A deprenyl metabolikus N-oxidációjának vizsgálata királis kapilláris elektroforézissel TÁBI TAMÁS

Átírás

1 SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA A deprenyl metabolikus N-oxidációjának vizsgálata királis kapilláris elektroforézissel Doktori (PhD) értekezés TÁBI TAMÁS Témavezető: Dr. Szökő Éva, a gyógyszerészeti tudomány kandidátusa, egyetemi docens Semmelweis Egyetem, Gyógyszerhatástani Intézet Budapest, 2006

2 Szigorlati Bizottság: Elnök: Takácsné dr. Novák Krisztina, DSc Tagok: Dr. Tímár Júlia, kandidátus Dr. Szatmári István, PhD 2

3 Tartalomjegyzék Összefoglaló...5 Summary...6 Rövidítések jegyzéke Bevezetés Célkitűzések Irodalmi áttekintés A deprenyl főbb farmakokinetikai tulajdonságai Felszívódás, eloszlás Metabolizmus, kiürülés A kapilláris elektroforézis alapelvei A kapilláris elektroforézis készülék Az elektroforézis fizikai háttere A kapilláris elektromigrációs technikák speciális tulajdonságai, összehasonlításuk más analitikai eljárásokkal Kapilláris vs. hagyományos elektroforézis technikák Az elektroozmotikus áramlás Kapilláris elektroforézis vs. HPLC A kapilláris elektromigrációs technikák csoportosítása A királis kapilláris elektroforézis Az enantiomer-elválasztás módjai Az enantiomer-elválasztás mechanizmusa, alapelvei kapilláris elektroforézis során A királis szelektorok hatása a vizsgált vegyületek elektroforetikus mobilitására Királis elválasztás több szelektor jelenlétében Az elektroozmotikus áramlás hatása az enantiomer-elválasztásra Enantiomer elválasztás nem-vizes kapilláris elektroforézissel Királis szelektorok Ciklodextrinek Egyéb szénhidrátok Koronaéterek Fehérjék Makrociklusos antibiotikumok Királis MEKC Módszerek Felhasznált anyagok Készülékek Elválasztási körülmények Módszer validálás Állatkísérletek In vitro metabolizmus vizsgálatok Mintaelőkészítés Folyadék-folyadék extrakció Szilárdfázisú extrakció A konjugált metabolitok izolálása Számítások Eredmények

4 5.1. Deprenyl-N-oxid és további deprenyl metabolitok egyidejű enantiomerelválasztása Elválasztás DMBCD jelenlétében Elválasztás CMBCD jelenlétében Az ephedrin származékok királis elválasztása Elválasztás kettős cilkodextrin rendszer felhasználásával A deprenyl-n-oxid izomerek és a ciklodextrinek közötti kölcsönhatás vizsgálata A ciklodextrin üregméretének hatása a komplexképzésre és a királis felismerésre A deprenyl-n-oxid izomerek kölcsönhatása semleges szubsztituenst tartalmazó ciklodextrinekkel A deprenyl-n-oxid izomerek kölcsönhatása negatívan ionizálható szubsztituenst tartalmazó ciklodextrinekkel A deprenyl in vivo metabolizmusának vizsgálata patkányokban Metabolikus profil, a módszer szelektivitása Módszer validálás Mintaelőkészítés, extrakció Linearitás, megbízhatóság A vizelettel ürülő metabolitok vizsgálata Egyszeri kezelés Ismételt adagolás A deprenyl-n-oxid in vivo metabolizmusa A deprenyl in vitro metabolizmusának vizsgálata Elválasztási körülmények Mintaelőkészítés, linearitás A deprenyl izomerek in vitro metabolizmusa FMO enzimek jelenlétében A deprenyl izomerek in vitro metabolizmusa humán máj mikroszóma preparátumon Megbeszélés A deprenyl metabolitok egyidejű enantiomer-elválasztása A deprenyl-n-oxid sztereoizomerek és különböző ciklodextrinek kölcsönhatásának vizsgálata A deprenyl in vivo metabolizmusának vizsgálata patkányokban Mintaelőkészítés, módszervalidálás A vizelettel ürülő metabolitok vizsgálata Egyszeri R-( )-deprenyl adagolás Ismételt R-( )-deprenyl adagolás A deprenyl-n-oxid in vivo metabolizmusa A deprenyl in vitro metabolizmusának vizsgálata Módszerfejlesztés In vitro metabolizmus vizsgálatok Következtetések Köszönetnyilvánítás Saját közlemények...82 Az értekezés témájában megjelent közlemények...82 Egyéb közlemények Irodalomjegyzék

5 ÖSSZEFOGLALÓ Doktori (PhD) értekezés Készítette: Tábi Tamás Semmelweis Egyetem Gyógyszerhatástani Intézet Témavezető: Dr. Szökő Éva, a gyógyszerészeti tudomány kandidátusa, egyetemi docens A selegilin vagy R-( )-deprenyl a monoamin-oxidáz (MAO) B enzim szelektív, irreverzibilis gátlószere, melyet kiterjedten alkalmaznak a Parkinson kór és más neurodegeneratív betegségek terápiájában. Az utóbbi években leírták a vegyület neuroprotektív, neuro-rescue és antiapoptotikus hatását is, melyek legalább részben függetlenek a MAO gátló hatástól, de szintén jelentős sztereoszelektivitást mutatnak. A kedvező hatások jelentős részének előfeltétele a vegyület metabolikus átalakulása, ugyanakkor az ismert metabolitok csak részlegesen bizonyultak hatékonynak. A dezalkiláció mellett nemrég felmerült egy másik metabolikus út lehetősége is, mely N- oxidált metabolit képződését eredményezi. Munkánk során arra kerestük a választ, hogy a deprenyl enantiomerek in vivo és in vitro metabolizmusa során milyen mértékben képződik ez az új metabolit. Mivel a prokirális tercier-nitrogént tartalmazó deprenyl N-oxidációja új aszimmetria centrum képződésével jár, vizsgálni kívántuk az átalakulás sztereokémiáját is. Vizsgálatainkhoz királis kapilláris elektroforézis módszereket dolgoztunk ki és validáltunk a deprenyl és metabolitjainak egyidejű enantiomer-elválasztására és meghatározására patkány vizeletben és mikroszóma preparátumban. Mind az R-( )-, mind az S-(+)-deprenyl esetében igazoltuk az N-oxid képződést in vivo és in vitro. Patkányok esetében a metabolizmust sztereoszelektívnek találtuk, az NS-izomerek képződése volt a preferált. Az N-oxidációban kiemelt jelentőségű flavin-tartalmú-monooxigenáz (FMO) enzim izoformái esetében igen jelentős eltérést tapasztaltunk a deprenyl enantiomerek metabolizmusában. A vegyület mindkét izomerje az FMO 1 esetében bizonyult jobb szubsztrátnak, ekkor az NS-izomerek 6-13-szoros mennyiségben képződtek, míg az FMO 3 esetében az NR-izomerek képződése volt preferált. A két izoenzim eltérő tulajdonsága jelentős fajbéli különbségeket eredményezhet a deprenyl metabolizmusában. 5

6 SUMMARY PhD thesis Prepared by Tamás Tábi Department of Pharmacodynamics, Semmelweis University Supervisor: Dr. Éva Szökő PhD, Associate Professor Selegiline or R-( )-deprenyl, a selective and irreversible inhibitor of monoamine oxidase (MAO) B enzyme, is widely used in the treatment of Parkinson s disease and other neurodegenerative disorders. In the recent years neuroprotective, neuro-rescue and antiapoptotic activities of the compound were also reported, and supposed to be, at least partly, independent from its MAO-B inhibitory effect, though still showing high stereoselectivity. The majority of these favorable effects requires the metabolic transformation of the compound; however, the known metabolites were found only partially effective. Recently, besides desalkylation another metabolic route has been proposed, that results in the generation of N-oxidized metabolite. The objective of our study was to investigate the extent of generation of this new metabolite during the in vivo and in vitro metabolism of deprenyl enantiomers. As a new asymmetry center is created during N-oxidation of the prochiral tert.-nitrogen containing deprenyl, the stereochemistry of the conversion was intended to be examined as well. To accomplish our aims, we have developed chiral capillary electrophoresis methods for the simultaneous separation of deprenyl enantiomers and their metabolites. The methods have been validated for the determination of the metabolites in rat urine and microsome preparations. In case of both R-( )- and S-(+)-deprenyl, the N-oxidation has been demonstrated in vivo and in vitro. In the rat the metabolism has been found to be stereoselective, the generation of the NS-isomers was preferred. In case of the isoforms of flavin-containing monooxygenase (FMO), the enzyme having primary importance in the N-oxidation, significant differences have been found in the metabolism of deprenyl enantiomers. Both isomers proved to be better substrates for FMO 1 that catalyzed the formation of the NS-isomers in 6-13 fold excess, while in case of FMO 3 the generation of the NR-isomers was preferred. The observed differences between the isoenzymes can result in significant species variations in deprenyl metabolism. 6

7 Rövidítések jegyzéke 1R,2R-( )-PE: 1R,2R-( )- pseudoephedrin 1R,2S-( )-NE: 1R,2S-( )-norephedrin 1R,2S-E: 1R,2S-( )-ephedrin 1R,NR-DNO: 1R,NR-(+)-deprenyl-Noxid 1R,NS-DNO: 1R,NS-( )-deprenyl-noxid 1S,2R-(+)-E: 1S,2R-(+)-ephedrin 1S,2R-(+)-NE: 1S,2R-(+)-norephedrin 1S,2S-(+)-PE: 1S,2S-(+)-pseudoephedrin 1S,NR-DNO: 1R,NR-(+)-deprenyl-Noxid 1S,NS-DNO: 1S,NS-( )-deprenyl-noxid CEBCD: karboxietil-β-ciklodextrin CMBCD: karboximetil-β-ciklodextrin CYP: citokróm P450 DMBCD: heptakis-(2,6-di-o-meti)-βciklodextrin EOF: elektroozmotikus áramlás FMO: flavin-tartalmú-monooxigenáz HPBCD: (2-hidroxi-propil)-βciklodextrin HPMC: hidroxipropil-metil-cellulóz IS: belső standard MAO: monoamin-oxidáz MEKC: micelláris elektrokinetikus kromatográfia R-A: R-( )-amphetamin R-D: R-( )-deprenyl R-DD: R-( )-dezmetil-deprenyl R m : migráció visszatartási faktor R-MA: R-( )-methamphetamin R-pOHA: R-( )-para-hidroxiamphetamin R-pOHMA: R-( )-para-hidroximethamphetamin R s : csúcsfelbontás S-A: S-(+)-amphetamin S-D: S-(+)-deprenyl S-MA: S-(+)-methamphetamin S-pOHA: S-(+)-para-hidroxiamphetamin S-pOHMA: S-(+)-para-hidroximethamphetamin α: enantioszelektivitás µ: elektroforetikus mobilitás µ app : látszólagos mobilitás µ eff : effektív mobilitás 7

8 BEVEZETÉS 1. Bevezetés Ecseri Zoltán a Chinoin Gyógyszergyár vegyésze által 1962-ben előállított fenilizopropil-metil-propargilamint deprenyl néven szabadalmazták [1]. A vegyület irreverzibilis monoamin-oxidáz (MAO) gátló hatását elsőként Knoll és munkatársai írták le 1965-ben [2]. Később fény derült arra, hogy a vegyület csak a MAO enzim egy frakcióját gátolja, melyet MAO-B enzimnek neveztek el [3], megkülönböztetve a Johnston által karakterizált, clorgylinnel szelektíven gátolható MAO-A enzimtől [4]. Hamarosan bebizonyosodott az is, hogy a vegyület R-( )-izomerje az antipódjánál sokkal hatékonyabb és szelektívebb gátlószere az enzimnek [5], így a további farmakológiai vizsgálatok elsősorban ezzel az izomerrel történtek, melyet selegilinnek is neveznek [6]. A gyógyszer dopamin potencírozó hatással rendelkezik, és hatékonynak találták a Parkinson kór tüneteinek mérséklésére [7, 8, 9, 10, 11]. A vegyület javította az Alzheimer kórban szenvedő betegek kognitív funkcióit is, anélkül, hogy befolyásolta volna a betegségre jellemző morfológiai eltéréseket [12], illetve előnyösen befolyásolta a stroke-on átesett betegek felépülését [13]. Ezen kedvező hatások alapján az R-( )- deprenylt világszerte kiterjedten alkalmazzák különböző neurodegeneratív betegségek kezelésére [14]. Később leírták az R-( )-deprenyl neuroprotektív [15, 16, 17, 18, 19, 20], neuro-rescue [21, 22, 23] és antiapoptotikus hatását [24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35] is, melyek, legalábbis részben, függetlenek a vegyület MAO gátló hatásától [17, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29]. Ezek a kedvező hatások szintén jelentős sztereoszelektivitást mutatnak. R-( )-deprenyl előkezeléssel kivédhető volt a DSP-4, egy szelektív neurotoxin, noradrenalin szintet csökkentő hatása egér hippocampusban, míg az S-(+)-deprenyl hatástalannak bizonyult [18]. Az R-( )-deprenyl szintén sztereoszelektív módon segítette az axotomizált neuronok regenerációját [23], és igen alacsony, nano pikomoláris koncentrációban mérsékelte a különböző sejtvonalakon a trófikus faktorok megvonásával kiváltott apoptosist [24, 26, 28], míg antipódja nem rendelkezett hasonló kedvező hatásokkal, még nagyságrendekkel magasabb koncentrációk alkalmazása esetén sem. Az R-( )-deprenyl neuro-rescue és antiapoptotikus hatása a MAO gátló hatáshoz szükségesnél jelentősen kisebb koncentrációban érvényesül, hátterükben az 8

9 BEVEZETÉS apoptosisban és a sejt túlélésében jelentős fehérjék expressziójának megváltozását valószínűsítik [23, 24, 25, 26, 27]. Az R-( )-deprenyl neuroprotektív és neuro-rescue hatását jelentősen csökkentette [18, 26], antiapoptotikus hatását pedig teljesen megszüntette a gyógyszermetabolizáló enzimek gátlása [26, 29]. Ezek az eredmények valamely metabolit vagy metabolitok kiemelt szerepére utalnak a vegyület ezen kedvező, MAO-B gátlástól független hatásaiban. Ugyanakkor az R-( )-deprenyl fő metabolitjai, a dezalkilációval képződő R- ( )-methamphetamin és R-( )-amphetamin nem mutattak hasonló kedvező hatásokat [18, 26, 29]. Az R-( )-dezmetil-deprenyl antiapoptotikus hatásával kapcsolatos eredmények ellentmondásosak. Tatton vizsgálataiban a vegyület kivédte a patkány pheochromocytoma eredetű PC 12 sejtvonalon szérum és növekedési faktor megvonással kiváltott apoptosist [26], ugyanakkor Szende és munkatársai hatástalannak találták a vegyületet humán melanoma eredetű A-2058 sejtvonalon szérummegvonással kiváltott apoptosis esetében [29]. Az eltérő eredményeket magyarázhatja a vizsgálatokban használt eltérő sejtvonal. Mivel az R-( )-deprenyl kedvező hatásai csak részben köthetők az anyavegyülethez, illetve az ismert metabolitjaihoz, fontos a vegyület metabolizmusának precíz felderítése, és az eddig nem vizsgált metabolitok neuroprotektív és antiapoptotikus hatásában betöltött szerepének tisztázása. A közelmúltban felvetődött egy korábban nem vizsgált metabolikus út lehetősége, melynek során a deprenyl tercier-nitrogénjének oxidációja deprenyl-n-oxid képződéséhez vezet [36]. Vizsgálatainkban a deprenyl-n-oxid az anyavegyülethez hasonlóan kivédte egy noradrenerg neurotoxin, a DSP-4 noradrenalin szintet csökkentő hatását egér hippocampusban, anélkül hogy befolyásolta volna az agyterület bazális noradrenalin koncentrációját [37, 38]. Az N-oxidált metabolit az R-( )-deprenyllel megegyező módon fokozta a sejtadhéziót különböző sejtek esetében [39]. A deprenyl-n-oxiddal végzett előzetes vizsgálatok alapján, az apoptosisra gyakorolt hatása eltér az anyavegyületétől, ugyanis a deprenyl, míg kis koncentrációban antiapoptotikus-, addig nagyobb koncentrációk esetén proapoptotikus hatással rendelkezik [29]. A deprenyl-n-oxid antiapoptotikus tulajdonságának vizsgálata során 9

10 BEVEZETÉS nagy koncentrációban sem tapasztaltak proapoptotikus hatást [Magyar K. személyes közlés], melynek kiemelt klinikai jelentősége lehet. Egy tercier-amin N-oxidációja során a tetraéderes szerkezetűvé váló kvaterner-nitrogén aszimmetria centrummá válhat. Így a prokirális nitrogént tartalmazó deprenyl izomerekből tehát négy N-oxid diasztereomer, azaz két pár enantiomer képződhet. Mivel a deprenyl-n-oxid izomerek potenciálisan hatékony metabolitok, fontos feltárni, hogy az R-( )-deprenyl metabolizmusa során melyik izomer képződése preferált, illetve vizsgálni kell külön-külön az egyes izomerek farmakológiai tulajdonságait. Egy vegyület optikai izomereinek elválasztása igen nagy kihívást jelent az analítikusok számára, mivel az enantiomerek kémiai és fizikai tulajdonságaikban nem térnek el, viselkedésük csak optikailag aktív közegben különbözik. Egy vegyület sztereoizomereinek szelektív meghatározása összetett analítikai rendszereket igényel, melyeknek kidolgozása nagy körültekintést követel meg. 10

11 CÉLKITŰZÉSEK 2. Célkitűzések Munkám során a deprenyl metabolizmusát kívántam vizsgálni kapilláris elektroforézis módszer alkalmazásával, különös tekintettel a vegyület N-oxidációjára és annak sztereokémiai sajátosságaira. Célul tűztük ki: 1. Kapilláris elektroforézis módszer kidolgozását a deprenyl enantiomerek lehetséges metabolitjainak, köztük az eddig nem vizsgált deprenyl-n-oxid izomereknek egyidejű királis elválasztására. 2. A módszer adaptálását és validitásának igazolását az R-( )-deprenyl metabolitjainak biológiai mintából történő meghatározására. 3. A deprenyl enantiomerek in vivo metabolizmusa során képződő deprenyl-n-oxid izomerek azonosítását, a metabolizmus sztereokémiájának vizsgálatát. A metabolitok vizeletürülési kinetikájának in vivo vizsgálatát patkányokban R-( )- deprenyl per os adagolását követően. 4. A deprenyl-n-oxid in vivo metabolizmusának vizsgálatát patkányokban. 5. A deprenyl enantiomerek N-oxidációjának vizsgálatát in vitro módszerrel. 11

12 IRODALMI ÁTTEKINTÉS 3. Irodalmi áttekintés 3.1. A deprenyl főbb farmakokinetikai tulajdonságai Felszívódás, eloszlás Orális alkalmazást követően a deprenyl gyorsan és jól felszívódik a gasztrointesztinális traktusból [38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47], a maximális plazmakoncentráció félmásfél órával a gyógyszer adagolását követően alakul ki [40, 44, 46]. A vegyület jelentős first pass metabolizmuson esik át [38, 42, 44, 47, 48,], biológiai hasznosíthatóságát 8 illetve 25 %-nak találták kutyák és egerek esetén [38, 44]. Egyidejűleg fogyasztott élelmiszer mintegy háromszorosára növelte a keringésbe jutó deprenyl mennyiségét, ugyanakkor nem volt hatással a metabolitok plazma koncentrációjára [49]. Mivel a MAO-B gátló hatásért az anyavegyület a felelős, igen jelentős eltérés tapasztalható az agyi enzimgátlásban orális és parenterális alkalmazás esetén [50]. A deprenyl jól felszívódik a bőrön keresztül is [51, 52, 53, 54]. Mivel a vegyület metabolizmusa a bőrben elhanyagolható [55], transzdermális alkalmazást követően a keringésbe jutó deprenyl mennyisége mintegy ötvenszerese az orális adagolás esetén tapasztalhatónak [52]. A vegyület gyorsan eloszlik a szövetekben. Az egereken végzett autoradiográfiás vizsgálatok eredményei szerint intravénás alkalmazást követően 30 másodperccel igen magas koncentráció tapasztalható a lipoidokban gazdag szövetekben, így az agyban is. A későbbi időpontokban a radioaktivitás az agyban gyorsan csökkent, míg a parenchimás szövetekben jelentős koncentráció alakult ki [40]. A deprenyl és/vagy a fő metabolitjai, a methamphetamin és az amphetamin kimutathatók voltak kísérleti állatok agyában intraperitoniális [56] és subcutan [57, 58] alkalmazást követően. Az amphetamint kimutatták Parkinson kóros betegek különböző agyterületein is post mortem [59]. Kettős jelzést tartalmazó deprenyllel Intézetünkben végzett vizsgálatok alapján mind az anyavegyületet jelző 14 C-propargil, mind az összes metabolitot jelző 3 H-fenil kimutatható volt a plazmában és az agy különböző területein is. Ismételt adagolás esetén mindkét radioaktivitás kumuláción ment keresztül. Az egyensúlyi 12

13 IRODALMI ÁTTEKINTÉS koncentráció a propargil-csoportot tartalmazó, illetve nem tartalmazó metabolitok esetén 4, illetve 7 nap alatt alakult ki mind a plazmában, mind a hatás elsődleges helyén, a striatumban [41, 60, 61]. 11 C izotóppal jelölt deprenyllel végzett pozitron emissziós tomográfiás vizsgálatok eredményei szerint a deprenyl enantiomerei között nincs különbség az eloszlás korai fázisában, mindkét izomer gyorsan penterál az agyba és az egyéb szövetekbe. A radioaktív jelölő kiürülése ugyanakkor jelentős sztereoszelektivitással rendelkezett, az R-( )-deprenyl jelentős kumulációt mutatott a magas MAO-B aktivitással rendelkező szövetekben, így az agyban, szívben és tüdőben, míg antipódja esetében az agyi radioaktivitás, a jelölt methamphetamin esetében tapasztaltakhoz hasonlóan, gyors, exponenciális csökkenést mutatott. A tartósan magas agyi radioaktív koncentráció hátterében az R-( )-deprenyl és a MAO-B enzim irreverzibilis kötődése áll [62, 63], melyet knock-out egereken végzett vizsgálatok is megerősítettek [64]. Autoradiográfiás eljárással kimutatták, hogy a vegyület elsősorban a MAO-B enzimben gazdag szubkortikális magvakban kötődik, míg az agykéreg és a fehérállomány kevés radioaktivitást tartalmazott [65]. A jelentős first pass metabolizmus és a gyors eloszlás következtében kialakuló alacsony plazmakoncentráció sokáig megnehezítette a deprenyl farmakokinetikai paramétereinek pontos meghatározását, ezért elsősorban a fő metabolitok, a dezmetil-deprenyl, a methamphetamin és az amphetamin viselkedését vizsgálták orális adagolást követően. A vizsgálatok során elsősorban a methamphetamin plazmakoncentrációja mutatott lináris összefüggést az alkalmazott deprenyl dózisával. A gyógyszer per os adagolását követően a dezmetil-deprenyl plazmakoncentrációja gyorsan csökkent, míg az amphetamin származékok eliminációja lassabbnak bizonyult [42, 66, 67]. A korai bioekvivalencia vizsgálatok során is az elsődleges dezalkilált metabolitok, a methamphetamin és a dezmetil-deprenyl plazmakoncentrációját hasonlították össze a különböző készítmények esetében [68, 69] ben Mahmood és munkatársai érzékeny fluorimetriás módszert dolgoztak ki a plazma deprenyl tartalmának meghatározására. Az eljárás alapját a vegyület MAO gátló hatása képezte, így a metabolitok jelenléte nem zavarta a vizsgálatot [70]. A módszer felhasználásával vizsgálták az R-( )-deprenyl farmakokinetikáját kutyákban orális adagolást követően. Az eredmények gyors felszívódást (t max = 25 ± 5,8 perc), nagy 13

14 IRODALMI ÁTTEKINTÉS eloszlási térfogatot (6,56 ± 0,56 l/kg), gyors eliminációt (t 1/2 = 60,24 ± 9,56 perc) és alacsony biológiai hasznosíthatóságot (8,51 ± 3,31 %) mutattak [44]. Humán vizsgálataikban is hasonló eredményekre jutottak, a maximális plazmakoncentráció félmásfél órával az adagolás után alakult ki, míg az eliminációs félidő körülbelül 70 percnek adódott. Nem találtak jelentős különbséget a főbb farmakokinetikai paraméterekben a vegyület tabletta vagy oldat formában történő alkalmazását követően [48]. A humán vizsgálatokban tapasztalt magas orális clearance alapján intenzív metaolizmusra következtettek, melyben a máj mellett az extrahepatikus szöveteknek is nagy jelentőséget tulajdonítottak [45]. Ismételt adagolást követően mind a deprenyl, mind a metabolitok esetében enyhe kumulációt figyeltek meg. A deprenyl és a dezmetil-deprenyl eliminációs félideje 3-6- szorosára nőtt az egyszeri adagolás során tapasztalható értéknek, mellyel párhuzamosan csökkent a farmakokinetikai paraméterek variabilitása [49] Metabolizmus, kiürülés A korai vizsgálatok során hamar kiderült, hogy a deprenyl metabolizmusa során dezalkilációval methamphetamin és amphetamin képződnek, melyek jelentős mennyiségben ürülnek mind a humán [42, 71, 72], mind a patkány vizeletben [40, 73, 74, 75]. A vizeletminták dezmetil-deprenylt is tartalmaztak, bár az amphetamin származékoknál jelentősen kisebb koncentrációban [42, 72, 74, 75]. Ismert, hogy az amphetamin származékok önálló farmakológiai hatással rendelkeznek. A pszichostimuláns hatásuk alapja, hogy fokozzák a katecholaminok szinaptikus felszabadulását a központi idegrendszerben [76, összefoglaló: 77]. A vegyületek hatása jelentős sztereoszelektivitást mutat, az S-(+)-izomerek sokkal nagyobb affinitással kötődnek a noradrenalin és a dopamin transzporterekhez, mint az R-( )-párjaik [78]. Az anyavegyület és a metabolitok hatásának sztereoszelektivitása hamar szükségessé tette a metabolizmus sztereokémiájának vizsgálatát. Elsőként Schachter és munkatársai közölték a dezalkiláció sztereoszelektív jellegét. R-( )-deprenyllel kezelt betegek vizeletét vizsgálták gázkromatográfiás módszerrel királis származékképzést követően. A mintákban kevesebb, mint 6,5 %-ban találtak S-(+)-amphetamint és S-(+)- methamphetamint, melyekről feltételezték, hogy a vizsgálatban felhasznált 14

15 IRODALMI ÁTTEKINTÉS gyógyszerben szennyezésként előforduló S-(+)-deprenylből képződtek [79]. Intézetünkben királis kapilláris elektroforézis módszert dolgoztak ki a deprenyl és a belőle dezalkilációval képződő amphetamin származékok enantiomer-elválasztására [80], melynek felhasználásával igazolták mind az R-( )-, mind az S-(+)-deprenyl sztereospecifikus dezalkilációját patkányokban. Az állatok vizelet- [74], plazma- és szövetmintáit [81, 82] vizsgálva igazolták, hogy az R-( )-deprenylből kizárólag R-( )-, míg enantiomerpárjából csak S-(+)-amphetamin származékok képződnek, a metabolizmus során nem történik racemizáció vagy inverzió. A metabolizmus sztereospecifikus jellegét Shin is megerősítette önkéntesek vizeletmintáinak analízise során. Vizsgálataiban királis származékképzést követően gázkromatográfiás elválasztást alkalmazott [72]. A deprenyl dezalkilációs metabolizmusa in vitro gátolható SKF-525A-val, a citokróm P450 (CYP) enzimek gátlószerével, az amphetamin képződését a methimazol is csökkentette, mely a flavin-tartalmú-monooxigenáz (FMO) enzim lehatséges szerepére utal a metabolit képződésében [83]. A különböző CYP izoenzimek dezalkilációhoz való hozzájárulásával kapcsolatos adatok ellentmondásosak. A methamphetamin és a dezmetil-deprenyl képződésében a CYP 2D6-nak [84, 85], a CYP 3A-nak [86, 87] és a CYP 2E1-nek [88] tulajdonítottak szerepet. A dezalkilált metabolitok további átalakulásokon mehetnek keresztül, a benzol-gyűrűn para-helyzetben, az oldalláncon pedig, β-pozícióban hidroxilálódhatnak. A parahidroxilált amphetamin származékok jelentős mennyiségben ürülnek deprenyllel kezelt patkányok vizeletében [73, 75, 89], és bár valamelyest kisebb arányban, de kimutathatók humán vizeletben is [72, 90]. Patkányok vizeletében kis mennyiségben para-hidroxidezmetil-deprenylt is azonosítottak [89]. Ezeknek a metabolitoknak jelentős hányada konjugátum formájában ürül [72]. Az oldallánc β-hidroxilációja ephedrin származékok képződését eredményezheti. A methamphetaminból ephedrin és pseudoephedrin, míg az amphetaminból norephedrin és nor-pseudoephedrin keletkezhet. R-( )-deprenyllel kezelt önkéntesek vizeletében kimutathatók voltak ezek a β-hidroxilált metabolitok, de összesített mennyiségük alig haladta meg az alkalmazott dózis 1%-át. Legjelentősebb mennyiségben az ephedrin 15

16 IRODALMI ÁTTEKINTÉS ürült, melyet a norephedrin követett, a pseudo- és nor-pseudoephedrin mennyisége elenyészően kicsi volt, ami a β-hidroxiláció sztereoszelektív jellegére utal [72]. Az intézetünkben patkányokon végzett farmakokinetikai vizsgálatok során nem találtak az R-( )- vagy S-(+)-deprenyllel kezelt állatok vizeletmintáiban detektálható mennyiségben ephedrin származékokat [74]. A dezalkiláció mellett az utóbbi időben felvetődött egy másik metabolikus út lehetősége is. Wu és Ichikawa in vitro vizsgálataiban azt tapasztalta, hogy a deprenyl és a hasonló kémiai szerkezettel rendelkező, nem szelektív MAO gátló pargylin kompetitíven gátolja az MPTP sertés májból izolált FMO enzim által katalizált metabolizmusát. Eredményeik arra utaltak, hogy a MAO gátló vegyületek maguk is szubsztrátjai az FMO enzimnek, és feltételezték, hogy a reakció során a tercier-aminokból N-oxid metabolitok képződnek [36]. Az oka annak, hogy a deprenyllel végzett széleskörű farmakokinetikai vizsgálatok miért nem számoltak be az N-oxid metabolitról a felhasznált analitikai eljárások tulajdonságai közt keresendők. A metabolizmus vizsgálatok során általában nagy hatékonyságú és érzékeny gázkromatográfiás módszereket használtak, melyek kiváló elválasztást és igen alacsony detektálási határokat biztosítottak. Ugyanakkor az analízis során alkalmazott magas hőmérséklet és a mintakomponensek megfelelő kromatográfiás tulajdonságát biztosító származékképzés óhatatlanul is a deprenyl-n-oxid bomlásához vezethettek. Kikura és munkatársai egy hasonló szerkezetű fenil-alkilamin, a dimetil-amphetamin metabolizmusát vizsgálták. A vegyület N-oxidált metabolitjának gázkromatográfiás analízise során négy csúcsot kaptak, melyek közül kettőt tudtak azonosítani, mint az anyavegyület dimetil-amphetamint, illetve annak dezalkilált származékát, a methamphetamint [91]. A magas hőmérséklet mellett, a primer- és szekunder-aminok gázkromatográfiás tulajdonságának javítására használt aciláló-reagensek is kiválthatják az N-oxid metabolitok bomlását, mivel dezalkilációt indukálhatnak. A dimetilamphetamin-n-oxidból trifluor-ecetsavanhidrid jelenlétében kvantitatív mennyiségben methamphetamin-trifluor-acetát képződött, így annak meghatározására csak szelektív extrakciót követően nyílt lehetőség [91]. Hasonló körülmények között a deprenyl-noxid szintén dezalkiláción mehetett keresztül, methamphetaminná, esetleg dezmetildeprenyllé alakulhatott, ami nemcsak az N-oxid detektálását tehette lehetetlenné, de a 16

17 IRODALMI ÁTTEKINTÉS dezalkilált metabolitok mennyiségének túlmérését is eredményezhette. A deprenyl metabolizmusának korai vizsgálata során vékonyréteg-kromatográfiás eljárásokat is alkalmaztak, mely a dezalkilált metabolitok és a deprenyl mellett más vegyületet is kimutatott, amit később, a gázkromatográfiás vizsgálatok során elvesztettek [92]. Nem kizárható tehát, hogy a korai metabolizmus vizsgálatokban nem azonosított metabolit a deprenyl-n-oxidnak felel meg. Nemrég HPLC illetve HPLC-MS módszerek alkalmazásával sikerült kimutatni az N-oxid metabolit képződését deprenylből in vivo humán vizeletben [93, 94] és in vitro máj mikroszóma preparátum felhasználásával [95, 96]. A farmakokinetikai vizsgálatok alapján igazolt metabolikus utak az 1. ábrán láthatók. CH 3 N + CH H 3 C OH 1R,NS-(-)-Deprenyl-N-oxid CH 3 N + CH H 3 C OH 1R,NR-(+)-Deprenyl-N-oxid C H 3 N CH 3 R-(-)-Deprenyl CH CH 3 NH H 3 C R-(-)-Methamphetamin CH 3 CH HN R-(-)-Dezmetil-deprenyl OH CH 3 NH H 3 C 1S,2R-(+)-Ephedrin 1R,2R-(-)-Pseudoephedrin NH 2 CH 3 R-(-)-Amphetamin CH 3 CH HN HO R-(-)-p-Hidroxi-dezmetil-deprenyl CH 3 NH HO H CH 3 C 3 R-(-)-p-Hidroxi-methamphetamin NH HO 2 R-(-)-p-Hidroxi-amphetamin OH NH 2 CH 3 1S,2R-(+)-Norephedrin 1R,2R-(-)-Nor-pseudoephedrin Konjugátum Konjugátum Konjugátum 1. ábra Az R-( )-deprenyl metabolikus útjai. 17

18 IRODALMI ÁTTEKINTÉS Az N-oxidáció során a prokirális nitrogént tartalmazó deprenyl enantiomerekből olyan speciális sztereokémiai sajátságú vegyület képződhet, mely az α-szénatom mellett egy heteroatomon, a kvaternerré váló nitrogénen is aszimmetria centrumot tartalmaz. A deprenyl-n-oxidnak így négy izomerje létezik, melyek közül kettő-kettő egymással enantiomer a többivel diasztereomer viszonyban van (2. ábra). Mivel az N-oxid metabolitnak szerepe lehet az R-( )-deprenyl kedvező farmakológiai hatásaiban, fontos megismerni a metabolit in vivo képződése mellett, annak sztereokémiáját is. CH 3 N + CH H 3 C OH 1R,NS-(-)-Deprenyl-N-oxid CH 3 N + CH H 3 C OH 1R,NR-(+)-Deprenyl-N-oxid CH 3 N + CH H 3 C OH 1S,NS-(-)-Deprenyl-N-oxid CH 3 N + CH H 3 C OH 1S,NR-(+)-Deprenyl-N-oxid 2. ábra A deprenyl-n-oxid izomerek sztereokémiája. Az optikailag aktív vegyületek enantiomereinek elválasztása igen nagy kihívást jelent az analítikusok számára, mivel ezek a vegyületek azononos fizikai és kémiai tulajdonságokkal rendelkeznek, köztük különbség csak királis közegben észlelhető. Kiemelkedő hatékonyságának következtében a kapilláris elektroforézis igen alkalmas a sztereoizomerek elválasztására, mivel akár kis sztereoszelektivitás mellett is képes az izomerek alapvonal elválasztására [97]. A technika nagy csúcskapacitásából és az elválasztás kettős jellegéből (kromatográfiás és elektroforetikus, melyet részleteiben később ismertetek) adódik, hogy a kitűnő királis szelektivitás magas kémiai szelektivitással is párosul. Ennek igen nagy jelentősége lehet a farmakokinetikai vizsgálatok során, ahol nem egy enantiomer pár elválasztása a cél, hanem több, egymáshoz gyakran hasonló vegyület (a vizsgált gyógyszer és metabolitjai) egyidejű enantiomer-elválasztására törekszünk, általában komplex biológiai mátrix jelenlétében [98, 99]. Az elektroforetikus elválasztási elv lehetővé teszi polaritásukban egymástól nagyon különböző anyagok egyidejű vizsgálatát és enantiomer-elválasztását, így 18

19 IRODALMI ÁTTEKINTÉS lehetőség nyílik egy gyógyszer, illetve I. és II. fázisú metabolitjainak egy futásban történő királis analízisére [100, 101]. A farmakokinetikai vizsgálatok általában nagyszámú minta analízisét teszik szükségessé, ami a kapilláris elektromigrációs technikák további előnyeire hívja fel a figyelmet, mint a rövid analízis idő, a kis minta és reagens szükséglet, a gazdaságos és környezetkímélő üzemeltetés. Ugyanakkor a módszer hátrányos tulajdonságainak (a HPLC technikákkal összevetve gyengébb reprodukálhatóság és érzékenység) kiküszöbölése körültekintő módszerfejlesztést és szakértelmet kíván [98, 99, 102, 103]. A királis kapilláris elektroforézis technikát intézetünkben korábban igen alkalmasnak találták az R-( )- és S-(+)-deprenyl metabolizmusának sztereokémiai vizsgálatára [74, 80, 81, 82], ezért jelen kísérleteinkben is ezt a technikát alkalmaztuk A kapilláris elektroforézis alapelvei A nagy hatékonyságú kapilláris elektroforézis (HPCE) vagy röviden kapilláris elektroforézis a tipikusan µm belső átmérőjű és cm hosszú, elektrolittal töltött kapillárisban kivitelezett elektromigráción alapuló technikák gyűjtőneve. Az eljárás elvi alapjait Hjertén dolgozta ki 1959-ben, és az azt követő néhány évben sikeresen alkalmazta a technikát mind szervetlen ionok és kis szerves molekulák, mind makromolekulák elválasztására [104]. Ezekben a korai vizsgálatokban még nagyobb, 3 mm belső átmérőjű kapillárisokat használtak, ami számos gyakorlati problémát vetett fel, melyek jelentős részét sikerült kiküszöbölni szűkebb furatú (0,2 mm belső átmérőjű) kapillárisok alkalmazásával [105]. A kapilláris elektroforézis mai formáját a hetvenes és nyolcvanas évek fordulóján érte el Mikkers illetve Jorgenson és Lukacs munkáinak nyomán [106, 107, 108, 109, 110] A kapilláris elektroforézis készülék A különböző kapilláris elektroforézis módszerek kivitelezésére egyazon készülék alkalmazható. Az elválasztó elektrolit összetételének helyes megválasztásával egymástól jelentősen eltérő metodikák alakíthatók ki, melyek alapjait később röviden összefoglalom. A készülék alapvető részei (3. ábra): 19

20 IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1. A kapilláris, melynek belső átmérője µm közötti, tipikusan 50 vagy 75 µm. A kapilláris anyaga leggyakrabban kvarc, melynek mechanikai ellenálló-képességét egy külső poliimid borítással javítják. A reprodukálható elválasztáshoz elengedhetetlen az elektroforézis során keletkező hő hatékony elvezetése és az állandó hőmérséklet biztosítása, ezért a kapillárist általában valamilyen termosztát rendszerrel veszik körül. Az elválasztás során a kapillárist természetesen a megfelelő elektromos vezetést biztosító elektrolit oldattal, általában pufferoldattal töltik fel, melyet elválasztó- vagy háttérelektrolitnak neveznek. 2. A kv feszültséget biztosító tápegység és a feszültséget a kapilláris végeihez vezető platina elektródok. A készülék megfelelő működésének ellenőrzéséhez szükséges a feszültség hatására kialakuló áram mérése, mely tipikusan nem haladja meg a 100 µa-t. 3. A puffertartó edények, melyek megteremtik az elektromos kapcsolatot a beléjük merített kapilláris és elektród között. A hagyományosan normál polaritásnak nevezett elrendezés esetén a kapilláris bemeneti, úgynevezett inlet vége az anóddal, kimeneti vagy detektor oldali, úgynevezett outlet vége a katóddal teremt közvetlen kapcsolatot. Ellentétes elrendezés esetén fordított polaritásról beszélhetünk. 3. ábra A kapilláris elektroforézis készülék felépítésének vázlata. 20

21 IRODALMI ÁTTEKINTÉS Az elválasztást minden analitikai technikánál megfelelő detektálásnak kell követnie. Az optikai detektálási módok igen egyszerűen kivitelezhetők a kapilláris elektroforézis eljárások során. Mivel a kapilláris anyaga az ultraibolya és látható fényt áteresztő kvarc, nincs szükség külön detektor cellára. A külső poliimid borítás eltávolításával kialakított detektorablaknál közvetlenül a kapillárison történhet meg az elválasztott mintazónák abszorbanciájának vagy fluoreszcenciájának detektálása. Természetesen lehetőség van külső detektorok (pl. elektrokémiai és tömegspektrometriás detektor) alkalmazására is, bár ilyenkor a kapilláris outlet végén az áramkör fenntartása speciális kiegészítő instrumentációt igényel [111, 112] Az elektroforézis fizikai háttere Az elktromigrációs technikák alapja a töltött részecskék elektroforézise, azaz elektromos tér hatására történő elmozdulása [107, 113, 114]. Egy q töltésű részecskére E elektromos térben ható elektromos erő (F el ) a következő: F el = qe = qu L (1) ahol U az alkalmazott feszültség, L pedig az erőtér hossza, mely esetünkben a kapilláris teljes hosszával egyezik meg. A részecske mozgását ugyanakkor a súrlódási erő F s fékezi, mely gömb alakú részecskét feltételezve függ a közeg viszkozitásától (η), a részecske hidrodinamikai (Stokes-féle) sugarától (r) és a haladási sebességétől (v): F s = 6πηrv (2) Elektroforézis során a két erő között dinamikus egyensúly jön létre, az ion v egyenletes sebességgel vándorol: F el = F s (3) qe = 6πηrv (4) v = q E = µe (5) 6πηr 21

22 IRODALMI ÁTTEKINTÉS Az ion vándorlási sebessége (v) adott térerő (E) hatására, tehát töltésétől, méretétől és a közeg viszkozitásától függ, melyeket együttesen a Debye-Hückel-Henry egyenlet szerint az ion elektroforetikus mobilitásával (µ) jellemezhetünk [107]. A mindennapi munka során általában nem gömb alakú molekulákat vizsgálunk és gyakran nem áll rendelkezésre az ionok hidrodinamikai rádiusza sem, ezért az Offord által peptidek papírelektroforézisére kidolgozott elméletből [115] kiindulva több empirikus eljárást dolgoztak ki az ionok elektroforetikus mobilitásának becslésére. A gyakorlatban is jól használható közelítés szerint az elektroforetikus mobilitás egyszerűbb szerkezetű, közel szférikus kismolekulák esetén fordítottan arányos az ion molekulatömegének (M r ) kétharmadik hatványával: q µ ~ 2/ 3 M r (6) Ugyanakkor összetettebb, inkább lineáris elrendeződést mutató molekulák, makromolekulák esetén az elektroforetikus mobilitás a molekulatömeg köbgyökével mutat fordított arányosságot [116, 117, 118]: q µ ~ 1/ 3 M r (7) A gyenge elektrolitok esetében a részecske töltése, s így elektroforetikus mobilitása is változik a ph függvényében, ezért ilyenkor a maximális töltéssel rendelkező részecskék esetében mérhető úgynevezett ion-mobilitás mellett megkülönböztetjük az adott ph-ra jellemző effektív mobilitást (µ eff ) is, mely figyelembe veszi, hogy a molekuláknak csak egy ph függő frakciója van ionos formában A kapilláris elektromigrációs technikák speciális tulajdonságai, összehasonlításuk más analitikai eljárásokkal A kapillárisban kivitelezett elektromigrációs eljárások számos speciális tulajdonsággal rendelkeznek összevetve a megfelelő hagyományos elektroforézis technikákkal, 22

23 IRODALMI ÁTTEKINTÉS melyeknek köszönhetően a kapilláris elektroforézis a modern, nagyműszeres analitika fegyvertárát gazdagítja [113, 114] Kapilláris vs. hagyományos elektroforézis technikák A kapilláris nagy felület térfogat arányának köszönhetően az elektroforézis során képződő úgynevezett Joule-hő elvezetése sokkal hatékonyabb a lap elektroforézis módszereknél tapasztalhatónál, ami lehetővé teszi nagyságrendekkel nagyobb feszültség alkalmazását, így gyors és nagyhatékonyságú elválasztások kivitelezését [118]. A kis belső átmérőjű kapillárisok alkalmazása a hagyományos elektroforézissel ellentétben szükségtelenné teszi a zónák diffúziós keveredését lassító szilárd vagy félszilárd mátrix (pl. gél, stb.) alkalmazását az analízis során [105]. Ezeken túlmenően a kapilláris kis térfogatából adódóan minimális a módszer reagens és mintaigénye, ami gazdaságos és környezetkímélő működtetést tesz lehetővé. A készülékek kivitelezése analógiát mutat a HPLC készülékekével, így ahhoz hasonlóan a detektálás on-line történik, a módszer kvantitatív eredményt szolgáltat és könnyen automatizálható [118] Az elektroozmotikus áramlás A kapilláris elrendezésből adódik az elektroozmózis jelenségének kiemelt fontossága is a kapilláris elektromigrációs technikák estében. A jelenség minden olyan rendszerben fellép, ahol az elektroforézis kivitelezésére használt edényzet felszíne töltéssel rendelkezhet, mivel ilyenkor a falon elektromos kettősréteg jöhet létre. Az elektroozmózisnak jelentősége azonban csak akkor van, ha a fal mentén kialakult elektromos kettősréteg vastagsága nem elhanyagolható az elválasztó közeg méreteihez (a kapilláris belső átmérőjéhez) viszonyítva. A jelenséget elsőkén Helmholtz írta le, mikor elektrolittal töltött üvegcsőben elektromos tér hatására folyadékáramlást tapasztalt [119]. Kvarc kapilláris alkalmazása esetén a felületi szilanol csoportok ph függő disszociációjának következtében a kapilláris belső felszíne negatív töltésűvé válik, minek hatására a puffer kationjai feldúsulnak a fal közelében elektromos kettősréteget hozva létre. A kettősréteg felszínhez közeli része statikus jellegű, míg a faltól távolabb elhelyezkedő diffúz része feszültség alkalmazásának hatására elmozdul a katód irányába. A diffúz rétegben áramló ionok magukkal viszik hidrátburkukat, és az 23

24 IRODALMI ÁTTEKINTÉS oldószer-molekulák közötti erős hidrogénhidas kölcsönhatás miatt megindul a kapillárisba töltött folyadék áramlása, melyet elektroozmotikus áramlásnak (EOF) nevezünk. Az áramlás mértékét elsősorban a fal felületi töltése, illetve pontosabban a fal és a hozzá kapcsolódó statikus réteg töltése határozza meg, melyet a fal ζ-potenciál értékével jellemezhetünk. Jelentős hatással van az elektroozmotikus mobilitásra (µ EOF ) a kapillárisba töltött elektrolit, pontosabban az elektromos kettősréteg viszkozitása (η ) és a közeg permittivitása (ε) is [104, 120]. ζε µ EOF = η' (8) Az elektroozmotikus áramlás gyakorlati jelentőségét az adja, hogy hatására a kapillárisba töltött elektrolit a katód felé áramolva magával ragadja a vizsgált vegyületek részecskéit is, ezért azok migrációs ideje az úgynevezett látszólagos mobilitás (µ app ) értékétől függ, mely a molekulák effektív mobilitásának (µ eff ) és az elektroozmotikus áramlás mobilitásának (µ EOF ) vektori összege: µ app = µ eff + µ EOF (9) A jelenségből következik, hogy reprodukálható elválasztás eléréséhez biztosítani kell az állandó elektroozmotikus mobilitást, ugyanakkor az erős elektroozmotikus áramlás megfelelő körülmények között (pl. magas ph-n) lehetővé teszi az ellentétes töltésű, illetve semleges részecskék egymás melletti detektálását Kapilláris elektroforézis vs. HPLC A kapilláris elektromigrációs technikák legnagyobb előnye a folyadék-kromatográfiás módszerekkel szemben a kimagasló hatékonyság. A kapilláris elektroforézis során elérhető elméleti tányérszám akár két nagyságrenddel is meghaladhatja a HPLC-nél tapasztalható értéket. A nagy hatékonyság fő oka, hogy ellentétben a nyomással vezérelt elválasztási technikák parabolisztikus áramlási profiljával, az elektromos térerő hatására létrejövő ionmigráció illetve elektroozmotikus áramlás profilja dugóhoz hasonlatos, a 24

25 IRODALMI ÁTTEKINTÉS részecskék sebessége a fal közelében és az elektrolit fázis belsejében megegyezik, így az áramlási különbségek nem vezetnek a zónák szélesedéséhez (4. ábra) [107]. 4. ábra Az elektromosan (A) és nyomással (B) vezérelt elválasztás áramlási profilja és a hatásukra létrejövő csúcsalak A kapilláris elektromigrációs technikák csoportosítása A különböző kapilláris elektromigrációs technikák során az analízis hajtóereje minden esetben a kapillárisban létrehozott elektromos térerő. A különböző metodikák azonban eltérnek az elválasztás mechanizmusában, minek oka a kapillárisba töltött elektrolit összetételének különbözősége. Kapilláris zónaelektroforézis (CZE) során a háttérelektrolit csak elektromos vezető és puffer szerepet tölt be, az ionok elválasztása tisztán elektroforetikus tulajdonságukon alapul, semleges részecskék elválasztása nem lehetséges [107, 108, 109, 110]. Az elektrokinetikus kromatográfiás eljárások során az elválasztó elektrolit valamilyen pszeudo-állófázist is tartalmaz, mellyel a vizsgált vegyületek különböző mértékben léphetnek kölcsönhatásba, így az ionok elválasztásában az elektroforetikus mellett, kromatográfiás elvek is részt vesznek. Ezekkel az eljárásokkal mód nyílik töltéssel nem rendelkező molekulák elektromosan vezérelt elválasztására is. A leggyakrabban alkalmazott pszeudo-állófázisok a felületaktív anyagok és a királis szelektorok. Előbbi esetben, melyet micelláris elektrokinetikus kromatográfiának (MEKC) neveznek, egy ionos tenzidet a kritikus micella-koncentrációt meghaladó mennyiségben alkalmazva töltéssel, s ezáltal saját elektroforetikus mobilitással rendelkező micellák jönnek létre. A vizsgált molekulák különböző mértékben oszlanak meg a hidrofil háttérelektrolit és a hidrofób micellafázis között [121, 122]. Királis kapilláris elektroforézis során a 25

26 IRODALMI ÁTTEKINTÉS pszeudo-állófázis valamilyen optikailag aktív molekula, mellyel különböző mértékben léphetnek kölcsönhatásba a mintakomponensek enantiomerei, így lehetőség nyílik azok elválasztására [123]. Az elektrokinetikus kromatográfiákhoz hasonló a kapilláris elektrokromatográfia (CEC) alapelve is, azonban ekkor valódi állófázist tartalmaz a kapilláris, mely lehet hagyományos kromatográfiás töltet, a kapillárisban létrehozott monolit vagy gél, illetve a kapilláris belső falára felvitt fázis. Az elválasztás ebben az esetben is a mintakomponensek elektroforetikus és kromatográfiás tulajdonságain alapul, fő előnye a folyadékkromatográfiás módszerekkel szemben, hogy az analízis hajtóereje nem, vagy nem elsősorban a hidrodinamikai nyomáskülönbség, hanem az elektroozmotikus áramlás, mely nagyobb hatékonyságot biztosít. Mivel az elektroozmotikus áramlás magában a töltött kapillárisban jön létre nem alakul ki jelentős ellenállás a töltetben sem, ami lehetőséget teremt hosszabb oszlopok, illetve kisebb szemcseméretű állófázis alkalmazására, így tovább növelve az elválasztás hatékonyságát [124, 125]. A kapilláris gélelektroforézis (CGE) a hagyományos lap gélelektroforézis kapillárisra adaptált változata. Az eljárás töltéssel rendelkező makromolekulák (nukleinsavak, natív és denaturált fehérjék) méret szerinti elválasztására alkalmas. A biopolimerek mozgatásáért töltésük, elválasztásukért a kapillárisba töltött szűrő mátrix a felelős [126, 127]. A kapilláris gélelektroforézishez hasonlóan a kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF) is a megfelelő lap technika kapilláris változata, melynek során a kapillárist különböző izoelektromos ponttal rendelkező ikerionos pufferek keverékéből álló, úgynevezett amfolit oldattal töltik meg, az inlet illetve outlet végét, pedig sav illetve lúg oldatba merítik. A feszültségforrás bekapcsolása után a kapillárisban dinamikus ph gradiens jön létre. Az elsősorban fehérjéket, esetleg más polielektrolitokat tartalmazó mintát általában az amfolit oldathoz keverve töltik a kapillárisba. A mintakomponensek a kialakult ph gradiensben addig vándorolnak, míg el nem érik az izoelektromos pontjuknak megfelelő ph-t, ahol többé nem rendelkeznek töltéssel, s így elektroforetikus mobilitással. Az eljárás második, a fókuszálást követő mobilizációs lépésében a kialakult zónákat valamilyen módszerrel továbbítják a detektor irányába, ami történhet nyomás alkalmazásával, az elektroozmotikus áramlás következtében vagy a ph gradiens újraszervezésével (magas sókoncentráció alkalmazásával) [128]. 26

27 IRODALMI ÁTTEKINTÉS A kapilláris izotachoforézis (CITP) egy olyan speciális módja az elektroforézisnek, mikor nem homogén puffer-rendszer alkalmazásával a kapillárisban egyenetlen térerő eloszlást hoznak létre. A nagy mobilitású vezetőionok által képzett zónában kisebb a feszültségesés, mint a közepes mobilitású mintazónában, vagy a kifejezetten alacsony mobilitású záró zónában. A térerő gradiens hatására a különböző mobilitású ionok egymást követő, keskeny zónákban felzárkóznak a leggyorsabb ion, a vezető ion által képzett zónához, és az az által diktált, egyforma sebességgel (izotachoforetikus módon) haladnak a kapillárisban. A kapilláris izotachoforézis csak azonos töltésű ionok elválasztására, detektálására és kvantitatív meghatározására alkalmas. Izotachoforézis során a kromatográfiában és az egyéb kapilláris elektroforézis módok esetében megszokottól eltérően az egyes mintakomponensek nem jól elváló csúcsok formájában, hanem egymást követő lépcsőként jelennek meg az izotachoferogramon [129]. Fő alkalmazási módja a mintában alacsony koncentrációban jelenlévő komponensek nagyobb térfogatból történő koncentrálása. A jobb kvantitatív értékelés érdekében ilyenkor az átmenti izotachoforetikus áramlást kapilláris zónaelektroforézissé alakítják, így a detektálás során az egymástól elvált zónák a megszokott csúcsok formájában jelennek meg az elektroferogramon [130, 131] A királis kapilláris elektroforézis Az enantiomer-elválasztás módjai A kapilláris elektroforézis során elérhető nagy hatékonyság különösen alkalmassá teszi a technikát az optikai izomerek elválasztására [97, 123]. Egy vegyület enantiomerei akirális közegben nem mutatnak különbséget fizikai és kémiai tulajdonságukban, így elektroforetikus mobilitásukban vagy kromatográfiás viselkedésükben sem. Elválasztásuk királis segédanyag felhasználásával lehetséges, melyre alapvetően két módszert dolgoztak ki. Indirekt analízis során egy királis reagenssel reagáltatva az enantiomereket, több királis centrumot tartalmazó vegyületeket hoznak létre. Mivel a reagens csak egy sztereoizomert tartalmaz, a reakcióban diasztereomerek keletkeznek, melyek már elválaszthatók a fizikai tulajdonságaikban rejlő különbségek alapján. A folyamat analóg a preparatív eljárások során alkalmazott reszolválással. Az indirekt analízis ugyanakkor 27

28 IRODALMI ÁTTEKINTÉS számos hátrányos tulajdonsággal rendelkezik, ezért mára egyre ritkábban alkalmazzák. Az eljárás során alapvető fontosságú a nagy tisztaságú és különösen magas enantiomertisztaságú reagens alkalmazása, mivel ellenkező esetben több termék képződésével találhatjuk szemben magunkat. Gyakori probléma, hogy nehéz a reakció kvantitatív végbemenetelét biztosítani, különösen alacsony koncentráció esetén. A származékképzés általában munka és időigényes, az analízis nehezen automatizálható és költséges [132, 133]. Az indirekt enantiomer elválasztás hátrányos tulajdonságai miatt az utóbbi két évtizedben a figyelem a direkt királis elválasztás irányába terelődött, mind a folyadékkromatográfiás eljárások, mind a kapilláris elektroforézis esetében. A direkt analízis során is királis segédanyagot használnak az enantiomerek elválasztásához, azonban nem alakítanak ki kovalens kötéseket a vizsgált molekula és a királis reagens között. Az elválasztást a királis szelektor jelenlétében végezve, in situ jönnek létre reverzibilis diasztereomer komplexek, melyeket gyenge másodlagos kötések stabilizálnak [133]. Dalgliesh három pontos kölcsönhatás szabálya szerint a sztereoszelektív kölcsönhatás, s így az enantiomer elválasztás feltétele, hogy a vizsgált molekula és a királis szelektor között legalább három pontos kötés jöjjön létre, melyek közül legalább egy pont sztereoszelektív kell, hogy legyen [134]. Királis kapilláris elektroforézis során ahhoz, hogy direkt enantiomer-elválasztást érhessünk el, a sztereoizomerek elektroforetikus mobilitását sztereoszelektív módon kell megváltoztatnunk. Ezt a háttérelektrolithoz adott királis szelektorral érhetjük el, mellyel a vizsgált molekula enantiomerei különböző mértékben léphetnek kölcsönhatásba. Amennyiben a vizsgált vegyület gyenge elektrolit, töltése erősen függ a közeg ph-jától. Királis kapilláris elektroforézis során a részecske töltésétől nemcsak az elektroforetikus tulajdonságai függnek, de hatással lehet a szelektorral való komplexképzésre is, melyre kiemelt figyelmet kell fordítani a módszerfejlesztés során. Amennyiben a sztereoszelektív komplexképzés a szelektor és a részecske között csak az utóbbi töltéssel rendelkező formájában jön létre a komplexképzést ionoszelektívnek, ellenkező esetben dezionoszelektívnek nevezzük. Ha mind a töltött, mind a semleges formában lévő vegyület részt vesz a sztereoszelektív komplexképződésben, duoszelektív folyamatról beszélhetünk [135]. 28

29 IRODALMI ÁTTEKINTÉS Az enantiomer-elválasztás mechanizmusa, alapelvei kapilláris elektroforézis során Direkt elválasztás során tehát a háttérelektrolitban feloldott királis szelektor, mint pszeudo-állófázis befolyásolja a vele kölcsönható enantiomerek effektív mobilitását (µ eff ), mely a szabad és komplex formában lévő enantiomer elektroforetikus mobilitásának (µ f illetve µ c ) és koncentrációjának ([E] illetve [EC]) függvénye: µ eff = [ E ] µ f + [ E ] + [ EC ] [ EC ] µ c (10) [ E ] + [ EC ] Ugyanakkor a szabad ([E]) és komplex ([EC]) formában lévő enantiomer koncentrációja a királis szelektor koncentrációjától ([C]) és a komplexképződés egyensúlyi állandójától (K) függ: [EC] = K[E][C] (11) Így a (10) egyenlet a következőképpen alakul: µ eff = [E] µ f + [E] + K[E][C] K[E][C] µ c = [E] + K[E][C] µ + µ K[C] f c 1+ K[C] (12) Az enantiomer elválasztás alapját a sztereoizomerek effektív mobilitásának különbsége képezi: µ = = µ 2 eff µ 1 eff 2 µ + K [C] f µ c 2 1+ K 2 [C] 1 µ + K [C] f µ c 1 1+ K 1[C] (13) mely vagy a komplexek eltérő stabilitásából (K 1 K 2 ) [136, 137, 138, 139, 140, 141], vagy az eltérő mobilitásukból ( µ 1 ) [97, 140, c µ 2 142] adódik. A gyakorlatban az c előbbi sokkal általánosabb, ezért jelentősége is nagyobb. Ebben az esetben a µ 1 = = c µ 2 c µ c felhasználásával a (13) egyenlet egyszerűbb formára hozható: 29

30 IRODALMI ÁTTEKINTÉS µ = ( µ )( )[C] f µ K 2 c K ( K 1 + K 2 )[C] + K 1 K 2 [C ] 2 (14) Ilyenkor a rendszer sztereoszelektivitását (α) az egyensúlyi állandók aránya adja: α = t t = µ µ 2 eff eff = K K 2 1 (15) ahol t 1 és t 2 az enantiomerek migrációs idejei [97]. Az enantiomer-elválasztás mechanizmusát mutatja vázlatosan az 5. ábra. 5. ábra A királis kapilláris elektroforézis mechanizmusának vázlata A királis szelektorok hatása a vizsgált vegyületek elektroforetikus mobilitására Töltéssel nem rendelkező királis szelektor alkalmazása esetén csak ionos vegyületek vizsgálhatók, mivel azok elektroforetikus mobilitását a szelektorral való kölcsönhatás csökkenti. Semleges molekulák esetében hiába alakul ki sztereoszelektív komplex, a szabad és a komplexált formában lévő enantiomerek mobilitása nem tér el (megegyezik az elektroozmotikus áramlás mobilitásával), így elválasztásuk sem lehetséges. 30