Témavezető: Kötelesné Suszter Gabriella

Átírás

1 Tudományos Diákköri Dolgozat ÁMENT ZSUZSANNA Peszticidek meghatározása alacsony zsírtartalmú élelmiszerekből keverőbabás extrakció alkalmazásával Témavezető: Kötelesné Suszter Gabriella Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2007

2 Tartalomjegyzék 1. Bevezetés Irodalmi áttekintés Növényvédelem, mely egyidős a mezőgazdasággal Szennyezett növényzet, peszticidek jelenlétét befolyásoló tényezők Növényvédő szerek szabályozása A peszticidek felosztása Módszerek a növényvédőszer-hatóanyagok koncentrációjának meghatározására Extrakciós eljárások Folyadék-folyadék extrakció (LLE) Szilárd fázisú extrakció (SPE) Szilárd fázisú mátrix diszperzió (MSPD) Szilárd fázisú mikroextrakció (SPME) Keverőbabás extrakció (SBSE) Retenciós idő zárolás (RTL) A növényvédő szer hatóanyagok detektálási módszerei Tömegspektrumos dekonvolúció (AMDIS) Kísérleti rész Célok A minta feldolgozásának menete Vizsgált növényvédő szerek A minta-előkészítés során végzett extrakció hatásfokának vizsgálata A keverési idő optimálása A mintabevitel Elemzés Kondicionálás, tisztítás A keverőbabák kezelése és kondicionálása Twiszter csövek és fiolák tisztítása Külső kalibrációval végzett mérések Validálás A validálás során vizsgált teljesítményjellemzők: Specifikusság vizsgálata Linearitás vizsgálata Az elméleti kimutatási határ (LOD) és a mennyiségi meghatározás határának (LOQ) megadása Összefoglalás Irodalomjegyzék

3 1. Bevezetés A peszticid szó jelentése kártevőt ölő szer, olyan anyag, illetve készítmény, amely elpuszítja a nemkívánatos élőlényeket. Évszázadokkal ezelőtt alkalmazásukat az életfeltételek javítása, jó minőségű és kellő mennyiségű élelmiszer előállítása vezérelték. Mára világossá vált, hogy ezen anyagok használata aggodalomra ad okot, mert a legtöbb esetben feltételezhető mutagén, teratogén, karcinogén hatás is [1,2]. Így a kezdeti célok, a jobb életfeltételek és a jó minőségű élelmiszerek igencsak megkérdőjeleződnek, a gazdasági érdek azonban, amely a kellő mennyiséget szorgalmazza, sok esetben erősebbnek bizonyul. Ezen kettős érdekek egyensúlyban tartását célozzák meg azok a jogszabályok, melyek a határértékeket szabnak az egyes hatóanyagok koncentrációjára. Követelmény, hogy a kijuttatott anyagok megjelenése és koncentrációja folyamatos kontroll alatt álljon, melyhez megfelelő teljesítőképességű, modern analitikai módszerek szükségesek. Egy új, korszerű analitikai módszer megjelenését általában hosszú periódus követ, melynek során a technika kipróbálásra és publikációra kerül. Egy rutinanalitikai labor esetében ez az időintervallum akár megkétszereződhet, hiszen a rutin alkalmazást meg kell előzze a módszer validálása, és annak hivatalos szervek általi jóváhagyása. A Wessling Hungary Kft. Élelmiszervizsgáló Laboratóriumában végzett munkám célja egy modern módszer rutinanalitikába való átültetése, validálása, mely kiválthatja a gyakran lassabb, nagy oldószerigényű, szabványosított eljárásokat. 2. Irodalmi áttekintés 2.1. Növényvédelem, mely egyidős a mezőgazdasággal Az évezredek során a létfenntartás ösztöne az emberiséget mindig is arra késztette, hogy a megélhetését biztosító terményeket védelmezzék az azonos ösztön által vezérelt egyéb fajokkal szemben. A gombaölő hatású ként, mint füstölőszert, Kínában már időszámításunk előtt 1000-ben használták. A XVI. században Japánban és Kínában arzén vegyületeket 3

4 alkalmaztak, mint inszekticid (rovarölő) anyagokat. Európában 1800-ban kezdték alkalmazni az arzén vegyületeket, és az 1900-as években jegyezték az első mérgezési eseteket, arzén tartalmú gyümölcsök és zöldségek fogyasztása után [3]. Peszticidekként 1940 előtt elsősorban szervetlen vegyületeket alkalmaztak, valamint néhány növényi eredetű molekulát, mint például a nikotint vagy permetrint. Az első szintetikus szerves peszticid, a DDT alkalmazása az 1930-as évekre nyúlik vissza. A világ teljes DDT termelése 1960 körül érte el a legmagasabb értéket, közel százezer tonnát, ezután meredeken visszaesett [4]. A DDT-t karbamátok és szerves foszfátok váltották ki, melyek kémiailag sokkal kevésbé stabilisak, és így az élő szervezetekben kisebb mértékben halmozódnak fel, azonban nagyobb reakciókészségük miatt erőteljesebben mérgezőek Szennyezett növényzet, peszticidek jelenlétét befolyásoló tényezők A peszticidek előfordulása a zöldségekben, gyümölcsökben és ezen alapanyagokból előállított termékekben egyrészt a növényvédő szerek nem megfelelő kezeléséből, esetleg ipari, kereskedelmi, vagy mezőgazdasági balesetekből adódhat. Másrészt viszont ezek az anyagok helyes mezőgazdasági gyakorlat esetén is közvetlenül a védeni kívánt terményekre, termésekre kerülnek. A növényen, ill. a növényben lévő koncentrációt többek között befolyásolhatja a klíma (esőzés, hőmérséklet, felszíni vizek szennyezettségének mértéke), a növényvédő szer vízoldhatósága, illékonysága, a kezelés során alkalmazott szerformátum, a kezelés módja (állománykezelés, felületre történő permetezés, talajba való bedolgozás, csávázás, légi kijuttatás stb.), az alkalmazott dózis, az alkalmazás ütemezése, a növényvédő szer kémiai és biológiai stabilitása (perzisztencia), eltarthatósága (gyorsan ill. lassan bomló). A vegyületek bomlása szempontjából, két fontos tényezőt kell figyelembe venni: a bomlás ütemét és módját. Ezek a tulajdonságok az egyes komponensekhez rendelhetőek meghatározott körülmények között, de nagyon különbözőek is lehetnek különböző célnövények esetében. A peszticidek toxikus hatása az együttesen zajló fizikai, kémiai és biológiai folyamatok következtében szűnik meg. 4

5 A kémiai degradáció körébe tartozik minden olyan lebomlási folyamat, mely nem igényel közvetlen kölcsönhatást a növénnyel. A kémiai lebomlás az alábbiak szerint történhet: Oxidáció: pl. β-oxidáció, hidroxilezés, dealkilezés, dehidrogénezés, epoxidáció, szulfoxidáció, gyűrűhidroxilezés, -hasítás Redukció: pl. dekarboxileződés, dehidrohalogénezés, hidrolízis, dehalogénezés, alkilezés, konjugációs reakciók stb. A kémiai bomláshoz általában aktiváció kell, amely lehet termikus, foto-, radio- vagy elektrokémiai. Az összes, a peszticidek bomlásában szerepet játszó folyamat közül rendszerint a mikrobiológiai bomlást tartják a legjelentősebbnek. A mikroorganizmusok azon tulajdonságát, hogy bizonyos peszticideket képesek lebontani, először Audus mutatta be [5], más kutatók, mint például Fellsott [6] rámutattak, hogy egyes növényvédő szerek ugyanazon a területen történő ismételt alkalmazása a mikrobiológiai bomlásuk akkora mértékű felgyorsulásához vezethet, hogy azok elvesztik hatékonyságukat Növényvédő szerek szabályozása Az ENSZ Élelmezésügyi Szervezete (FAO) és az Egészségügyi Világszervezet (WHO) indította el 1963-ban a Codex Alimentarius Programot, amely nemzetközileg elfogadott élelmiszerszabványokat dolgoz ki. A nemzetközileg elfogadott élelmiszerszabványokon felül a Codex tartalmaz előírásokat az élelmiszerhigiéniára, adalékanyagokra, peszticid maradékokra, egyéb szennyezőkre, címkézésre, az analitikai és mintavételezési módszerekre vonatkozóan. A peszticidekkel és a megengedett maximális mennyiségükkel külön kötet foglalkozik [7]. Az Európai Unió korábban a tagországok döntéshozó testületeinek csak ajánlást adott az egészségügyi határértékekről Február 23-a óta az eddigi irányelvek helyett rendeletben szabályozza a szermaradékok határértékeit (396/2005/EC). Az új rendelet az egész Európai Unió összes tagállamára érvényes határértékeket szab meg. Egységes határértékeket ad meg a növényi és állati eredetű termékekre, valamint gabonafélékre, noha az eddigi gyakorlat szerint a három terület külön elbírálás alá esett. Abban az 5

6 esetben, ha egy engedélyezett hatóanyag termény párra nincsenek toxikológiai adatok egységes 10 µg/kg-os határértéket engedélyeznek. Magyarországon az EüM-FVM együttes, folyamatosan frissülő rendelet szabályozza az egyes peszticidekre és a növényi mátrixokra vonatkozó határértékeket, illetve az esetleges tiltásokat. Az engedélyezett, korlátozott, illetve tiltott szerek listája megtalálható a Növény- Talaj- és Agrárkörnyezet-védelmi Igazgatóság honlapján [8] A peszticidek felosztása A növényvédőszer-hatóanyagok felosztása, illetve besorolása a veszélyesség, a kémiai szerkezet, a felhasználás módja, valamint a hatás és hatásmechanizmus alapján történik. Az egységes felosztás jelenleg nem megoldott. A WHO által javasolt felosztás [9]: Vegyi felosztás, és a kategóriák nemzetközi rövidítései: Arzén-vegyületek (AS) Bipiridilium származékok (BP) Karbamátok (C) Kumarin származékok (CO) Réz-vegyületek (CU) Higany-vegyületek (HG) Nitrofenol származékok (NP) Szerves klór-vegyületek (OC) Szerves foszfátok (OP) Szerves ón-vegyületek (OT) Fenoxi-ecetsav származékok (PAA) Pirazolok (PZ) Piretroidok (PY) Triazin származékok (T) Tiokarbamátok (TC) Felhasználás szerinti felosztás, és a kategóriák nemzetközi rövidítései: Aficid (levéltetű írtó, AP) Akaricid (atkaölők, AC) Bakteriosztatikus peszticidek (fertőtlenítők, B) Fumigánsok (füstölők, FM) Fungicidek (gombaölőszerek, F) Herbicidek (gyomirtók, H) Inszekticidek (rovarölőszerek, I) Larvicidek (lárvaölőszerek, L) Miticidek (atkaölőszerek, MT) 6

7 Molluszcidek (puhatestűek elleni szer, M) Nematocidek (féregőlők, N) Növényi fejlődést szabályozó peszticidek (PGR) Rodenticidek (rágcsálóirtók, R) Talajra alkalmazott peszticidek (S) A felsorolás jól érzékelteti, hogy az analitikai feladatok a peszticidek meghatározását illetően mennyire szerteágazóak. Jól tükrözi ezt a minta-előkészítési és a detektálási módszerek sokasága is Módszerek a növényvédőszer-hatóanyagok koncentrációjának meghatározására A növényvédő szerek, mint nyomszennyezők környezeti elemekben való kimutatására több száz módszer született, mióta a szintetikus növényvédő szerek alkalmazásával egyidejűleg fejlődésnek indult a növényvédőszer-analitika. Általánosságban a szermaradékok analitikájában megkülönböztetünk egy bizonyos komponens mérésére alkalmas, single-compound és több hatóanyag egyidejű mérésére alkalmas, multi-residue módszereket. Egy komponens, ill. egy vegyületcsalád kimutatására alkalmas eljárásokat rendszerint a gyártó cégek fejlesztették ki az általuk gyártott termékekre, és az engedélyezéshez kapcsolódó vizsgálatok folyamán is ezeket alkalmazták. Ma a növényvédő szerek nagy száma, valamint az osztályokba sorolás nehézségei miatt nem alkalmazhatóak ezek a módszerek, így a mai rutin analitikai eljárásokban arra törekednek, hogy a több száz növényvédő szerből minél többet meghatározzanak minél kevesebb mérésből. Gyors és hatékony módszerekre van szükség ahhoz, hogy még a gyorsan romló élelmiszerek esetén is ellenőrzött termék kerülhessen a fogyasztókhoz. A helyes kontroll alapja az élelmiszeranalitikában is a helyes mintavétel valamint a minta alapos homgenizálása, mely meghatározó szerepet játszik az eljárás során, és nagyban befolyásolja a helyes mérési eredményt. A mintavételezéssel szemben támasztott fő elvárás, hogy reprezentatív legyen, ezért egyes estekben speciális mintavevő eszközöket alkalmaznak. Ezután következik a minta feldolgozása. 7

8 A mintavétellel, a minták szállításával és tárolásával kapcsolatos munkálatokat szakemberek végezték, és ez a fázis nem képezte vizsgálataim tárgyát, valamit munkám során a feladat jellegéből adódóan multi-residue módszer alkalmazása szükségszerű, így a továbbiakban ezeket a módszereket tekintem át Extrakciós eljárások A multi-residue módszerek közös jellemzője hogy olyan extrakciós eljárásokat próbálnak alkalmazni, ami a meghatározást végző műszer számára a hatóanyagokat alkalmas oldószerben tartalmazó extraktumot eredményez, ugyanakkor minél kevesebb egyéb szennyező anyagot (mátrixalkotót) visz be a készülékbe Folyadék-folyadék extrakció (LLE) Szerves komponensek extrahálására használt eljárás (Liquid-liquid Extraction), melynek során az oldott meghatározandó anyag megoszlik az extrahálandó mártrixalkotók és az ezekkel nem elegyedő oldószer között. A használt oldószerek (diklór-metán, dietil-éter, etil-acetát, kloroform, hexán, petroléter, toluol) nagy része ártalmas a dolgozók egészségére és a környezetre, ezen túlmenően a módszer időigényes és nagy mennyiségű oldószer felhasználásával jár, ezért egyre kevésbé felel meg a mai modern analitikai laboratóriumra vonatkozó követelményeknek. A klasszikus módszert (LLE) az élelmiszeranalitikában régóta alkalmazzák, növényvédőszer-analitikában pedig a nyers (pl. vizes, acetonos) extraktban oldott hatóanyagok szerves fázisba vitelére [10], vagy olyan élelmiszereknél, melyeknél egyszerű rögtön folyadék fázisból kiindulni, mint például a méz esetében [11] Szilárd fázisú extrakció (SPE) A szilárd fázisú extrakció (Solid Phase Extraction), oszlopkromatográfiás módszer, melynek során a tisztítandó extraktumot meghatározott sebességgel (általában vákuumot alkalmazva) átbocsátják egy adszorbenst tartalmazó kolonnán, melyen a célkomponensek megkötődnek. [12]. 8

9 Az extraktumok további tisztításának szükségességét számos tényező határozza meg. Ilyenek pl. a mátrixot felépítő egyéb anyagok, a mérendő koncentrációszint, a detektálási módszer és az extrakciós módszer szelektivitása. A legelterjedtebben alkalmazott módszer a gél permeációs kromatográfia (GPC). Az eljárás fizikai alapú, molekulaméret szerinti szeparáció. Azok a komponensek eluálódnak elsőként az oszlopon, amelyek a töltetpórusokba nem férnek bele. Az oszlopok hosszú élettartalmúak, és a módszer automatizálható [13] Szilárd fázisú mátrix diszperzió (MSPD) A szilárd fázisú mátrix diszperzió (Matrix Solid Phase Dispersion) a szilárdfázisú extrakcióval rokon, leggyakrabban zöldség és gyümölcs elemzésénél, vagy nehezen kezelhető minták (pl. tojás) esetén alkalmazzák. A módszer leegyszerűsíti és meggyorsítja a minta-előkészítés folyamatát, mivel egyetlen lépésbe tömöríti a minta homogenizációját, a sejtek roncsolását és a minta felvitelét a por állagú fázisra, mely gyakran az SPE töltetek közül kerül ki. A töltetet eldörzsölik a homogenizált mintával, az így nyert keveréket SPE patronba töltik, majd kondícionálás, tisztítás után leoldják a vizsgálandó komponenseket [14] Szilárd fázisú mikroextrakció (SPME) A szilárd fázisú mikroextrakciót (Solid Phase Micro Extraction) J. Pawliszyn fejlesztette ki [15, 16], majd a Supelco cég szabadalmaztatta és forgalmazza. A SPME lényege egy kvarc- vagy fémszál (fíber), amelynek felületére kémiai kötéssel különböző polimer folyadékfilmet rögzítenek. A polimer lehet poláris (pl. polimetakrilát) vagy apoláris (pl. polidimetil-sziloxán), mely a szálon vékony megosztó fázist alkot, ami a minta gőzterébe (ez az ún. headspace SPME, azaz HS-SPME), vagy a vízmintába helyezve szelektíven adszorbeálja a minta egyes komponenseit. Az adszorpciót követően a fíbert a gázkromatográf C-ra fűtött injektorába helyezve, az extrahált komponensek termikusan deszorbeálódnak, és az analízis elvégezhető. 9

10 A SPME-vel történő minta-előkészítés rendkívül egyszerű és gyors, a szükséges mintatérfogat 5 20 cm 3, emellett nagy a dúsítás mértéke (körülményektől függően szeres), így alacsony kimutatási határ érhető el Keverőbabás extrakció (SBSE) A keverőbabás extrakció (Stir Bar Sorptive Extraction) egy egyensúlyi megoszláson alapuló új technika, melyet Baltussen és kutatócsoportja fejlesztett ki, és a Gerstel cég Twister néven forgalmaz [17]. Az elv hasonlít a SPME-hez, egy keverőbabára felvitt polimer réteg extrahálja a mérendő komponenseket a mintából. A polimer (jelenleg csak polidimetil-sziloxán (PDMS) kapható) fázist olyan üvegtestre viszik fel amely a mágneses részt burkolja (1.a ábra), így megvalósítható a kevertetés, melynek során az extrakció mellett a minta agitálása is biztosított. (A twister másik szintén SPME-hez hasonló alkalmazása a gőztér analízis (1. c. ábra)). Az adszorpciós lépés után az extrahált komponenseket visszaoldhatjuk vagy lefűthetjük. 1.a. ábra: A keverőbaba, b: SBSE, c:hs-sbse A visszaoldást (2. ábra) általában HPLC-s elemzés esetén alkalmazzák, vagy ha a lefűtéshez szükséges speciális egység nem áll rendelkezésre. 2. ábra: visszaoldás 10

11 Gázkromatográfiás elemzésnél a keverőbabát a mintából kivéve megszárítjuk, majd egy deszorpciós csőbe helyezzük. A lefűtés egy erre kialakított termodeszorber egységben történik (3.a. ábra), mely a gázkromatográfiás injektor fölé van szerelve (3.b. ábra). 3.a ábra: Termodeszorber egység (TDU), b: Termodeszorber felépítése A deszorpció két lépésből áll: a lefűtés a TDU-ban történik melyen beállítható a kezdő hőmérséklet, a felfűtési sebesség és a véghőmérséklet. A második lépés a csapdázás a programozhatóan fűthető injektorban (Programable Temperature Vaporization PTV vagy Cooled Injection System CIS). Ezután a termodeszorbert lehűtjük, és pillanatszerűen felfűtjük az injektort, valamint elindul az oszlop hőmérsékletprogramja. Ezzel rávisszük a mintát az oszlopra, megtörténik az injektálás. A módszer extrakciós hatásfoka rendkívül nagy, mely részben a fázis méretének köszönhető (vastagsága 0,1 1 mm, térfogata kb. 50 µl), amely jóval nagyobb, mint a SPME esetében (vastagság µm, térfogat kb. 0,5 µl), ahol könnyen előfordulhat a fíber túltelítése. A keverőbabás extrakciónál ennek valószínűsége nagyon csekély. Az extrahálható komponensek körét az egyes hatóanyagok K o/w, azaz oktanol-víz megoszlási hányados értéke határozza meg. A gyakorlat azt mutatja, hogy azoknak a vegyületeknek a visszanyerése több mint 50%, amelyeknél a K o/w > 100. Vagyis az irodalom alapján azok a vegyületek elfogadhatóan twiszterezhetőek, melyekre igaz, hogy a log K o/w > 2 [18]. 11

12 Az egyes komponensekre vonatkozó megoszlási hányadosok és az elméleti visszanyerési adatok a Gerstel által fejlesztett szoftverben (Twister Recovery Calculator) találhatóak meg. A módszer növényvédőszer-analitikai alkalmazása nagy jelentőségű, saját munkám szempontjából kiemelkedő fontossággal bír Prof. Pat Sandra és munkatársainak 2003-as közleménye, melyben keverőbabás extrakcióval meghatározott növényvédőszermaradékokat zöldség és gyümölcs mátrixokban vizsgálták retenciós idő zárolásos (RTL) GC-MS módszerrel [19] Retenciós idő zárolás (RTL) A retenciós idő zárolás, (Retention Time Locking) az Agilent által kifejlesztett szoftver-vezérelt technika, mely elektronikus nyomásszabályozóval rendelkező készülékeken alkalmazható. Lényege, hogy a végleges hőmérsékletprogrammal felvett standard kromatogram egyik, általunk kiválasztott csúcsára retenciós idő- vivőgáz nyomás görbét veszünk fel. Öt párhuzamos mérés kromatogramja alapján a rendszer rögzíti a retenciós időket az eredeti vivőgáznyomáson, majd ennek 10 és 20%-kal növelt, illetve csökkentett értéke mellett, és (öt pontos) kalibráló egyenest készít a retenciós idő vs. vivőgáz adatokból. Ha később karbantartási okokból vágunk az oszlopból, megváltozik a retenciós idő. Ekkor a rendszer az eredeti paraméterek által meghatározott görbe alapján új nyomás értéket számít ki, úgy, hogy a retenciós idő változatlan maradjon. A RTL használata előnyös lehet SIM (Selective Ion Monitoring) módszerek esetén, hogy tartani tudjuk a retenciós idő ablakokat, azonban még ennél is jelentősebb a kereskedelmi forgalomban lévő azonosító módszerek esetén. Az azonosító módszer tartalmazza az oszlophőmérséklet-programot, az alkalmazott oszlop típusát és a kiválasztott vegyületet, mely adatok segítségével azonos retenciós időket produkálhatunk tetszőleges számú vegyületre. Az Agilent peszticid RTL adatbázisában több mint 500 vegyület található [20]. 12

13 2.7. A növényvédő szer hatóanyagok detektálási módszerei A szelektív gázkromatográfiás detektorok nélkülözhetetlen alapját alkotják a peszticidek azonosítási módszereinek. A detektálás alapja a vizsgálandó molekulában található heteroatom, illetve funkciós csoport. Az 1. táblázat tartalmaz néhány a növényvédőszer-maradék analitikában általánosan használt konvencionális detektort és szelektivitásukat [21]. Detektor Elektronbefogási detektor (ECD) Nitrogén-foszfor detektor (NPD) Elektrolitikus vezetőképességi detektor (ELCD) Lángfotometriás detektor (FPD) Szelektivitás Halogének, CN, NO 2, egyéb elektronbefogásra alkalmas csoportok Nitrogén és foszfor Halogének, kén, nitrogén Foszfor, kén, ón 1. táblázat: Peszticidek meghatározására alkalmas hagyományos GC detektorok A számos hatóanyagra jól használható GC-s technikák egyes vegyületcsoportokra (azok termikus instabilitása vagy kevésbé illékony voltuk miatt) nem alkalmazhatók közvetlenül. Ezekre tipikus példákat tartalmaz a 2. táblázat [22]. Vegyületcsoport Savas gyomirtó szerek Poláris gyomirtó szerek Fenil-karbamid gyomirtó szerek Szulfonil-karbamid gyomirtó szerek Oxim-karbamát rovarölő szerek Benzimidazol gombaölő szerek Ditiokarbamát gombaölő szerek Poláris gombaölő szerek GC-vel nem vizsgálható vegyületcsoportok ill. vegyületek fenoxi-alkánsavak, benzoesavak, propionsavak paraquat, diquat, glifozát diuron, fenuron,izoproturon, neburon klórszulforon, metszulforon aldikarb, oxamil benomil, karbendazim maneb, mankoceb, cineb trifoorin, foseil-al 2. táblázat: GC-s módszerekkel nem mérhető hatóanyagcsoportok és vegyülettípusok 13

14 Ezen vegyületek detektálása származékképzést követően GC-s módszerekkel, illetve származékképzés nélkül vékonyréteg-kromatográfiás vagy folyadékkromatográfiás méréssel valósítható meg Tömegspektrumos dekonvolúció (AMDIS) Mátrix komponensekkel erősen szennyezett minták esetében, vagy több vizsgálandó komponens koelúciója esetén nem valósul meg a teljes kromatográfiás elválasztás, a csúcsok átlapolhatnak, esetleg teljesen el is fedhetik egymást. Amennyiben tömegspektrométerrel detektálunk, lehetőségünk van az átfedő kromatográfiás csúcsok dekonvolúciójára az egyes komponensek tömegspektrumai alapján. A dekonvolúció egy tisztán matematikai eljárás, mely az egyes fragmensek intenzitásának időbeli változását követi, meghatározza az együtt mozgó, egy vegyülethez tartozó fragmenseket, kivonja a spektrumból a hátteret és az interferenciát, és előállítja a letisztított spektrumot. Az így kapott spektrum az adatbázissal összevetve általában jó egyezést ad. Ilyen dekonvolúciós szoftver az AMDIS (Automated Mass-spectral Deconvolution and Identificaton System), melyet a NIST (National Istitute of Standards and Technology) fejlesztett ki [23, 24]. A letisztított tömegspektrumot a szoftver összeveti az NIST spekrumkönyvtárával, és kiszámítja az egyezés minőségét, így a dekonvolúciós szoftver az adatbázisban található vegyületekre célzottan átvizsgálja a scan kromatogramokat. A szoftver a bevitt adatok dekonvolúciója után listát hoz létre. A lista egyes elmeire kattintva egy ablakban ábrázolja az eredeti tömegspektrumot és a matematikai módszerrel tisztított tömegspektrumot. Egy másik ablakban összeveti a tisztított spektrumot a találatként megjelölt hatóanyag NIST könyvtárban található tömegspektrumával (4.ábra). 14

15 4.ábra: Extrahált spektrum az AMDIS szoftverben 15

16 3. Kísérleti rész 3.1. Célok Feladatom alapjául Dr. Kende Anikó munkája szolgált [25], amely során az EKOL (Elválasztástechnikai Kutató-Oktató Laboratórium) keretein belül elindította a keverőbabás minta-előkészítési technika adaptálását növényvédőszer-maradékok élelmiszer alapanyagokból történő meghatározására. Célom, elvégezni a Wessling Hungary Kft. Élelmiszervizsgáló Laboratórium számára egy SBSE-TD-RTL-GC-MS módszerrel történő méréssorozatot növényvédő szer maradékok meghatározására, valamint a módszert optimálni, végül előkészteni a módszer akreditációját A minta feldolgozásának menete Az első lépésben a mintát homogenizáljuk. Az élelmiszerminták sokfélesége miatt ez a művelet lehet, őrlés, darálás, turmixolás, folyékony élelmiszerek esetén keverés, rázatás. A homogenizált mintából 15 g-ot centrifugacsőbe mérünk, és ahhoz 30 ml metanolt adunk. Vizsgálataim során az ezután következő extrakciós lépést optimáltam, összehasonlítva az ultrahangos rázatás és a rázatógépen történő agitálás extrakciós hatásfokát (3.4. bekezdés). A rázatást követően a próbákat centrifugáljuk (10 perc, 3500 rpm), így elkülönülnek a nagyméretű mátrixalkotók, és tiszta fölülúszót kapunk. A felülúszó fázisból kiveszünk 2 ml-t, és 8 ml desztillált vizet tartalmazó fiolába rakjuk, majd belehelyezünk egy 10 mm hosszú, 0,5 mm vastag PDMS fázissal bevont üveg keverőbabát (Twister -t). Kevertetéshez Gerstel Twister 15 helyes mágneses keverőt használtam. Meghatározott idejű kevertetés után (3.5. bekezdés), a keverőbabákat a vizsgált oldatból kivesszük, leöblítjük desztillált vízzel, papírtörlőn leitatjuk róla a vizet, majd 16

17 speciálisan erre a célra kialakított twister-deszorpciós csőbe helyezzük. A csövet fém kupakjával lezárjuk, majd az automata mintaadagoló tálcájába helyezzük. Ezt követi a mintabevitel (3.6. bekezdés) és az elemzés (3.7. bekezdés) Vizsgált növényvédő szerek A növényvédőszer lista (3. táblázat), mely 195 hatóanyagot tartalmaz adott volt, összeállításánál fontos szerepet játszott az EKOL azon törekvése, mely szerint olyan módszert kíván előállítani, amely a Magyarországon szabályozott (tiltott, illetve engedélyezett) növényvédőszerek teljes palettája lefedhető. (Jelenleg a Magyarországon engedélyezett peszticidek száma közel 400.) Hatóanyag Retenciós idő TIon Q1 Q2 Q3 CAS-szám log Ko/w 1 2,4,5-T methyl ester ,4-D methyl ester ,6-benzonitril/dichlobenil phenylphenol acetochlor ametryn aminocarb atrazine azinphos-ethyl azinphos-methyl benalaxyl benfluralin benzolylporp-ethyl BHC a bifenox bifenthrin bis(2,3,3,3-tetrachloropropyl) ether bitertanol bromophos bromophos-ethyl bromopropylate bromucaonzole buprofezin Butylate cadusaphos carbophenothion chlorfenapyr chlorfenprop-methyl chlorfenson chlorfenvinphos

18 31 chlorobenzilate chloroneb chloropropylate chlorothalonil chlorpropham chlorpyriphos chlorpyriphos-methyl chlorthal-dimethyl chlorthiophos clodinafop-propargyl Command/Clomazone coumaphos cyanazin cyanofenphos cyfluthrin cypermethrin cyphenothrin cyproconazole cyprodinil Demeton-S-methyl desmetryn diazinon dicamba dicaphton dichlofenthion dichlofluanid diclobutrazol dicloran diethofencarb difenoconazole diflufenican diniconazole diphenylamin dipropetryn disulfoton ditalimphos edifenphos endosulfan a endosulfan b endrin EPN epoxiconazole EPTC etaconazole ethion ethofenprox Etridiazole/Terrazole famphur fenamiphos fenarimol

19 81 fenazaquin fenchlorphos fenclorim fenitrothion fenpropathrin fenpropimorph fenson fensulfothion fenthion fenthion-sulfone fluazifop-p-butyl flubenzimine fluchloralin fludioxinil flumetralin fluquinconazole flusilazole fonofos genite heptachloroepoxide alpha heptachloroepoxide trans hexaconazole hexazinone ioxynil octanoate iprobefos isocarbophos isodrin isoprocarb isopropalin kresoxim-methyl Lindane linuron malathion metazachlor Methamidophos methidathion Methiocarb methyl-parathion metolachlor mevinphos myclobutanil napropamide nitralin nitrapyrin nitrofen nuarimol o,p`-dde o,p`-ddt o,p'-ddd oxadiazone

20 131 p,p`-ddd paclobutrazol paraoxon parathion penconazole pendimethalin pentachloroaniline pentachloroanisole Pentachloronitrobenzene Permethrin phorate phosalone piperonyl butoxide pirimiphos-ethyl pirimiphos-methyl procymidone profenofos profluralin promecarb prometryn FPD propalin propazine propham propiconazole propyzamid prothiophos pyraclofos pyrazophos pyridaben pyridafenthion pyrifenox pyrimethanil pyriproxifen quinalphos quinomethionate quinoxyfen quintozene/pentachloronitrobenze Resmethrin ruelene/crufomate Safrotin/Propetamphos sebuthylazine sulfotep tebuconazole tebufenpyrad tebutam tecnazene tefluthrin terbacil terbufos terbumeton

21 181 terbuthylazine terbutryne tetraconazole tetradifon tetramethrin I tetrasul thiometon tolclophos-methyl tolyfluanid triadimefon triadimenol triallate trifluralin trimethacarb vinclozolin táblázat: Vizsgált növényvédő szerek Munkám során ezen komponensek twisterezhetőségét vizsgáltam A minta-előkészítés során végzett extrakció hatásfokának vizsgálata Vizsgálataim során az ultrahangos rázatás és a rázatógépen történő agitálás extrakciós hatásfokát hasonlítottam össze. Mindkét esetben három párhuzamos mintát készítettem, azokat percig rázattam, majd a kapott eredmények átlagát vizsgáltam. A mért adatok egyértelműen mutatják (5.ábra), hogy az egyes komponensekre a rázógépes rázatás során nagyobb csúcsterület értékeket kaptam, a későbbiekben tehát ezt alkalmaztam. 21

22 Az extrakciós hatásfok vizsgálata Promecarb Tebutam Fenclorim Atrazine Terbumeton Pyrimethanil Sebuthylazine Vinclozolin Tetraconazole Cyprodinil Penconazole Procymidone o,p'-dde Flumetralin Nitrofen ultrahang Fluazifop-butyl p,p'-ddd rázógép Benalaxyl Propiconazole I Propiconazole II Resmethryn I Resmethryn II Bromuconazole I Bifenthrin Fenpropathrin Bromuconazole II Fenarimol Bitertanol Fluquinconazole alpha-cypermethrin 5.ábra: Az ultrahangos és rázatógépes mintaelőkészítés során kapott csúcsterületek összehasonlítása 3.5. A keverési idő optimálása Az optimális keverési időt 3-3 párhuzamos mérés átlagából, fél, egy, másfél és két órás kevertetés csúcsterület adataiból határoztam meg. Az átlagértékek ábrázolásából kitűnik (6.ábra), hogy másfél óra kevertetés után beáll az egyensúly, a csúcsterület értékek maximálisak, és további fél órás kevertetéssel nem növekednek. Ezért a további méréseim során másfél órás kevertetést alkalmaztam. 6.ábra: Csúcsterület értékek ábrázolása a keverési idő függvényében 22

23 3.6. A mintabevitel A kísérleteket Agilent 6890 GC, 5973 performance electronics inert MS rendszeren végeztem. A termodeszorber, Twister Desorption Unit (TDU), alatt a Cooled Injection System (CIS) Peltier hűtésű programozható injektorral csatlakozik a gázkromatográfiás oszlophoz. Az automata mintaadagoló, Gerstel MPS2, a deszorpciós csövek kezelésére is alkalmas (7.ábra). 7.ábra: Gerstel MPS-2 automata mintaadagoló A CIS és a TDU közötti kapcsolatot a liner hozza létre, melynek hossza kb. 6 mm-rel meghaladja az injektor hosszát. A TDU felhelyezésekor a CIS tetején kiálló liner szakasz a TDU belsejébe kerül úgy, hogy közvetlen kapcsolat jön létre a behelyezett deszorpciós cső szűkítés utáni szakasza és a liner között. A gázzárásról speciális, fémbe ágyazott grafittömítések gondoskodnak. A gázrendszer koordinálását egy vezérlő rendszer végzi, amely biztosítja a vivőgázt, a TDU és a CIS split ágát és szabályozza a pneumatikát mozgató sűrített levegőt is. A mintabevitel első lépése, hogy a gázkromatográf ready-jelet (készenlétet) ad ki, mire a CIS és TDU beállítja a kezdeti hőmérsékleteket (TDU 40 C, CIS 20 C). A TDU pneumatikus szelepe kinyit. A szelep zárásáról mindig az aktuális deszorpciós cső és 23

24 annak fém kupakja gondoskodik. Amikor nem folyik mérés, egy üres cső van a készülékben. Az automata mintaadagoló kiemeli a záró csövet a TDU-ból és parkoló pozícióba helyezi. Ezután kiemeli a mintatartó csövet a megfelelő tálcáról, és behelyezi a TDU-ba. A TDU hőmérséklet programja 40 C-ról 720 C/min sebességgel felfűt 280 Cra, majd 4 percig tartja a véghőmérsékletet. Négy perc után a Peltier hűtő visszahűti a TDU-t 40 C-ra. Ezalatt a vivőgáz a TDU-n keresztül átöblíti a deszorpciós csövet, és magával viszi a deszorbeált komponenseket a CIS-be. A CIS hőmérséklete 20 C, hogy a TDU-ból érkező anyagokat kicsapdázzuk. A CIS hőmérsékletprogramja akkor indul, amikor a TDU visszahűtött, ekkor 720 C/min sebességgel felfűt 280 C-ra és megtörténik az injektálás Elemzés A kromatográfiás oszlop HP-5 MS+ 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm típusú. Szennyezett minták esetén a szennyezők az oszlop elején kondezálódhatnak, ezért a karbantartás során általában egy cm-es darabot levágnak az oszlopról. Ennek következtében azonban változnak a retenciós idők, és a SIM ablakokat korrigálni kell minden karbantartás után, valamint a retenciós idő zárolás esetén kicsúszhatunk abból a tartományból, amelyre az eredetileg felvett ötpontos függvény érvényes, és amelyből a szoftver a megfelelő nyomásértéket számolja. Ennek kiküszöbölésére alkalmas az általam is használt bontható kötés Column Union Assembly (Agilent # ), melynek segítségével az analitikai oszlophoz azzal egyező paraméterekkel rendelkező előtétoszlop csatlakoztatható. A két oszlop egy üvegtestben találkozik, így meggyőződhetünk a helyes pozícionálásról. Szakszerűen alkalmazva gázszivárgási problémák nem merülnek fel. A későbbiek során történő karbantartások alkalmával pedig elegendő az előtétoszlop cseréje, biztosítva ezzel az állandó hosszúságú oszlopot. Az oszlop hőmérsékletprogramja az Agilent növényvédő szer azonosításra kifejlesztett RTL módszere alapján 70 C-ról indul, tartja 2 percig, majd 25 C/min sebességgel felfűt 150 C-ig, ahonnan 3 C/min sebességgel fűt 200 C-ig, végül 8 C/min sebességgel fűt fel 280 C-ra, majd ezt a hőmérsékletet még 10 percig tartja. Összefoglalva (4. táblázat): 24

25 70 C 2 perc 25 C/min 150 C 3 C/min 200 C 8 C/min 280 C 10 perc 4.táblázat: Az RTL módszer alapján fejlesztett hőmérsékletprogram A transfer line hőmérséklete 300 C, az oldószer csúcsot kivágó solvent delay 3,2 min. Az ionforrás hőmérséklete 230 C, a kvadrupólé 150 C Kondicionálás, tisztítás Tekintettel arra, hogy a mérendő komponensek általában labilisak és rendszerint kis koncentrációban vannak jelen a mintában, valamint több kutató is bizonyította egyes vegyületek adszorpcióját a használt üvegeszközök [26], és egyéb anyagok, például polietilén felületén [27], nagyon körültekintőnek kell lenni az analízis során használandó eszközök kiválasztása, kezelése és tisztítása során. Az általam használt eszközök közé tartozik a poletilén centrifugacső, melyet egyszeri mintaelőkészítésre alkalmazok, valamint 40 ml-es fiolák, twiszter deszorpciós üvegcsövek, és természetesen a keverőbabák. Az utóbbi eszközök újbóli használata szükségszerű, ezért kezelésüket, tisztításukat nagy körültekintéssel végeztem A keverőbabák kezelése és kondicionálása A keverőbabák esetében a tisztítási eljárás alapjául a gyártók által mellékelt leiratot alkalmaztam, valamint vizsgáltam és optimalizáltam az áztatásra és lefűtésre szükséges időt, melyek után az esetleges maradékszennyezőket már nem lehet kimutatni. A kondicionálás első lépése az oldószeres leoldás. A keverőbabákat metanol: diklórmetán 1:1 arányú elegyébe helyezzük, majd ultrahanggal 20 percig rázatjuk. Ez az időintervallum elegendő ahhoz, hogy a baba felületén lévő PDMS fázis a diklórmetán hatására jól láthatóan kifehéredjen, megduzzadjon, és szennyező célkomponensek 25

26 feltehetőleg legnagyobb koncentrációban az oldószerbe vándoroljanak. Ezután a babákat újabb, tiszta oldószerelegyben két napig áztatjuk, elegendő időt biztosítva ezzel az egyensúly kialakulásához. A keverőbabákat az oldószerelegyből kivéve addig szárítjuk, míg a PDMS fázis ismét elnyeri eredeti színét és méretét, ezután következik a lefűtés. A kondicionálás ezen lépése történhet a gyártó által forgalmazott regeneráló egységben, vagy annak hiányában a mérőkészülékben. A kondicionálás után a mérési módszerrel a vizsgálandó komponensek nem kimutathatóak, a baba tisztának tekinthető. A két napos ázatási idő hosszúnak tűnhet, ez azonban azért szükséges, mert ugyan egyes babák esetén pusztán az ultrahangos rázatás elegendőnek bizonyult, másoknál azonban az egy napos áztatás után is visszamérhetőek (10 babából átlagosan 4 esetén) kb. 1 0,1%-ban a célkomponensek. Ez azért fordulhat elő, mert a vizsgált hatóanyagok koncentrációja nagymértékben eltérhet az egyes mintákban. Hogy megmondhassuk, éppen melyik babát használjuk mintákból történő nyomjelzésére és melyiket a kalibráció legfelső pontjának beállítására, szükséges lenne azok életútját nyomon követni, amely azonban merész vállalkozás, különös tekintettel arra, hogy mindegyikük egyforma Twiszter csövek és fiolák tisztítása Mint már korábban említettem, a használt üvegeszközök felületén is valószínű egyes apoláris komponensek adszorpciója, ezért a kikevertetéshez alkalmazott fiolákat mosogatás előtt a babák esetében is alkalmazott oldószer eleggyel öblítettem át. A twiszter csövek tisztításánál érdemes minél többet egyszerre mosogatni úgy, hogy azokat szűkítéssel lefelé főzőpohár aljára állítjuk. A tisztításra váró csöveket legelső lépésként mosogatószeres vízben tíz percig ultrahangban rázatjuk, hogy az esetleges zsíros szennyeződéseket lemossuk. Ha a csöveket kizárólag tiszta kesztyű segítségével mozgatjuk, ez a lépés elhagyható. Ugyanezt a lépést (feltöltés-rázatás) elvégezzük a következő oldószerekkel, a következő sorrendben: desztillált víz, aceton, hexán, aceton [25]. Ezután a csöveket száradásig állni hagyjuk. Az ultrahangos tisztítási lépések során az oldószer párolgása miatt a főzőpohárra óraüveget helyezünk. 26

27 3.9. Külső kalibrációval végzett mérések Munkám megkezdésekor külső kalibrációt alkalmazva végeztem a mennyiségi meghatározást. Kísérletek sokaságát elvégezve a mérések alatt az alapos karbantartás elvégzése után is nyilvánvalóvá vált a babák korróziója. Ez megfigyelhető felületükön, de nyomon követhető a kalibrációs görbék korrelációs koefficiens (R 2 ) értékeinek összevetése alapján is (8. ábra). A grafikonról 10 különböző napon végzett kalibrációs görbék R 2 értékeit olvashatjuk le. 8.ábra: R 2 értékek változása különbőző napokon végzett kalibráció adatokból Az egyes görbéken jól látható, hogy a változás minden komponensre azonos napokon szignifikáns. Ebből azt a következtetést vontam le, hogy a babák adszorpciós képessége 27

28 nem azonos, valószínűleg minden felhasználás alkalmával csökken, melynek logikus magyarázata lehet, hogy egyes mátrixok komponensei kedvezőtlen esetben eltömíthetnek kötőhelyeket, valamint a lefűtések alkalmával fázisvérzés is előfordulhat. A mérési sorozat szermaradék vizsgálatok esetén akkor tekinthető elfogadhatónak, ha a kalibráció korrelációs koefficiense nagyobb, mint 0,99. Ezt a babák eltérő tulajdonságai miatt külső kalibrációval nem sikerült biztsítani, ezért belső standardet választottam. A belső standard megválasztásánál fő szempont, hogy biztosan ne forduljon elő a mintában, kémiai és fizikai tulajdonságai hasonlóak legyenek a meghatározandó komponenesekéihez, valamint a minta egyik komponensével se lépjen fel koelúció. Választásom a szermaradék analitikában széles körben alkalmazott deuterált chlorpyriphos-methyl-re esett. 4. Validálás A validálás kihívása egyrészt az a számtalan féle élelmiszerfajta melyek peszticidtartalmának mérésére megrendelés érkezhet, másrészt a meghatározandó hatóanyagok sokasága. A hitelesség és pontos validálás miatt nem elegendő egyszer (egyetlen növény esetén) elvégezni a validálást, hanem esetenként minden egyes mátrixra el kell végezni a méréseket. Mivel sok esetben mutatkozik egyezés a mátrixalkotók tekintetében, a Codex Alimentarius a tapasztalatok összegzését felhasználva adott tulajdonságú csoportokra reprezentatív növényeket ajánl 5. táblázat [28]. Csoport Általános tulajdonság Áru csoport Reprezentatív fajok I. magas víz és klorofill tartalom leveles zöldségek spenót, fejes saláta hüvelyesek Zöldbab II. magas víz és alacsony klorofill tartalom csonthélyasok barack, cseresznye bogyós gyümölcsök Földieper kis gyümölcsök Szőlő gumós növények burgonya, répa, petrezselyem III. magas savtatalom citrusfélék narancs, citrom IV. magas cukortartalom mazsola, datolya V. magas zsírtartalom olajos magvak dió, pekándió, pisztácia 28

29 VI. alacsony nedvességtartalom gabona búza, rizs, kukorica gabonából készült termék korpa, liszt Egyéni vizsgálatot igénylő termények fokhagyma, sör, tea fűszer növények, vörös áfonya, stb. 5.táblázat: Növényvédőszer maradékok validálásakor alkalmazható reprezentatív fajok Mivel ugyanilyen hasonlóság nemcsak az egyes élelmiszerfajták, hanem a vizsgálandó hatóanyagok között is fennáll, a validáláshoz követve a AOAC/FAO/AEA/IUPAC irányadásait [29] egy olyan mixet készítettem, melyek tulajdonságai [30] reprezentatív tartományát alkotják mind a 195 vizsgált hatóanyagnak (6. táblázat). Hatóanyag log K o/w retenciós idő vizoldhatóság Gőznyomás stabilitás DT50 mg/l C mpa C [napok] ph; C Methamidophos , 22 Mevinphos , 20 Demeton-S-methyl ,22 Terbacil Methidathion Bifenthrin Propham Azinphos-methyl , 22 Fenchlorphos Procymidone Vinclozolin Diazinon , 20 Cyprodinil Chlorpyriphos ,5 8, 25 Fenazaquin o,p`-dde Dicloran , 20 Lindane Linuron , 20 Bitertanol Difenoconazole Acetochlor , 20 6.táblázat: A validáláshoz használt hatóanyagok 29

30 A komponensek fizikai-kémiai tulajdonságaikat tekintve széles tartományt fednek le: vízoldhatóság 0,065mg/l 600g/l; logk o/w -0,80 8,15; gőznyomás 2, mPa; stabilitás nap (ph=7). (Természetesen más, egyéb paraméterekkel rendelkező hatóanyagok is alkothatnák a validáláshoz használt mixet.) Az összeállításnál számomra legfőbb paraméter az oktanol-víz megoszlási hányados volt, hiszen ettől (valamint a babán lévő fázis méretétől) függnek a gyártó által megadott elméleti visszanyerési adatok is. Ezért legtöbbet olyan komponsek közül választottam melyek logk o/w értéke az elfogdhatónak mondott 2 körüli tartományt fedi le. A hatóanyagok közül a methamidophos, mevinphos, demeton-s-methyl és terbacil babás kevertetés után nem detektálható (9.b.ábra) (logk o/w <1,89), ezért az ez alatti logk o/w -vel rendelkező hatóanyagokat a továbbiakban nem-twisterezhetőnek tekintem. 9.a ábra: A standard kromatogram folyadékinjektálással; 30

31 9.b ábra: A standard kromatogram keverőbabás extrakciót követő lefűtéssel 4.1. A validálás során vizsgált teljesítményjellemzők: Specifikusság: A vizsgálandó szermaradékokat interferáló szennyezés nem zavarhatja. A specifikusság meghatározásához felvettem és összevetettem a hozzáadásos vizsgálathoz használt kontroll minta, a kalibrációhoz használt standard elegy és a kimutatási határ szintjének megfelelő koncentráció szinten végzett hozzáadás után kapott minta kromatogramját. 31

32 Linearitás: A detektálási mód lineáris tartományának át kell fognia a tervezett analitikai tartományt. A szükséges koncentráció-tartományban elkészítettem a kalibrációs egyenest és regresszióanalízis segítségével döntöttem az összefüggés lineáris voltáról, annak elfogadhatóságáról. A linearitás vizsgálatát az analitikai eljárás munkatartományán belül végeztem el. Elméleti kimutatási határ (LOD µg/kg): Az alkalmazott kromatográfiás körülmények között a zaj háromszorosával egyenlő csúcs létrehozásához szükséges anyagmennyiségből számított koncentráció. Mehatározása analitikai standardok injektálásával történt a kalibrációs görbéből történő számítással. Mennyiségi kiértékelés határa (LOQ, µg/kg): Az a mintában mérhető legkisebb szermaradék koncentráció, melyet elfogadható pontossággal, helyességgel és ismételhetőséggel lehet meghatározni. Az alábbiakban narancs mátrixra, (amely magas savtartalmú citrusféléket reprezentál) részletesen ismertetem az elvégzett validálás eredményeket és azok értékelését Specifikusság vizsgálata A specifikusság meghatározásához összehasonlítottam a validálási eljárás során felvett vizsgálathoz használt minta (narancs), a kalibrációhoz használt standard elegy és a vizsgált mátrixhoz a kimutatási határ szintjén történő hozzáadás után kapott kromatogramokat. A 10.a és 10.b ábrán példaként kromatogram részletek láthatóak a procymidonra kiértékelve. 32

33 10.a ábra: Narancsminta kromatogramrészlet, standard hozzáadása nélkül 10.b ábra: A kimutatási határ szitjén történő hozzásadás után kapott kromatogramrészlet a procimidonról A módszert specifikusnak tekintjük, ha a kontroll mintában a vizsgált hatóanyagokat zavaró kromatográfiás csúcs nem jelenik meg, illetve nincs hatással a kiértékelés megbízhatóságára. Ez a kritérium minden komponens esetén teljesült. 33