transzmembrán glikoproteinek, melyeket különböző proteázok hasíthatnak az extracelluláris térben, így szolúbilissá válhatnak (5). A TNF-α és a FASL esetében a mátrix-metalloproteázok, a TRAIL esetében cisztein proteázok végzik ezt a hasítást. A membránkötött és szolúbilis ligandoknak eltérő lehet a biológiai hatása. A FASL esetében a szolúbilis forma kevésbé hatékony az apoptózis indukálásában, mint a membránkötött. A TNF-α esetén a szolúbilis forma a TNFR1-hez kötődik, míg a membránkötött a TNFR2-höz. 2.1.3. A receptorközvetített sejthalálprogram elemei A halálreceptorok és ligandok kapcsolódása után különböző jelátvivő fehérje aktiválódik: a haláldomén és a haláleffektordomén fehérjék, a kaszpázok, a foszfolipázok, a MAP-kinázok, az NF-κB aktivációs kaszkád fehérjéi, valamint aktív gyökök is termelődnek. A legteljesebb képpel a TNFR1 esetében rendelkezünk. A különböző receptorok eltérő utakat aktiválnak, ezért a hatás tekintetében nagy különbségek adódhatnak az egyes szövetek és sejtek között is. A receptorok aktiválódása után a jel adaptermolekulákon keresztül jut az iniciátor molekulákig (iniciátor kaszpázok, kinázok, szfingomyelináz), amelyek 7

aktiválják a megfelelő effektorokat. A különböző jelátviteli utak során aktiválódhat a sejthalál mechanizmusa, de bármilyen meglepő, olyan jelek is kialakulhatnak, melyek a sejt szaporodását, túlélését segítik elő (7, 1). 2.1.4. Haláldomén és haláleffektor domén fehérjék A DISC kialakításában fontos szerep jut a receptorokhoz kötődő, DD-t tartalmazó adapter fehérjéknek [pl. TNFR-associated death domain (TRADD), Fasassociated death domain (FADD)]. Ezekhez kapcsolódhatnak más fehérjék is [pl. receptor-interacting protein (RIP), prokaszpáz-8 (FLICE)], melyek különböző jelátviteli utak részei lehetnek (NF-κB aktiváció, JNK aktiváció, apoptózis). A FADD a haláldoménen kívül tartalmaz egy haláleffektor domént [death effector domain (DED)] is (8), amely az ún. CARD (caspase recruiting domain) fehérjecsaládba tartozik. Ezek a fehérjeszerkezetek a kaszpázok egymáshoz és más adapterfehérjékhez való kapcsolódását teszik lehetővé. A FADD-hoz a homológ DEDen keresztül prokaszpáz-8 kapcsolódhat (ritkán prokaszpáz-10), ennek hatására konformációváltozáson mennek keresztül, amely autóaktivációt vált ki (9). Az aktiválódott kaszpáz-8 effektor kaszpázok hasításával indíthatja el az apoptózist. A DISC-ben gátló fehérjék is találhatók [pl. c-flip (FLICE inhibitory protein)]. A cflip a kaszpáz-8-cal nagyfokú homológiát mutat, de az aktív centrumából hiányzik az enzimaktivitáshoz szükséges cisztein. A FADD-hoz kötődve gátolja a prokaszpáz-8 aktiválódását (10). Mivel található benne egy kaszpáz-8 hasítóhely, szubsztrátja lehet az aktív kaszpáz-8-nak, de enzimaktivitás hiányában nem tud további molekulákat aktiválni, így az enzimkaszkádot megszakítja. A szerin-treonin-kináz RIP haláldoménje segítségével kapcsolódhat mind a halálreceptorokhoz, mind az adapterfehérjékhez, míg a kináz doménje és a "TNFRassociated factor-2" (TRAF2) segítségével aktiválja az "NF-κB-inducing kinase"-t (NIK) (11), ami az NF-κB sejtmagba való transzlokálódásáért felelős. A RIP szerepet játszik a kináz útvonalak (ERK, p38 és JNK) TNF-receptor általi aktiválásában is (12). A RIP-hez kapcsolódó RAIDD/CRADD (RIP-associated Ich1/CED3 homologous protein with death domain) CARD doménje a kaszpáz-2-vel kapcsolatba kerülve szintén közvetítheti az apoptotikus jelet (13). 8

A halálreceptor-halálligand kötődést követően kialakuló DISC hatására aktiválódhatnak az iniciátor kaszpázok (kaszpáz-2, -8, -10), melyek továbbíthatják az apoptotikus jelet a többi effektor kaszpáz, pl. kaszpáz-3 felé. Megfigyelték, hogy egyes sejtvonalakban a mitokondrium szükséges ahhoz, hogy a FasL által kiváltott apoptózis teljes mértékben végbemenjen (14). Ezekben a sejtekben a kaszpáz-8 mennyisége elégtelen ahhoz, hogy aktiválja az effektor kaszpázokat, viszont képes arra, hogy beindítsa a mitokondriális apoptotikus utat, amelynek segítségével megvalósulhat az aktiváció. Ezek a II. típusú sejtek (15), míg azokat, amelyek a halálreceptorokon keresztül a mitokondriumtól függetlenül is képesek apoptózist indukálni, I. típusú sejteknek nevezik (2. ábra). TNF FasL 1 κ B p50 p65 NF-κB p50 p65 SODD NIK Ceramid TNFR DD TRADD TRAF2 RAIDD RIP Kaszpáz-2 MEKK1 JNKK JNK/SAPK CrmA FADD Kaszpáz-8 Kaszpáz -3 Kaszpáz -6 Kaszpáz -7 Effektor Kaszpázok Pro- APAF-1 Kaszpáz-9 IAP Smac Endonukleázok Kaszpáz-10 Kaszpáz-9 Cyto c Cyto c datp FLIP FADD Bcl-2 Fas FADD Kaszpáz-8 Pro- APAF-1 Kaszpáz-9 Cyto c Smac Bid tbid Túlélési szignálok DD kináz CARD kaszpáz DED DNS Fragmentáció Apoptózis 2. ábra A TNFR és a Fas által használt jelátviteli útvonalak 9

2.2. Kaszpázok, mint az apoptózis központi résztvevői Az apoptózis effektor folyamatainak nagyon fontos résztvevői a kaszpázok. 2.2.1 A kaszpázok fajtái A kaszpázoknak számos tagjáról bebizonyosodott, hogy központi szerepet játszanak az apoptózisban, iniciátorként és effektorként egyaránt. Az eddig azonosított 14 emlős kaszpáz szerepe sokféle, résztvesznek az apoptózisban, valamint a gyulladásos folyamatokban. Bár a család összes tagjának (2. Táblázat) pontos funkciója nem ismert, a legtöbbnek az apoptózissal kapcsolatos szerepe már elfogadottnak látszik. 2. Táblázat A kaszpáz család tagjai (16-21) # gyulladásos, * apoptotikus kaszpázok Kaszpáz Egyéb név Feltételezett szubsztrát kaszpáz 1# ICE, CED-3 pil-1β, pyama, PARP, pnedd2, pic aktin kaszpáz 2* ICH-1, NEDD-2 pnedd2, PARP kaszpáz 3* CPP32, Yama, apopain pcpp32, PARP, PKCδ, DNS-PK, SREBP-1,-2, prb, Rho-GDI, fodrin, I-CAD, gelsolin kaszpáz 4# ICE rel II, TX, ICH-2 pice, ptx, PARP kaszpáz 5# ICE rel IIi, TY, ICH-3 kaszpáz 6* Mch2 PARP, laminok kaszpáz 7* Mch3, ICE-LAP3, CMH-1 PARP, kaszpáz 6, HnRNP -C1, -C2 kaszpáz 8* FLICE1, MACH1, Mch5 pice-like, pcpp32- like kaszpáz 9* ICE-LAP6, Mch6 PARP kaszpáz 10* FLICE2, Mch4 PPARP, pice-like, pcpp32 kaszpáz 11# egér pice, (19) kaszpáz 12* Endoplazmás retikulumot ért stressz során kialakuló apoptózisban játszik szerepet kaszpáz 13* ERICE kaszpáz 14 Keratinociták fejlődésében van szerepe 10

Szekvenciaelemzésekből és biokémiai tesztek alapján a kaszpázokat két nagy családba sorolják őket: 1.) gyulladásos folyamatokban szerepet játszó (# jelölt) (kaszpáz-1, -4, -5, -11, -13) 2.) apoptotikus folyamatokban szereplő (* jelölt) (kaszpáz-3, -6, -7, -8, -9, -10, -12). A kaszpáz-13 a szekvenciahomológia alapján az első családba tartozik, míg hatás alapján a másodikba. 2.2.2. A kaszpázok szerkezete A kaszpázok aminosav szerkezete hasonló (22). Mindegyik proenzim formában (zymogén) expresszálódik (30-50 kda), amely 3 doménből (NH 2 -terminális prodomén, valamint egy nagy (kb. 20 kda) és egy kis (kb. 10 kda) alegység) áll, és proteolítikus aktiváláskor - melyet sokszor egy másik kaszpáz végez - a két alegység egy heterodimert alkot. 2.2.3. A kaszpázok aktiválódása A kaszpázok előalakjai nem teljesen inaktívak, az aktív forma kb. 1-2 %-ával működnek. A haláldoménnel, illetve CARD-dal rendelkező szabályozó fehérjék segítik az aktiválódásukat. Segítségükkel elegendő közelségbe kerülnek egymáshoz, ahogy a kaszpáz-8 esetében láttuk, és hasítani képesek egymást. A DISC-en kívül még a mitokondrium közelében található apoptoszómánál találtak ilyen fehérjekomplexet. Az apoptoszómában az Apaf-1 az ATP és a citokróm-c kötés hatására szabaddá váló CARD-ja kötni tudja a prokaszpáz-9 molekulákat, melyek szintén autokatalítikus hasítással aktiválódnak (23). A többi kaszpáz aktiválására a legelfogadottabb elképzelés a kaszkád-modell, amelyben az iniciátor kaszpázok aktiválják a végrehajtó kaszpázokat (3. ábra). 2.2.4. A kaszpázok szubsztrátjai A kaszpázok igen specifikus proteázok, mindig az aszparaginsav után hasítanak és legfeljebb a szomszédos 4 aminosav határozza meg a különböző kaszpázok 11

specificitását (P1-P4). A különböző enzimeknek más-más a hasítási szekvenciájuk, ezzel magyarázható, hogy sokféle folyamatban vesznek részt (2. Táblázat 3. oszlop). A szubsztrátok között találunk DNáz gátlót (ICAD) (24), a Bcl-2 család antiapoptotikus tagjait (25), szerkezeti fehérjéket (laminok, gelsolin) (26) és kinázokat (FAK, PAK2, DNS-PK) (3. ábra). Ez mind hozzájárul a sejtalkotók degradálódásához és a sejt apoptotikus testekre való széteséséhez. Granzyme B Perforin FasL Fas Kaszpáz-7 Xiap Kaszpáz-9 clap1 clap Kaszpáz-3 FADD Kaszpáz-10 Kaszpáz-13 Kaszpáz-8 CrmA datp Pro- Kaszpáz-9 APAF-1 APAF-1 Cyto c Cyto c Pro- Kaszpáz-9 Kaszpáz-6 Hasitás Kaszpáz-4 Kaszpáz-12 ER stressz Mitokondrium Cyto c Laminok PARP SREBP ER I C A D CAD I C A D DNS Fragmentáció CAD HMG1 Topo II HMG2 Apoptózis 3. ábra A kaszpázok aktiválódása és néhány szubsztrátja 2.2.5. A kaszpázok szabályozása A kaszpázok működésének szabályozása más proteolítikus rendszerekéhez hasonlóan (pl. véralvadás, komplementrendszer) meglehetősen komplex, tartalmaz szabályozó proteázokat, kofaktorokat, visszajelzéseket, küszöbértékeket. A szabályozás egyik részét az jelenti, hogy a kaszpázok proenzim formában termelődnek és aktiválásukhoz egy proteolítikus hasítás szükséges. A szabályozás másik részét a sejtben jelenlevő gátlófehérjék adják, melyek meggátolják az enzimek működését, illetve 12

aktiválódásukat. Ezek azonosításában nagy szerep jutott a vírusokkal folytatott kísérleteknek. Három különböző osztályba tartozó vírusgátlót találtak: a CrmA-t (27), a p35-t (28), és az IAP fehérjecsaládot (29). A Cowpox vírus CrmA proteinje a serpin családba tartozik, hatásos (K i < 1 nm) gátlószere az iniciátor és a gyulladásban szerepet játszó kaszpázoknak. A Baculovirus p35 fehérje a kaszpázok aktív helyére kötődik és főképp az apoptotikus kaszpázokat (kaszpáz-1, -3, -6, -7, -8, -10) képes gátolni (30). Az IAP fehérjék sok tagot számláló családot alkotnak és ezekből több megtalálható az emlősökben is. Mindegyik fehérje tartalmaz 1-3 speciális BIR (Baculovirus IAP repeats) domént, ami egy klasszikus cinkujj motívum. Az apoptózisgátlást a BIR doménnek a kaszpázok aktív centrumába való kötődése teszi lehetővé. Képesek a kaszpáz-3, -7, -9-t gátolni. Ezenkívül ubiquitin-ligáz tulajdonsággal is rendelkeznek és résztvehetnek a sejtciklus szabályozásban és a jeltovábbításban is (31). Vannak olyan gátlófehérjék, melyek az iniciátor kaszpázok aktiválódásában játszanak szerepet. A c-flip a kaszpáz-8 aktiválódását gátolja, míg az ARC (apoptosis repressor with caspase recruitment domain) a szív- és harántcsíkoltizomban gátolja a kaszpáz-2 aktivitását, valamint a kaszpáz-8-cal és a CED-3-mal képes komplexet alkotni (32). Mesterséges kaszpázgátlószereket is kifejlesztettek, amelyek főként peptidalapúak. Aszparaginsav-α-aldehidek és -α-ketonok (reverzibilis, átmeneti állapot analógok pl. zvad-fmk) és az aszpartil-diazo-metánok, aszpartil-halo-metánok, aszpartil-acil-oxi-metánok (irreverzibilis inhibitorok, affinitás jelzők) lehetnek hatékony gátlói a kaszpázoknak (33). 2.3. Az apoptózis mitokondriális útja A mitokondrium, mint energiatermelő központ nélkülözhetetlen szerepet játszik az eukariótasejtek életében. A mitokondrium azonban nemcsak a sejt életében, hanem a halálában is fontos szerephez jut. Hogyan lehetséges ez? A nekrózisként ismert sejtelhalást a mitokondrium károsodása, az oxidatív foszforiláció elégtelensége, az ATP-hiány okozza. Ezzel ellentétben egyesek szerint a mitokondrium a sejt Pandóra-szelencéje (34), mivel olyan fehérjéket tartalmaz, melyek a citoplazmába kerülve elindítói, sokszor elengedhetetlen résztvevői lehetnek az 13

apoptotikus folyamatnak. Ezek között a fehérjék között találhatók pl. a prokaszpázok, az apoptózis indukáló faktor (AIF), az adenylát-kináz 2, vagy pl. a légzési láncban is résztvevő citokróm-c (kaszpáz aktivátor is), a Smac/Diablo (nemrégen felfedezett kaszpáz koaktivátor) és néhány hősokk fehérje (Hsp10, Hsp60). E fehérjéknek a citoplazmába kerülését pedig más, a Bcl-2 családba tartozó mitokondriális fehérjék szabályozhatják, serkenthetik vagy gátolhatják. Mi több, ezeknek a fehérjéknek a működését számos külső vagy belső jel befolyásolja (4. ábra). Végül a pro- és az antiapoptotikus jelek, és az általuk kiváltott események hatásának eredője dönti el, hogy a mitokondriummembrán áteresztővé válik-e. A mitokondriális membrán permeabilitásának fokozódása szükséges ugyanis az apoptózist kiváltó fehérjék kiszabadulásához, és ettől függ, hogy a programozott sejthalál mitokondriális útja elindul-e vagy sem. foszfatázok: kalcineurin, PP1α kinázok: Akt/PKB, RSKS DNSkárosodás p53 Bad dimerizáció sugárzás JNK/SAPK Bcl-xl Hsp70? alkilálás ceramid Bax Bid PTPC Bax kaszpáz-8 közvetített Bid hasítás? Bcl-2? kaszpáz-7 aktiválás PKCδ Bim forbolészter forbolészter Ca ++ TR3? NGF citokróm-c retinoidszármazékok mikrotubuluskárosodás 4. ábra A mitokondriumot elérő jelek A mitokondriumot számos irányból érhetik el olyan jelek, melyek a citokróm-c kiáramlását okozhatják. A jelek részint a mitokondrium átmeneti permeabilitási póruskomplexét stimulálják, részint a Bcl-2 család tagjaival lépnek kapcsolatba és így okozzák a citokróm-c kiáramlását (35). 14

2.3.1. Mitokondrium: az apoptotikus jelek integrátora Az előzőekben láthattuk, hogy a halálreceptorokon keresztül kiváltott apoptózisban a mitokondrium leginkább csak jelerősítő szerephez jut, míg a kemoterápiás szerek hatására főleg a mitokondriális apoptotikus út aktiválódik. Ezekben a folyamatokban a proaptototikus jelek a mitokondriumban összegződnek és a citokróm-c kiszabadulásával indul el a valódi apoptotikus folyamat, a kaszpáz-kaszkád működése. Központi kérdés tehát, hogy mi váltja ki a citokróm-c kiszabadulását. A daganatellenes terápia sokszor irányul a sejt genomiális DNS-ének károsítására és ezáltal az apoptotikus program beindítására. A DNS-károsodás hatására sok folyamat elindulhat, de az apoptózis szempontjából a p53-nak jelentős szerepe van. A p53 sejthalált válthat ki transzaktivációs képességével, és közvetlen jelutakon keresztül (36). Számos gén aktiválódik p53 hatására, melyek bizonyítottan szerepet játszanak az apoptózisban, de nem mindegyik közvetíti egyértelműen az apoptotikus hatást (pl. a BAX, a Fas/APO-1/CD95 receptor, a KILLER/DR5 receptor), míg néhány más génnek nem egyértelmű az apoptózishoz való pozitív vagy negatív viszonya. A p53 indukálta gének közül mind a BAX, mind a PIG3 terméke a mitokondriumon fejti ki hatását. Míg a Bax fehérje pórusformáló képességével előidézheti a citokróm-c kiáramlását a mitokondriumból, addig a PIG3 terméke oxidatív gyökök indukálásával a mitokondrium enzimrendszerében okozhat kárt, illetve kinyithatja a permeabilitási pórust (PTP). A p53 viszont nemcsak más gének aktiválásával, hanem önmaga is képes szabályozni a mitokondrium belső membránjának depolarizációját (37). A Bcl-2 fehérjecsalád anti-apoptotikus tagjai (Bcl-2, Bcl-x L ) gátolni képesek a p53-nak a mitokondriumra kifejtett hatását. Igen sok akár halálreceptor, akár citotoxikus szerek által kiváltott apoptotikus folyamatban figyelhető meg ceramidképződés. A ceramid útvonalnak egyik legjelentősebb tagja a GD3-gangliozid, az α-2,8-szialil-transzferáz (ST8) terméke, amely az endoplazmatikus retikulumban (ER) és a Golgi-készülékben található (38). Az enzim - és így a GD3-szintézis - gátlásával a ceramid-indukálta mitokondriumdepolarizáció megakadályozható (39). Habár a ceramidfüggő-út kinázokon/foszfatázokon keresztül is befolyásolhatja a mitokondriumot, mégpedig az 15

AKT-aktivitás szabályozásán és a Bad fehérje foszforilálásán keresztül (40), de bizonyos hatásokhoz a GD3 nélkülözhetetlen. Láthattuk, hogy igen sok apoptotikus folyamatban a mitokondrium főszerepet kap, mint a folyamat elindítója. A most következőkben megismerhetjük azokat a mechanizmusokat, amelyek segítségével az apoptotikus folyamat a mitokondriumtól elindulhat. 2.3.2. A mitokondrium szerkezete és morfológiai változásai az apoptózis alatt A mitokondrium két membránnal, egy külső burkoló és egy igen nagy felületű, betüremkedésekben gazdag belső membránnal rendelkezik. A mitokondriumok sejten belül elszórva helyezkednek el, de bizonyos jel hatására ez az eloszlás megváltozhat. Apoptotikus jelek következtében (pl. TNF által indukált apoptózis) a mitokondriumok kondenzációja és a mag köré rendeződése figyelhető meg. Ez a mozgás valószínűleg kinezin közvetített transzportnak köszönhető, melyet feltételezhetően a Bax proapoptotikus fehérje termelődése előz meg (41). Szerepet játszik-e a mitokondriumok kondenzációja a citokróm-c kibocsátásban? Mi lehet a célja a mag köré rendeződésnek: a magas ATP szint fenntartása, vagy segíti az AIF-nek (Apoptosis Inducing Factor) a mitokondriumból a sejtmagba történő transzlokációját? Ezeknek a kérdéseknek a tisztázása még további kutatásokat igényel. 2.3.3. A Bc1-2 fehérje család A sejthalál mechanizmusainak vizsgálata során sok szabályozó - serkentő és gátló - molekulát találtak a kutatók. Ezek között fedezték fel azt a fehérjecsaládot, melynek tagjai fontos szerepet játszanak az apoptózis folyamatában. Az első fehérje, a bcl-2 (18q21), melyet a B-sejtes follikuláris lymphomákban azonosítottak (a 18-as kromoszóma egy darabjának transzlokációja a 14-es kromoszómára, bcl B cell lymphoma), és amelyről az egész család a nevét kapta, a sejthalált gátolja (42, 43). Ennek a fehérjének a felfedezése egyben az onkogének új családját nyitotta meg, melyek a proliferáció serkentése helyett a sejthalált gátolják. 16

BCL-2 BCL-X L BCL-W MCL-1 A1/BFL-1 BOO/DIVA NR-13 E1B-19K BHRF1 KS-BCL-2 ORF16 LMW5-HL CED-9 BAX BAK BOK/MTD BCL-X S BID BAD BIK/NBK BLK HRK BIM/BOD NIP3 NIX/BNIP3 EGL-1 Antiapoptotikus tagok Emlős Virális C. elegans BH4 BH3 BH1 BH2 TM Pro-apoptotikus tagok Emlős Csak BH3-mal rendelkezők C. elegans 5. ábra A Bcl-2 fehérje család tagjai (44) A bcl-2 család fehérjéinek mindegyike tartalmazza a bcl-2 homológ (BH) fehérjedomének egyikét (BH1-BH4). Ezeket a motívumokat helixek alkotják, amelyekkel a fehérjék képesek homo- és heterodimerek alkotására. A család tagjai két nagy csoportba sorolhatók aszerint, hogy az apoptózist gátolják (antiapoptotikus) vagy serkentik (proapoptotikus) (5. ábra). A proapoptotikus családon belül találunk olyanokat, melyek csak a BH3 doménnel rendelkeznek. 2.3.3.1. A Bcl-2 család antiapoptotikus tagjai Az antiapoptotikus tulajdonsággal rendelkezőknek általában legalább három BH doménjük van. Az antiapoptotikus hatásukat zömmel úgy fejtik ki, hogy a proapoptotikus tagokkal heterodimereket alkotnak, mégpedig a különböző térszerkezetű BH3 domének kötődése révén, így a proapoptotikus tagok esetleges pórusformálását megakadályozzák (45). Ugyanez fordítva is igaz. A proapoptotikusak lekötik az 17

antiapoptotikusokat. A fehérjék heterodimerizációját másodlagos kötőerők: hidrofóbhidrofil kölcsönhatások, és elektrosztatikus erők biztosítják (46). A Bcl-2 család tagjai, főleg az antiapoptotikus hatásúak, általában a különböző sejtorganellumok (mitokondrium, endoplazmatikus reticulum és a sejtmag) külső citoplazmatikus membránjában találhatóak (47, 48). Ezt a membránba történő beépülési képességüket a legtöbbjükben megtalálható transzmembrán doménnek köszönhetik, amelyet általában a C terminális végen 20 hidrofób aminosav alkot. 2.3.3.2. Proapoptotikus családtagok A proapoptotikusak (pl. Bid, Bax, Bad, Bim) a citoplazmában vagy a citoszkeletonhoz kötve találhatók, és megfelelő stimulus hatására vándorolnak valamelyik sejtorganellumba, általában a mitokondrium külső membránjába (48-52). Itt a család más tagjaihoz kötődve, azok aktivitását befolyásolva szabályozzák a citokrómc kiáramlását. A citokróm-c kiáramlását sokféle elmélet magyarázza. Valószínűleg mindegyik igaz, mert e folyamatok különböző sejttípusokban különbözőképpen játszódhatnak le. A citokróm-c kibocsátásához elengedhetetlen a mitokondriális membránok a külső és/vagy a belső áteresztőképességének nagymértékű növekedése. A belső membrán áteresztővé válása, úgy tűnik, kevésbé általános jelensége az apoptózisnak, mint a külsőé; bár a citokróm-c külső membránon való kijutását többnyire a belső mitokondriális membrán depolarizációja követi (a Ψm csökken), jelezve, hogy a belső membrán is valamiképpen résztvevője a folyamatnak. A citokróm-c kibocsátással foglalkozó elméletek két nagy csoportba sorolhatók: a citokróm-c a külső mitokondriummembrán valamilyen pórusán, csatornáján keresztül jut ki a citoplazmába (6. ábra A); a mitokondriális mátrix duzzadása okozza a külső membrán felszakadását és így jut ki a citokróm-c a citoplazmába. (6. ábra B). A folyamatokban a Bcl-2 család tagjai, a VDAC (feszültség függő anion csatorna), az ANT (adenin nukleotid transzlokátor) játszhatnak fontos szerepet. 18

A. Bax csatorna Bax/VDAC csatorna lipid-fehérje csatornák B. ADP ATP PTP VDAC záródás VDAC Citokróm-c anyagok < 1,5 kda PTP nyílás H 2 O, oldott anyagok 6. ábra A citokróm-c kibocsátás különböző formái A.) Pórusok általi kibocsátás (35) B.) A mátrix duzzadása miatt a külső membrán felszakad 2.3.4.1. Póruselmélet 1. A Bcl-2 család tagjai közül a Bcl-2, a Bcl-x L, a Bax és a hasított Bid fehérje képesek pórus formálására. A pórusformáló képesség lehetőségét a Bcl-x L fehérje háromdimenziós szerkezetének bakteriális toxinokhoz, pl. a diphtheria toxinhoz való hasonlósága vetette fel. A fehérjék membránba való beépülése ph-függő folyamat. Emiatt a pórusformáló képesség miatt lehetséges, hogy ezek a fehérjék csatornákat képezzenek a mitokondrium külső membrájában. A probléma az, hogy egyedül nem elég nagyok ahhoz, hogy átérjék a kettős lipidmembránt. A Bax fehérje esetében viszont kimutatták, hogy oligomereket alkothat és ezek már képesek nagy vezetőképességű csatornát alkotva átérni a membránt, elősegítve a citokróm-c kiszabadulását (53). 2. A VDAC a külső mitokondriális membránban található és rajta keresztül zajlik az ATP/ADP csere. Kimutatták, hogy Bcl-2 és polianionok hatására a VDAC olyan pórust formál, ami csak igen kis részecskeméretű oldott anyagokat (< 5 kda) enged át. Viszont a Bax vagy a Bak hatására a csatorna áteresztőképessége megnő és a 19

citokróm-c kiszabadulhat a membrán közötti térből. A kísérletekből egyértelműen kiderült, hogy itt a póruskomplex központi magja a VDAC és nem a Bax vagy a Bak. Ebben az esetben valószínű, hogy a Bcl-2 típusú fehérjék a VDAC konformációváltozását indukálják (54). Azt találták, hogy a hasított Bid a VDAC pórus zárását okozza, és így idézi elő a mitokondrium működésének gátlását (55). 3. A Bax és a tbid nemcsak egymással és a VDAC-vel, hanem lipidekkel is kapcsolatba léphetnek, így olyan lipid vagy lipid-fehérje pórusokat hozhatnak létre, amelyek elég nagyok ahhoz, hogy a két membrán közötti fehérjéket a citoplazmába engedjék (56). 2.3.4.2. Duzzadás elmélet 1. Azokban a modellekben, ahol a külső membrán felszakadását a mitokondriális mátrix duzzadása idézi elő, jelentős szerepet kap az ANT fehérje. Ez a molekula a belső membránban található és végzi az ATP/ADP cserét a mátrix és a membránok közötti térrel. Az ANT sokféle mitokondriummembrán-permeabilitást szabályozó molekulával létesíthet kapcsolatot. Ilyen a VDAC, a ciklofillin D, Bax, Bak, Bc1-2, a Bc1-x L, valamint néhány virális fehérje, mint a Pul37X (citomegalovírus apoptózis gátló fehérjéje) és a Vpr (HIV-1 apoptózis indukáló fehérjéje) (57). 2. A külső membrán felszakadását, a mátrix duzzadását a belső membrán hiperpolarizációja is kiválthatja. A hiperpolarizáció hatására töltések áramlanak a külső membránhoz, ahol a VDAC is található. Ez a fehérje a feszültség növekedésének hatására bezáródik, így megakadályozhatja az ATP/ADP cserét, előidézve a mátrix duzzadását. Ezt a folyamatot a Bcl-2 és a Bcl-x L gátolhatja (57). Ezekben az elméletekben a mitokondriális membránok permeabilitásának változása és ezzel a citokróm-c kiszabadulása lehet, hogy eltérő módon, de mégis hasonló molekulák részvételével zajlott le. Úgy tűnik, hogy ezek a fehérjék mind egy hatalmas enzimkomplex, a permeabilitási átmeneti póruskomplex (PTPC) részei, illetve e köré szerveződnek (7. ábra). 20

2.3.4.3. Permeabilitási átmeneti póruskomplex Az átmeneti permeabilitási póruskomplex (PTPC) a mitokondrium belső és külső membránjának találkozásainál alakulhat ki, a VDAC és az ANT részvételével. Hozzájuk kapcsolódik a külső membránban található benzodiazepin perifériális receptor (BPR), a két membrán közötti térben a kreatin-kináz (CK), a külső membrán citoplazma felöli részén a VDAC-hoz kapcsolódó hexokináz II (HK), a mátrix irányából a ciklofillin D, valamint a Bax és Bcl-2 (58). citoplazma Külső membrán membránok közötti tér BPR víz, oldott anyagok VDAC ANT HK CK ciklofillin D belső membrán mátrix zsírsavak, Ca ++, Bax, Bak ROS, NO bongkrekát ciklosporin A 7. ábra Az átmeneti permeabilitási póruskomplex felépítése A komplex felépítésében részt vesz az adeninnukleotid-transzlokátor (ANT) és a feszültségfüggő anioncsatorna (VDAC). Hozzájuk kapcsolódik a külső membránban a benzodiazepin perifériális receptor (BPR), a kreatin-kináz a membránok közötti térben. A VDAC-hoz kapcsolódik a hexokináz II (HK) a külsőmembrán citoplazma felől és az ANT-hoz a ciklofillin D, valamint a Bax és a Bcl-2. Egyes anyagok (bongkrekát, ciklosporin A) gátolják a pórus nyitását, míg a Bax, a Bak, a VPR, a Ca++, a GD3, a zsírsavak, a ROS és a NO elősegítik azt. (35) A PTPC működését sokféle anyag befolyásolhatja (7. ábra), melyek hatásai sejttípusonként eltérőek lehetnek, ami azt jelzi, hogy a PTPC szabályozása is sejttípustól függ (59). A PTPC nyitását előidézhetik a a mitokondrium működése során is keletkező reaktív oxigéngyökök (ROS). Petrosillo és mtsai kimutatták, hogy ROS hatására peroxidálódhat a cardiolipin (a mitokondriumban található foszfolipid), és ennek 21

hatására válik le a citokróm-c a mitokondrium belső membránjáról, ami az első lépése az apoptózis során bekövetkező citokróm-c kibocsátásnak (60). Sokféle mechanizmust láthattunk, amelyek során a mitokondriumból a citokróm-c és egyéb anyagok kiszabadulhatnak. Némely csak a külső membrán permeabilizálódásának fokozódásával, némely a belső membrán áteresztőképességének növekedésével is jár. Utóbbi esetekben természetesen a légzési lánc működése is leáll. A kérdés ekkor az, hogy vajon egy kaszpázaktivációval járó apoptózis vagy egy bioenergetikai /redoxkatasztrófa történik-e. Ezt a mitokondrium és a glikolízis által termelt ATP mennyisége dönti el. 2.3.5. A mitokondrium és a kaszpázok kapcsolata A citokróm-c kibocsátása, azért is fontos jelenség, mert ennek a molekulának a segítségével történhet meg az apoptózis effektor molekuláinak, a kaszpázoknak az aktiválása, amelyek azután befejezik az apoptotikus programot, feldarabolják a sejtet apoptotikus testekké. A citokróm-c a citoplazmában egy másik kulcsfaktorral, az Apaf-1-gyel és datp-vel vagy ATP-vel együtt alkotja az apoptoszómát. Ennek a nagy, többtagú DISChez hasonló enzimkomplexnek, az előbb említett molekulákon kívül tagja még a prokaszpáz-9 is. A komplex feladata az utóbbi aktiválása és ennek segítségével a kaszpázkaszkád elindítása (23). Az apoptoszómának a kialakulását gátolhatják hősokk-fehérjék, valamint a Bcl-2 és a Bcl-x L is. A Hsp90 az Apaf-1-hez, a Hsp27 a citokróm-c-hez, a Hsp70 pedig az Apaf-1-hez vagy a prokaszpáz-9-hez kötődve gátolja a komplex kialakulását (61-64). A kaszpázok apoptoszómán keresztüli aktivációját az apoptózist gátló fehérjecsalád (IAP család) tagjai, beleértve az XIAP-t is, képesek gátolni. Az IAP okozta gátlás viszont kiküszöbölhető egy mitokondriális fehérje, a Smac/Diablo (second mitochondria-derived activator of caspases/direct IAP binding protein with Low p1) segítségével, amely a citokróm-c-vel egyidőben juthat ki a mitokondriumból, és a sejtet az IAP-k gátlása révén az apoptózisra érzékennyé teszi (65). Az előbb leírt mechanizmus alapján a citokróm-c kibocsátás és a kibocsátás módjától függő mitokondriumdepolarizáció előbb következik be, mint a kaszpázok, 22

főként az effektor kaszpázok aktivációja. Sok korábbi kísérletben, amikor a kaszpázok aktiválódásának idejét próbálták meghatározni, azt az eredményt kapták, hogy a kaszpázok aktivációja még a mitokondrium előtt bekövetkezik. Ezekben az esetekben ugyanis a kaszpázok gátlásával a mitokondrium depolarizáció is gátolható volt. Később vetődött fel az az elképzelés, mely szerint a mitokondrium és a kaszpázok egy öngerjesztő, egymást pozitívan erősítő kör részei (66). Ezt támogatják azok a kísérleti eredmények is, melyek arról számolnak be, hogy egy kezdeti, alacsony szintű citokrómc kibocsátás elindíthatja a kaszpáz-9 és -3 aktiválódását, de még nem történik meg a depolarizáció. Egy későbbi esemény során viszont nagy mértékű citokróm-c kiáramlás már depolarizációt okoz. Az utóbbi kaszpázgátlókkal gátolható volt, míg a korábbi nem. Tehát a kaszpázok okozták a nagymértékű citokróm-c kiáramlást és a mitokondrium depolarizációját (67). Milyen molekulákon keresztül fejtették ki hatásukat a kaszpázok? A kaszpáz-3 aktiváció után kimutatták Bcl-2 hasítását (ezzel az antiapoptotikus hatás proapoptotikussá válik), más kísérletekben pedig prokaszpáz-8 és Bid aktiválását is. Feltételeznek még más citoplazmatikus faktort is, amely a kaszpázok hasítása révén vezet a mitokondrium depolarizációjához és a citokróm-c kiáramlásához. Elmondhatjuk tehát, hogy a mitokondriumdepolarizációt okozó tényezők közé tartoznak a kaszpázok is, bár az általuk előidézett események, így a mitokondriumdepolarizáció is az apoptózis folyamatának inkább a későbbi történései közé tartozik. Az eddig leírtakban a mitokondriumból kiszabaduló citokróm-c aktiválta a kaszpázokat. Kiderült, hogy ezeknek az enzimeknek az eloszlását is szabályozhatja a mitokondrium, ugyanis a mitokondriális prokaszpáz-2 és -9 a PTPC nyílása után kerül ki a citoszolba (68). A prokaszpáz-3-nak szintén van citoplazmatikus és mitokondriális előfordulása és a Bcl-2 szabályozza ezek aktiválódását. Chandra és mtsai (69) kimutatták, hogy prokaszpáz enzimek többsége kikerül a mitokondriumból, és a citoplazmában aktiválódik. Az aktív enzimek egy része viszont (aktív kaszpáz-3, -9) a mitokondriumba szállítódik és aktiválja az ott levő prokaszpázokat. 23

2.3.6. A mitokondriumból kibocsátott toxikus faktorok kaszpáz-függő és -független apoptotikus utak Mostanában egyre több közlemény jelenik meg, ahol a programozott sejthalál formája kaszpáz-független apoptózis, vagy kaszpáz-független nekrózis. A citokróm-c kibocsátása során a citokróm-c mellett sok más sejthalált indukáló faktor is kiszabadul a membránok közötti térből. Ezek között van a korábban említett IAP-gátló Smac/Diablo, az apoptózis-indukáló faktor (AIF), a DNS- létrát létrehozó Endonukleáz G és a szerinproteáz aktivitású Omi/HtrA2. Az oxidoreduktáz aktivitással is rendelkező AIF DNS-fragmentációt indukál kaszpázoktól függetlenül. A mitokondriummembrán depolarizációja után a citoplazmába kerül, majd a sejtmagba transzlokálódik, ahol a kromatin kondenzációját idézi elő és nagyméretű DNS darabok (~50 kb) keletkeznek. A feltételezések szerint bizonyos magi nukleázok, pl. az Endonukleáz G játszik még szerepet ebben a DNS fragmentációban. A fent említett hatásokon kívül a mitokondrium depolarizációját, a citokróm-c és a prokaszpáz-9 kibocsátását, valamint a foszfatidil-szerin plazmamembránban való kifordulását okozza (70). A Hsp70 nemcsak az Apaf-1-et képes kötni, hanem az AIF-hez kötődve gátolja annak apoptotikus hatását (71). Az apoptózis egyik első észlelési módja a DNS-létra kimutatása volt. Ezt a nukleoszómális darabolódást a CAD (caspase activated DNase) végzi, amelyet a kaszpázok aktiválnak az ICAD hasításával. Viszont az ICAD-knockout egerek esetén is találtak oligonukleoszómális DNS fragmentációt (72). Van Loo és mtsai kimutatták, hogy apoptotikus szignál hatására az Endonukleáz G a mitokondriumból kiszabadulva kaszpáz-független DNS-fragmentációt idéz elő (73). A mitokondrium apoptózist indukáló faktorai között van az Omi/HtrA2 fehérje is. Ez az 50 kda-os szerin-proteáz homológiát mutat a bakteriális HtrA (high temperature requirement A) endoproteázzal, mely normál hőmérsékleten chaperon, míg magas hőmérsékleten proteázaktivitással rendelkezik (74). Az Omi szintén kettős aktivitással rendelkezik: citoplazmába való kerülése után az IAP-fehérjékhez kapcsolódik és gátolja a kaszpázokhoz való kötődésüket, így kaszpáz-függő apoptózist indukál (75). Ugyanez a fehérje szerin-proteáz aktivitásával pedig kaszpáz-független apoptózist indukál, eddig még ismeretlen módon. 24

Egyre több molekulát fedeznek fel, melyek résztvevői lehetnek egy kaszpázfüggetlen sejthalál folyamatnak. Chang és mtsai találták meg a WOX1 oxidoreduktáz fehérjét, mely a Bcl-2 expresszióját csökkenti, a p53 expresszióját/aktivitását növeli (76). Ez a fehérje is a mitokondriumban található, ahonnan kiszabadulva a sejtmagba transzlokálódik. Felfedezték az AIF-nek két homológját is: az AMID-ot (77) és a PRG3-at (78). Az AMID a külső mitokondriummembránban található és apoptózist indukál, ami független a kaszpázoktól, a p53-tól és a Bcl-2-től. A PRG3 viszont a citoplazmában található, p53- és kaszpáz-függő apoptózist okoz. 2.3.7. Programozott sejthalál apoptózis vagy nekrózis? A sejthalálnak más formái is lehetnek az apoptózis mellett. Az egyik legjobban feltérképezett forma az apoptózis mellett a nekrózis. A nekrózis során a sejt megduzzad, a citoplazmában vakuolumok jelennek meg, a sejtmembrán felszakad, a DNS pedig darabolódhat, de véletlenszerűen, nem a nukleoszómák mentén. A programozott sejthalált sokáig az apoptózissal azonosították, de az utóbbi években megjelentek olyan közlemények, ahol a programozott sejthalálnak alternatív formáit is kimutatták. Bizonyos esetekben apoptózisszerű sejthalálról vagy nekrózisszerű sejthalálról beszélnek, mivel a sejtek morfológiájukban vagy az apoptózisra vagy a nekrózisra hasonlítanak, de egyes alkotóelemek hiányoznak a pontos besoroláshoz (79). Más esetekben pedig ugyanannak az anyagnak a segítségével nekrózist és apoptózist is sikerült kiváltani, függően a környezettől, a dózistól (80) vagy sejttípustól, mint a TNFα (81) és a TRAIL (82) esetében. A TNFα által kiváltott nekrózis során a RIP, a TRAF2 és a FADD közvetítette a nekrotikus jelet, ami a ROS felszabadulás után keletkezett. Az eredmények vizsgálata során kitűnik, hogy a sejtelhalálás során általában bizonyos proteázok aktiválódnak, amelyek a folyamatok végrehajtói. Ahogy az apoptózisban részben a kaszpázok játsszák a fő szerepet, addig a nekrózis során a szintén cisztein-proteáz kalpain aktiválódik és felelős számos fehérje darabolódásáért (83). Bizonyos kaszpáz-független sejthalál formák során pedig a lizoszómális katepszinek a felelősek a DNS-fragmentáció elindításáért (84). 25

2.4. Sejthalált kiváltó természetes és mesterséges anyagok Aktiválások-gátlások bonyolult, molekuláris rendszere tartja életben a sejteket, illetve megfelelő jelre elpusztítja azokat. Különböző betegségek során ez a szabályozás sérülhet, egyes tagok meghibásodása, túltermelése megakadályozhatja a normális működést. A daganatos megbetegedésekben az egyik fő probléma a sejthalál elmaradása, gátlása, míg autoimmunbetegségekben, AIDS-ben vagy néhány idegrendszeri betegségben a túlzott mértékű sejthalál a betegség jellemzője. Ezeknek a betegségeknek a gyógyítása során fontos, hogy vissza tudjuk állítani a sejthalál normális menetét és mértékét. A kutatások nagy része arra irányul, hogy különböző anyagok segítségével sejthalált célzottan tudjunk előidézni vagy gátolni a beteg sejtekben, szervekben, ezzel elősegítve a gyógyulást. Az apoptózist befolyásoló anyagok lehetnek mesterségesek és természetes eredetűek. A pontos hatásmechanizmusuk megismerése szükséges ahhoz, hogy alkalmazásuk racionális legyen. 2.4.1. A transzformáló növekedési faktor béta 1 (TGFβ1) A TGFβ1 multifunkcionális citokin a TGFβ fehérje család tagja, amelybe több citokin is tartozik [TGFβ, activin, bone morphogenic factor (BMP)]. A TGFβ1 a sejtek növekedését, differenciálódását és apoptózisát befolyásolja. A TGFβ1 gátolja az immunrendszert (85), a T-lymphocyták, az NK-sejtek, a neutrofil granulocyták, a makrofágok és a B-sejtek proliferációját és funkcionális differenciációját. Számos megfigyelés támasztja alá, hogy a daganatsejtek TGFβ1-t expresszálva segítik elő saját növekedésüket a lokálisan kifejtett immunszupresszív hatással (86). A TGFβ1 hatását sejtfelszíni receptorokon keresztül (TGFβRI és TGFβRII) fejti ki, melyek a szerin/threonin-kináz receptorcsaládba tartoznak. A TGFβ1 TGFβRI-RIIhöz való kötődésének hatására a RII foszforilálja a RI-et, amely aktiválja a jelátvitelt végző Smad molekulákat (87). A Smadok felelősek azért, hogy a jel a receptoroktól a sejtmagba szállítódjon, ahol transzkripciós-faktorok segítségével TGFβ-reszponzív elemekhez kapcsolódnak és különböző gének átírását szabályozzák. A TIEG (TGFβ induced early gene) az egyik legelső a gének között, amit a TGFβ1 aktivál (88). Ez a fehérje 3 zinkujjmotívumot tartalmaz és transzkripciós faktorként működve gátolhatja 26

bizonyos gének kifejeződését, ezen keresztül pedig a sejtek növekedését, proliferációját gátolja, apoptózisukat indukálja (89). A TGFβ1 által kiváltott apoptózisnak a mechanizmusa még nem teljesen tisztázott. Hepatocitákban a TGFβ1 által kiváltott apoptózis ROS emelkedéssel és az antiapoptotikus Bcl-2 fehérjék expressziójának csökkenésével jár (90). Néhány lymphoma (pl. egyes CLL-ek) képes TGFβ1 termelésre, ugyanakkor elveszíti érzékenységét a TGFβ1-gyel szemben (91). 2.4.2. Retinoidok természetes és mesterséges retinsavak A retinoidok természetes és mesterséges analógjai az A-vitaminnak, a sejtek differenciálódását, proliferációját és apoptózisát befolyásolják. Az all-transz-retinsav (ATRA) és mesterséges analógja, a N-(4-hydroxyphenil)-retinamide (fenretinid, 4HPR) hatékony daganatellenes szerek, használják pl. - az akut promyelocitás leukémia esetén, ahol az ATRA a daganatos sejtek differenciálódását segíti elő (92), míg neuroblasztoma kezelésében a 4HPR cytotoxikus hatását használják ki (93). Nemcsak antiproliferatív, hanem apoptotikus hatásuk is van, amit mind in vivo (94), mind in vitro [pl. emlőráksejteken, petefészekráksejteken, akut lymphoblasztos leukémia sejteken, (95-97)] igazoltak. Lymphoma sejteken viszont igen kevés vizsgálat történt a retinoidokat illetően. A retinoidok a hatásukat a specifikus retinoid/rexinoid receptorokon (RAR, RXR) keresztül fejtik ki. Bizonyos esetekben viszont kimutatták, hogy receptorfüggetlen is lehet a retinoidok hatása (98). Mind az ATRA, mind a 4HPR a mitokondriális apoptotikus utat használja, de különböző módon. Az ATRA akut myeloblasztos leukémia sejtekben csökkentette a Bcl-2 szintjét (99), míg HeLa sejtekben és izolált mitokondriumok esetén a ANT-hoz kötődve a mitokondriális PTP nyílását indukálta (100). A 4HPR a légzési lánc gátlásával növeli a ROS termelődést, valamint a Bcl-2 család fehérjéinek szabályozásával okoz PTP nyitást (101, 102). Ezek az események pedig a kaszpázkaszkád aktiválódását és DNS-fragmentációt indukálnak. 27

2.4.3. Cisplatin A cisplatint (cis-diammin-di-kloroplatinum(ii), CDDP) bár már 25 éve használják a daganatellenes terápiában, molekuláris hatásmechanizmusa még mindig nem tisztázott. Az ismert, hogy a DNS-hez kötődik és interkaláló ágensként keresztköti a kettős spirált, ami a transzkripció és a DNS kettőződése során DNS-töréseket okoz (103). A DNS-sérülés hatására sok szignáltranszdukciós molekula aktiválódik (pl p53, p78, MAPK). Ha a törések nem javítódnak ki, akkor sejthalált indukáló jelek indulhatnak el. Kimutatták, hogy a sejt állapotától, illetve a szer koncentrációjától függően apoptózis vagy nekrózis következik be (104). Az apoptózis során a mitokondrium depolarizációját és a kaszpázok aktivációját figyelték meg. A CDDP hatását több faktor is gátolhatja: 1.) ha foszfolipidekhez kötődik, akkor csökken a sejtbe jutó molekulák mennyisége 2.) ha a sejtbe bejutó szer glutationhoz kötődik, akkor transzportfehérjék kiszállítják a sejtből 3.) ha gátolt a DNS-t javító és vizsgáló fehérjék működése 4.) ha az apoptotikus útvonalak hibásak/gátoltak (105). CDDP hatására a Bcl-2 szintje csökken (106), míg a proapoptotikus tagok változatlanok maradnak (107). Ez jelzi, hogy a rezisztenciának a magas Bcl-2 szint is oka lehet. Megfigyelték, hogy a JNK - a stressz aktiválta protein kináz (SAPK) útvonal tagja - aktiválása szükséges a cisplatin indukálta apoptózishoz (108). A stockholmi Karolinska Intézetben kimutatták, hogy a 224 melanóma sejtekben a cisplatin által kiváltott apoptózisban a Bak molekula központi szerepet játszik (109). Ebbe a kutatásba kapcsolódtam be, amelynek során tovább vizsgáltuk különböző melanóma sejtvonalakban a Bak aktivációját és más fehérjékkel való kapcsolatát a cisplatin által kiváltott apoptózisban. 28

3. CÉLKITŰZÉSEK Célkitűzésünk az volt, hogy pontosabban megismerjük bizonyos természetes és mesterséges anyagok által kiváltott apoptózis mechanizmusát. 3.1. Célkitűzéseink a TGFβ1 hatásának vizsgálata során A TGFβ1-et termelő B-lymphoma sejtekben, melyek érzéketlenek a saját TGFβjukra, TGFβ1 által indukálható-e az apoptózis? Ha igen, akkor melyik apoptotikus jelátviteli út aktiválódik a TGFβ1 hatására B- lymphoma sejtekben és ez hogyan befolyásolható, TGFβ1 kezelés hatására történik-e sejtciklusgátlás a HT58 sejtekben? 3.2. Célkitűzéseink az ATRA és a 4HPR hatásának vizsgálata során Képesek-e a retinsavak apoptózist indukálni B-sejt eredetű lymphoma sejtekben? Különböző apoptotikus mechanizmust használ-e az ATRA (természetes retinsav) és szintetikus analógja, a 4HPR? 3.3. Célkitűzések a Bak konformációváltozásának vizsgálata során Különböző melanoma sejtvonalakban cisplatin hatására aktiválódik-e a Bak? A Bak-nak milyen aktivációs lépéseken kell keresztül mennie az apoptózis indukció során, és milyen tényezők befolyásolják az aktivációt? 29