9. Szilárdfázisú szintézisek oligopeptidek, oligonukleotidok
Peptidszintézis Amidkötés kialakítása R H + H 2 Q R Q + H 2 H R H + H 2 Q R + H 3 Q sav-bázis reakció már nem nukleofil
Amidkötés kialakítása A karbonsavat aktiválni kell R X + H 2 Q R H Q + HX X = jó távozó csoport X = klorid, anhidrid, aktív észter
Dipeptid szintézis H 2 CH C H H 2 CH C H CH 3 H Alanin Glicin C ezeket összekeverve és aktiválószert hozzáadva Ala-Ala; Ala-Gly; Gly-Gly; Gly-Ala Az Ala-CH reagáljon az H 2 -Gly- vel Az H2-Ala és Gly-CH inert legyen védõcsoportok
Védőcsoportok -terminális és amino-védőcsoportok (a teljesség igénye nélkül) tercier-butil-oxi-karbonil (Boc) savra érzékeny pl. trifluorecet sav (TFA) fluorenil-metil-oxi-karbonil (Fmoc) bázisra érzékeny pl. piperidin
Védőcsoportok C-terminális és karboxil-védőcsoportok H tercier-butil-észter (tbu) savra érzékeny pl. trifluorecet sav (TFA) H benzil-észter (Bn) H 2 / Pd / C
Védőcsoportok Egyéb, oldallánc-védőcsoportok (Cys, Tyr, Ser, Thr) Trifenil-metil (Tritil, Trt) savra érzékeny pl. trifluorecet sav (TFA) benzil (Bn) tercier-butil (tbu) H 2 / Pd / C savra érzékeny pl. trifluorecet sav (TFA)
-CH aktiválás Aktív észterré alakítás (in situ)
-CH aktiválás Aktív észterré alakítás (in situ) Átészterezés hidroxibenztriazol okkal (kevesebb racemizáció)
Aktiválás a gyakorlatban karbodiimid + triazol együtt DCC DIC EDC (EDAC)
ldatfázisú vs. Szilárdfázisú szintézis oldat lcsóbb Homogén agyobb mennyiségekre, rövidebb peptidekre Lassú em automatizálható szilárd Drága, pazarló Heterogén Kisebb mennyiségre, hosszabb szekvenciákra Gyors Könnyű tisztítás automatizálható
Szilárd hordozók (gyanták) Két fő technika (Fmoc/tBu; Boc/Bn) Boc/Bn : Merrifield gyanta (polisztirol / divinil benzol) Fmoc/tBu : Wang gyanta (p-hidroxibenzil alkohol / polisztirol) egyéb gyanták : amid végű, hasíthatóság stb.
Szilárd hordozók (gyanták) Stabil legyen, kémiailag ellenálló Duzzadóképesség jól átjárható legyen Az első aminosavat rá lehessen kapcsolni A szintézis végén le lehessen hasítani
Az első aminosav kapcsolása Eltér a többitől (lánchosszabbítás) A CH-csoporton keresztül történik A szilárdfázisú peptidszintézis során C felé haladunk! A szintézis végén le lehessen hasítani
Szintézis első aminosav felkapcsolása -védett elsõ aminosav gyanta BocH CH 2 C H H KF BocH CH 2 C
Védőcsoport eltolítás (terminális) BocH CH 2 C 1. védõcsoport eltávolítás (TFA) H 2 CH 2 C szabaddá váló -terminális
Második aminosav felkapcsolása Gly-gyanta H 2 CH 2 C BocH CH C CH 3 H 2. Második, -terminálisán védett aminosav (Boc-Ala)+ aktiválószer (DIC / HBt) BocH CH C H CH 2 C CH 3 Boc-Ala-Gly-gyanta
1. Védőcsoport eltávolítás 2. Boc-aminosav kapcsolása 3. Egy-egy kapcsolás hatékonysága ~99% 4. Csak 20 aminosav után nő meg a rövidebb peptidek száma jelentősen 5. Kapcsolások hatákonysága színreakcióval ellenőrizhető Lánchosszabítás BocH BocH BocH BocH Lys Val Val Ala Asp Lys Val Ala Gly 1. TFA 2. Boc-Val Gly 1. TFA 2. Boc-Lys Ala Ala Gly 1. TFA 2. Boc-Asp Gly
Kész peptid a gyantán Boc/Bn stratégia a kész peptid lehasítása a gyantáról és az összes védőcsoport eltávolítása (HF speciális berendezés) Fmoc/tBu stratégia: -terminális Fmoc lehasítása utána a peptid és a többi oldallánc védőcsoport lehasítása egyben TFA-val A kész peptid tisztítása HPLC-vel, (HPLC-MS) Hosszabb peptidek szintézise fragmeskondenzációval (rövidebb szakaszok szilárd fázison, majd ezeket oldatban kapcsolják össze megfelelő védőcsoportok kombinációja szükséges)
em természetes aminosavak H 2 CH C H H 2 CH C H C CH 2 H 2 C CH 2 CH Propargil glicin 3 Azidoetil-glicin H 2 CH C H H 2 CH C H H 2 C CH 2 Fluoreszcens aminsoav CH 2 Me I I-Phe 20
ligopeptidek módosításai Zsírsavakat kapcsolhatunk hozzá (lipoproteinek, lipopeptidek) Biotint kapcsolhatunk hozzá Gyógyszerhatóanyagot Szerves csoportokat pl. fémionokat komplexáló ligandumokat (PET jelzés) Ciklizálás (akár gyantán is) Automatizálás
Peptidek felhasználása Membránfehérjék modellezése (lipopeptidekkel) Assay készítés (biotinilált peptidek) Szállítópeptidek (gyógyszerek irányított célbajuttatása) Gyógyszerhatóanyagok szintézise (epitópok) Kombinatorikus szintézis
Furka Árpád Kombinatorikus peptidszintézis
ligonukleotidok szintézise A nukleozid 3 / 5 foszfátok nem eléggé reaktívak 3 --foszforamidit származékok A többi funkciós csoportot inaktiválni kell (védőcsoportok) A származékok kereskedelmi forgalomban beszerezhetők
Védőcsoportok 5 -hidroxil csoport dimetoxi tritil (DMT) savérzékeny T (U) nem igényel védőcsoportot A, da aminocsoportját Bz védőcsoporttal C, dc aminocsoportját Bz, vagy Ac védőcsoporttal G, dg, aminocsoportját izobutiril csoporttal védik A foszfit csoportot cianoetillel védik A DMT kivételével bázisra érzékenyek A származékok kereskedelmi forgalomban beszerezhetők
Védőcsoportok
Védőcsoportok
Szintetikus ciklus 5 -véghez kapcsolódik a következő nukleotid 5 -DMT csoport eltávolítása, az 5 H szabaddá válik A következő, 5 -DMT nukleotid kapcsolása (tetrazol reagenssel) A kevés (<1%) elreagálatlan 5-H t deaktiválják (capping) Ac 2 -val Az új foszfit-triésztert (P(III)) oxidálni kell (nem stabil), meg nem is ez van a nukleinsavakban pl. I 2 /víz Hordozó: polisztirol (makropórusos), vagy üveg (controlled pore glass, CPG)
Szintetikus ciklus
LIGUKLETIDK UTÓKEZELÉSE Védőcsoportok eltávolítása, hordozóról való lehasítás A lúg hatására lehasad: -védőcsoportok a bázisokról - β-cianoetil csoport a fosztátról - oligo a hordozóról - Liofilezés, sómentesítés - Tisztítás: HPLC (méret szerint, ioncsere)
LIGUKLETIDK: FELHASZÁLÁSI TERÜLETEK - primerek: DS, RS szekvenálás, PCR, mutagenezis -linkerek: mesterséges hasítóhelyek bevitele - adapterek: különböző (nem-kompatibilis) ragadós DS végek összekötése, esetleg hasítóhely bevitelével - hibridizációs próbák, DS diagnosztika - géndarabok - egyéb, pl. DS affinitásoszlopok készítése, stb.
ligonukleotid módosítások - Azid / acetilén linkert tartalmazó (klikk-kémia) - Tiol-linker (pl. arany felszínhez) - Biotin linker - Fluoreszcens módosítások (pl. molecular beaconhez) - géndarabok - egyéb, pl. DS affinitásoszlopok készítése, stb. - nem természetes nukleotidok beépítése
ligonukleotid módosítások H Me 2 D1 3' G C G C T C A A X A T A A T T A T C G G 5' X = D1: DA1 A: DA5 5' C G C G A G T T Y T A T T A A T A G C C 3' Y = D2: DA3 D3: DA4 A: DA2 5' C G C G A G T T A Y A T T A A T A G C C 3' Y = D2: DA6 D3: DA7 5' C G C G A G T T A T A T Y A A T A G C C 3' Y = D2: DA8 D3: DA9 H Et 2 3 S D2 H 3 S D3 Et 2