Tematika Korszerű tömegspektrometria a biokémi miában Szabó Pál MTA Kémiai Kutatóközpont Bevezetés: ionizációs technikák és analizátorok összehasonlítása a biomolekulák szemszögéből Mikromennyiségek mintaelőkészítése Intakt fehérjék vizsgálata: lehetőségek és korlátok Enzimatikus és kémiai hasítások oldatban és gélben Peptidtérkép készítése, szekvenciameghatározás Kromatográfia a mikro illetve nano tartományokban Peptidek tandem tömegspektrometriás szekvenálása Poszttranszlációs módosítások vizsgálata: metilálás, diszulfid hidak, foszforilálás, glikozilálás Fehérjekomplexek vizsgálata Enzimek aktív centrumának meghatározása Nukleinsavak vizsgálata Egyebek Az MS felépítése Ionforrás Adatgyűjtő rendszer Mintabevitel Ionforrás Interface Analizátor Vákuumrendszer Detektor Cél: Töltött részecskék előállítása Ionizációs módok: elektronütközéses ionizáció (EI) kémiai ionizáció (CI) gyors atom bombázás (FAB) lézerdeszorpció (LDI, MALDI) ionizáció légköri nyomáson (API) electrospray ionizáció (ESI) légköri nyomású kémiai ionizáció (APCI) photospray ionozáció (PSI) Gyors atom bombázás Gyors atom bombázás Cél: kiterjeszteni a vizsgálható vegyületek körét Megoldás: mátrix bevonása az ionképzésbe Mátrix: glicerin, NOBA Tömeghatár: néhány ezer Da Fragmentáció: kismértékű Gyors atom/ion: Xe, Cs Kvázi-molekulaion: [MH], [MNa], 1
Lézerdeszorpció MALDI ionképz pződés Matrix Assisted Laser Desorption Ionization- Time of Flight Mass Spectrometry Leggyakoribb mátrixok: 4-hidroxi-a-ciano fahéjsav (CHCA) 2,5-dihidroxi benzoesav (DHB) 3,5-dimetoxi-4-hidroxi fahéjsav (SA) Mátrix-minta kristályok a targeten Mintatartó 20 kv hn AH Rács Laser Rács 1. A mátrix-minta oldatot rászárítjuk a mintatartóra. 2. Laserimpulzus hatására molekulák lépnek ki a gázfázisba. 3. A minta molekuláit a mátrix ionizálja, majd az elektrosztatikus tér felgyorsítja. 4. Repülési idő (TOF) tömegspektrometriás detektálás. A MALDI előnyei Tipikus MALDI spektrum Lágy ionizáció: intakt biomolekulák vizsgálata lehetséges Széles tömegtartomány: nagy móltömegű biomolekulák (> 300 kda) vizsgálata Keverékek egyidejű vizsgálata lehetséges, nem igényel bonyolult tisztítást, elválasztást Nagy érzékenység (fmol tartomány) Könnyen értelmezhető spektrumok (kis töltöttség) Sók, pufferek hatása kisebb Gyors % Intensity 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 24607 [M3H] 3 49813 [M2H] 2 74667 Voyager Spec #1=>NR(2.00)=>RSM100[BP = 149089.4, 3562] [MH] 149131 [2M3H] 2 99694 1 pmol lineáris mód 25 kv gyors. fesz [2MH] 298434 3562.3 0 0 20000 80000 140000 200000 260000 320000 Mass (m/z) Ionizáci ció légköri nyomáson Electrospray ionizáci ció IonSpray: (Pneumatikusan segített electrospray) Nagyfeszültség (5-6 kv) hatására töltött cseppek kerülnek a gázfázisba (koncentrációérzékeny!). Áramlási sebességek: TurboV (2µL/min 3mL/min) Turbo-IonSpray (2µL/min 1mL/min) IonSpray (2 to 200µL/min) Micro-IonSpray (50 to 1000 nl/min) NanoSpray (~1µL-5µl in tip, 20-50 nl/min) Kis áramlás fi nagyobb érzékenység! 2
Turbo V TM Áramlási tartomány: 2 3000 µl/min TurboIonSpray TM Áramlási tartomány: 2 1000 µ L/min IonSpray TM Áramlási tartomány: 2 200 µ L/min Microelectrospray Áramlási tartomány: 50 1000 nl/min Nanospray Microtechnikák másként Áramlási tartomány: 20 50 nl/min 3
Sprayképz pződés Oldószerelt szereltávolítás Nitrogén gázfüggöny légköri nyomás 1. töltött cseppek képződése 3. Coulomb robbanás vákuum 2. oldószereltávolítás Gázfüggöny interface Oldószerelt szereltávolítás légköri nyomás CUR DP SK vákuum FP Fűtött kapilláris Q0 Párologtató gáz HPLC eluens Spray Fűtőegység Szárítógáz N 2 Fűtött kapilláris Többszörösen sen töltt ltött tt ionok Rekonstruált tömegspektrumt Lágy ionizáció m/z = (M nh )/n 4
Eluensmódos dosítók Sóhatás Szerves savak (hangyasav, ecetsav) elősegítik a bázikus vegyületek (sp 3 N-tartalmú) protonálódását. Semleges együletek kationok (alkálifém, ammónium) segítségével is képezhetnek ionokat. 0.1 % hangyasav vagy ecetsav a legjobb adalék pozitív módban peptidek, fehérjék vizsgálatára, a 0.1% TFA HPLC-MS méréseknél kedvelt. Ammónium-formiát vagy-acetát javasolt puffernek 2-10 mm koncentrációban. Foszfátpuffer, TEA kerülendő!!! 5