Véna homograftok életképessége szövetbanki tárolás során

Átírás

1 Véna homograftok életképessége szövetbanki tárolás során PhD Thesis Dr Galambos Barnabás Témavezető: Prof. Dr Nemes Attila Semmelweis Egyetem Doktori Iskola II Klinikai Tudományági Doktori Iskola Budapest Szigorlati bizottság: Prof. Dr. Füst György, Dr. Gyűrűs Péter, Dr. Lotz Gábor Hivatalos bírálók: Dr. Entz László, Dr. Gyűrűs Péter 1

2 Tartalomjegyzék 1.Bevezetés 3. 2.Vizsgálat célja 3. 3.HipothesisekI 4. 4.Anyagok és módszerek 4. 5.Eredmények Konklúzió: Megbeszélés A homológ értranszplantatio klinikai alkalmazása 6. 9.Thezisek Köszönetnyilvánítás Publikációs lista 8. 2

3 1. Bevezetés A rekonstruktív verőérműtétek többsége graft implantációt igényel. A felhasznált graftok a femoro-infragenuális bypasshoz használt autológ véna mellett - nagy költségű műanyag prothesisek..a megnövekedett élettartam, a helyreállító érműtétek nagy száma miatt a betegek harmadának nem lesz megfelelő saját vénája rekontsruktív érműtét elvégzése céljára.autológ anyag helyettesítésére a homograftok kiválóan alkalmazhatóak. Kórházunkban a viszonylag nagy számban előforduló szervdonáció, a Szövetbank eszközállománya, magas szintű tárgyi és szakmai felkészültsége, valamint a regionális feladatokat is ellátó érsebészet nagyszámú beteganyaga, szakmai készültsége teszi lehetővé homograftok nyerését, tárolását és implantálását, a bevezetett új módszerrel kapcsolatos tanulmányok, kutatások (pl.: sejtéletképesség összehasonlító vizsgálat) elindítás 2.A vizsgálat célja A methyl tetrazolium teszt(mtt) szín erőssége arányos a mitokondriális enzim aktivitással, mely a celluláris életképességet jelzi. A cél az MTT teszt értékelése volt, mint életképesség vizsgálat a véna homograft kísérletekhez.kutatásaink első részében egy új költség hatékony,gyors,effektív,könnyen reprodukálható és megbízható életképességi vizsgálat kifejlesztése vált szükségessé amely könnyen alkalmazható a homografttokhoz..kutatásaink második szakaszában.in vitro össze kívántuk hasonlítani az eddig konvencionálisan és rutinszerűen alkalmazott cryoprezerváció hatását az erek életképességére egy új konzerválási eljárással (+4 C tárolás szövetkultúra médiumban). In vitro vizsgáltuk friss cadaverből (24 órán belül elhunyt ) ill. agyhalott többszerv donorból kivett erek életképességét a két különböző konzerválási eljárással. 3

4 3.Hipothesisek 1. Methyltetrazólium kolorimetriás életképességi vizsgálat alkalmazható-e a homograftok esetében 2. Első vagy másod rendű enzim kinetikát követ a methyltetrazólium lebontása 3. Mikor éri el a +4 C.-on, hideg anoxiában hosszú ideig tárolt véna homograft azt az életképességi szintet amit a cryoprezervált allograftoknál megtalálható volt 4. Van-e különbség a különböző módon nyert véna allograftok életképességei között agyhalott, több szerv donorokból (nincs ischaemiás idő) cadaverekből ( max. 24 h.-ja tartó, ischamiás periódus) 5. A rendszeres médium cseréknek van-e szerepe az életképesség változásaiban a különböző módon nyert véna homograftok között 4. Anyagok és módszerek A friss véna mintákat többszerv kinyerés során gyűjtöttük be. Az MTT teszt megbízhatóságát fluoreszcens festék kombinációval (1 µg/ml jód propidium PL és 4 µg/ml SYTO-16 festékekkel) teszteltük. A reakció enzimkinetikáját szintén vizsgáltuk. A reagens koncentrációt, a biopszia méretét és az inkubációs időt optimalizáltuk.vena saphaena magnaból származó szövettani mintákat (biopsziákat) cryopreservaltunk és a mintákat két megegyező csoportra osztottuk és tároltuk szövetkultúra médiumban 42 napig, +4 C fokon, mind szokásos médium cserével mind anélkül. Minden egyes véna allograftból harmadnaponta vett minták életképességét methyltetrazolium redukciós vizsgálattal ellenőriztük. Mind agy-halott többszerv-donorokból mind holttestekből, - melyek meleg vértelen (ischaemiás) ideje maximum 24 óráig tartott - származó véna allograftok életképességének mutatói összehasonlításra kerültek. 4

5 5. Eredmények A véna homograftok súlya és a pigment produktumok aktivitása között lineáris összefüggést találtunk. A nem-specifikus reakció (8.6%) volt megfigyelhető a kontroll mintákban. Az MTT hasadás egészen 0.1 %-ig (w/v = súly/térfogat %) követte a Michaelis kinetikát. A Michaels állandó (2,805 ± 130µM), a maximális sebesség (196 ± 2.2 X 10-5 µm s -1 ) és a sebességi állandó (6.98 ± 0.2 X 10-7 s -1 ) kiszámolható volt. Az életképességet a fluoreszcens festékek egyidejűleg vizualizált élő/holt sejtek arányával értékeltük, melyet képanalizáló software segítségével kalkuláltunk. A 42 napig, +4 C fokon tartott véna allograftok hasonló életképességet mutattak (58.9 ± 1.2 %) a cryopreservalt vénákkal (59.7 ± 2.3 %). Ez igaz volt még akkor is, amikor a cryopreservalt és felolvasztott allograftok 3 napos felolvasztás-utáni inkubációnak voltak kitéve, kifejezetten kedvező kondíciókkal (58.7 ± 1.6 %). Nem volt életképességi indexbeli különbség a médiummal cserélt és nem cserélt minták között, valamint a két különböző donor csoportból gyűjtött anyagok között. 6. Konklúzió: Kolorimetriás mérésekben az MTT használata nagy érzékenységet mutat.. A vizsgálat egyszerű, nem drága és reprodukálható a véna homograftok tanulmányozásában. Véna allograftok +4 C fokon való huzamosabb idejű tárolása értékes módszer a szokásos szövetbanki gyakorlatban. Elegendő mennyiség beszerezhető holttestekből, hasonlóan szöveti donorokhoz. 5

6 7.Megbeszélés A felnőttekben használatos érhomograftok használata az elmúlt évtizedekben terjedt el, elsősorban a fejlődő cryopreservációs módszerek, másodsorban a szaporodó érsebészeti tapasztalat és kitolódó életkor miatt. A cryoprezervációs módszer ismert, de a konzerválás folyamán elszenvedett életképesség csökkenés túl nagy, így annak növelése megoldandó. Friss cadaverből ( 24 órás exit ) illetve multiorgan donorból fresh graft eljárással nyert homograftok in vitro életképesség vizsgálata egyedülálló, szakirodalomban ezzel kapcsolatos dokumentáció nem állt rendelkezésre 8. A homológ értranszplantatio klinikai alkalmazása In vivo össze kívánjuk hasonlítani az eddig konvencionálisan és rutinszerűen alkalmazott cryoprezerváció hatását az erek életképességére egy új konzerválási eljárással (+4 C tárolás szövetkultúra médiumban). Az eredménytől függően az így konzervált érallograftokat klinikailag implantáljuk, megfelelő indikációk fennállása esetén. Az hűtve hideg anoxiában tárolt allograftok felhasználásával egy hatásos és költséghatékony terápiás eljárást kívánunk bevezetni szélesebb körben. 6

7 9.Thézisek 1. Az MTT kolorimetriás életképességi vizsgálat kiválóan alkalmazható a homograftok esetében. A vizsgálat egyszerű, nem drága és reprodukálható. 2. MTT reduktáz enzimreakcio követte a Michaelis kinetikát egészen a 0.1%-os koncentrációig 3. A 42 napon a +4 C fokon tartott véna allograftok hasonló életképességet mutattak a cryopreservalt vénákkal. 4. Friss cadaverből ( 24 órás exit ) illetve multiorgan donorból fresh graft eljárással nyert homograftok in vitro életképesség vizsgálata hasonló eredményt mutatott. 5. A medium cseréknek nem volt értékelhető hatása a véna homograftok sejtéletképességeinek változásaira 10.Köszönetnyilvánítás: Értekezésem elkészítése a,doktori képzéshez történő csatlakozás,a doktori iskola sikeres elvégzése miatt rendkívüli köszönettel tartozom Nemes Attilának és Acsády György professzor uraknak.a kísérletes és klinikai kutatómunka sikeres elvégzése nem jöhetett volna létre a győri Petz Aladár Megyei Kórház Érsebészeti osztálya és a Nyugat-Magyarországi Regionalis Szövetbank segítsége nélkül,külön megköszönve kollégáimnak Tamás László és Csönge Lajos főorvos uraknak továbbá Zsoldos Péter és Banga Péter kollégáimnak a pótolhatatlan segítségét és biztatását az évek hosszú sora alatt.külön köszönöm Boros Mihály és Olah Attila professzor uraknak a munkám megjelentetésében nyujtott segítségét.. 7

8 11.Saját témával kapcsolatos közlemények jegyzéke Eredeti közlemények 1.B.Galambos, L.Tamás, P.Zsoldos,,T.Czigány,L.Jakab,J.Németh,L.Csönge:Vascular injuries in everyday practice, Zenterblatt für Chirurgie 2004;129: B.Galambos.L.Csönge,A.Olah,R.von Versen,L.Tamás,P.Zsoldos: Quantitative of viability,eur.sur.res.2004; B.Galambos,L.Csönge A.Olah,R.von Versen,L.Tamás,P.Zsoldos :.Preservation of fresh vein homogarfts viability during long term storage Eur.Sur.Res.2005;37: B.Galambos,L.Tamás,P.Zsoldos,T.Czigány,L.Jakab:Tapasztalatok és eredmények a végtagi érsérülések ellátásában,magyar Sebészet;2005 közlésre elfogadva Abstraktok : 1.B.Galambos,T.Gunther,T.László Experience and results of the treatment of infected vascular grafts;cardiovascular Surgery,Suppl. 2 ESCVS 50nd congress 2000 abstracts 2.B.Galambos,T.Gunther.L.Tamás,T.Czigány,L.Jakab,J.Németh;Tapasztalatok és eredmények az érsebészeti prothezisgenyedések sebészi kezelésében;érbetegségek Suppl.2 Fiatal angiológusok országos fóruma abstract B.Galambos,L.Tamás,P.Zsoldos,T.Czigány,L.Jakab;Vascular injuries in everyday practice;zntr.chir. suppl.3 asbtract ESS 64nd congress2001 B.Galambos,L.Tamás,P.Zsoldos,T.Czigány,L.Jakab;Vascular injuries in everyday practice 4.Cardiovascular surgery ESCVS 52nd Congress abstract Suppl.2 Vol:11 5.B.Galambos,L.Tamás,P.Zsoldos,T.Czigány,L.Jakab:Tapasztalatok és eredmények a supraaortikus erek sebészeti kezelésében:érbetegségek Suppl B.Galambos,L.Tamás,P.Zsoldos,T.Czigány,L.Jakab:Homograftok életképességvizsgálata MTT teszttel;magyar sebészet Suppl

9 7.B.Galambos.L.Csönge,A.Olah,R.von Versen,L.Tamás,P.Zsoldos: Quantitative of viability,eur.sur.res.2004 Athen suppl. 8.B.Galambos,L.Csönge A.Olah,R.von Versen,L.Tamás,P.Zsoldos :.Preservation of fresh vein homogarfts viability during long term storage Eur.Sur.Res.2004 Arhen suppl B.. 9.B.Galambos.L.Csönge,A.Olah,R.von Versen,L.Tamás,P.Zsoldos: Quantitative of viability;cardiovascular surgery 2004 ESCVS 53nd suppl.ljubljana 10.B.Galambos,L.Csönge A.Olah,R.von Versen,L.Tamás,P.Zsoldos :.Preservation of fresh vein homogarfts viability during long term storage ;Interactive thoracic surgery,2005 Athen suppl. Előadások 1.B.Galambos,T.Gunther.L.Tamás,T.Czigány,L.Jakab,J.Németh;Tapasztalatok és eredmények az érsebészeti prothezisgenyedések sebészi kezelésében Fiatal Angiol.Orsz.; Balatonkenese; 2000 Balatonkenese; Előadás fődij 2.B.Galambos,T.Gunther,T.László Experience and results of the treatment of infected vascular grafts;. ESCVS 50nd kong.; 2000 Budapest; 2poszter 3.B.Galambos,L.Tamás,P.Zsoldos,T.Czigány,L.Jakab;Vascular injuries in everyday practice ESS 64nd congress; 2001 Budapest; Előadás fődij 4.B.Galambos,T.Gunther,T.László Experience and results of the treatment of infected vascular grafts;. Fiatal sebészek angol; MST fiatal; 2001 Budapest; előad 5.B.Galambos,T.Gunther.L.Tamás,T.Czigány,L.Jakab,J.Németh;Tapasztalatok és eredmények az érsebészeti prothezisgenyedések sebészi kezelésében Fiatal seb. magyar; MST; 2001 Budapest; e 6.B.Galambos,L.Tamás,P.Zsoldos,T.Czigány,L.Jakab;Vascular injuries in everyday practice ESCVS 52ndév; 2003 Isztambul; 2 előad. 7.B.Galambos,L.Tamás,P.Zsoldos,T.Czigány,L.Jakab:Tapasztalatok és eredmények a supraaortikus erek sebészeti kezelésében ; MAÉT; 2003 Szeged; poszter 9

10 8.B.Galambos.L.Csönge,A.Olah,R.von Versen,L.Tamás,P.Zsoldos: Quantitative of viability CEVF; Central Eur. Vasc. For; 2004 Dubrovnyik; poszter 9.B.Galambos.L.Csönge,A.Olah,R.von Versen,L.Tamás,P.Zsoldos: Quantitative of viability Eur.Soc. of. Surg.Res.; ESSR 52 kongr.; 2004 Athen; poszter 10.B.Galambos.L.Csönge,A.Olah,R.von Versen,L.Tamás,P.Zsoldos: Quantitative of viability ESCVS; ESCVS éves kong; 2004 Ljubljana; Dos Santos dij előad 11.B.Galambos.L.Csönge,A.Olah,R.von Versen,L.Tamás,P.Zsoldos: Quantitative of viability ISMS; Intern.Soc. of microrosurg.; 2004 Debrecen; poszter 12.B.Galambos,L.Tamás,P.Zsoldos,T.Czigány,L.Jakab:Homograftok életképességvizsgálata MTT teszttel MAÉT; MAÉT éves; 2004 Pécs; poszter 10