Véna homograftok életképessége szövetbanki tárolás során

Véna homograftok életképessége szövetbanki tárolás során PhD ÉRTEKEZÉS DR GALAMBOS BARNABÁS Témavezető: Prof. Dr Nemes Attila Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Budapest 2005 II Klinikai Tudományági Doktori Iskola Szigorlati bizottság: Prof. Dr. Füst György, Dr. Gyűrűs Péter, Dr. Lotz Gábor Hivatalos bírálók: Dr. Entz László, Dr. Gyűrűs Péter 1

Tartalomjegyzék Rövidítések 4 I. Bevezetés 5 I.1. Történeti áttekintés 5 I.2. Prezervációs lehetőségek 5 I.3. Cryoprezerváció 6 I.4. Hideg anoxiában hosszú ideig tartó hűtve tárolás 6 I.5. Felhasználási területek 6 I.6. Transzplantációs eredmények 7 I.7. Életképességi vizsgálatok 8 I.8. Személyi és tárgyi feltételek 9 I.9. A methyl tetrazolium kvantitatív csökkenése, mint életképességi mutató 9 I.10. Véna allograft életképességének megőrzése hosszú távú tárolás során 10 II. Hipothesisek 11 III. Anyagok és módszerek 12 III.1.rész 12 III.1.1. Allograftok kivételének protokollja és a tárolás standardizálása 13 III.1.2. MTT vizsgálat adaptációja véna homograft tanulmányokhoz 14 III.1.3. MTT hasadás enzim-kinetikai karakterizálása 15 III.1.4. Életképesség meghatározása fluoreszcens festékkel 16 III.1.5. Negatív kontroll 16 III.1.6. Statisztika 17 III.2.1. Véna allograftok cryopreserválása 18 III.2.2. Friss véna és holttestből(cadaverből) származó véna tartósítása 4 C fokos tárolás során 19 III.2.3. ph monitorozás 19 III.2.4.Negatív kontroll 20 III.2.5.Vizsgálaton belüli és közötti variabilitás 20 III.2.6. Az életképesség tesztelése MTT vizsgálattal. 21 III.2.7 Szövettani vizsgálat 21 IV. Eredmények 22 IV.1. MTT vizsgálat 22 2

IV.2. MTT hasadás és enzim kinetikák karakterizálása 23 IV.3. Festékek 24 IV.4. Negatív kontrollok 26 IV.5. Friss vénák és holttest (cadaver) homograftok hosszú-idejű 4 C fokos tárolása IV.6. Cryopreservalt homograftok 31 IV. Szövettani vizsgálatok 33 V. THESISEK 38 VI. Diszkusszió 39 VI.1 MTT vizsgálat 39 VI.2 Prezerváció 40 VI.3 Klinikai alkalmazások 42 VI.4. Homograftbeültetések 43 VI.5. Tervezett kísérletes és klinikai tanulmányok 44 VII. Köszönetnyilvánítás 46 VIII. Irodalomjegyzék 47 IX. Saját témával kapcsolatos közlemények jegyzéke: 51 X. Egyéb publikációk 53 XI. Összefoglaló 54 XII. Abstract 55 3

Rövidítések 1. Da: Dalton 2. d.f.: denumeral frekvencia 3. DMSO: dymethyl-sulfoxid 4. EB: ethidium bromid 5. HE: haematoxilin eosin 6. Km: Michaelis állandó 7. vmax: maximális sebesség 8. Km/vmax sebességi állandó 9. MTT methyltetrazólium 10. NS normal saline 11. SE standard error 12. PBS phosphate buffer solution 13. PI propidium iodide 14. VSM vena saphena magna 15. TCM tissue culture medium 4

I. Bevezetés I.1 Történeti áttekintés Az érhomograftok használata a kezdeti kísérleteket is tekintve több évtizedes múltra tekint vissza. Kezdetben elsősorban a gyermekszívsebészeti gyakorlatban terjedt el billentyűpótlás esetén. Ezt a műtétet hazánkban is végezték és végzik a gyermekszívsebészeti gyakorlatban. A felnőttekben használatos érhomograftok használata az elmúlt évtizedekben terjedt el, elsősorban a fejlődő cryopreservációs módszerek, másodsorban a szaporodó érsebészeti tapasztalat és kitolódó életkor miatt.(1-5) Az érsebészet korai napjaiban frissen tartósított artéria és véna homograftokat használtak a rekonstruktiv érműtéteknél. Azonban e koncepció hamar elvetésre került, a nagyarányú aneurizma képződés és biodegeneráció miatt.a sikertelenséget immunológiai okokkal magyarázták. Ujabb lökést adott a homograftbeültetéseknek az új prezervációs eljárások bevezetése.a dimethyl-sulfoxid (DMSO) felhasználásával lehetővé vált a programozott mélyfagyasztás azaz a cryoprezerváció, létrejöttek a szövetbankok melyek az egyéb szövetdonorokhoz hasonlóan képesek voltak bármennyi ideig tárolni az allograftokat. Azonban a tartósítási eljárások még mindig nagy mennyiségű sejtpusztuláshoz vezettek a DMSO citotoxikus hatása miatt. A 80-as évek második felében E. Kieffer és munkacsoportja Europában egy másfajta prezervációs eljárással ért el jelentős sikereket. Hosszú ideig hideg anoxiában (4 fokos tárolás) tárolt allograftok három héten belül felhasználhatóak voltak. Nemrégiben graft infekciók és a kritikus végtagi ischémia miatt elvégzett rekontsruktív érműtétek eredményei javultak a homograftok alkalmazásával, a tartósítási protokollok megújultak. [6-11]. Mindazonáltal, a graft degeneráció még mindig limitáló tényező a sikeres hosszú-távú eredményekhez. I.2. Prezervációs lehetőségek Jelenleg, az élő sejteket tartalmazó véna homograftok tárolására két fő tartósító eljárás használatos, a fagyasztva tartósítás (cryopreserváció) és a friss graftok speciális szövet kultúra médiumban való tárolása 4 C fokon anoxiában [1,12]. 5

I.3.Cryoprezerváció Az allograftok eltávolítása az ún. multi-organ harvesting keretében történik (szervdonáció agyhalott cadaverből), illetve történhet a halál beállta után, az autolysis okozta károsodások előtt (6 órán belül), mindkét esetben steril műtői körülmények között. Eltávolítás után a használható érszakaszt szállító illetve prezerváló oldatba helyezik. A preparátumokat 24 órán belül előkészítik a mélyfagyasztásra és tárolásra. A prezerváció a Szövetbankban történik az egyik lehetséges változata a cryoprezerváció, azaz programozott mélyfagyasztás és -150 C hőmérsékleten történő tárolás (100 ml DMSO oldatban). I.4. Hideg anoxiában hosszú ideig tartó hűtve tárolás A másik a hűtött fresh-graft eljárás, azaz a preparatum +4 C hőmérsékleten, speciális prezerváló oldatban (Eagle s MEM médium, vagy X-Vivo 10 + antibiotikum kombináció) történő tárolása.az oldat steril, tápoldaton és az antibiotikumokon kívül egyéb addicionális szert nem tartalmaz mennyisége a tárolt homograft súlyától függ. I.5. Felhasználási területek A rekonstruktív verőérműtétek többsége graft implantációt igényel. A koronária és perifériás verőérelzáródás miatt végzett rekonstruktív műtéteknél az autológ vénák a leginkább preferált allograftok [14, 13, 15]. A populáció megnövekedett életkora, a növekvő számú redo műtétek, a bypass graftokban kialakuló intimális hyperplázia és felgyorsult atherosclerozis miatt, a betegek több mint harmadának nem lesz megfelelő saját vénája rekontsruktív érműtét elvégzése céljára. Amikor autológ véna nincs jelen, a glutaraldehyde-tartósított umbilikális vénáról ismert, hogy elfogadható, hosszú-távú 6

eredményeket lehet elérni velük [16, 17]. Érprothézisek használhatóak nagy-átmérőjű erek esetében, azonban a jelenlegi biotechnologia mellett elég szerény a nyitvamaradásuk, amikor kis-átmérőjű erek helyettesítésére használják, mint érpótló anyagokat. A nagy költségű műanyag prothezisek helyett, továbbá minden olyan esetben ahol autológ érpótló anyagra van szükség homograftokat használhatunk. Homológ vasculáris graftként a véna saphena magna, az aorto-ilicalis verőérszakasz, mélyvénák és az arteria femoralis communis valamint az arteria femoralis superficialis jön szóba. I.6. Transzplantációs eredmények Máj és vese transzplantáció eredményei alapján nyilvánvalóvá vált, hogy a transzplantátum erei csak ritkán thrombotizálódnak vagy képeznek aneurizmát, akár 20 éves vagy annál is hosszabb nyomonkövetés során. A nyitott graftok hisztológiai vizsgálatai életképes sejteket mutattak neoendothel, elasztin és simaizomképződésssel. Kimutatták, hogy az életképes sejtek száma az allograftokban kulcsfontosságú a hosszú távú graft átjárhatóság miatt a térd feletti és alatti rekonstrukciók eseteiben egyaránt [18, 14]. Úgy tűnik, hogy az intakt, életképes sejtek előfeltételei az autológ és alloplasztikus bypass graftok hosszútávú átjárhatóságának. Ezért fogadtuk el azt a hipotézist, hogy az életképes sejtek minél nagyobb számban történő megőrzése elengedhetetlen a hosszú távú nyitvamaradás eléréséhez a homograftokban. Ez csak friss graftok kivételének esetében és azonnali beültetéssel érhető el. Jelenleg, az allograftok elérhetősége korlátozott a donorok alacsony száma és a jogi problémák miatt. A donor bankok megléte ellenére, a humán allograftok beszerzése és tárolása, tartósítása nehézségekbe ütközik. Jelentős számú betegnél észlelt másodlagos dilatáció és meszesedés hátterében a jelenleg használatos sterilizálási és tárolási módszerek állnak. Míg a különböző tárolási technikák, mint a tartósítás +4 C vagy +20 C fokon egyszerű sóoldatban nem tartja fenn az életképességet a vénafal sejtjeiben, a cryopreserválás módszerének kifejlesztése a megfelelő sejtszintű kutatások után talán lehetővé teszi a vénák tarolását hosszabb ideig, jelentős sejtkárosodás nélkül. A végső 7

célja ennek az eljárásnak véna bank létrehozásának elérése, mely azonnal és biztonságosan használható, amikor csak szükséges. Számos tanulmányt publikáltak, melyek értékelték a homograftok életképességét cryopreserválás után és 60%-os sejt túlélésről számoltak be, de megbízható adatok, fagyasztási és felolvasztási paraméterekről, a szövetkultúra médium csere és tárolási időtartamról jelenleg nem állnak rendelkezésre. [20, 21]. Kérdéses továbbá, hogy mely az az igazán megbízható és hatékony életképességi vizsgálat amellyel a homograftok élő sejtjeinek a számát implantáció előtt meg tudjuk ítélni.. I.7. Életképességi vizsgálatok Az életképesség az élő rendszer stabil állapotban való önfenntartási képességeként definiálható [22, 23, 24]. A homograft életképes sejtje akkor tekinthető holtnak, amikor néhány alap aspektusa a sejt működésnek nem funkcionál tovább. Ilyen sejtfunkció lehet az intermedier metabolizmus, amit az oxigénfogyasztás reflektál, vagy a magas energiájú komponensek fenntartási képessége, mint az ATP. Ezen komponensek csökkenése a homograft szövetben károsodási markerként használatos [1-3]. Számos típusú teszt használható a szerv kinyerés optimalizálására, szállítására és tartósítására. Az életképesség megítéléshez használt legelterjedtebb vizsgálatok a következők: oxigénfogyasztási, festék kizárási, metabolikus vizsgálatok és szövettani módszerek. Oxigén consumptiós vizsgálat rendkívül nehézkes a sejtmembrán gyakori sérülése miatt, amit a fagyasztva-tartósítás során keletkező ozmotikus stressz eredményez. A DMSO citotoxicitása szintén membránsérülést okozhat továbbá a vizsgálat az oxigén parciális nyomásától is függ. A fragmentált DNS koncentráció változásának mérésén alapuló életképességi vizsgálat minőségileg értékes, de bonyolult, időigényes és drága, hasonlóan a festék kizárási módszerhez. A szövettani vizsgálatok sok esetben még életképes sejteket mutatnak miközben a mitokondriális enzimek már irreverzibilisen károsodtak és a sejtek már gyakorlatilag életképtelenek. [22, 23, 24]. 8

I.8. Személyi és tárgyi feltételek A nemzetközi szakirodalomban publikált eredményeket figyelembe véve, s a hazai Országos Érsebészeti Intézet úttörő munkáját követve, valamint intézményünk lehetőségeit kihasználandó indokoltnak láttuk homológ véna és artéria graftok alkalmazását. Kórházunkban a viszonylag nagy számban előforduló szervdonáció, a Szövetbank eszközállománya, magas szintű tárgyi és szakmai felkészültsége, valamint a regionális feladatokat is ellátó érsebészeti centrum nagyszámú beteganyaga, szakmai képzettsége teszi lehetővé homograftok nyerését, tárolását és implantálását, a bevezetett új módszerrel kapcsolatos tanulmányok, kutatások (pl.: sejt-életképesség összehasonlító vizsgálat) elindítását. I.9. A methyl tetrazolium kvantitatív csökkenése, mint életképességi mutató Kutatásaink első részében egy új költség hatékony, gyors, effektív, könnyen reprodukálható és megbízható életképességi vizsgálat kifejlesztése vált szükségessé amely könnyen alkalmazható a homografttokhoz. E munka tárgya a megbízható, egyszerű és nem költséges módszer adaptálása volt a véna homograftok életképességének vizsgálatára. Az MTT vizsgálat a sárga tetrazolium só, 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid (MTT) az életképes sejtek mitokondriális enzimeinek piros színű formazan pigmentté való átalakításán alapszik. E vizsgálat széles körben használatos, kémiai-érzékenység, immunológiai sejt stimulálás, sejt toxikusság, gomba és féreg vizsgálatokban [25-40]. Néhány tanulmány, szilárd szövetekre szintén ismert [41-44], azonban véna homograftokon végzett MTT vizsgálatokról szóló közlemények nem ismeretesek. Az enzimreakciók részletei, az enzimkinetika, beleértve a sebességi állandót szintén ismeretlen, pedig fontos markere minden egyes szövettípusnak. Az MTT teszt megbízhatóságát független életképességi teszttel való összehasonlítással is értékeltük az eredmények hitelesítése céljából. 9

I.10.Véna allograft életképességének megőrzése hosszú távú tárolás során Az itt leirt tanulmányok arra hivatottak, hogy értékeljék a véna homograftok életképességében bekövetkező változásokat hosszútávú hűtött tárolás során és azonosítsák azt a pontot, amelyen, a +4 C fokon tárolt véna homograftok életképessége eléri azt a szintet, amelyet rendszerint a cryopreservalt allograftoknál található. Megbecsültük a véna homograftok életképességét egy átdolgozott methyltetrazolium (MTT) méréssel, gyakori időközökkel a 4 C fokon való hosszú tárolás során és összehasonlítottuk ezen graftok életképességét a megfelelő cryopreservalt véna mintákkal. Összehasonlítottuk a véna allograftok életképességét az agy-halott többszerv-donorokból és, maximum 24 óráig tartó vértelen (ischaemiás) idejű holttestekből, hogy megbecsüljük az életképes sejtek károsodását. A rendszeres médium csere hatása a homograftok életképességére szintén meghatározásra került. A hosszú ideig hűtve tárolt allograftok felhasználásával egy hatásos és költség-hatékony terápiás eljárást kívánunk bevezetni szélesebb körben. 10

II.Hipothesisek 1. Methyltetrazólium kolorimetriás életképességi vizsgálat alkalmazható-e a homograftok esetében 2. Első vagy másod rendű enzim kinetikát követ a methyltetrazólium lebontása 3. Mikor éri el a +4 C.-on, hideg anoxiában hosszú ideig tárolt véna homograft azt az életképességi szintet amit a cryoprezervált allograftoknál megtalálható volt 4. Van-e különbség a különböző módon nyert véna allograftok életképességei között agyhalott, több szerv donorokból (nincs ischaemiás idő) cadaverekből ( max. 24 h.-ja tartó, ischamiás periódus) 5. A rendszeres médium cseréknek van-e szerepe az életképesség változásaiban a különböző módon nyert véna homograftok között 11

III.Anyagok és módszerek III.1.rész III.1.1. Allograftok kivételének protokollja és a tárolás standardizálása A vizsgálataink elvégzéséhez a VSM (vena saphaena magna)-t válsztottuk, mely rutinszerűen használatos a homograft beültetéseknél, könnyen hozzáférhető más szervek transzplantációs célú rutin kinyerési eljárásai során. A VSM-ák agy-halott többszerv donorokból távolítottuk el, akiknek megvolt a donációkutatás céljából történő beleegyezésük. A donorok átlag életkora 36 év volt (20-54). A VSM-k átlagos hossza 44 cm (39-49 cm), az átmérője 13 mm (5-21 mm) és a súlyuk 10 mg (6-16 mg) volt. A véna minden egyes sejttípusának jelentős a variabilitása a méretet, sejt sűrűséget, metabolikus aktivitást és biokémiai tulajdonságokat illetőleg a különböző donorokban, még ugyan abban a régióban vagy anatómiai rétegekben is. Éppen ezért a vizsgált teljes-falvastagságú kimetszéseket, következetesen a VSM saphenofemoralis junctiójától disztálisal lévő első 5 cm-es részéből végeztük.. Ehhez a tanulmányhoz minden allograftot a győri, Nyugat Magyarországi Régionalis Szövet Bank, szolgáltatta és a Petz Aladár Egyetemi Oktató Kórház, Győr. A vénákat agy-halott paciensekből távolítottuk el és azonnal szövetkultúra médiumba helyeztük. (X-Vivo 10, Biowhitaker, Walkersville, Md., USA). X-Vivo 10 egy Iscove s által módosított Dulbecco médium-alapú szövetkultúra médium, mely tartalmaz rekombináns és pasztörizált emberi szérum fehérjéket (humán szérum albumin, humán transzferrin, humán rekombináns inzulin). Gentamicint, 80 mg/l (Hoffman-La Roche, Basel, Switzerland) és 1 g/l ceftazidime-et (Lilly, Pharma, Giessen, Germany) adtunk a médiumhoz. Más addicionális szérum vagy aminosav nem került hozzáadásra a szállító vagy tároló médiumhoz. A véna homograftok felszínét megvizsgáltuk és az olyan darabokat amelyeken a degeneráció vagy betegség egyértelmű jelei láthatóak voltak nem használtuk fel. A friss véna homograftokat 150 ml szövet kultúra médiummal borított Nalgene üvegekben tároltuk. A biopszia készítéskor, a vénákat kivettük a tárolásból és 4 mm-es biopszia mintákat metszettünk ki a teljes falvastagságból. A biopszia idején, a vénákat kivettük a hűtött tárolásból és 4 mm-es teljes falvastagságú biopszia szeleteket metszettünk ki, melyek tartalmazták az intakt endothéliumot, a 12

media és adventitia réteget Minden kísérletnél három példányban készült mintákat teszteltünk Minden donor szerológiailag ellenőrzött és bakteriológiailag tesztelt volt.. III.1.2.MTT vizsgálat adaptációja véna homograft tanulmányokhoz Minden 10.-ik napon friss MTT (Sigma, St. Louis. Mo., USA) oldatot készítettünk, a por PBS-ben való feloldásával, majd 4 C fokon tároltuk. Mivel a mitokondriális enzimaktivitás alapvető a sejtéletképesség szempontjából, ezen enzimaktivitás megbecslése használható, mint életképességi mutató. Ahogy az autolízis előrehalad, a légzési láncban (pl. cytochrome oxidase és succinic dehydrogenase) mitokondriális enzimaktivitás eléri a nullát 24 és 36 óra alatt [32-34, 39]. A biopszia mintákat 37 C fokon, 200 µl MTT tartalmú 96-részes tálcában inkubáltuk. Az optimális koncentráció és inkubációs idő nem volt ismert, a mintákat különböző koncentrációjú (0.01-0.5 w/v%;súly/térfogat%) MTT-ben 1 és 3 óra közt inkubáltuk. A mitokondriális enzimek által termelt formazan pigment nem víz oldékony, de a megfelelő szerves oldószerrel való kivonás után a koncentrációja spektrofotométerrel mérhető. A maximális abszorpció µ=563 nm-en volt mérhető. A szövet súlya és a kioldott formazan pigment abszorpciója közti kapcsolat szintén ismeretlen volt. A minták 10 perces desztillált vízbe való tételével állítottuk le a reakciót, majd minden biopsziát szárazra itattunk le. Lemérve a mintákat, 24-részes tálcákon 37 C fokon, egy éjszakán át inkubáltuk, 1 ml ethylene glycol monomethyl ether-ben (methyl cellosolve, Sigma, St. Louis, Mo., USA) a formazan eltávolítása céljából. A kapott szín denzitás arányos a mitokondriális enzimaktivitással, ami tükrözi a sejt életképességét, függetlenül a sejt ciklus stádiumaitól. Az életképesség index, mint optikai abszorpció µ 563 nm hullámhossz/ mg homograft/ ml sejtoldó fejeztük ki. A kivonási puffer oldat ph-ja a rendkívül fontos tényezője a vizsgálatnak azóta, amióta a nem-savas miliőről (ph>5.0) kimutatták, hogy fals eredményeket okozhat. A sejtoldót 70 µl 0.006 N HCl/ml-rel ph 3.5-re savanyítottuk. A leolvasást Beckmann Dual spektrofotométerrel (Fullerton,Calif.,USA)végeztük. 13

III.1.3.MTT hasadás enzim-kinetikai karakterizálása Ismert, hogy az MTT hasadás egyenesen arányos az életképes sejtek számával, de az összefüggés nem lineáris, az inkubáció során fellépő időhöz kapcsolt progresszív sejt halál miatt. Az eltérő normál és tumoros sejtvonalak első-rendű enzimkinetikát követnek [19]. Nem volt ismert, vajon a véna homografttok szövet enzimei hasonló tulajdonságúak-e, és a sebességi állandó szintén ismeretlen volt. V max /K m, a sebességi állandó, (mikor V max a reakció maximális sebessége és K m a Michaelis állandó,) fontos markere a mitokondriális aktivitásnak egy adott sejttípus esetén és független a sejtciklustól. Az MTT leginkább két eltérő helyen hasad a légzési láncban: (a) succinate dehydrogenase által, és (b) cytochrome c 1, és cytochrome c között [35]. Agyhalott működő keringésű donorból származó friss véna mintákat 1 óráig különböző koncentrációjú MTT oldatokban (0.01-1% w/v) inkubáltunk, majd az abszorpciót meghatároztuk. Az eredményt Michaelis és Menten elméletéből derivált Lineweaver és Burk egyenlet segítségével fejeztük ki: l/v=k m /V max x l/s+l/v max ahol a v a reakció sebessége µm s -1 -ban (v=y/t), y a hasított MTT µm-ban, t az idő s (másodpercekben), s a kezdeti MTT koncentráció µm-ban, K m a Michaelis állandó, és V max a maximális reakció sebesség µm -1 -ban. Az egyenlet megrajzolható egyenes görbeként, ahol a görbe lejtése a K m /V max, az x tengely a l/s, az y tengely az 1/v. Az MTT, mint szubsztrát és a formazan pigment, mint enzim reakció produktuma közötti összefüggés, döntő fontosságú volt a Lineweaver és Burk egyenlet elemeinek kvantitatív meghatározása érdekében, beleértve a V max és K m értékeket is. Az MTT molekulasúly 414.3 Da (Dalton), a 1-(4,5-dimethylthiazol-2-y)-3,5-diphenyl-formazan pigment molekula súlya 335.4 Da volt. A sorozat hígítása az MTT formazan pigmentnek (Sigma, St. Louis, Mo., USA) methyl-cellosolve-val történt, hogy meghatározzuk az ismert koncentrációjú formazan abszorpcióját =563 nm-en. A hasított 14

MTT mennyiségét az abszorpció átlagértékeiből kalkulálhattuk. A hasított MTT mennyisége egyenlő a keletkezett formazan mennyiségével. III.1.4. Életképesség meghatározása fluoreszcens festékkel A homograft sejtek életképességét fluoreszcens festék kombinációval is értékeltük, hogy az MTT vizsgálat eredményeit hitelesítsük. Ebben a munkában használt festék kombináció lehetővé tette, hogy szimultán vizualizálhassuk az életképes és a nem életképes sejteket [36-39]. A VSM-ból egy véna homograft darabot vettünk és felosztottuk. A mintát tartó lemezt kis fém blokkhoz ragasztottuk, majd 30-µm-vastagságú szeleteket vágtunk vibratommal (Technical Products International Inc., St. Louis, Mo., USA) alacsony sebességgel és közepes amplítudóval. A szeletek 10 percig szobahőmérsékleten inkubálodtak a festékben, majd desztillált vízzel átöblítettük a nem reagált festékek eltávolítása miatt. A munkában használt oldat tartalmazott 1 µg/ml propidium iodide (PI) és 4 µm/ml SYTO-16 festéket, (mindegyik a Molecular Probes, Eugene, Oreg., USA-tól) e festékeket normál sóoldatban oldottuk fel. A PI phenanthridium intercalator, melynek megjelenése kizárt az élő sejtekben, és gyakran használják halott sejtek, membrán integritás és DNS struktúra vizsgálatánál, mely megengedi szelektíven a fényesen festődő piros sejtek vizualizációját, melyek a halott sejtek populációját alkotják. A SYTO-16 festék egy sejt permeábilis nukleinsav festék, mely megfelelő élő sejtek festésére. Mindkét festékre szükség van az élő és holt sejtek elkülönítéséhez, a PI piros, míg a SYTO-16 zölden fluoreszkál. Nikon Diaphot 300 epifluoreszcens mikroszkóp (Nikon, Japán) használatával vizsgáltuk a szekciókat, mely 100 W-os (Watt-os) xenon ívlámpával és a gyártó standard szűrő szettjével volt felszerelve, fluoreszcenssel-jelölt komplexek vizsgálatához. A szűrő kombináció lehetővé tette mind a zölden, mind a pirosan fluoreszkáló sejtek egyidejű látását. Az élő és holt sejtek arányát elmentett képekből becsültük meg Image-Pro Plus képanalizáló szoftver segítségével (Media Cybernetics, Silver-Springs, Calif., USA). Friss, negatív kontroll minták, különböző tárolási intervallumok után megfestésre kerültek, hogy verifikáljuk a festékek megbízhatóságát és alkalmazhatóságát. A százalékos életképességi index az MTT-vel és az életképes és 15

holt sejtek arányának megbecslése a fluoreszcens festési módszer összehasonlítása révén történt. III.1.5. Negatív kontroll Véna homograftok eltérő módon való életképtelenné tétele negatív kontrolként szolgáltak. Három módszer teszteltük, beleértve az ismételt melegítési és fagyasztási ciklust, forró vízben és folyékony nitrogénben; a hő kezelést (+ 96 C fokon, 1 órán át); és a kiszárítást szobahőmérsékleten. III.1.6. Statisztika Az eredményeket összehasonlító variancia teszt (ANOVA), használatával hasonlítottuk össze, Windows Visual Basic, Microsoft programmal. P<0.05-t tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. 16

II.rész A vizsgálataink második részében következő kísérletek végeztük el (1) A véna homograftok kinyerésének és előkészítésének standardizálása után, három homograft csoport életképessége lett összehasonlítva: (a) azonnal cryopreservalt friss vénák; (b) 3 napos szöveti kultúra médiumban inkubált, majd cryopreservalt friss vénák (TCM); (c) azonnal cryopreservalt vénák, 3 napos újra-élesztési periódussal a mérés előtt. (2) (a) A megfelelő friss véna homograftok életképességét monitoroztuk 42 napig +4 C fokon TCM-ben való tárolás során, médium cserével vagy anélkül. E kísérlet célja a médium csere hatásának megbecsülése volt a véna homograftok életképességére. (b) Friss több-szerv donor csoport és maximum 24 órás ischémiás cadaver(holttest) csoport életképességi indexének összehasonlítása. (3) Friss véna allograftok médiumának ph monitorozása hűtött tárolása során TCM csere nélkül. Teoretikusan a ph mutatja metabolikus salak anyagok mennyiségét és jelzi a homograftok metabolikus intenzitását. (4) Kontrolok: negatív kontrolok preparálása. (5) Szövettani vizsgálatok Minden minta életképessége MTT méréssel lett értékelve 17

III.2.1. Véna allograftok cryopreserválása A kísérletre szánt véna biopszia darabokat kétféle módon cryopreserváltak. Először, amint a minták hozzáférhetővé váltak a kísérlethez, azonnal cryopreserválásra kerültek. Másodszor, 3 napos + 4 C fokos, X-Vivo 10 mediumban való tárolás után ugyan ezt az eljárást alkalmaztuk. Három véna biopszia darabot 1 ml X-Vivo 10 TCMes, 2 ml cryovial-ba (fagyasztó-csövecskébe) helyeztük. A mintákhoz, X-Vivo 10 médiumba cseppenként a fagyhatástól védő 20% DMSO (v/v; Sigma, St. Louis, Mo., USA) adagoltunk, hogy a végső 10%-os (1.4 M) DMSO koncentrációt érjük el a 2 ml-es médiumban. A biopszia darabokat 30 percig hagytuk kiegyenlítődni ebben fagyhatástólvédő oldatban, majd kontrolált fagyasztó Cryoson BU-10 (Forma Scientific) használatával percenként 1 C fokos hűtéssel +4-ről -40 C fokra hűtöttük. A fagyasztócsővecskéket folyékony nitrogént tartalmazó párologtatóba helyeztük és -170 C fok alatt tároltuk. A biopszia mintákat felolvasztás és életképesség vizsgálat előtt 2-től 4 hétig tároltuk. A cryopreservalt biopszia mintákat rövid idejű 37 C fokos vízbe való merítéssel olvasztottuk fel, míg a tartalmuk nem vált latyakossá. A nagymennyiségű fagyhatástólvédő oldatot fokozatosan lefejtve és helyettesítve friss, hűtött X-Vivo 10 médiummal távolítottuk el. E kezdeti hígítás után, a biopszia darabokat áttöltöttük nagy centrifuga csövekbe, ahol 10-15 ml X-Vivo 10 médium hozzáadásával tovább higult a fagyhatásvédő anyag. A minták legalább 30 percig voltak hígításnak kitéve az életképességi vizsgálatot megelőzőleg. Ezt követően a biopszia mintákon minden egyes donorból mérést végeztünk, mind a felolvasztás után azonnal, illetve egy újraélesztési inkubáció után is. Az inkubáció a homograftok 37 C fokos, 5% CO 2 -dal ellátott, 25 mm-es Petri csészébe X- Vivo 10 TCM tartalmú médiumba való alámerítésével történt 72 órán át. 18

III.2.2. Friss véna és holttestből(cadaverből) származó véna tartósítása 4 C fokos tárolás során Először, a vizsgálat első részében 20 donorból származó VSM-et használtunk fel. A vizsgálat ezen részének a célja a 4 C fokon tárolt friss véna allograftok életképességének vizsgálata volt egy bizonyos időtartam alatt, és a rendszeres médium csere hatásának meghatározása. Az allograftokat két azonos csoportra osztottuk és 100 ml TCM médiumban tároltuk 42 napig, + 4 C fokon. A tároló médiumot az első csoportnál minden másnap cseréltük, míg a második csoport, mint kontroll esetében cseréletlen maradt a vizsgálat során végig. Minden harmadnap a véna allograftok teljes falvastagságából kimetszett 4 mm-es biopszia mintákon életképességet vizsgáló mérés készült. Háromszorozott mintapéldányú biopsziákat vizsgáltunk minden egyes tesztkérdésben. Másodszor, két különböző módón nyert allograftok életképességi mutatóit hasonlítottuk össze. Az (a) csoportban, agy-halott több-szerv donorból lett 20 friss véna allograft kinyerve. Itt nem volt meleg ischémiás (vértelen) időszak az eltávolításig.. A (b) csoportban, holttestekből (cadaverek) lett a 20 véna allograft kivéve. A halál beállta utáni meleg vértelen (ischémiás) időintervallum az asystolia-tól az eltávolításig minden egyes donornál eltérő volt, 5-től 22 óráig terjedően. A hideg, ischémiás időintervallum (a kimetszéstől a laboratóriumba való szállításig a teszt elvégzéséhez) állandó volt. III.2.3. ph monitorozás A hosszú idejű hűtött tárolás során médium ph mérése 5 friss véna mintán történt zárt rendszerben. A rendszer teljesen steril ép allograftot tartalmazó, 100 ml X- Vivo 10 médimmal fedett, + 4 C fokon tárolt és antibiotikummentes volt. Sterilizált, kalibrált üveg ph elektród merült a médiumba (Orion, Boston, Mass., USA). A médium minden egyes esetben 42 napig érintetlen maradt. A ph leolvasása minden nap feljegyzésre került. 19

III.2.4.Negatív kontroll 10 véna minta szobahőmérsékleten való, 48 órán keresztüli kiszárítása szolgáltatta a negatív mintákat. Kontrasztként, felsőbb életképességi referencia értékként ebben a vizsgálatban 10 friss véna allograft szolgált. III.2.5.Vizsgálaton belüli és közötti variabilitás Kontrol vizsgálatok elvégzésével és statisztikai analízissel értékeltük mind a vizsgálatokon belüli, mind a vizsgálatok közötti variabilitást. Ezen kontrol vizsgálatok célja volt a potenciális méréshez-kapcsolható hatások vizsgálata, melyek számottevően beleszólhatnak a megfigyelt jel fluktuációiba a mérések során az idő múlásával. Mint összehasonlítható szövet, két holttest (cadaver) donorból származó, teljes-vastagságú bőr minták lettek kimetszve és tárolva ugyan olyan feltételekkel, mint a véna allograftok. Ezekből származó biopsziákat gyakori időközökben elvégzett MTT mérés segítségével értékeltük, és az adatok grafikusan százalékban kifejezett életképesség szerint ábrázoltuk az első méréshez képest (0. nap). Ezt követően, a + 4 C fokon tárolt friss véna minták és a duplikált fagyasztott minták, valamint a közel életképtelen emberi bőr milliliterenkénti, milligrammonkénti abszorpciója lett összehasonlítva, hogy megbizonyosodjunk vajon a reagenseknek, vagy más tényezőknek van-e számottevő hatása a fluktuációkra. A felolvasztást követően az azonos minta duplikált vizsgálatait végeztük el különböző mérési intervallumokban, úgy hogy az előzetesen cryopreservalt bőr allograftokat felolvasztottuk és megegyező biopsziákat (0.3 mm vastag, 4 mm átmérőjű) készítettünk. Egy adott donorból származó mintákat véletlenszerűen osztottuk szét fagyasztócsövecskékbe (fagyasztó-tubusonként 3 bőr mintadarab), melyek 10 %-os végső koncentrációjú DMSO-t tartalmaztak, 2 ml X-Vivo 10 médiumban. A fagyasztó-tubusok három példányban készült bőr biopsziákat tartalmaztak, melyek mind ellenőrzött fagyasztási rátával fagyasztottuk és folyékony nitrogén gőz fázisában tároltuk a tesztek elvégzéséig. 21 napos periódusban, minden alkalommal a minták MTT teszttel lettek ellenőrizve, a három példányban készült bőr mintákat tartalmazó fagyasztó-csövecskéket felolvasztottuk (37 C fokos vízfürdő) és egyidejűleg teszteltük. Itt mind a két véna és 20

bőr biopsziákat azonos időben és azonos reagenssel inkubáltuk megegyező feltételek között, ahogy azt korábban az MTT vizsgálat megbízhatóságának értékelésekor leírták. Az adatok statisztikai analízise t teszttel és F teszttel történt, amely a vizsgálaton belüli és közti variabilitását vizsgálja 80 donor esetében. III.2.6. Az életképesség tesztelése MTT vizsgálattal. Az eredményeket, a laboratóriumban az allograftok első napon (0-dik nap) mért értékeihez viszonyított MTT százalékos csökkenéseként prezentáltuk. Az eredményeket a nem specifikus háttér mátrix MTT csökkenésével korrigáltuk, kivonva a negatív kontroll értékeket. III.2.7 Szövettani vizsgálat A 4 C-on hideg anoxiában tárolt allograftok morfológiai változásait ill. az élletképes sejtek számát histológiai vizsgálattal kontrolláltuk. A kinyerést követően azonnal (0.-ik nap) ill. 42 nap tárolást követően elvégzett HE (haematoxilin eosin) festéssel történő szövettani vizsgálatokkal az eredményeinket hitelesítettük. 21

IV. Eredmények IV.1. MTT vizsgálat A véna homograftok produkálta vörös szín maximális abszorpcióját 0.1% (1mg/ml) koncentrációnál detektáltuk. Ezt a koncentrációt és inkubációs időt használtuk a rutin gyakorlatban (1. ábra). A véna homograftok súlya és a formazan produkció aktivitása között lineáris összefüggést találtunk. A maximális abszorpciót 563 nm-es hullámhosszon detektáltuk. MTT aktivitás különbőző ideig inkubált friss véna homograftok esetén Absorptio 563nm/mg/ml 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 1 óra 2 óra 3 óra 0,5 1 1,5 2 MTT koncentráció (mg/ml) 1. ábra MTT aktivitás friss véna homograftokban, különböző ideig inkubálva őket. 22

IV.2. MTT hasadás és enzim kinetikák karakterizálása A formazan pigment és ennek abszorpciója közt fennálló összefüggést meghatározva, a hasított MTT kvantitatív kalkulációja az adott MTT koncentrációból adódott. Ahogy a kettes ábrán látható, a l/v és l/s közt fennálló kapcsolat lineáris egészen 0.1% MTT koncentrációig, tehát a sejt mitokondriális enzimei, melyek hasítják az MTT-t követik a Michaelis kinetikát és lehetséges a kalkulációja mind a Michaelis állandónak (K m ) mind a reakció maximális sebességének. A görbe lejtője a K m /V max volt. Különböző egyenletekből a K m, V max és a sebességi állandó (V max /K m ) értékeit meghatároztuk, különböző donor homograftok használatával (1-es táblázat). K m ± SE (μm) V max ± SE (μm/sec) V max / K m ± SE (1/sec) 2085 ± 130 μm 196 ± 2.2 x 10-5 μm/sec -1 6.98 ± 0.2 x 10-7 1. táblázat.: MTT-t hasító enzim reakció jellemzője friss véna homograftokban.( SE Standard error) K m értéke hasonló a patkány lépsejt értékeihez (2,274 ± 302 µm), a reakció maximális sebesség 13-szor lassabb a véna homograftokban. 23

Az MTT enzim kinetikája friss véna homograftok esetén A sebesség reciproka: 1/v (sec M -1 ) 500 400 300 200 100 0 0,1% MTT 0 5 10 15 20 25 A szubsztrát koncentráció reciproka: 1/s (μm -1 ) 1. ábra: MTT hasítás enzim kinetikája friss véna homograftokban. A reakció első-rendű kinetikát követ 0.1 % (w/v) koncentrációig. IV.3. Festékek A kombinált festés jól elkülöníthető piros (halott) és zöld (élő) sejteket mutatott, erős háttérfestődés nélkül. A sejtek minden vagy semmi képen festődtek, így nem volt átmeneti szín piros és zöld között. Friss homograftokban az élő/holt arány 90/3 (97% élő) volt. A negatív kontrollban (szobahőmérsékleten kiszárított) lévő sejtek 100%-a pirosan festődött (0% élő), mutatva 8,6% MTT redukciós aktivitást (3. ábra). 24

Összefüggés az MTT százalékos normalizált értékei és a fluorescens festékekkel végzett sejtéletképességi vizsgálat között (r=0.99) 120 100 MTT százalékos normalizált értékei 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 120 Az életképes sejtek százaléka fluorescens festékekkel mérve 2. ábra.: Összefüggés az MTT %-os normalizált értékei és a fluoreszcens festésekkel végzett százalékos sejt életképességi vizsgálat között (r=0.99). A biopsziák fluoreszcens festéssel látott életképes sejtek növekvő %-a korrelált az MTT redukciós vizsgálat normalizált százalékos értékeivel. Az adatok hat MTT vizsgálat mérésének középértéke és egy érték a fluoreszcens festési módszernek eredménye. P=0.001. A vizsgálatok egymást hitelesítették. 25

IV.4.Negatív kontrollok Az ismételt melegítés-fagyasztás ciklus és a kiszárítás 96 C fokon magasabb jelet produkált (>150% relatív %), mint a friss ép véna homograftok, azonban a fluoreszcens festés halott sejteket mutatott. Úgy tűnik, hogy a magas hőfokú kezelés növeli a fals pozitív jelet ebben a reakcióban, ezért a melegítés nem megfelelő megbízható negatív kontrollok létrehozásához. A legalacsonyabb jel (8.6 ± 1.8 % relatív %) kiszárított mintáknál volt detektálható. A kombinált fluoreszcens festés 100%-ban halott sejteket mutatott minden fenti esetben. IV.5. Friss vénák és holttest(cadaver) homograftok hosszú-idejű 4 C fokos tárolása A homograft életképességeket értékelve, a mitokondriális MTT reductase aktivitás hosszú ideig kimutatható volt, jelezve a sejt túlélését in situ 4 C fokos tárolás során (3. ábra). Széles sávú fluktuáció volt megfigyelhető az egymást követő homograftok életképesség mérési eredményei között az idő múlásával. Ezek a periodikus fluktuációk csökkentett amplítudót és frekvenciát mutattak a 6 hetes megfigyelési periódus során ( 3, 4. ábra). Ez a fluktuációs jelenség minden egyes mért minta estén megfigyelhető volt (n=70). Mindazonáltal minden homograft szövet mutatott fluktuációkat, időben az első mérés csúcs értéke variálódott. Ezért összehasonlító célból, néhány grafikon esetében az első csúcs értékét normalizáltuk az idő nullpontjaként, ezzel a fluktuációk periodikusság az egyedi donorok esetében összehasonlíthatóvá vált. 3-as ábra néhány 4 C fokon tárolt allograft normalizált adatait mutatja az idő függvényében. Alaposan vizsgáltuk a mérésbeli fluktuáció potenciális külső okait, mint például médium csere, hőmérséklet, biopszia helyének lokalizációja és a tetrazolium vizsgálat reagenseinek öregedése. Ezen becslések a fluktuáció biológiai eredetének valószínűségét jelzik. Nem volt jelentős különbség az életképességi indexben a médium cserét és nem cserélt minták esetében. 26

Különböző donorok életképesség vizsgálatai a b c d e 120% Normalizált életképesség százalék (friss véna=100%) 100% 80% 60% 40% 20% 0% 1. 5. 9. 13. 17. 21. 25. 29. 33. 37. 41. Tárolási idő (nap) 3. ábra.:a véna allograftok életképességi vizsgálatai különböző donorokból, médium csere nélküli tárolással, MTT életképességi tesztvizsgálat alapján. Minden esetben (n=70), fluktuáció volt megfigyelhető, ami fokozatosan csökkent amplítudóban és frekvenciában 27

Egy adott donorból származó véna allograft szövetének normalizált százalékos életképességi vizsgálatai nem cserélt medium cserélt 120% Normalizált életképesség (friss véna=100%) 100% 80% 60% 40% 20% 0% 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 Tárolási idő (nap) 4. ábra.:egy adott donorból származó véna allograft szövetének normalizált százalékos életképességi fluktuációi. A médium cserélt és nem cserélt minták életképessége közt nem volt különbség. 28

Az agy-halott többszerv-donorokból és holttest(cadaver) donorokból származó véna homograftok között sem volt életképességbeli különbség megfigyelhető (5. ábra). A ph mérés szerint a médium konstansan 7.2 maradt a 42 napos, 4 C fokos tárolás során. A hűtött környezet hőmérsékletének monitorozása állandó hőmérsékletet mutatott (kevesebb, mint 2 C fokos fluktuáció). Az MTT vizsgálat megbízhatóságát a véna allograftok életképességének a két eltérő típusú kontroll mintákkal való összehasonlítása alapozta meg. Először, a friss véna mintákat hasonlítottuk össze az idővel fokozatosan csökkenő életképességű bőr allograftokkal (6, ábra), másodszor fagyasztott emberi bőr kontroll biopsziák konstans életképességét,hasonlítottuk össze a véna homograftokon fluktuációt mutató életképességével,melyet grafikusan ábrázoltunk. (6, ábra). Azokban az esetekben is, amelyekben, ugyanazon eredetű reagenst használtunk, a bőr életképesség konstans maradt, míg a véna metabolikus aktivitása periodikus fluktuációt mutatott (6 ábra). Az adatoknak, az összevont (pooled) minták közötti F statisztikai teszt használatával végzett statisztikai analízise (megfigyelt érték: 14.9, d.f. számláló=502,d.f. nevező=754, p<0.001) azt mutatta ki, hogy az életképességbeni fluktuációk speciálisan véna allograftokra jellemzőek. Ez a teszt megállapítja, vajon a napokon belüli mérési folyamat precizitása relatíve nagy a napról napra végzett eljárás variábilitásához képest. Ezek az adatok jelzik, hogy az életképességen belüli fluktuációk nem kizárólagosan az adott napon végzett mérések variábilitásának tudható be; hanem egy sajátos belső funkciónak tulajdoníthatóak. 29

Különböző tárolású allograft csoportok százalékos életképességi értékeinek öszzehasonlítása Friss (nap) A csoport n=20 B csoport n=20 1,2 Normalizált százalékos életképesség (friss véna=100%) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Friss (nap) A csoport n=20 B csoport n=20 5. ábra.: Különböző tárolású allograft csoportok normalizált százalékos életképességi értékeinek az összehasonlítása: O. nap = friss véna allograftok; A csoport = agy-halott többszer donorokból származó véna allograftok; B csoport = 4 C fokon, 42 napig tárolt véna allograftok holttest(cadaver) donorokból. Nincs szignifikáns különbség a csoportok között a 42 napos tárolás után. 30

IV.6.Cryopreservalt homograftok A 0-dik napon cryopreservalt allograftok életképessége csak 59.7 ± 2.1 %- a (± a középérték standard hibája) volt az eredeti, 0.-dik posztmortem nap (friss holttest) életképességi értékének (7. ábra). Ezen minták és a cryopreservalt, illetve a cryopreservatiot megelőző 3 napos, + 4 C fokon való TCM-ben inkubált minták életképességében különbség nem volt megfigyelhető (59.2 ± 1.9 %-a a 0.-dik nap értékének). Szintén nem volt jelentős életképességbeli különbség a cryopreservalt véna minták között, melyek 30 perc és 1 órával a felolvasztás után lettek mérve és azok közt melyek 3 napos felélesztési periódusnak lettek kitéve TCM-ben 37 C fokon a mérést megelőzőleg (58.7 ± 1.6 %). Friss véna allograftok elérték ugyanazon életképességbeli szintet (58.9 ± 1.2 % SE) + 4 C fokon, 42 napos tárolás után, mint amit a fagyasztva-tartósított vénák esetében általában megfigyelhető.medium cseréket vizsgálva a hűtött formában tárolt allograftok 59.7-58.9 %-ban őrizték meg életképességüket a 0.-dik napon mért mérésekhez képest ( n=16 nem-cserélt médiumban, n=14 cserélt médiummal), értelemszerűen (7. ábra). Ezek a statisztikai analízisek kétmintás t teszttel lettek elvégezve. Kontroll kísérletek a fluktuáció külső okainak vizsgálatára. a Véna homograft minta és egy adott holttest donor friss bőr mintája, (mely 21 napig 4 C fokon együttesen volt tárolva), MTT életképességi tesztvizsgálatainak sorozata grafikusan ábrázolva. b A fagyasztott bőr életképességi indexe relatíve állandó maradt, míg a véna allograft életképességi indexe ismét fluktuálódott. 31

Egy adott holttest donor friss bőrmintájával történő összehasonlító életképességi vizsgálat Véna allograft Bőr Normalizált % életképesség (friss =100%) 200% 150% 100% 50% 0% 0. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. Tárolás ideje (nap) Egy adott holttest donor fagyasztott bőrmintájával történő összehasonlító életképességi vizsgálat Életképességi index 30 25 20 15 10 5 0 Véna allograft Bőr (fagyasztott) 1. 3. 5. 7. 9. 11. 13. 15. 17. 19. 21. Tárolási idő (nap) 6. ábra.: Kontroll kísérletek a fluktuáció külső okainak vizsgálatára. a Véna homograft minta és egy adott holttest donor friss bőr mintája, (mely 21 napig 4 C fokon együttesen volt tárolva), MTT életképességi tesztvizsgálatainak sorozata grafikusan ábrázolva. b A fagyasztott bőr életképességi indexe relatíve állandó maradt, míg a véna allograft életképességi indexe ismét fluktuálódott. 32

Friss, cryopreservált és 4 o C fokon tárolt véna graftok életképességi vizsgálatainak összehasonlítása Normalizált %.-os életképesség (friss véna=100%) 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% Friss (nap 0.n=70) Cryopreserált n=26 Cryo. 3 nap n=18 Cryo. inkubált n=23 Media cserélt n=14 Nem cserélt n=16 7. ábra.: Friss, cryopreservalt (fagyaszva tartósított) és 4 C fokon tárolt véna allograftok életképességi vizsgálatának összehasonlítása. Friss = friss véna homograftok; Cryopreservalt = fagyasztva-tartósított véna allograftok a 0.-dik napon, Cryopreservált: 3 napos tárolás utáni fagyasztva-tartósított véna allograftok; Cryo. inkubált = 0.-dik napon fagyasztva-tartósított allograftok, melyeket utána felolvasztottuk és inkubáltuk 72 órán át 37 C fokon X-Vivo 10 médiumban a vizsgálatot megelőzőleg; Media cserélt Nem cserélt + 4 C fokon, 42 napig tárolt allograftok médium cserével és anélkül. A fagyasztva-tartósított csoportok között nem volt szignifikáns különbség. IV.7 Szövettani vizsgálatok 33

Jól tudjuk, hogy a morfológiai destrukció már a sejthalál késői fázisában következik be, ezért nem alkalmas a hisztológia életképességi tesztre, de eredményeink jól korreláltak az életképességi vizsgálatokkal. A 0.-dik napon az allograftok a tárolás megkezdése előtt normál szövettani és sejt morfológiát mutattak. (8, 9 ábra). 42 napos hideg anoxiában, TCM.-ben történt tárolást követően az érfal szerkezete ugyan fellazult, de még így is 60 % feletti az életképes sejtek száma és az érfal rétegeinek degeneratioja sem számottevő (10-12 ábra) 8. ábra: Teljes falvastagságú friss véna allograft képe a tárolási eljárás kezdetekor ( 0. nap, HE festés). Morfológia ill. sejtsruktúra ép (40x nagyítás) 34

9. ábra Normál sejtmorfológia a 0.-ik napon az allograftok hideg anoxiában TCM.-ben történő tárolásának megkezdésekor. (60x nagyítás, HE) 35

10. ábra: Érfal keresztmetszete 42 napos hideg anoxiában történt tárolást követően. Az érfal rétegei fellazultak, de intaktak. (40y nagyítás, HE) 11. ábra: Az életképes sejtek száma 60% feletti 42 napos tárolást követően. Az érfal szerkezete megtartott. (60 x nagyítás,he) 36

12. ábra Az érfal szerkezete fellazult, de az ép sejtek száma magas (80x nagyítás HE) 37

V. THESISEK 1. Az MTT kolorimetriás életképességi vizsgálat kiválóan alkalmazható a homograftok esetében. A vizsgálat egyszerű, nem drága és reprodukálható. 2. MTT reduktáz enzimreakció követte a Michaelis kinetikát egészen a 0.1%-os koncentrációig 3. A 42 napon a +4 C fokon tartott véna allograftok hasonló életképességet mutattak a cryopreservalt vénákkal. 4. Friss cadaverből (24 órán belül elhunyt) illetve multiorgan donorból fresh graft eljárással nyert homograftok in vitro életképesség vizsgálata hasonló eredményt mutatott 5. A medium cseréknek nem volt értékelhető hatása a véna homograftok sejtéletképességeinek változásaira 38

VI. Diszkusszió VI.1. MTT vizsgálat Az MTT használata kolorimetriás vizsgálatban magas érzékenységet mutat, gyors, olcsó és reprodukálható eljárást kínál, mely jól használható a véna homograftok életképességének indikátoraként. A vizsgálat mitokondriális enzimaktivitáson alapszik, mely kulcsfontosságú sejtfunkció és érzékeny minden káros hatásra függetlenül a sejtciklus állapotaitól. Az optimális koncentráció megegyezett a korábban közöltekkel, de az inkubációs idő rövidebb volt [25, 27, 35]. Az MTT formazan pigment oldása ph érzékeny reakció, ezért az oldószer ph-ja 5.0 alatt kell, hogy legyen, különben fals adatok keletkezhetnek. Az MTT vizsgálat során 8.6% nem-specifikus aktivitás volt detektálható, mely főleg a fehérjéknek köszönhető eredmény [36, 40]. Fluoreszcens festés összehasonlításával ez kimutatható volt, mikor halott sejtek nem voltak láthatók. Hasonlóan, a magas fals pozitív jelet indukáló intenzív hő kezelés nem volt megfelelő negatív kontrollok létrehozására ebben a vizsgálatban. Az MTT reduktáz enzimreakció követte a Michaelis kinetikát egészen 0.1%-os koncentrációig, magasabb koncentrációk esetén progresszív sejt halál volt detektálható. Enzim reakció karakterizálásával 6.98 ± 0.2 X 10-7 s -1 a sebességi állandót kalkuláltuk. A Michaelis állandó hasonló más sejtekéhez [19] (2,805 ± 130 µm), míg a maximális sebesség 196-2.2 X 10-5 µm/s volt a véna homograftok esetében. Fluoreszcens festékek használatával jó minőségű kép produkálható erős háttér nélkül. Mivel a festék felvétele és sejtből való kizáródása függ a membrán integritástól. A festési módszer teoretikusan kissé alábecsüli az élő sejtek számat a szekció felszínén, a metszés okozta károsodás miatt, de ennek aránya nem túl magas. A fluoreszcens festési módszer hitelesíti az MTT vizsgálat eredményeit, így tehát e módszerek alkalmasak a véna homograftok életképességének megbecslésére. Indítványozzuk, hogy e módszer használható legyen különböző gyógyszerek, az ischémia hatásának a vizsgálatára, a homografttárolásra és különböző cryopreserváló eljárások összehasonlítására végzet homografttanulmányokhoz. A legfőbb hátránya ennek a módszernek a direkt korreláció hiánya a transzplantáció-utáni életképességgel, 39

valamint nem jelzi a prezerváció graft integritására gyakorolt hatását. Mindezen korlátok ellenére, az MTT teszt gyors és prediktív tesztnek tűnik a véna homograftok életképességének megbecsülésére in vitro körülmények között VI.2. Prezerváció Az elmult évtizedekben igazolódott,hogy a véna homograftok megfelelően helyettesítik az autológ vénákat a kritikus végtagi ischémia eseteiben illetve a szeptikus helyreállító érműtétekben. [3, 4,5]. A vénás allograftokkal történő rekonstrukciók korai eredményei kitűnőek. [9,10,11]. Azonban a hosszú-távú eredmények csalódást okoznak, a késői graft degenerációk miatt. Kimutatott, hogy az életképes sejteket a tartósítási folyamat során vesztik el. Néhány faktor felelős a véna homograftok ezen sejtjeinek elvesztésért. A tartósító szerek toxocitása, különösen a hozzáadott antibiotikumok, a cryopreservációs folyamat, spontán sejthalál és végül a túlélő sejtek destrukciója, melyet az immonológiailag kompetens gazda sejtek életképes sejtekre kifejtett pusztító hatása eredményez. Hasonló károsodást okozhat az immunhisztokémiai vizsgálatokkal igazolt Chlamydia pneumoniae jelenléte is mely ez érfal összes rétegének destrukciójához vezet.[45, 46]. A homograft hosszú távu átjárhatóságának javítása érdekében az életképes sejtek degenerációjának megelőzése, a sejtek életben tartása döntő fontosságúnak tűnik. Sajnos a MTT teszt nem alkalmas szelektíven az endothel életképességének a vizsgálatára. Azonban az endothel integritásának a megőrzését még semmilyen prezervációs eljárással nem sikerült biztosítani.az endothel csak az azonnali friss graft beültetéseknél marad intakt.a máj és vesetranszplantáció eseteiben ez alapvető fontosságú [47, 48]de a homograftok eseteiben véleményem szerint és itt az irodalom sem egységes más a helyzet.a homograftok szerencsére immunológiailag nem annyira aktívak így beültetés előtt nem kell HLA azonossságra törekedni és utána sem szükséges immunszupresszió, kizárólag a vércsoportazonosságot tartják döntőnek. Nehéz lenne a betegbeválasztás a homograftok eseteiben ha az endothel integritását minden áron meg szeretnénk őrizni, hiszen a homograftkivételt követően azonnali beültetésre van szükség. Bármilyen tartósító eljárás az endothel károsodásához, leépüléséhez vezet. Beültetést követően az endothel antigenitása a döntő, mivel a 40

vércsoportantigének itt tapadnak. Ezen immunológiai okok miatt kilökődik, helyette neoendothel saját sejtekből képződik mely immunológiailag semleges. Véleményem szerint és az irodalom erre vonatkozó adataira hivatkozom, a homograft beültetéseknél fontosabb a media és az adventitia integritása. E két réteg szolgál graftként addig amíg a neoendothelképződés befejeződik. Az ér mindhárom rétegének a megfelelő életképessége a döntő fontosságú a transzplantáció sikere szempontjából. Az MTT teszt ennek megítélésére tökéletesen alkalmas Véna allograftok cryopreserválása, a homograftokok szervbankokban történő elhelyezése az általánosan elfogadott módszerek szerint kevesebb, mint 60 %-os sejt túlélést eredményez. Azon próbálkozások, hogy javítsuk a cryopreservalt vénák életképességét kedvező szövet kultúra médiumokkal a fagyasztás okozta sérülés után, nem vezetett eredményre. Azok a véna allograftok, melyeket +4 C fokon, 42 napig tároltunk hasonló életképességet mutattak, mint a legjobb cryopreservalt minták. A 6- hetes tárolási idő elegendőnek bizonyult a graftok méret szerinti csoportosításához, kiterjedt donorszűréshez, a megfelelő tároláshoz, mikrobiológiai értékeléshez és a szövet-bankban történő elhelyezéshez továbbbá a transzplantációhoz szükséges időigényes követelményhez. Steril tápláló médiumban való tárolás a homograftok mitokondriális aktivitásának fluktuációját váltotta ki. Ezt a médium által kifejtett metabolikus stimuláció eredményezhette. Nem volt különbség az életképességi indexekben a cserélt és a nem cserélt médiumban tárolt minták között. Ez az eredmény mutatja, hogy az allograft médiumhoz viszonyított mennyisége megfelelő volt és a metabolikus salakanyagok nem játszottak fontos szerepet az életképesség időbeli elvesztésében. Ezt az álláspontot szintén támogatja az a megfigyelés, hogy a ph érték változatlan a nem cserélt médiumban tárolt minták esetében a 42-napos tárolás során. E megfigyelés fontos a szövetbankok tárolási gyakorlatában, mert a médium cserélésének az elhagyása a tárolás során megszünteti a baktériummal való fertőzés problémáját. Az agyhalott többszerv donorokból és maximum 24 órás ischémiás idejű holttestekből származó minták között nem volt életképességbeli különbség megfigyelhető a 42 napos tárolás során. Úgy tűnik, hogy a viszonylag rövid idejű ischémia nem okozhat irreverzibilis károsodást az életképes sejteknek. 41