Új tartalékfehérje gének izolálása a Bánkúti 1201 búzafajtából doktori értekezés tézisei készítette: Nagy Ila Julietta Biológia Doktori Iskola Doktori Iskola vezetője: Erdei Anna Kísérletes Növénybiológia Program vezetője: Szigeti Zoltán témavezető: Dr Takács Imre 2006
Bevezetés A prolaminok a búza endospermiumában halmozódnak fel a virágzást követő négy-öt hét folyamán (Reeves és mtsai. 1986). A csírázás idején lebomlanak és aminosavakkal táplálják a fejlődő csíranövényt. Emellett hatalmas gazdasági jelentőségük is van, mivel ezek a fehérjék teszik lehetővé, hogy a lisztből kenyeret süthessünk. A búzalisztben lévő tartalékfehérjék víz és dagasztás hatására egy kiterjedt fehérje mátrixot képeznek, amelyet sikérnek (glutén) nevezünk. A sikérkomplexet nagyszámú fehérje alkotja, melyek technológiai szempontból két jól elkülöníthető csoportra oszthatók: gliadinokra és gluteninekre. Mindkét csoport nagyszámban tartalmaz cisztein aminosavakat, melyek diszulfid kötéseket képeznek. Míg azonban a gliadinok esetében a diszulfid hidak csak molekulán belül jönnek létre és ebből következően csak momomer formában mutathatók ki, addig a glutenin molekulák intermolekuláris kötések létrehozására is képesek. A glutenin alegységekből felépülő makropolimerek alapvetően meghatározzák a kenyér sütőipari minőségét. A gliadinok között alfa, gamma és omega gliadinokat különböztethetünk meg, a gluteninek kismolekulatömegű (LMW) és nagymolekulatömegű (HMW) frakciókra oszthatók fel. A HMW glutenin gének a Glu1 lókuszon találhatók, párokba rendeződve, minden lókuszon egy nagyobb x és egy kisebb y típusú gén helyezkedik el. Az LMW glutenin gének túlnyomó részét a Glu 3 lókusz tartalmazza. Payne (1987) szerint a sütőipari minőség meghatározásában a HMW glutenin gének, azokon belül is a Glu1D lókusz génjei különösen erős hatással bírnak: az 1Dx5+1Dy10 allélkombináció a jó minőségű fajtákra jellemző, míg az 1Dx2 vagy 1Dx3 valamint 1Dy12 kombináció a gyengébb minőségű fajtákban fordul elő. A régi magyar búzafajták világhírűek voltak kiváló minőségükről. Bár agronómiai jellemzőik miatt ma már kiszorultak a köztermesztésből, a modern biotechnológiai eljárások lehetővé teszik értékes génjeik izolálását és felhasználását. Érdekes módon ezek a fajták kivétel nélkül a 2x+12y allélkombinációt hordozzák a D genomon, megtörve a Payne szabályt. A régi fajták legismertebb képviselője a Bánkúti 1201, amely egészen a 70-es évekig maradt köztermesztésben. A martonvásári Mezőgazdasági Kutatóintézetben immár évtizedes múltra tekint vissza a Bánkúti 1201 fajta molekuláris szintű kutatása. Az elmúlt évek során kollégáink nagyszámú izogén törzset izoláltak ebből az eredetileg heterogén fajtából, megteremtve a genetikai alapot a jelen dolgozat tárgyát is képező molekuláris biológiai kutatásokhoz (Vida és mtsai., 1998). Ezt követően számos új HMW és LMW glutenin gént izoláltunk a fent említett törzsekből (Juhász és mtsai., 2003, Nagy és mtsai., 2003).
Az alábbi kutatási tervet tűztük ki célul: 1. Az előzményekre támaszkodva a Bánkúti 1201/11310 vonal 18-20 napos szemterméseiből az mrns izolálását, melyből cdns könyvtárat létrehozva lehetőség nyílik minél nagyobb számú tartalék fehérje génjének izolálására. 2. A fent említett vonal HMW-x típusú glutenin génjei közül a D genomon kódoltnak teljes hosszában való izolálása annak eldöntésére, hogy a Dx2-es, vagy a Dx3-as típus fordul-e elő ebben a vonalban. 3. A cdns könyvtárból LMW-glutenin gének izolálása specifikus radioaktív próbával jelzett hibridizáció során, az izolált gének szekvenálása, és a szekvenálási adatok összevetése az adatbanki adatokkal. mrns izolálás Anyag és módszer Bánkúti 1201/11310 vonal 18-20 napos szemterméseiből Dynabeads mrna DIRECT kittel izoláltuk a mrns frakciót a gyártó cég instrukciói alapján, majd a procedúrát megismételtük, hogy a rrns-ek koncentrációját elfogadhatóra csökkentsük. cdns klónozás cdns szintézishez 2-5µg mrns-t használtunk fel. A reakciókat a SuperScript TM Plasmid System for cdna Synthesis and Plasmid Cloning kit (Gibco-BRL) segítségével végeztük. A rekombináns plazmidokat elektroporációval vittük be DH10B elektromax (Gibco-BRL) sejtekbe, BioRad elektroporátor segítségével. A baktérium sejteket 60µg/ml ampicillin tartalmú LB táptalajra szélesztettük és 37 C-on éjszakán át tenyésztettük. A véletlenszerűen kiválasztott kolóniákban PCR amplifikációval és restrikciós analízissel ellenőriztük a cdns inzertek jelenlétét és méretét. A kolóniákat fiziológiás sóoldattal lemostuk a táptalajról, majd folyékony nitrogénben lefagyasztottuk és 80 C-on tároltuk későbbi felhasználásig. A génbank szűrése A HMW x gének keresésekor kb. 15 000 klónt szűrtünk a HMW-x próbával. Az LMW-glutenin szekvenciát tartalmazó klónokat összesen kb. 1000 kolónia között kerestük. A kolóniákat steril nejlon filterekre (Amersham Hybond-N) replikáltuk, amelyeket Maniatis és munkatársai (1982) által leírtak szerint kezeltünk, majd 0,25M Na 2 HPO 4, 1mM EDTA, 1%BSA, 7%SDS összetételű
prehibridizációs oldatban inkubáltuk 2 órán át 65 C-on, majd hozzáadtuk a radioaktív próbát tartalmazó hibridizációs oldatot és 16-20 órán át 65 C-on inkubáltuk. A háttér aktivitás eltávolítása érdekében a filtereket a következő séma szerint mostuk: 2xSSPE, 0,1% SDS 10 perc 20 C kétszer, 1xSSPE, 0,1% SDS 30 perc 65 C, 0,2xSSPE, 0,1% SDS 30 perc 65 C. Ezután a filtereket KODAK X-OMAT XAR-5 filmen exponáltuk a pozitív klónok azonosítása végett. DNS jelölés A HMW-x klónok azonosításához az Ax2 *B allél 1 300 bázispár hosszú fragmentumát (Juhász és mtsai., 2001) illetve a Dx5-ös génnek a prim51/prim52-es primerpárral amplifikált 450 bp hosszú fragmentumát (N-terminálisát) használtuk próbaként (D Ovidio és mtsai., 1994). Az LMW-glutenin DNS próba készítéséhez a Ciaffi M. és mtsai., (1999) által izolált LMW1D1 gén C terminális szakaszát használtuk, amelyet specifikus primerekkel amplifikáltunk PCR reakció útján. A PCR terméket low-melting 1%-os TAE agarózgélből (Sigma) izoláltuk vissza QIAEX II. kit (Quiagen) segítségével. 25-30ng DNS-t jelöltünk Pharmacia Oligolabelling kittel 2 ΜΒq [α- 32 P] dctp (111 TBq/mmol) felhasználásával. PCR amplifikáció és klónozás A cdns génbankból ötvenezer kolóniát növesztettünk fel és kivontuk belőlük a plazmid DNS-t (Qiagen Plasmid Kit). A kiméra specifikus primerek szekvenciái a következők voltak: GliNF1: 5 ATACAGGTCGACCCTAGTGG 3, a primer kötőhely az M16064 gamma-gliadin gén N- terminális doménjében található 60 bázispár távolságra a start kódontól (Sugiyama és mtsai. 1986). LMWCR2: 5 TTATCAGTAGGCACCAACTC 3, a primer az LMW1D1 gén végéhez kapcsolódik átfedve a stop kódonokat (Ciaffi és mtsai. 1999). A PCR reakció 0,4 µm primert (külön-külön), 200 µm dntp-t, 1,5 mm MgCl 2 -ot, 20 ng plazmid DNS-t és 2,5 egység Taq polimerázt (Promega) tartalmazott 15 µl térfogatban. A program a következő volt: 94 C/4 perc (egy ciklus), 95 C/ 0,5 perc, 55 C/0,5 perc, 72 C/1 perc (harminc ciklus), 72 C/20 perc. A genomi DNS-ből indított PCR reakciónál a primerkoncentrációt megdupláztuk, a primerkötő hőmérsékletet 60 C-ra, a ciklusszámot pedig 40-re növeltük. 100 ng genomi DNS adtunk 50 µl reakcióelegyhez. A Taq polimerázt Herculase DNS polimerázzal (Stratagen) helyettesítettük. Az amplifikált fragmenteket a PCR 2.1 TOPO TA Cloning kit (Invitrogen) segítségével klónoztuk. Szekvencia elemzés A nagytisztaságú plazmid DNS-t Qiagen Plasmid Kit segítségével állítottuk elő. A szekvenáló
reakcióhoz az ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit-et használtunk, majd a mintákat egy ABI 310 automata szekvenátorral olvastuk le. A kapott szekvenciaadatokat a GCG szoftvercsomaggal elemeztük (Genetics Computer Group). Eredmények összefoglalása 1. A Bánkúti 1201/ 11310-es genotípusból cdns könyvtárat készítettünk 18-20 napos szemtermésből, vagyis az antézis utáni 18-20 napon izoláltuk a fejlődő búzaszemből az mrns-t. Az mrns-ről átírt dupla szálú cdns a frakcionálás után mintegy 100ng-nyi mennyiségét arra alkalmas plazmidba építettük be, majd a rekombináns plazmidokat E. coli sejtekbe transzformáltuk. Az elektroporációt követően körülbelül 60 000 kolóniát kaptunk 1ng cdns-re vetítve, tehát a génbank nagysága kb. 6 millió klón. A PCR és restrikciós analízis alapján a klónok 90%-a tartalmaz inzertet. 2. Több, mint 65 000 kolóniát szűrtünk a Bánkúti 1201-es cdns génkönyvtárból 1Dx5 próbával, ahhoz hogy a D genomon kódolt HMWx típusú gén teljes szekvenciáját izolálni tudjuk. A szekvenciaanalízis alapján egyértelműen bizonyítást nyert, hogy a Dx2 allél fordul elő Bánkúti 1201/ 11310-es genotípusban. 3. A Bánkúti 1201-es cdns bankból mintegy 1100 klónt szűrtünk az LMW1D1 gén C- terminális régióját használva próbaként (Nagy és mtsai., 2003). Az LMW-GS specifikus transzkriptumok parciális koncentrációja meghaladja a 3%-ot a szóbanforgó fejlődési stádiumban. Összesen 30 klónt izoláltunk és térképeztünk. A 9 leghosszabb klónt szekvenáltuk meg. Négy azonosnak bizonyult az LMW1D1 génnel, amelyet legelsőként izoláltak, és gyakorisága alapján domináns alegységnek tűnik a Bánkúti 1201 fajtában is. Négy klón az Ikeda és munkatársai (2002) által publikált géncsaládokhoz mutat nagyfokú homológiát, ezek közül egy a referencia génhez képest egy 132 aminosavnyi deléciót tartalmaz. A kilencedik olyan rekombináns szekvenciát tartalmazott, amely ezidáig teljesen ismeretlen volt a szakirodalomban (lásd később). 4. Az LMW1D1 próbával izolált klónok között találtunk egy olyan unikális szerkezetű rekombináns (kiméra) gént is, amely ezidáig teljesen ismeretlen volt. A gén N-terminális vége gamma gliadin, a C-terminális része viszont LMW-GS specifikus szekvenciákat tartalmazott. Gamma-gliadin és LMW1D1 specifikus primerekkel a cdns bankból 8 klónt izoláltunk, a genomból 6 fragmentumot klónoztunk, (ebből négy azonos volt a cdnsekkel). A szekvenálás után mind hasonló szerkezetűnek bizonyultak. Ezek a szekvenciák minden bizonnyal valamilyen rekombinációs folyamat révén jöttek létre a genomban.
Következtetések HMW-glutenin gének izolálása és jellemzése A D genomon kódolt HMW-glutenin gén teljes hosszában való izolálása céljából kolóniahibridizációt végeztünk. A röntgenfilmen nagyszámú pozitív jelet kaptunk, ezek alapján a HMW-x gének (transzkriptumok) parciális koncentrációja 1%-ra becsülhető. Az összesen ötvenegy izolált klónt restrikciós analízisnek vetettünk alá. A négy leghosszabb inszertet tartalmazó klón között teljes hosszúságú Ax2 *B és Bx7 szekvenciákat tartalmazó klónokat azonosítottunk. A HMW-x pozitív klónok közül a rövidebb Dx fragmenteket tartalmazókat restrikciós analízissel azonosítottuk. A négy ilyen klón segítségével a keresett allél 3' végének a szekvenciáját meghatároztuk. Mivel az első szűrési kísérletben (kb. 15 000 klón) teljes hosszúságú Dx-es gént nem találtunk, a továbbiakban nagyobb számú populációt vizsgáltunk. A génbankból 10x5000 klónt növesztettünk fel. Az izolált DNS-t kétféle kombinációban hasítotuk endonukleázokkal és Sothern blott alapján egy csoportot választottunk ki, mely tartalmazta a keresett klónt. Kolónia hibridizáció után izoláltuk 2 telepet, amelyek nagy valószínűséggel ugyanazt a klónt képviselik A szekvenálás során kiderült, hogy a klón 45 bp-ral a startkodon előtt kezdődik, tehát a gén 5, nem transzlálódó részéből is tartalmaz egy szakaszt. A repetitív régió átszekvenálásához szubklónozást alkalmaztuk. A szekvenciaanalízis alapján kiderült, hogy a Dx2 gén van ebben a vonalban. LMW-glutenin gének izolálása és jellemzése A Bánkúti 1201-es cdns bankból mintegy 1100 klónt szűrtünk, az LMW1D1 gén C-terminális régióját használva próbaként (Nagy és mtsai., 2003). A pozitív kolóniák száma jóval meghaladta a harmincat, tehát az LMW-GS specifikus transzkriptumok parciális koncentrációja meghaladja a 3%-ot, a szóban forgó fejlődési stádiumban, mivel a használt kondíciók mellett lehetnek olyan LMW-glutenin gének, melyekkel nem hibridizál a jelölt próba. A transzkripció mértéke azonban még ennél magasabb is lehet, amikor az a legnagyobb mértékű. Az expressziós profilja ezeknek a géneknek genotípusonként különbözik, jelen genotípusnál pontosan nem ismert. Összesen 30 klónt izoláltunk és PCR reakcióval ellenőriztük az inszertek hosszát. Túlnyomó többségük túlságosan rövid inszertet tartalmazott, a 9 leghosszabb klónt szekvenáltuk meg. Egy közülük (B21) olyan rekombináns szekvenciát (kiméra) tartalmazott, amely eddig teljesen ismeretlen volt a szakirodalomban (lásd: lent). A maradék 8 klón jellemzőit és csoportosítását az 1. táblázat tartalmazza. Az első csoportot négy LMW1D1 specifikus klón alkotja (közülük három teljes hosszúságú),
100%-os homológiát mutatva a referencia génhez (Colot és mtsai., 1989). Három klón olyan LMW-glutenin génekkel mutat nagyfokú homológiát melyeket a közelmúltban izoláltak japán kutatók egy helyi puhaszemű búzafajtából (Ikeda és mtsai., 2002). Klón jele Aminosav szám Osztályozás Homológia foka Klón hossza B4 307 LMW1D1 100% Teljes B15 307 LMW1D1 100% Teljes B17 307 LMW1D1 100% Teljes B22 204 LMW1D1 100% Részleges B6 195 G5 100% Részleges B23 157 G5 99% Részleges B25 157 G4 98% Részleges B12 130 G2 <50% Részleges 1.Táblázat A 8 megszekvenált LMW-GS pozitív klón jellemzői. A klónokat az adatbázis és Ikeda és mtsai., (2002) szekvencia adataihoz való homológia alapján csoportosítottuk. A csoportokat az N- és a C-terminális konzervált domén szekvenciái alapján állították fel. A G2 csoportba sorolt szekvenciák N-terminálisa az LMW glutenin alegységek m (LMWGS-m) típusai közül a kenyérbúza fajtákban leggyakrabban előfordulónak megfelelő (Lew és mtsai., 1992, Masci és mtsai., 1998). A G4 csoportba tartozó szekvenciák csak az első helyen levő izoleucinnal térnek el az LMWGS-m típusától (Masci és mtsai., 1998). A G5 csoportba sorolt szekvenciák a kenyérbúzában második leggyakrabban előforduló LMW-GS-m típusba sorolhatóak (Masci és mtsai., 1998). Különlegességük abban áll, hogy az N-terminális rész hidrofóbabb, mint más LMW glutenin alegységek esetében, aminek köszönhetően a tészta rugalmasságát növelheti (Belton 1999). A G4 és G5 csoportba tartozó nukleotid szekvenciákat először Ikeda és munkatársai (2002) írták le. Mindhárom csoport tagjai 8-8 cisztein aminosavat tartalmaznak, melyek közül az első és a hetedik vesz részt molekulák közti kötések kialakításában. Az általunk izolált alléleknél az N-terminális konzervált domént illetően egyik esetben sem rendelkezünk szekvencia adattal. A csoportosítást a C-terminális szekvenciák homológiái alapján végeztük, bármifajta következtetést csak megfelelő óvatossággal lehet levonni, hiszen a teljes szekvenciák izolálása még módosíthatja az osztályozást. A B12-es klón teljes hosszát vizsgálva nem mutatott szignifikáns homológiát semmilyen ismert prolamin szekvenciával, a G2 osztályba tartozó fehérjékhez képest az általunk izolált génszakasz egy 132 aminosavnyi deléciót tartalmaz. Amennyiben a deléciótól eltekinünk, a homológiái foka 93%-nak adódik, a deléció előtti 36 aminosavnyi szakaszon 81%, a deléció utáni 92 aminosavnyi szakaszon pedig 97%-os az egyezés a két fehérje között. A deléció következtében a ciszteinek száma 5-tel csökken, ami azt jelenti, hogy ha feltételezzük, hogy a gén N-terminális konzervált doménje nem tér el a referencia géntől, akkor az általunk izolál génszakasz egy 3 cisztein aminosavat tartalmazó glutenin fehérje génjének a 3' vége lehet. Az első két cisztein a tipikus LMW gluteninek 1. és 7. cisztein aminosavjának felel meg, így feltételezhetően képes intermolekuláris
kötésre, amiből ugyanolyan működésre következtethetünk, mint ami a "normális" LMW gluteninekre jellemző. Ami az izolált klónok megoszlását illeti, az elég aránytalannak mondható. Az LMW1D1 eredetű cdns-ek frekvenciája nagyon magas (50%). A nagy parciális koncentrációjából, ill. a 100%-os konzerváltságából következően ez a gén fontos komponense lehet az LMW-GS családnak. A maradék négy klón már sokkal inkább megoszlott (három különböző szekvencia csoport). A B21- es szekvencia (ltsd. következő fejezet) különleges tulajdonságai alapján egy eddig ismeretlen rekombináns gént, géncsaládot reprezentál. Gliadin-Glutenin kiméra szerkezetű gének izolálása és jellemzése A cdns génbankot LMW glutenin specifikus próbával szűrtük, annak érdekében, hogy ismeretlen LMW glutenin géneket vagy alléleket izoláljunk (Nagy és mtsai. 2003). A nagyszámú pozitív klón között egy olyan szekvenciát azonosítottunk (B21), amely egészen sajátos amfipoláris struktúrát mutatott. A DNS fragmentum N-terminális része gamma-gliadin, a C-terminális része LMW glutenin szekvenciákat tartalmazott. A két különböző eredetű fragmentum fúziója egy viszonylag rövid rekombináns gént eredményezett. A feltételezett fehérje termék azonban még ennél is rövidebb lett, mivel a fúzió során kereteltolódás történt, ami az eredeti aminosav szekvencia jelentős részét eltávolította (a stop kódon feljebb tolódott). A kereteltolódás emellett természetesen teljesen megváltoztatta a glutenin domén aminosav sorrendjét is, olyan módon, hogy az új szekvencia már semmilyen homológiát nem mutat az ismert prolamin génekkel. Az egyetlen cisztein, amelyet a glutenin domén eredetileg tartalmazott szintén elveszett, viszont a kereteltolódásos mutáció egy új ciszteint hozott létre egy másik pozícióban. Ezt a gént Ch1-nek neveztük el kiméra szerkezete miatt. Mivel feltételeztük, hogy a rekombinációs esemény, amely a Ch1 gént létrehozta többször is megismétlődhetett, kiméra specifikus PCR primerekkel teszteltük mind a cdns könyvtárat, mind a genomi DNS-t. Ilyen módon további kilenc molekuláris kimérát sikerült izolálnunk. A kiméra gének legfontosabb jellemzőit az 2. táblázat foglalja össze. A feltüntetett szekvenciák figyelemreméltó variabilitást mutatnak mind nagyságukat, mind eredetüket, mind pedig a gliadin/glutenin szekvenciák arányát illetően. Amennyiben a kódoló szekvenciákat vesszük számításba (vagyis a fehérjetermék hosszát), úgy a legkisebb molekula a Ch6, mindössze 82 aminosavval. A Ch2 és Ch4 ezzel szemben majdnem négyszer nagyobb, elérve ill. megközelítve a parentális gének hosszát (318 ill. 307 aminosav). A gliadin/ glutenin arány is igen széles határok között változik, a két szélső értéket a Ch7 (63%/37%) és a Ch4 (11%/89%) képviseli. Fontos megjegyezni, hogy a gliadin fragment hossza sohasem haladja meg a 420 nukleotidot, így a ciszteinek minden esetben a glutenin fragmentben
találhatóak (a gliadinok nem tartalmaznak ciszteint a molekula N-terminális részén). Szembetűnő, hogy számos kiméra tartalmaz hosszabb-rövidebb deléciókat, amelyek azonban sohasem változtatják meg a leolvasási keretet (hárommal oszthatóak). A deléciók határain rövid szekvencia ismétlődések fedezhetők fel, amelyek arra utalnak, hogy ezek az átrendeződések genetikai rekombináció útján jöttek létre. A széleskörben elterjedt nézetek szerint a prolamin gének repetitív régiójában bekövetkező rekombinációs folyamatok döntő szerepet játszottak ezen géncsalád evolúciójában (Kreis és mtsai. 1985, D Ovidio és mtsai. 1996). A leghosszabb deléciót a Ch3 klón hordozza a glutenin doménben. Ez a mutáció különös jelentőséggel bír, mivel a Ch3 gén láthatólag a Ch4-ből keletkezett egy 597 bp hosszú delécióval, amely eltávolította a glutenin fragment túlnyomó részét. Ehhez hasonló közvetlen leszármazás a többi kiméra esetében nem fedezhető fel, azonban egy másfajta kapcsolat a Ch1 és Ch2 szekvenciák között is kimutatható. Mindkét gén ugyanazt a deléciót hordozza. Ebben az esetben a deléció vélhetőleg a gliadin szülői génben következett be a glutenin előddel történt rekombináció előtt. Egyelőre nem világos, hogy a kiméra szekvenciák miért tartalmaznak nagy számban olyan deléciókat, amelyek a szülői génekben nem fordulnak elő. Elképzelhető, hogy ezek a mutációk egyfajta melléktermékei annak a rekombinációs folyamatnak, amely létrehozta ezeket a rekombináns géneket. A rekombináns prolamin gének különféleképpen csoportosíthatók szerkezeti tulajdonságaik alapján. A Ch1,6,7,8 és 10- es klónok kereteltolódásos mutációt hordoznak, következtetésképpen protein termékük nem is tekinthető valódi tartalékfehérjének a megváltozott aminosav sorrend miatt. Nagy különbség van a szóbanforgó gének között a ciszteinek számában is. A Ch2 és Ch4 tartalmazza mind a hét glutenin eredetű ciszteint a C-terminális régióból. A legtöbbjük azonban csak egy ciszteinnel rendelkezik, vagy az eredeti pozícióban, vagy a kereteltolódás által módosított helyen. A Ch10-es különleges helyet foglal el a kimérák között, mivel egyáltalán nem tartalmaz ciszteint az omega- gliadinokhoz hasonlóan. Bár jelenleg nem áll rendelkezésünkre egyértelmű bizonyíték, hogy a kiméra proteinek valóban kimutathatóak az endospermiumban, a feltételezett fehérjék bizonyos tulajdonságai kikövetkeztethetőek a szekvencia adatokból. A csoporton belül jól elkülöníthető családot alkotnak a kereteltolódást nem tartalmazó polipeptidek, amelyek valószínűleg láncterminálóként működnek. Rendkívűl eltérő ciszteintartalmuk ellenére ezek a molekulák ugyanis csak egyetlen olyan szulfhidril csoportot tartalmaznak, amely intermolekuláris kötésre képes (Köhler és mtsai. 1993). A kereteltolódást hordozó klónok egy kivételével szintén egyetlen ciszteinnel rendelkeznek, amelynek pontos térbeli pozíciója nem ismert, mivel a prolaminokétól teljesen eltérő aminosav szekvenciában foglal helyet. A Ch10-es fehérje egyetlen ciszteint sem tartalmaz, így fukcionális szempontból egyértelműen gliadinnak tekinthető. Mindent összevetve tehát azt mondhatjuk, hogy a tíz feltételezett kiméra protein közül funkcionális szempontból kilenc valószínűleg gluteninként, egy
pedig gliadinként viselkedik. A kiméra fehérjék közül a Ch1-et sikerült eddig termeltetni bakteriális rendszerben, majd poliakrilamid gélen azonosítani. A kapott termék molekulatömege jó egyezést adott az elméleti értékkel, bizonyítva, hogy az új, egyszeres stop kódon valóban működőképes (a normál prolamin gének kettős stop kódont tartalmaznak). Ugyanakkor a termék nem oldódott etanolban, tehát fizikai-kémiai jellemzői eltérnek a szülői génekétől. Ami a kiméra gének kromoszómális lokalizációját illeti, közvetlen bizonyítékaink egyelőre nincsenek. A közvetett bizonyítékok azonban arra utalnak, hogy ezek a szekvenciák a D genomhoz kapcsolhatók. Az 1. táblázatban feltüntetett glutenin szülői szekvenciák közül egy kivételével (ab062863) mindegyik a D genomhoz köthető (D Ovidio és Masci, 2004). A gliadin szülők genomi pozíciója ismeretlen. A rekombináns tartalékfehérje gének tulajdonságait és jelentőségét illetően még számos nyitott kérdés vár megoldásra. Bizonyításra szorul a kiméra fehérjék jelenléte a lisztben, valamint tisztázni kell funkcionális tulajdonságaikat is. Jelenleg nem ismerjük ezeknek a szekvenciáknak az előfordulását a különböző genotípusokban, rokonsági körökben. Hasonlóképpen megfejtésre várnak annak a rekombinációs folyamatnak a részletei is, amely a múltban létrehozta ezeket a különös géneket. Elnevezés Fragment méret (bp) Gliadinglutenin határ (bp) a Gliadin arány Deléciók (bp) b A protein hossza (a.sav) d Ciszteinek száma Homológ szekvenciák Gliadin rész Glutenin rész Ch1 c,g 527 300-306 (+) 63% 24 (206.) 151 (42) 1 af234644 X13306 Ch2 c 900 251 (-) 33% 24 (206.) 318 7 af234644 X13306 Ch3 c 270 39-41 (-) 31% 597 (99.) 108 1 af234644 X13306 Ch4 c 867 39-41 (-) 11% - 307 7 af234644 X13306 Ch5 c,g 285 99-111 (-) 50% - 113 1 M16064 X13306 Ch6 c,g 320 90 (+) 40% - 82 (42) 1 M16064 X13306 Ch7 c 592 357-359 (+) 65% 69 (157.) 176 (40) 1 af234644 ab062863 Ch8 c,g 436 120 (+) 37% 93 (46.) 122 (40) 1 af144104 ab062851 Ch9 g 360 146-149 (-) 50% - 140 1 M16064 ab062867 Ch10 g 568 299-303 (+) 58% - 168(49) 0 M16064 ab062867 2. táblázat. Az izolált kiméra gének főbb strukturális jellemzői. a: Kereteltolódás van (+), kereteltolódás nincs (-). b: A deléciók helye zárójelben van feltüntetve. d: A zárójelben lévő szám a kereteltolódás által eltávolított aminosavak számát jelöli. c: cdns könyvtárból izolált klónok, g: Genomi DNS-ből izolált klónok. Irodalomjegyzék Bedő, Z., Kárpáti, M., Vida, Gy., Krammarik-Kissimon, J. and Láng, L. (1995). Good breadmaking quality wheat (Triticum aestivum L.) genotypes with 2+12 subunit composition at the Glu-D1 locus. Cer. Res. Comm., 23, 3: 283-289. Belton, P. S. (1999). On the elasticity of wheat gluten. J. Cereal Sci., 29: 103-107. Ciaffi, M., Lee, Y. K., Tamás, L., Gupta, R., Skerritt, J. and Appels, R. (1999). The low-molecularweight glutenin subunit proteins of primitive wheats. III. The genes from D-genome species. Theor.
Appl. Genet., 98: 135-148. Colot, V., Bartels, D., Thompson, R. and Flawell, R. (1989). Molecular characterization of an active wheat LMW glutenin gene and its relation to other wheat and barley prolamin genes. Mol. Gen. Genet., 216: 81-90. D Ovidio, R., Porceddu, E. and Lafiandra, D.(1994). Pcr analysis of genes encoding allelic variants of high-molecular-weight glutenin subunits at the Glu-D1 locus. Theor. Appl. Genet., 88: 175-180. D Ovidio, R., Lafiandra, D. and Porceddu, E. (1996). Identification and molecular characterization of a large insertion within the repetitive domain of a high-molecular-weight glutenin subunit gene from hexaploid wheat. Theor. Appl. Genet., 93: 1048-1053. D Ovidio, R. and Masci, S. (2004). The low-molecular-weight glutenin subunits of wheat gluten. J. Cereal Sci., 39: 321-339. Ikeda, T. M., Nagamine, T., Fukuoka, H. and Yano, H. (2002). Identification of new low-molecularweight glutenin subunit genes in wheat. Theor. Appl. Genet., 104: 680-687. Juhász, A., Tamás, L., Karsai, I., Vida, Gy., Láng, L. and Bedő, Z. (2001). Identification, cloning and characterisation of a HMW-Glutenin gene from an old Hungarian wheat variety, Bánkúti 1201. Euphytica, 119:75-79. Juhász, A.-Larroque, O. R.-Tamás, L.-Hsam, S. L. K.-Zeller, F. J.-Békés, F.-Bedő, Z.: 2003. Bánkúti 1201-an old Hungarian wheat variety with special storage protein composition. Theor. Appl. Genet., 107 (4): 697-704. Köhler, P., Belitz, H. D. and Wieser, H. (1993). Disulphide bonds in wheat gluten: further cysteine peptides from high-molecular-weight (HMW) and low-molecular-weight (LMW) subunits of glutenin and from γ-gliadins. Z. Lebensm. Unters. Forsch., 196: 239-247. Kreis, M., Forde, B. G., Rahman, S., Miflin, B. J. and Shewry, P. R. (1985a). Molecular evolution of the seed storage proteins of barley, rye and wheat. Journal of Molecular Biology, 183: 499-502. Lew, E. J.-L., Kuzmicky, D. D. and Kasarda, D. D. (1992). Characterization of low-molecularweight glutenin subunits by reversed-phase high-performance liquid chromatography, sodium dodegyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, and N-terminal amino-acid sequencing. Cereal Chem., 69: 508-515. Maniatis, T., Fritsch, E. F., and Sambrook, J. (1982). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. Masci, S., D' Ovidio, R., Lafiandra, D. and Kasarda, D. D. (1998). Characterization of a lowmolecular-weight glutenin subunit gene from bread wheat and the corresponding protein that represents a major subunit of the glutenin polymer. Plant Physiol., 118,4: 1147-1158. Nagy, I. J., Takács, I., Tamás, L. and Bedő, Z. (2003). Molecular cloning and characterization of low-molecular-weight sequences from an old Hungarian wheat variety, Bánkúti 1201. Cer Res Comm., 31 (1-2): 25-31. Payne, P. I. (1987). Genetics of wheat storage proteins and the effect of allelic variation on bread making quality. Ann Rev Plant Physiol., 38: 141-153. Reeves, C. D.-Krishnan, H. B.-Okita, T. W.: 1986. Gene Expression in Developing Wheat Endosperm. Plant Physiol., 82: 34-40. Sugiyama, T., Rafalski, A., and Söll, D. (1986). The nucleotide sequence of a wheat γ-gliadin clone. Plant Sci., 44: 205-209. Vida, Gy., Bedő, Z., Láng, L. and Juhász, A. (1998). Analysis of the quality traits of a Bánkúti 1201 population. Cer. Res. Comm., 26, 3: 313-320.