Humán maradványok molekuláris diagnosztikája Márk László PTE ÁOK Biokémiai és Orvosi Kémiai Intézet
Antropológia módszerei Nem Életkor Elhalálozási idő Igazságügyi vonatkozások Patológiás és traumás elváltozások
46, XX 46, XY
Citrát-tartalom meghatározása Citrát koncentráció ( ppm) 11000 férfiak nők 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 0-5 6-10 11-15 16-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71- Életkor
Hormone Mass Fingerprinting Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] 5000 288.456 regint 2\0_F6\1\1Ref 1200 311.277 4000 1000 289.291 3000 800 279.210 301.165 600 340.309 2000 1000 271.251 316.500 400 257.208 268.257 331.287 263.292 301.269 279.263 200 0 260 270 280 290 300 310 320 nő m/z 0 50 260 270 280 290 300 310 320 330 340 férfi m/z Jámbor É.; Patonai Z.; Varga V.; Bajnóczky I.; Marcsik A; Márk L.: Hormone Mass Fingerprinting: Novel high-throughput molecular sex determination of archaeological and forensic human skeletal remains by MALDI TOF mass spectrometry, Forensic Science International (under review)
Antropológia módszerei Nem Életkor Elhalálozási idő Igazságügyi vonatkozások Patológiás és traumás elváltozások http://www.firstpeople.us/photos/the_oldest_man_of_nootka.jpg
Femur proximális epiphysis
Kollagén koncentráció 210000 205000 200000 Kollagén koncentráció ppm 195000 190000 185000 180000 0-5 6-10 11-15 16-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71- Életkor
Ca/P arány 2,00 1,90 1,80 Ca/P arány 1,70 1,60 1,50 1,40 0-5 6-10 11-15 16-20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71- Életkor
Antropológia módszerei Nem Életkor Elhalálozási idő Igazságügyi vonatkozások Patológiás és traumás elváltozások http://artfiles.art.com/images/-/thomas-rowlandson/time-and-death-their-thoughts-imparton-works-of-learning-and-of-art-giclee-print-c12058299.jpeg
Mikor halt meg K?
Kormeghatározási technikák Relatív módszerek Abszolút technikák
Abszolút technikák Radiokarbon kormeghatározás Aminosav racemizáció meghatározása Kálium-argon Urán bomlásisor alapján
Radiokarbon Willard F. Libby (1908-1980) (1960 NP)
A kozmikus sugárzás kölcsönhatásai során keletkező neutronok radiokarbon végmagra vezető magreakciói Reakció típusa Q érték (MeV) Relatív izotóp gyakoriság az atmoszférában A magreakció egy magra vonatkoztatott gyakorisága A reakció előfordulásának gyakorisága az atmoszférában 14 N(n,p) 14 C +0,626 1 1 1 16 O(n, 3 He) 14 C -14,6 0,269 <1*10-2 <3*10-3 17 O(n,α) 14 C +1,82 9,9*10-5 0,23 3*10-3 15 N(n,d) 14 C -7,98 3,7*10-4 1*10-2 3*10-3 13 C(n,γ) 14 C +8,17 2,3*10-6 5*10-4 3*10-3 20, 21, 22 Ne hasítás 1,2*10-5 1*10-2 3*10-3
Kozmikus sugárzás C-14 CO 2 Radiokarbon keletkezés
A radiokarbon mennyiségének változása a légkörben Bristlecone pine
Mai radiokarbon
AMS AMS (Accelerator Mass Sprctrometry) Few mg of the samples
Szükséges mintamennyiségek Minta típus C tartalom (%) Minimális minta mennyiség (g) proporcionális AMS faszén, tőzeg, mag 50 90 3 6 10-3 5*10-2 szövet, vászon 10 50 6 50 2*10-3 2,5*10-2 fa, tőzeg (nedves) 2 10 30 150 10-2 1,25*10-1 üledék, talaj 0,2 5 50 1500 2*10-2 1 csont, fog 1 5 60 300 2*10-2 3*10-1 karbonát, korall, cseppkő 10 10 30 2,5*10-2 talajvíz, rétegvíz 0,01 50 500 5*10-2 2*10-1
Radiokarbon forradalom 1611-ben Usser érsek: Kr. e. 4004. okt. 23 reggel 9 órakor
C14-es, radiokarbon-vizsgálatn1988-ban a Római Katolikus Keresztény Egyház hozzájárulását adta a C14- es eljárás alkalmazásához, kifejezve ezzel elkötelezettségét a tudományos vizsgálatok iránt. Az egymástól független három különböző egyetemen (Oxford, Zürich, Arizona) végzett eredmény ugyanazt hozta: a küldött minta alapján a lepel keletkezése1260 és 1390 közé tehető.
IR spektroszkópia
C.I. FT-IR 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 C.P.
Antropológia módszerei Nem Életkor Elhalálozási idő Igazságügyi vonatkozások Patológiás és traumás elváltozások http://www.thrillermagazine.it/imgbank/news/colombo_1.jpg
Antropológia módszerei Nem Életkor Elhalálozási idő Igazságügyi vonatkozások Patológiás és traumás elváltozások
A csontszövet kémiai felépítése Szervetlen összetevők Makroelemek Mikroelemek Nyomelemek Szerves komponensek Kollagén Rezisztens proteinek Protein-poliszacharida komplex Citrát Lipidek
Posztmortem változások
Posztmortem változások
Patológiás változások
A klasszikus módszerek hátrányai Töredékes csontvázak vizsgálata Csontokon nem megjelenő patológiás folyamatok kimutatása Morfológiai elváltozásokat mutató nem patológiás leletek elemzése
A klasszikus módszerek hátrányai Töredékes csontvázak vizsgálata Csontokon nem megjelenő patológiás folyamatok kimutatása Morfológiai elváltozásokat mutató nem patológiás leletek elemzése
A klasszikus módszerek hátrányai Töredékes csontvázak vizsgálata Csontokon nem megjelenő patológiás folyamatok kimutatása Morfológiai elváltozásokat mutató nem patológiás leletek elemzése
Folyadékkromatográfia Minta Pumpa Kolonna A B Mozgófázis (eluens) Detektor (UV/VIS) UV/VIS kromatogram 38
Tömegspektrometria Ionforrás Analizátor Detektor Minta Tömegspektrum m/z 39
Ionizáció Fast Atom Bombardment (FAB) Elektrospray, Nanospray (ESI, NanoESI) Atmoszférikus kémiai ionizáció (APCI) Atmoszférikus ionizáció (API) (ESI+APCI) Termospray (TSI) Fotoionizáció (PI) Lézer deszorpciós ionizáció (MALDI, SELDI) 40
41
MALDI 42
Analizátor Kvadrupol Ioncspda (itrap) Repülési idő (TOF) 43
TOF mi = tömeg zi = töltés E = mágneses mező ti = repülési idő ls = a source hossza ld = szabad repülési úthossz e = elektron töltése (1.6022x10-19 C) 44
Q 45
Trap 46
47
48
49
50
m/z 51
m/z 632.896 m/z 52
Precursor ion kiválasztás m/z 632.896 53
m/z 632.896 leányionok 54
Munkamenet Protein extraction Separation nhplc on line nesi MS/MS Diagnosis 1D- or 2D SDS PAGE or DIGE Identification of ancient proteins Digestion MALDI TOF/TOF MS Peptide Mass Fingerprinting or Direct Sequencing
Proteinek elválasztása HPLC, nano-hplc, UPLC SDS-PAGE DIGE
Mennyiségi változások Kontrol minták Patológiás minták
Munkamenet Protein extraction Separation nhplc on line nesi MS/MS Diagnosis 1D- or 2D SDS PAGE or DIGE Identification of ancient proteins Digestion MALDI TOF/TOF MS Peptide Mass Fingerprinting or Direct Sequencing
Peptide Mass Fingerprinting (Mascot, Phenyx)
Mycobacterium tuberculosis
Mikolsavak analitikája Márk (2007) Folia Anthropologica 5:45-50
Régészeti minták
Intens. [a.u.] 1318.3 600 1290.0 1274.3 400 200 1226.9 1346.4 1379.2 1424.7 1470.0 1560.0 1604.8 1515.1 1649.2 0 1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550 1600 1650 m/z
Paleoproteomika 68 millió éves T. rex kollagén szekvenciájának meghatározása Nielsen-Marsh et al. (2005) PNAS 102 (12):4409-4413
Fehérjék vizsgálata Intens. [a.u.] Fehérjeforrás (csontőrlemény) homogenizálása Gélelektroforézis (12%-os SDS- PAGE) 1200 1477.776 1000 800 Fehérjék kivágása 600 1105.556 1962.075 Fehérjék tryptikus emésztése 400 200 0 2115.242 1586.778 2216.191 1267.657 1833.946 2705.482 2960.642 2455.448 3067.689 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 m/z MALDI TOF/TOF Peptidek azonosítása (Mascot)
Bélmegyer 65
Csongrád 183
Bácsalmás 39
Eredmények
M. tuberculosis evolúciója
M. tuberculosis evolúciója Brosch et al. (2002) PNAS 99:3684-3689
M. leprae Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] x10 4 912.4 1.0 0.8 701.3 0.6 0.4 561.1 953.8 638.9 870.9 0.2 0.0 1159.8 1282.0 1026.1 1361.4 00 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 m/z 1000 1159.8 800 1282.0 600 1189.4 400 200 1026.1 1321.8 1102.2 1361.4 1230.7 0 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400 1450 m/z
Treponema pallidum
60 koncentráció (ppm) Középkori szifiliszes csont ok Hg koncent rációja (n=5) 50 40 30 20 A referencia mint ák Hg koncent rációja (n=10) 10 0
Osteosarcoma
Identified human proteins in osteosarcoma (Mascot score >60) Interferon alpha G Hypotetical rhabdomyosarcoma antigen Mu-RMS-40.6c DLC-1 CEP 110 protein Intracellular protein Mg11 homolog DKFZp564A032.1 Retinoic acid-induced protein 1 Dead box protein 3 Dead box helicase Dead box polypeptide 4 Nucleocapsid protein Zinc finger protein 490
Személyazonosítás
Köszönöm a figyelmet!