A VASZKULÁRIS ENDOTELIÁLIS NÖVEKEDÉSI

Átírás

1 A VASZKULÁRIS ENDOTELIÁLIS NÖVEKEDÉSI FAKTOR SZINTÉZISÉNEK ÉS SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA HIPOXÁS ÁLLAPOTOKBAN Dr. Vannay Ádám Doktori értekezés Budapest, 2004 Témavezeto: Dr. Szabó András, egyetemi docens Készült a Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Krónikus betegségek gyermekkori prevenciója címu Ph.D. programjának keretében. Programvezeto: Prof. Tulassay Tivadar Opponensek: Dr. Kovács Tibor Dr. Tóth Mikós Szigorlati bizottság: Prof. Rácz Károly Dr. Szalay Csaba Dr. Prohászka Zoltán

2 TARTALOMJEGYZÉK 1. RÖVIDÍTÉSEK 6 2. ÖSSZEFOGLALÓ 9 3. SUMMARY BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS A VEGF génszerkezete A VEGF szintézisének szabályozása A VEGF izoformái A VEGF receptorai A VEGF receptorainak (VEGFR1, VEGFR2) szignalizációja A VEGF biológiai hatásai A VEGF szintézisének és a vese iszkémia/reperfúziós károsodásának 32 kapcsolata 4.8. A hisztamin és a VEGF szintézis kapcsolata a vese iszkémia/reperfúziós 33 károsodása során 4.9. A dehidro-epiandrosztendion és a VEGF szintézis kapcsolata a vese 34 iszkémia/reperfúziós károsodása során A patkány VEGF izoformáinak mrns szintu kimutatása A VEGF génpolimorfizmusok és a kis születési súlyú koraszülöttek 35 retinopátiájának kapcsolata 5. CÉLKITUZÉSEK ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK In vivo patkány vese iszkémia/reperfúziós kísérletek A kísérletek során felhasznált állatok Mutéti beavatkozás Kezelési protokollok Szérum kreatinin és karbamid meghatározás A ves eszövet hisztológiai vizsgálata 41 2

3 Hisztamin ELISA DHEA és dehidro-epiandrosztendion-szulfát radioimmunoassay Szemikvantitatív és kompetitív RT-PCR mérések A patkány vesék szöveti VEGF szintjének meghatározása Western blottal Immunhisztológia Az in vivo patkány vese iszkémia/reperfúziós kísérletek statisztikai analízise A patkány VEGF izoformáinak mrns szi ntu kimutatása real time 51 RT-PCR- fluoreszcens rezonancia energia transzfer segítségével A VEGF különbözo izoformáinak detektálásához használt real time RT-PCR 51 rendszer tervezése során felmerülo megfontolások Rekombináns DNS molekulák eloállítása A rekombináns DNS molekulák klónozása A VEGF izoformáinak detektálása real time RT-PCR-fluoreszcens 56 rezonancia energia transzfer segítségével 6.3. A VEGF gén promoter polimorfizmusainak és a kis születési súlyú 56 koraszülöttek retinopátiája közti kapcsolat vizsgálata A vizsgálatba bevont kis születési súlyú koraszülöttek klinikai adatai DNS izolálás A VEGF T -460 C polimorfizmusának detektálása real time PCR-fluoreszcens 58 rezonancia energia transzfer segítségével A VEGF G +405 C polimorfizmusának detektálása PCR- restrikciós fragment 58 hossz polimorfizmus segítségével A populációs adatok statisztikai feldolgozása EREDMÉNYEK A VEGF szintézisének vizsgálata vese iszkémia/reperfúziós 60 patkánymodellben A szérum kreatinin és karbamid koncentrációjának változásai A vesék szövettani elváltozásai VEGF, IL-6 és az IL-1? mrns expresszió változásai a patkány vesékben A VEGF fehérje szint változásai a patkány vesékben A VEGF szöveti eloszlása a vesében 65 3

4 7.2. A hisztamin és a hisztamin kettes receptor antagonista, ranitidin kezelés 67 hatásának vizsgálata a VEGF szintézisére vese iszkémia/reperfúziós patk ánymodellben A patkányok vese iszkémiát követo túlélése A patkányok szérum kreatinin és karbamid koncentrációjának változásai A patkányok vese tubuláris károsodásának változásai A patkányok szérum hisztamin koncentrációjának változásai A patkányok VEGF mrns expres sziójának változásai a vesében A patkányok L-6 mrns expressziójának változásai a vesében A patkányok VEGF fehérje szintjeinek változásai a vesében A dehidro-epiandrosztendion kezelés hatásának vizsgál ata a VEGF 74 szintézisére patkány vese iszkémia/reperfúziós modellben A patkányok vese iszkémiáját követo túlélés A patkányok szérum kreatinin és karbamid koncentrációjának változásai A vesék szövettani elváltozásai A DHEA kezelés hatása a szérum DHEA és dehidro-epiandrosztendionszulfát 77 koncentrációjára A patkányok VEGF mrns expressziójának változásai a vesében A patkányok IL-1? mrns expressziójának változásai a vesében A patkányok IL-6 mrns expressziójának változásai a vesében A patkányok VEGF fehérjeszint változásai a vesében A patkány VEGF izoformák mrns expressziójának real time 81 RT-PCR-fluoreszcens rezonancia energia transzferrel történo kimutatása A VEGF 120 mrns expressziójának kimutatása A VEGF 144 mrns expressziójának kimutatása A VEGF 164 mrns expressziójának kimutatása A VEGF 188 mrns expressziójának kimutatása A VEGF204 mrns expressziójának kimutatása A VEGF gén promoter polimorfizmusainak és a kis születési súlyú 87 koraszülöttek retinopátiája közti kapcsolat vizsgálata A VEGF promoter régió -460-as lokusz vizsgálatának reprezentatív real time 87 PCR-fluoreszcens rezonancia energia transzfer eredményei 4

5 A VEGF +405-ös lokusz vizsgálatának reprezentatív PCR-RFLP eredményei A VEGF -460-as, illetve +405-ös lokuszának allél, illetve genotípus 88 frekvenciái A kis születési súlyú koraszülöttek haplotípus megoszlása EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE, KÖVETKEZTETÉSEK A patkányvesék iszkémia/re perfúziós károsodása során a VEGF 91 szintézisében bekövetkezo változások megbeszélése 8.2. A hisztamin és a hisztamin kettes receptor antagonista ranitidin 93 kezelésnek a posztiszkémiás patkányvese VEGF szintézisére gyakorolt hatásának megbeszélése 8.3. A dehidro-epiandrosztendion kezelés nek a posztiszk émiás patkányvese 96 VEGF szintézisére gyakorolt hatásának megbeszélése 8.4. A patkány VEGF izoformák detektálására kialakított real time RT-PCRfluoreszcens 99 rezonancia energia transzfer rendszer eredményeink megbeszélése 8.5. A VEGF promoter polimorfizmusainak és a kis születési súlyú 100 koraszülöttek retinopátia kockázatának megbeszélése 9. EREDMÉNYEK ÖSSZEGZÉSE IRODALOMJEGYZÉK ÁBRÁK ÉS TÁBLÁZATOK JEGYZÉKE PUBLIKÁCIÓS LISTA KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 126 5

6 1. RÖVIDÍTÉSEK Akt anti-apoptikus kináz BAD Bcl 2 antagonista bfgf bázikus fibroblaszt növekedési faktor camp adenozin 3, 5 -monofoszfát Crk avian szarkóma vírus CT10 homológ DAG diacilglicerol DHEA dehidro-epiandrosztendion DHEA-S dehidro-epiandrosztendion-szulfát dntp dezoxi nukleotid trifoszfát ECM extracelluláris mátrix EGF epidermális növekedési faktor enos endoteliális nitrogén-monoxid szintáz FAK fokális adhéziós kináz FR transzkripcióra nem kerülo génszakasz FRET fluoreszcens rezonancia energia transzfer Fyn, fyn tirozinkináz protoonkogén GAP GTPáz aktíváló fehérje GAPDH glicerin-aldehid-foszfát dehidrogenáz Grb2, növekedési faktor receptor köto fehérje 2 HIF-1 hipoxia indukálta faktor 1 HR2 hisztamin receptor 2 HRE hipoxia válasz elem HSPG heparin szulfát proteoglikán HuR Hu-antigen R HUVEC human köldökzsinór endotélsejt I/R iszkémia/reperfúzió IAP apoptózis gátló IGF-I inzulinszeru növekedési faktor I IL-1? interleukin-1? IL-6 interleukin-6 6

7 IP3 inozitol 1,4,5,-trifoszfát IRES riboszóma köto hely JNK c-jun N -terminális protein kináz L-NAME N(G)-nitro-l-arginin metil észter MAM meprin-a5 antigen-protein-tirozin foszfatáz? MAPK mitogen-aktivált protein kináz MEK mitogén-aktivált protein kináz kináz MMP mátrix metalloproteáz NCBI nemzeti biotechnikai információs központ Nck, Nck mediátor fehérje NF IL-6 nukleáris faktor IL-6 NF?? nukleáris faktor-??? NO nitrogén-monoxid NP-1 neutropilin-1 PBS foszfátpuffer PCR polimeráz láncreakció PDGF trombocita növekedési faktor PG propilén-glikol PGI 2 prosztaciklin PI3K foszfatidilinozitol 3 -kináz PIGF placenta növekedési faktor PIP2 foszfatidilinozitol-biszfoszfát PKC fehérje kináz C PLA 2 foszfolipáz A2 PLC foszfolipáz C Pyk2 FAK tirozinkináz 2 Raf-1 v-raf-1 rágcsáló leukémia vírus onkogén homológ Ras Ras-GTP-áz aktivitású fehérje 1 RFLP restrikciós fragment hossz polimorfizmus RIA radioimmunoassay ROP koraszülött ek retinopátiája RT reverz transzkripció 7

8 Sch schwannomin sflt -1 szolúbilis VEGF receptor 1 SHP fehérje-tirozin foszfatáz SNP egy nukleotidot érinto polimorfizmus Sos guanin nukleotid kicserélo faktor Src avian szarkóma vírus onkogén TGF transzformáló növekedési faktor UTR fehérjére át nem íródó génszakasz VEGF vaszkuláris endoteliális növekedési faktor VEGFR1 VEGF receptor 1 VEGFR2 VEGF receptor 2 VLBW kis születési súlyú koraszülött VVO veziko-vakuoláris sejtorganellumok Yes Yamaguchi szarkóma vírus onkogén homológ 8

9 2. ÖSSZEFOGLALÓ A vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) egy számos izoformával (VEGF 121, VEGF 145, VEGF 165, VEGF 189, VEGF 206 ) rendelkezo homodimer polipeptid. A VEGF fontos szabályzó eleme az endotélsejtek differenciálódásának, proliferációjának, vándorlásának és így az angiogenezisnek. A VEGF ezeken a folyamatokon kívül számos sejtfunkciót, így a nitrogén-monoxid (NO) és prosztaciklin (PGI 2 ) termelést, a simaizomsejt proliferációt és az apoptózist is befolyásolja. Vizsgálataink során a VEGF szintézisét, illetve annak szerepét vizsgáltuk különbözo hipoxiás kórképekben. Állatkísérleteink kapcsán vizsgáltuk a VEGF szintézisét a vese iszkémia/reperfúziós (I/R) károsodása során és kifejlesztettünk egy, a különbözo patkány VEGF izoformák mrns expresszióját detektáló real time RT-PCR rendszert. Humán vizsgálatainkban VEGF gén polimorfizmusok (SNP) allél és haplotípus frekvenciáit vetettük össze a kis születési súlyú koraszülöttek retinopáta (ROP) kockázatával. Állatkísérleteink során azt találtuk, hogy más posztiszkémiás szervektol eltéroen, a posztis zkémiás vesében változatlan VEGF mrns expresszió mellett emelkedik a VEGF fehérje szintje. Kísérleti állataink hisztamin, ranitidin, illetve dehidro-epiandrosztendion (DHEA) kezelése után a VEGF mrns expresszió, illetve fehérje szint, egymástól eltéro irányú változását tapasztaltuk a posztiszkémiás vesékben. Adataink a VEGF szintézisének egyedülálló, poszt -transzkripcionális szabályozására utalnak a posztiszkémniás vesében. A kifejlesztett real time RT-PCR rendszer egyedülálló módon alkalmas a különbözo patkány szövetekben a VEGF 120-as, 144-es, 164-es, 188-as és 205-ös izoformáinak egymástól független detektálására. A VEGF -460 C alléljának, valamint a -460 TT/ +405 CC haplotípus ának elofordulása gyakoribb volt a retinopátia fokozott kockázata miatt krioterápiával vagy fotokoagulációval kezelt kis születési súlyú koraszülöttekben, mint a nem kezeltekben. Összefoglalva, adataink a vese VEGF szintézisének egyedülállóan, a korábbi in vitro, illetve in vivo modellekben tapasztaltaktól különbözo, poszt-transzkripcionális jellegére utalnak. Humán genetikai vizsgálataink eredménye arra utal, hogy a VEGF T -460 C és G +405 C SNP-k vizsgálata hasznos információt ad a kis születési súlyú koraszülöttek, ROP rizikójának becslésére. 9

10 3. SUMMARY Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a homodimeric polipeptid which posses different isoforms (VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF189, VEGF206). VEGF plays a crucial role in the differentiation, proliferation and migration of the endothel cells and therefore in angiogenesis. VEGF also regulates multiple endothelial cell functions, such as synthesis of nitric oxide (NO) and prostacyclin (PGI 2 ), proliferation of vascular smooth muscle cell and apoptosis. We investigated the regulation of VEGF synthesis and its role in different ischemic diseases. In our animal experiments we analysed the changes in VEGF synthesis in a rat model of ischemia/reperfusion (I/R) induced acute renal failure. Moreover, we developed a new real time RT-PCR method to measure the mrna expression of different VEGF izoforms. In our human study we investigated the association of functional promoter polimorphisms of VEGF with the risk of proliferativ retinopathy (ROP) of very low birht weight infants (VLBW). In rats with I/R induced acute renal failure the increased VEGF protein levels but not mrna expression suggesting that during renal I/R injury VEGF synthesis - distinct from other organs - is primarily regulated at a post-transcriptional level. Histamine, ranitidine and DHEA pretreatment of the rats resulted in distinct changes in VEGF mrna expression and protein levels in the postischemic kidneys further supporting the importance of posttranscriptional mechanisms in the regulation of VEGF synthesis. Our real time RT -PCR system, irrespectively of each other, is able to detect the different VEGF izoforms. We observed increased prevalence of VEGF +405 C allele and VEGF TT/ +405 CC haplotype in VLBW infants between treated with or without cryotherapy/photocoagulation due to risk of proliferative ROP. In conclusion our data suggest that ischemic kidney has a unique regulation of VEGF synthesis. Our data emphasize the importance of the posttranscriptional regulation of VEGF synthesis in the postischemic rat kidney. Our findings also suggest that testing of VEGF SNPs would provide valuable information for the risk assessment of ROP in VLBW infants. 10

11 4. BEVEZETÉS, IRODALMI ÁTTEKINTÉS A vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) befolyásolja az endotélsejtek differenciálódását [1], proliferációját [2] és migrációját [3]. Ezeken a folyamatokon keresztül szabályozza az angiogenezist mind, az embrionális fejlodés során [4] mind, pedig a születést követoen [5]. A VEGF számos betegség patomechanizmusában (kardiovaszkuláris megbetegedések, daganatok, reumatoid artritisz) játszik szerepet. Azon betegségek esetén, ahol az angiogenezis a patomechanizmus központi eleme (daganatok, gyulladásos kórképek), a túl nagy mennyiségben termelodo VEGF a betegség progressziójához vezethet. Ugyanakkor más betegségekben, ahol az érellátási, illetve a keringési zavar dominál (pl.: iszkémiás szívbetegség), a VEGF mint terápiás eszköz jöhet szóba. Egyre világosabban látszik az is, hogy a VEGF egy multifunkcionális citokin, amely nem csak az angiogenezist befolyásolja. A VEGF az endotélsejtek (és más egyéb sejtek pl.: vese tubuláris epitélsejt) számos egyéb biológiai funkcióját is szabályozza. A VEGF fokozza a nitrogén-monoxid (NO) és a prosztaciklin (PGI 2 ) [6] szintézist, valamint gátolja a trombusképzodést [7] és a simaizom sejtek proliferációját [8]. A VEGF hatással van a gyulladásos folyamatokra [9] és befolyásolja a sejtek apoptozisát [10, 11]. Mivel VEGF számos biológiai folyamat (angiogenezis, szöveti átépülés, gyulladás, apoptózis, daganatáttét-képzés) szabályozásában vesz részt, fontos megérteni a különbözo betegségek patomechanizmusában betöltött szerepét A VEGF génszerkezete A humán VEGF gén a hatos kromoszóma rövid karján (6p21.3) helyezkedik el. A VEGF génjének 5, illetve 3 végi transzkripcióra nem kerülo (flanking region - FR), illetve fehérjére át nem íródó régiója (untranslated region = UTR) igen összetett szerkezetu (1. ábra). Ezeknek a területeken lokalizált, speciális nukleotid 11

12 szekvenciáknak fontos szerepe van a gén trans zkripciós, illetve transzlációs szintu szabályozásában. A VEGF gén transzkripciója a bázistól indul (vastag, nagy betu ) [12]. A VEGF transzkripciós start pontja körüli régióban, ellentétben számos más génnel, nem található TATA szekvencia (TATA box). Mindössze a gén távoli 5 FR szakaszán található TATA box (-2465 és es bázisai között), ez azonban túl távol helyezkedik el a gén transzkripciós start pontjától ahhoz, hogy szignifikáns hatása lehessen a transzkripcióra [12]. A es és os bázisok között található a gén azon szakasza (5 TACGTTTT 3 ), amely a transzkripció hipoxia általi szabályozásáért felelos (hipoxia válasz elem - HRE) a hipoxia indukálható faktor-1 (HIF 1) megkötésén keresztül. Ehhez a régióhoz közel (-2000 és és bázisai között) fekszik még egy úgynevezett, járulékos HIF-1 transzkripciós faktor köto szekvencia (5 ACAGGTC 3 ), amelynek szintén szerepe van a hipoxia hatásának közvetítésében. Ugyanezek a régiók felelosek a NO VEGF transzkripciójára kifejtett hatásaiért is [13]. Két 5 CCGCCC 3, illetve 5 GGGCGG 3 bázis szekvenciájú szakasz, úgynevezett GC box található a gén 5 FR régiójában (-2138 és -2133, valamint és bázisok között) [12]. A transzkripciós start pontot közvetlenül megelozo régióban négy GC box is található (-1133 és -1128, és -1118, és -1107, valamint és bázisok között). További két GC box van az 5 UTR régióban a -518 és -513, valamint a -66 és -61 bázisok között [12]. Korábban hasonló GC boxokat találtak más gének transzkripciós start pontja körüli régiókban is. Ezeknél a géneknél a GC box-ok feladata az Sp1-es transzkripciós faktor megkötése. Feltételezheto, hogy a VEGF estében is hasonló szerepe van ezeknek a GC gazdag szekvenciáknak [12]. Öt kötohely található az AP-1-es (-2930 és -2924, és -2258, és -1969, és -1522, valamint -620 és -614 bázisok között) és ketto az AP-2-es (-1875 és -1868, valamint -135 és -128) transzkripciós faktor számára a VEGF 5 FR, illetve 5 UTR régiójában. Az AP-1-es és az AP-2-es transzkripciós faktorok kötohelyeivel komplementer szakaszok jelenléte a VEGF transzkripciójának 12-O-tetradekanoilforbol-13-acetáton, illetve camp-n keresztüli aktiválhatóságára utalnak [12]. 12

13 A VEGF 5 UTR-jának és bázisa közötti szakaszán egy extra start kodon (AUG) található. Bár a pontos jelentosége ennek a struktúrának nem ismert, részét képezi a VEGF 5 UTR-n található transzláció folyamatának szabályozásáért felelos génszakasznak (internal ribosomal entry site IRES). Ezért valószínusítik az extra start kodonnak transzláció szabályozásában való szerepét. A VEGF 5 UTR-jén két IRES szekvenciát is azonosítottak (IRES A és B), ezek a szakaszok a gén 947 és 555 (IRES B), illetve a 293 és a 1 (IRES A) bázisai között helyezkednek el [14]. Ezeken a gén szakaszokon (IRES A és B) belül is kitüntetett szerepe van a -947 és a -904, -659 és a -555, illetve a és a -192, a -187 és a -131, valamint a -121 és a -41 bázisok közti szakaszoknak. Ezen szakaszok deléciója jelentos mértekben csökkenti a VEGF transzlációját. Az eddig felsorolt, a VEGF szintézisének szabályozásában fontos génszakaszokon kívül ösztrogén receptor köto régió található a gén 5 UTR (5 GGGCAAAGTGACT 3 ) régiójában a gén -637 és -625 bázisai között. Ez a régió mind az ösztrogén? mind, pedig? receptorát megkötik. Ez a szekvencia felelos a VEGF transzkripciójának ösztrogén általi szabályzásáért [15]. A gén 5 UTR régiójának közvetlenül a transzlációs start kodont megelozo régiója igen gazdag G, illetve C bázisokban. Bár a pontos szerepe ezeknek a GC gazdag régióknak nem ismert, minden bizonnyal a transzláció finom szabályozásában van szerepük. Hasonló szerkezete van más növekedési faktorok a (bázikus fibroblaszt növekedési faktor = bfgf, illetve a transzformáló növekedési faktor béta = TGF?) 5 UTR régiójának is [16, 17]. A VEGF gén fehérjét kódoló régiója, mintegy 14 kb hosszúságú, 8 exont tartalmazó szakasz. A génrol átírt mrns alternatív splicingja során több különbözo VEGF izoforma keletkezik [18, 19]. A VEGF 3 UTR-ja AU gazdag. A gén 3 UTR-jén sikerült azonosítani egy 13 bázisnyi szakaszt (5 TTTTTTAATTTTA 3 ), mely képes egy RNS köto fehérje, a HuR megkötésére. A HuR megkötése a VEGF mrns-ének stabilizálásához vezet [20]. 13

14 1. ábra: A humán VEGF gén promoterének, kódoló szakaszának és részleges 3 UTR-jának, illetve FR-jának szerkezete (nemzeti biotechnikai információs központ (NCBI) AF095785, AF437895) aatgagcccttagggctcagagcctccatcctgccccaagatgtctacagcttgtgctcc tggggtgctagaggcgcacaaggaggaaagttagtggcttcccttccatatcccgttcat cagcctagagcatggagcccaggtgaggaggcctgcctgggagggggccctgagccagga aataaacatttactaactgtacaaagaccttgtccctgctgctggggagcctgccaagtg gtggagacaggactagtgcacgaatgatggaaagggagggttggggtgggtgggagccag cccttttcctcataagggccttaggacaccataccgatggaactgggggtactggggagg taacctagcacctccaccaaaccacagcaacatgtgctgaggatggggctgactaggtaa gctccctggagcgttttggttaaattgagggaaattgctgcattcccattctcagtccat..... c/a gcctccacagaggctatgccagctgtaggccagaccctggcaagatctgggtggataatc agactgactggcctcagagccccaactttgttccctggggcagcctggaaatagccaggt..t/c cagaaaccagccaggaatttttccaagctgcttcctatatgcaagaatgggatgggggcc tttgggagcacttagggaagatgtggagagttggaggaaaagggggcttggaggtaaggg aggggactgggggaaggataggggagaagctgtgagcctggagaagtagccaagggatcc tgagggaatgggggagctgagacgaaacccccatttctattcagaagatgagctatgagt ctgggcttgggctgatagaagccttggcccctggcctggtgggagctctgggcagctggc ctacagacgttccttagtgctggcgggtaggtttgaatcatcacgcaggccctggcctcc acccgcccccaccagccccctggcctcagttccctggcaacatctggggttgggggggca gcaggaacaagggcctctgtctgcccagctgcctccccctttgggttttgccagactcca cagtgcatacgtgggctccaacaggtcctcttccctcccagtcactgactaaccccggaa ccacacagcttcccgttctcagctccacaaacttggtgccaaattcttctcccctgggaa gcatccctggacacttcccaaaggaccccagtcactccagcctgttggctgccgctcact ttgatgtctgcaggccagatgagggctccagatggcacattgtcagagggacacactgtg gcccctgtgcccagccctgggctctctgtacatgaagcaactccagtcccaaatatgtag ctgtttgggaggtcagaaatagggggtccaggagcaaactccccccaccccctttccaaa 14

15 gcccattccctctttagccagagccggggtgtgcagacggcagtcactagggggcgctcg gccaccacagggaagctgggtgaatggagcgagcagcgtcttcgagagtgaggacgtgtg..... c/t tgtctgtgtgggtgagtgagtgtgtgcgtgtggggttgagggtgttggagcggggagaag... t/c gccaggggtcactccaggattccaacagatctgtgtgtccctctccccacccgtccctgt ccggctctccgccttcccctgcccccttcaatattcctagcaaagagggaacggctctca ggccctgtccgcacgtaacctcactttcctgctccctcctcgccaatgccccgcgggcgc gtgtctctggacagagtttccgggggcggatgggtaattttcaggctgtgaaccttggtg ggggtcgagcttccccttcattgcggcgggctgcgggccaggcttcactgggcgtccgca... g/a gagcccgggcccgagccgcgtgtggaggggctgaggctcgcctgtccccgccccccgggg cgggccgggggcggggtcccggcggggcggagccatgcgccccccccttttttttttaaa agtcggctggtagcggggaggatcgcggaggcttggggcagccgggtagctcggaggtcg TGGCGCTGGGGGCTAGCACCAGCGCTCTGTCGGGAGGCGCAGCGGTTAGGTGGACCGGTC AGCGGACTCACCGGCCAGGGCGCTCGGTGCTGGAATTTGATATTCATTGATCCGGGTTTT ATCCCTCTTCTTTTTTCTTAAACATTTTTTTTTAAAACTGTATTGTTTCTCGTTTTAATT TATTTTTGCTTGCCATTCCCCACTTGAATCGGGCCGACGGCTTGGGGAGATTGCTCTACT TCCCCAAATCACTGTGGATTTTGGAAACCAGCAGAAAGAGGAAAGAGGTAGCAAGAGCTC CAGAGAGAAGTCGAGGAAGAGAGAGACGGGGTCAGAGAGAGCGCGCGGGCGTGCGAGCAG. g/c CGAAAGCGACAGGGGCAAAGTGAGTGACCTGCTTTTGGGGGTGACCGCCGGAGCGCGGCG TGAGCCCTCCCCCTTGGGATCCCGCAGCTGACCAGTCGCGCTGACGGACAGACAGACAGA CACCGCCCCCAGCCCCAGCTACCACCTCCTCCCCGGCCGGCGGCGGACAGTGGACGCGGC GGCGAGCCGCGGGCAGGGGCCGGAGCCCGCGCCCGGAGGCGGGGTGGAGGGGGTCGGGGC TCGCGGCGTCGCACTGAAACTTTTCGTCCAACTTCTGGGCTGTTCTCGCTTCGGAGGAGC CGTGGTCCGCGCGGGGGAAGCCGAGCCGAGCGGAGCCGCGAGAAGTGCTAGCTCGGGCCG GGAGGAGCCGCAGCCGGAGGAGGGGGAGGAGGAAGAAGAGAAGGAAGAGGAGAGGGGGCC GCAGTGGCGACTCGGCGCTCGGAAGCCGGGCTCATGGACGGGTGAGGCGGCGGTGTGCGC AGACAGTGCTCCAGCCGCGCGCGCTCCCCAGGCCCTGGCCCGGGCCTCGGGCCGGGGAGG AAGAGTAGCTCGCCGAGGCGCCGAGGAGAGCGGGCCGCCCACAGCCCGAGCCGGCAGAGG.... t/c. Met Asn Phe Leu Leu -40 GAGCGCGAGCCGCGCCGGCCCCGGTCGGGCCTCCGAAACC ATG AAC TTT CTG CTG 15

16 Exon 1 Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu Tyr Leu His His Ala Lys TCT TGG GTG CAT TGG AGC CTT GCC TTG CTG CTC TAC CTC CAC CAT GCC AAG Trp Ser Gln gtaagcggtcgtgccct...tctctttctgtcctcag TGG TCC CAG Exon 2 Ala Ala Pro Met ALa Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu V GCT GCA CCC ATG GCA GAA GGA GGA GGG CAG AAT CAT CAC GAA Ggtgagtcccc al Val Lys Phe Met Asp ctggctg...catcgcctctcatgcag TG GTG AAG TTC ATG GAT Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe GTC TAT CAG CGC AGC TAC TGC CAT CCA ATC GAG ACC CTG GTG GAC ATC TTC Exon 3 Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro CAG GAG TAC CCT GAT GAG ATC GAG TAC ATC TTC AAG CCA TCC TGT GTG CCC Leu Met Arg Cys GlY Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro CTG ATG CGA TGC GGG GGC TGC TGC AAT GAC GAG GGC CTG GAG TGT GTG CCC Glu Thr Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln ACT GAG GAG TCC AAC ATC ACC ATG CAG gtgggcatctttgggaa... Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln GLy Gln...gcttccttcctttccag ATT ATG CGG ATC AAA CCT CAC CAA GGC CAG Exon 4 His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Ar CAC ATA GGA GAG ATG AGC TTC CTA CAG CAC AAC AAA TGT GAA TGC AG gtgagg Exon 5 g Pro Lys Lys Asp atgtagtcacg...ctccctacccattgcag A CCA AAG AAA GAT Arg Ala Arg Gln Gln Ly/AS AGA GCA AGA CAA GAA AA gtaagtggccctgactt...gtttt Exon 6 S Lys Ser Val Arg Gly Lys Gly Lys Gly Gln Lys Arg Lys Arg tttattttccag A AAA TCA GTT CGA GGA AAG GGA AAG GGG CAA AAA CGA AAG CGC Lys Lys Ser Arg Tyr Lys Ser Trp Ser Va AAG AAA TCC CGG TAT AAG TCC TGG AGC GT gtacgttggtgcccgct... l Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg...cttttgcctttttgcag T CCC TGT GGG CCT TGC TCA GAG CGG AGA Exon 7 Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn AAG CAT TTG TTT GTA CAA GAT CCG CAG ACG TGT AAA TGT TCC TGC AAA AAC Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Ar ACA CAC TCG CGT TGC AAG GCG AGG CAG CTT GAG TTA AAC GAA CGT ACT TGC AG g Cys Asp gttggttcccagaggca... ttttccatttccctcag A TGT GAC Exon 8 Lys Pro Arg Arg *** AAG CCG AGG CGG TGA GCCGGGCAGGAGGAAGGAGCCTCCCTCAGGGTTTCGGGAACCAGATCTC TCACCAGGAAAGACTGATACAGAACGATCGATACAGAAACCACGCTGCCGCCACCACACCATCACCATC 16

17 GACAGAACAGTCCTTAATCCAGAAACCTGAAATGAAGGAAGAGGAGACTCTGCGCAGAGCACTTTGGGT t/c CCGGAGGGCGAGACTCCGGCGGAAGCATTCCCGGGCGGGTGACCCAGCACGGTCCCTCTTGGAATTGGA TTCGCCATTTTATTTTTCTTGCTGCTAAATCACCGAGCCCGGAAGATTAGAGAGTTTTATTTCTGGGAT TCCTGTAGACACACCCACCCACATACATACATTTATATATATATATATTATATATATATAAAAATAAAT ATCTCTATTTTATATATATAAAATATATATATTCTTTTTTTAAATTAACAGTGCTAATGTTATTGGTGT CTTCACTGGATGTATTTGACTGCTGTGGACTTGAGTTGGGAGGGGAATGTTCCCACTCAGACCTGACAG GGAAGAGGAGGAGATGAGAGACTCTGGCATGATCTTTTTTTTGTCCCACTTGGTGGGGCCAGGGTCCTC TCCCCTGCCCAGGAATGTGCAAGCCAGGGCATGGGGGCAAATATGACCCAGTTTTGGGAACACCGACAA AC CCAGCCCTGGCGCTGAGCCTCTCTACCCCAGGTCAGACGGACAGAAAGACAGATCACAGGTACAGG t/c GATGAGGACACCGGCTCTGACCAGGAGTTTGGGGAGCTTCAGGACATTGCTGTGCTTTGGGGATTCCCT CCACATGCTGCACGCGCATCTCGCCCCCAGGGGCACTGCCTGGAAGATTCAGGAGCCTGGGCGGCCTTC g/a GCTTACTCTCACCTGCTTCTGAGTTGCCCAGGAGGCCACTGGCAGATGTCCCGGCGAAGAGAAGAGACA t/c CATTGTTGGAAGAAGCAGCCCATGACAGCTCCCCTTCCTGGGACTCGCCCTCATCCTCTTCCTGCTCCC g/a CTTCCTGGGGTGCAGCCTAAAAGGACCTATGTCCTCACACCATTGAAACCACTAGTTCTGTCCCCCCAG t/c GAGACCTGGTTGTGTGTGTGTGAGTGGTTGACCTTCCTCCATCCCCTGGTCCTTCCCTTCCCTTCCCGA GGCACAGAGAGACAGGGCAGGATCCACGTGCCCATTGTGGAGGCAGAGAAAAGAGAAAGTGTTTTATAT ACGGTACTTATTTAATATCCCTTTTTAATTAGAAATTAAAACAGTTAATTTAATTAAAGAGTAGGGTTT TTTTTCAGTATTCTTGGTTAATATTTAATTTCAACTATTTATGAGATGTATCTTTTGCTCTCTCTTGCT CTCTTATTTGTACCGGTTTTTGTATATAAAATTCATGTTTCCAATCTCTCTCTCCCTGATCGGTGACAG g/a TCACTAGCTTATCTTGAACAGATATTTAATTTTGCTAACACTCAGCTCTGCCCTCCCCGATCCCCTGGCT CCCCAGCACACATTCCTTTGAAATAAGGTTTCAATATACATCTACATACTATATATATATTTGGCAACTT t/c GTATTTGTGTGTATATATATATATATATGTTTATGTATATATGTGATTCTGATAAAATAGACATTGCTAT TCTGTTTTTTATATGTAAAAACAAAACAAGAAAAAATAGAGAATTCTACATACTAAATCTCTCTCCTTTT TTAATTTTAATATTTGTTATCATTTATTTATTGGTGCTACTGTTTATCCGTAATAATTGTGGGGAAAAGA TATTAACATCACGTCTTTGTCTCTAGTGCAGTTTTTCGAGATATTCCGTAGTACATATTTATTTTTAAAC AACGACAAAGAAATACAGATATATCTTaaaaaaaaaaaagcattttgtattaaagaatttaattctgatc tcaaagctcctcttggtttctccttctccattgaatccttgctctagacttcctcccgccccctttccct cttcctctggggaacatggcatttgtcttgggtctgggaaaggtacgtctaatgtgtaggatatggggtg acccaccttgttgtgctgggggcaaagtccttccattttggctgagctggtcctgggggaacccatccat cctgtcttgatatagaaggtgggaagctctgggaatgggtggagggggagaaacagcttaggagccaagg 17

18 gcccttgcaattggtagtgctgccttcaggaattagatgatccaggcccctgtcccttagccagggaaag aactggccatgtctccaagcttgctgcccaggagacaggagagagctgtttttgtctgtgggggtcttgt tggctgcaacaggctgggagtgggagggggatgctgctggagggctgtgactccagggtgtaacttaatt ttacatagttttacaccctggagttccttgagcctctggaagatggacccataggtttggtcaccactga tgggactccctgccccagcttgccataagctcttctctcacgtcctgctcctgggtaaggtggcacctat ccaggtctttgacactgaagggcagtgcttccaaattcacttcctctagcctctcatttattcttgcaaa ccatagatatggcttgaataaatattgagccagtcattgtgctgctatgaataagacacaattccacccc tcaaggatctggtgaggatgggtgggtggggagacccaaaactataaatccatgagcagaaaaatacata aaatgtgctgggggcatctgatctagcttgggagtgggagttgtattgggggtggtggctggggggtggt g/a gtcttatgacattatctctaggctgccacttaaagtatggtttgaagacagggagaacggggcggcggag tgaaagggttgaggacatcccaggcagaagggatagtgtgagcaaggcatgaaggtggcacttgggcagg A gén teljes szakaszán számos polimorf hely található (aláhúzott betu felette jelölve a báziscsere). A gén transzkripciója a bázisnál (vastag nagybetu) indul. TATA box található a gén és es bázisai között (vastag kisbetu). A gén es és os, illetve a és és bázisai között találhatóak a hipoxia indukálható faktor-1 megkötéséért felelos génszakaszok (aláhúzott, vastag kisbetuk). GC boxok találhatók a gén és -2133, és -1272, és -1128, és -1118, és -1107, és -1091, -518 és -513, valamint -66 és -61 bázisok között (bekeretezett szakaszok). AP-1 transzkripciós faktor kötohelyek vannak a gén és -2924, és -2258, és -1969, és -1522, valamint -620 és -614 bázisai közti területén (bekeretezett, vastag kisbetu). AP-2 transzkripciós faktor kötohelyek vannak a gén és -1868, valamint -135 és -128 bázisai között (bekeretezett aláhúzott, vastag betu). A VEGF 5 UTR-jén található IRES A 293 és a 1, az IRES B pedig a 947 és 555 bázisai között helyezkednek el (csíkos vonal). Ösztrogén receptor kötohely van a gén -637 és -625 bázisai között (aláhúzott, vastag betu). A VEGF start kodonja elott egy extra start kodon található a -185 és -187 bázisok közti területen. (vastag dolt nagybetu). A hármas és négyes exonok által kódolt aminosavak (vastag betu) felelosek a VEGF receptoraihoz való kötodésért. A stop kodon a 8-as exon 3 végén található (csillagok). A 3 UTR, illetve a 3 FR génszakaszon számos AU gazdag terület helyezkedik el (bekeretezett dolt betu). Ezek közül egy 13 bázisnyi szakaszról (duplán aláhúzott) mutattak ki HuR köto képességet. 18

19 4.2. A VEGF szintézisének szabályozása A hipoxia hatása a VEGF szintézisére A VEGF szintézisének legfontosabb szabályzó faktora a hipoxia. Az oxigéntenzió csökkenése a VEGF szintézisének gyors, reverzibilis fokozódásához vezet mind in vitro mind in vivo [5, 21]. A hipoxia számos ponton befolyásolja a VEGF transzkripcióját, illetve transzlációját. A hipoxia hatására fokozódik a HIF-1 szintézise [22]. A HIF-1 heterodimer molekula, amely HIF1? és HIF1? alegységekbol épül fel [23]. Hipoxia hatására a HIF-1 a sejtmagba transzlokálódik, kötodik a VEGF gén promoterén elhelyezkedo HRE-hez [24], ez a VEGF génjének fokozott transzkripciójához vezet [25]. A hipoxia számos kevésbé tisztázott mechanizmuson keresztül is képes fokozni a VEGF szintézisét. A hipoxia hatására aktiválódó transzkripciós faktorok, mint a nukleáris faktor-??? (NF?? ) [26], SP1 [27], AP1 [28], AP2 [29], valamint a felhalmozódó adenozin [30] is képes a VEGF szintézisét fokozni. Más vizsgálatok szerint a hipoxia során foszforilálódó avian szarkóma vírus onkogén (Src) szintén fokozza a VEGF expresszióját [31]. A transzkripció fokozásán túl, a hipoxia hatással van a VEGF mrns-ének stabilitására is [32]. A hipoxia a 3 UTR régió adenozin-uracil gazdag régióihoz kötodo fehérjéken (HuR) keresztül stabilizálja a VEGF mrns-ét [33]. Így a VEGF mrnsének a normoxiás körülmények közötti, 40 perces féléletideje akár 180 percre is megnohet [34]. A VEGF 5 UTR-jén található két IRES szekvencia is, amely elosegíti a VEGF mrns-ének riboszómához való kötodését és transzlációját [17]. A VEGF mrns-ének IRES dependens transzlációs mechanizmusa lehetové teszi a transzlációt még fokozottan hipoxiás körülmények között is, amikor más transzlációs mechanizmusok már gátoltak [14, 35]. 19

20 A VEGF bioszintézise és a citokinek kapcsolata Számos pro- és anti-inflammatorikus citokinrol, valamint növekedési faktorról bizonyították be, hogy fokozza a VEGF szintézisét. In vitro az interleukin-1? (IL-1???[36], az interleukin-6 (IL-6) [37, 38], az epidermális növekedési faktor (EGF) [39], bázikus fibroblaszt növekedési faktor (bfgf) [40], a transzformáló növekedési faktor? és? (TGF?, TGF???[41, 42]??az inzulinszeru növekedési faktor I (IGF-I) [43], valamint a trombocita növekedési faktor (PDGF) [44] fokozza a VEGF mrns expresszióját, illetve fehérje szintjét A VEGF izoformái A VEGF szoros rokonságot mutató növekedési faktorokat (VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D és placenta növekedési faktor (PIGF)) magába foglaló fehérjecsalád tagja. A VEGF génje 8 exont tartalmaz. A VEGF mrns-ének alternatív splicingja során 5 különbözo izoforma (VEGF 121, VEGF 145, VEGF 165, VEGF 189, VEGF 206 ) keletkezik. Az különbözo izoformák a 6a a 6b, illetve a 7-es exon meglétében, illetve hiányában különböznek egymástól (2. ábra) [12]. A különféle sejtek, illetve szövetek eltéro mértékben expresszálják a különbözo VEGF izoformákat. A VEGF 121-es izoformája a lépben, a vesében és a tüdoben, a 145-ös izoformája a méhlepényben, a 165-ös az agyban és a vesében, a 189-as a szívben és a tüdoben, míg a 206-os izoforma elsosorban a méhlepényben fordul elo [45, 46, 47]. A VEGF 121-es izoformája enyhén savas karakteru, a sejtekbol szabadon szecernálódik [48]. A VEGF 145-ös izoformája 6-os exon által kódolt 24 aminosav jelenléte miatt enyhén bázikus karakteru [18]. VEGF 165-ös izoforma a VEGF145-höz hasonlóan enyhén bázikus karakteru a 7-es exon által kódolt bázikus aminosavak jelenléte miatt [49]. Szekrécióját követoen 30-40%-ban sejt, illetve extracelluláris mátrix (ECM) kötött marad. Ezért a VEGF 165-ös izoforma heparin szulfát proteoglikánokkal (HSPG) való interakciója teheto felelossé [48]. A VEGF 189-es, illetve a 206-os izoformái mind a 6-os mind a 7-es exon által kódolt bázikus aminosavakat tartalmazzák, ezek a legbázikusabb karakteruek. Ezek az izoformák szinte 20

21 teljes mértékben ECM asszociáltan fordulnak elo [48, 50]. Az ECM-hez kötött VEGF izoformák raktárt képeznek, melybol heparin, heparán szulfát, heparináz, plazmin vagy plazminogén aktivátor hatására felszabadulhatnak [48]. A különbözo VEGF izoformák diszulfidhidakkal stabilizált homodimerek formájában aktívak. A VEGF heterodimerek biológiailag inaktívak [51]. 2. ábra: A humán VEGF izoformáinak szerkezete. E1-E5 E8 VEGF 121 E1-E5 E6a E8 VEGF 145 E1-E5 E7 E8 VEGF 165 E1-E5 E6a E7 E8 VEGF 189 E1-E5 E6a E6b E7 E8 VEGF Aminosav (db) A humán VEGF különbözo izoformái a VEGF gén nyolc különbözo exonjának (E1-8) alternatív splicingja során jönnek létre A VEGF receptorai A VEGF-nek két tirozinkináz receptora, a VEGF receptor 1 (VEGFR1, Flt-1) [52] és a VEGF receptor 2 (VEGFR2, KDR/Flk-1) ismert (3. ábra) [53]. Mindkét tirozinkináz receptor elsosorban az endotélsejtek felszínén expresszálódik, de számos más sejten (VEGFR1: trofoblaszt [54], mezangiális sejtek [55], monociták [56]; VEGFR2: hematopoetikus [57] és a retina progenitor sejtek [58] is kimutattak már muködo VEGF receptorokat. A VEGFR1 (180 kd) és a VEGFR2 (230 kd) tirozinkináz receptorok aminosav homológiája eléri a 44%-ot [59]. 21

22 3. ábra: A VEGF receptorainak sematikus ábrája. Hét extracelluláris immunglobulinszeru domén (1-7) felelos a VEGF megkötéséért és a receptorok dimeralizációjáért. Mindkét receptor rendelkezik egy transzmembrán (TM) és két intracelluláris tirozinkináz (TK) doménnel. Ortega N. és mtsai.: Front Biosci. 4:D141-D520, A VEGF tirozinkináz receptorai 7 extracelluláris immunglobulinszeru doménbol, egy transzmembrán régióból és egy intracelluláris a katalitikus egységet tartalmazó tirozinkináz doménbol állnak [60]. A VEGFR1 VEGF iránti affinitása pm, míg a VEGFR2-jé pm [60]. A VEGFR1, illetve a VEGFR2 elso három extracelluláris, immunglobulinszeru doménje felelos a VEGF megkötéséért [61, 62]. A VEGF molekulák biológiai hatásukat homodimerek formájában fejtik ki. A dimeralizáció során a VEGF monomerek egymással ellentétes orientációjú egységeit diszulfidhidak kötik össze. A VEGF VEGF 1-es receptorához való kötodéséhez a 63. aszparaginsav, a 64. és a 67. glutaminsav, míg a VEGFR 2-es receprothoz való kötodéséhez a 82. arginin a 84. lizin és a 86. hisztidin jelenléte nélkülözhetetlen [63]. A receptorokhoz való kötodéséhez elengedhetetlen aminosavak, a VEGF monomerek ellentétes oldalán helyezkednek el [63] (4. ábra). 22

23 4. ábra: A VEGF homodimerek háromdimenziós modellje. A VEGF monomerek (zöld) egymással ellentétes orientációjú egységeit diszulfidhidak (sárga) kötik össze egymással. A VEGF VEGFR1-hez (piros), illetve VEGFR2 -höz (kék) való kötodésért felelos aminósavak a monomerek ellentétes végén helyezkednek el. Keyt BA. és mtsai.: J Biol Chem. 271: , Így a VEGF monomerek dimeralizációja lehetové teszi, hogy egyszerre két receptorhoz is kötodve receptor homo [61], illetve heterodimerek [62] jöjjenek létre. A VEGF receptorok dimeralizációját segítik elo a negyedik, az ötödik, a hatodik és a hetedik extracelluláris, immunglobulinszeru domének is [64, 65]. A receptor dimerek 100-szor nagyobb affinitással kötik meg a VEGF-et, mint a monomerek [66]. A VEGFR1 génjérol a teljes receptor mrns-énél rövidebb mrns is expresszálódhat [67]. Ez az mrns egy, a komplett VEGFR1-nél rövidebb, szolubilis receptort (sflt-1) kódol. Az sflt-1 tartalmazza VEGFR1 elso hat immunglobulinszeru doménjét, hiányzik viszont a VEGFR1 hetedik immunglobulinszeru, a transzmembrán és az intracelluláris tirozinkináz doménje is. Az sflt-1 tartalmaz egy további 31 aminosav hosszú karboxi terminális véget, amit érdekes módon a VEGFR1 génjének egy intronikus szakasza kódol [67]. Az sflt-1 nagy affinintással (K d? pm) köti a VEGF-et, de a hiányzó tirozinkináz doménje miatt a VEGF biológiai hatásait nem közvetíti [68]. Emiatt ezt a receptorformát a VEGF természetes antagonistájának tartják [67]. 23

24 A VEGF rendelkezik egy nem tirozinkináz transzmembrán receptorral, a neutropilin-1-el (NP-1) is (5. ábra). Az NP-1 egy 140 kd nagyságú rövid intracitoplazmatikus résszel rendelkezo receptor. Az endotélsejteken kívül számos egyéb sejten is kimutatták a jelenlétét [69]. Az NP-1 képes specifikusan megkötni a VEGF 165-ös izoformáját. Ezt a kötést VEGF génjének 7-es exonja által kódolt fehérjék teszik lehetové [70]. Jelenleg az NP-1-et a VEGFR2 ko-receptorának tartják. Az NP-1 a VEGFR2 VEGF iránti affinitását, mintegy négyszeresére növeli [71]. 5. ábra: A neutropilin-1 sematikus szerkezete. a1 a2 b1 b2 c A neutopilin 5 extacelluláris (komplement C1r homológ-a1; komplement C1s homológ-a2; VIII-as véralvadási faktor homológ-b1; V-ös véralvadási faktor homológ-b2; MAM (meprin-a5 antigen-proteintirozin foszfatáz?) homológ-c), egy transzmembrán és egy intracelluláris doménnel rendelkezik. Ortega N. és mtsai.: Front Biosci. 4: D141-D520, Az elozoekben felsorolt receptorokon kívül a HSPG-ok egy további kis affinitású kötohelyet jelentenek a VEGF számára. A VEGF extracelluláris mátrix-asszociált HSPG -okhoz való bekötodése más növekedési faktorok (bfgf) HSPG kötésboli felszabadulásához vezethet [72]. Feltételezik, hogy a HSPG-ok egyúttal a VEGF extracelluláris raktárai is [50]. A HSPG-ok további feltételezett szerepe a VEGF receptoraihoz való kötodésének modifikálása. Kis koncentrációban a heparin elosegíti a VEGF humán melanoma sejtekhez való kötodését, míg nagy koncentrációban gátolja azt [73]. A glipikán-1 - glikozil-foszfatidilinozitolhoz kötött HSPG - elosegíti a VEGF heparináz kezelt sejtekhez való kötodését [74]. 24

25 4.5. A VEGF receptorainak (VEGFR1, VEGFR2) szignalizációja A VEGF receptorait a VEGF különbözo izoformáin kívül számos, a VEGF családba tartozó faktor is (VEGFR1: placenta növekedési faktor 1 és 2 (PIGF-1 és 2), VEGF-B; VEGFR2: VEGF-C és D) aktiválja [60]. Ugyan a VEGFR1 VEGF iránti affinitása jóval nagyobb, mint a VEGFR2-jé [60], tirozinkináz aktivitása viszont csak a tizede a VEGFR2-jének [75]. A VEGFR1 intracelluláris tirozinkináz doménjén több autofoszforilációs helyet azonosítottak (Tyr 794, 1169, 1213, 1242, 1327, 1333) [76, 77]. Ennek ellenére azonban a receptor muködéséhez nincs feltétlen szükség a receptor foszforilációjára. A VEGFR1 tirozinkináz doménjének deléciója ugyanis nem befolyásolja a VEGF angiogenezist serkento potenciálját [78]. A receptor 794-es és a 1169-os tirozin autofoszforilációja úgy tunik fontos szerepet tölt be a VEGFR1 foszfolipáz C??(PLC?????protein kináz C (PKC) szignáltranszdukciós kaszkád aktiválásában [76] (6. ábra). A VEGFR1 aktiválása számos, az avián szarkóma vírus onkogén (Src) családhoz tartozó molekula (Fyn tirozinkináz protoonkogén (Fyn), Yamaguchi szarkóma vírus onkogén homológ (Yes)) foszforilációjához vezet, ennek jelentosége azonban nem ismert [79] (6. ábra). A VEGFR2 intracelluláris tirozinkináz doménjén is több autofoszforilációs helyet azonosítottak (Tyr 801, 951, 996, 1054, 1059, 1175) [80, 81]. A foszforilált VEGFR2 aktiválja a PLC?? PKC rendszert. Ebben kiemelt jelentosége van a 801-es és a 1175-ös tirozin foszforilációjának. Az aktivált PLC??aktiválja a PKC -t (elsosorban a PKC??t). Ezt követoen azonban, más tirozinkináz receptoroktól szokatlan módon, a PKC?? közvetlenül aktiválja a Raf-1-et, majd az tovább aktiválja a mitogén-aktivált protein kináz kináz (MEK) aktiválásán keresztül a mitogen-aktivált protein kináz (MAPK) rendszert [82] (6. ábra). Más vizsgálatok szerint a VEGFR2 foszforilációjakor a MAPK az Sch növekedési faktor receptor köto fehérje 2 (Grb2) - guanin nukleotid kicserélo faktor (Sos) - Ras-GTP-áz aktivitású fehérje 1 ( Ras) - v-raf-1 rágcsáló leukémia vírus onkogén homológ (Raf) - MEK rendszeren keresztüli aktivációja is tetten érheto [83] (6. ábra). 25

26 A VEGFR2 foszforilációjakor beszámoltak még az Nck mediátor fehérje (Nck), a fehérje-tirozin foszfatáz 1 és 2 (SHP-1 és SHP-2) aktiválódásáról is, ezek jelentosége jelenleg kevéssé ismert [84]. A VEGFR2 foszforilációja aktiválja a foszfatidilinozitol 3 -kinase (PI3K) - antiapoptikus kinázt (Akt) rendszert is [85] (6. ábra). Mindkét receptor foszforilációja aktiválja a fokális adhéziós kinázt (FAK) [86]. A VEGFR2 esetén a FAK foszforilációja a Grb2 és az Shc fehérjéken keresztül valósul meg [80] (6. ábra). 6. ábra: A VEGFR1 és a VEGFR2 fobb szignáltranszdukciós útvonalai. VEGFR1 VEGF köto hely VEGFR2 Adhézió A VEGFR1, illetve VEGFR2 szignáltranszdukciós útvonalai. Rövidítések: fokális adhéziós kinázt (FAK), Nck mediátor fehérje (Nck), diacilglicerol (DAG), Fyn tirozinkináz protoonkogén (Fyn), GTPáz aktíváló fehérje (GAP), növekedési faktor receptor köto fehérje 2 (Grb2), inozitol 1,4,5,-trifoszfát (IP3), mitogénaktivált protein kináz (MAPK), mitogén-aktivált protein kináz kináz (MEK), foszfatidilinozitolbiszfoszfát (PIP2), fehérje kináz C (PKC), foszfolipáz C (PLC), v-raf-1 rágcsáló leukémia vírus onkogén homológ (Raf-1), Ras-GTP-áz aktivitásúfehérje 1 (Ras), schwannomin (Sch), fehérje-tirozin foszfatáz (SHP), guanin nukleotid kicserélo faktor (Sos), Yamaguchi sarcoma vírus onkogén homológ (Yes). Ortega N. és mtsai.: Front Biosci. 4: D141-D520,

27 4.6. A VEGF biológiai hatásai VEGF, VEGFR1 és VEGFR2 knock-out egerek Egerekben a VEGF gén inaktiválása, még a heterozigótákban (VEGF +/-) is korai, a embrionális napon bekövetkezo elhulláshoz vezet [87]. A VEGF heterozigóta knock-out embriók fejlodése retardált, számos fejlodési rendellenességet mutatnak. Jelentos a szív, a nagy erek fejletlensége és a különbözo szervek érellátásának hiánya. A erek és az érrendszer fejletlensége mellett szembetuno az egerek idegrendszeri fejletlensége. Homozigóta VEGFR1 knock-out egerek már az embrionális fejlodés 8-9. napján elpusztulnak. Ezekben az állatokban az endotélsejtek kialakulása ugyan zavartalan, de a sejtek nem formálnak er eket [88]. A VEGFR2 knock-out egerek szintén korán, a 8-9. embrionális napon elpusztulnak. Ezekben az állatokban az érképzési zavar mellett a hematopoetikus ossejtek zavart fejodése is kimutatható [89] A VEGF hatása az erek permeabilitására A VEGF-et eloször, mint az erek permeabilitást fokozó faktort írták le [90]. Ezt a hatását különbözo mechanizmus ok révén fejti ki. A fokozott érpermeabilitás közvetítésében jelentos a VEGFR2 szerepe. A VEGFR2-höz kötodni nem képes VEGF mutáns hatására ugyanis nem fokozódik az erek permeabilitása [91]. A NO, illetve a PGI 2 szerepét a VEGF érpermeabilitást fokozó hatásának közvetítésében számos in vivo kísérlet igazolja. A ciklooxigenáz gátló indometacin, illetve az endoteliális nitrogén-monoxid szintáz (enos) gátló N(G)-nitro-l-arginin metil észter (L-NAME) hatására jelentosen csökken a VEGF indukálta érpermeabilitás [6]. A PLC? és a PKC foszforilációját, illetve az intracelluláris Ca 2+ mobilizációját a vénák VEGF indukálta permeabilitás fokozódásban tartják fontosnak [92]. A fenesztrált endotélsejtek elofordulása az élo szervezetben bizonyos szövetekre korlátozott (vese glomerulus, gyomor-bélrendszer, endokrin szer vek, az agy bizonyos 27

28 területei). In vitro a VEGF hatására az erek endotéljének fenesztrációját figyelték meg a mellékvesekéreg [93] és az agyi hajszálerek endotélsejtein [94] is. A VEGF fokozza a nemrégiben felfedezett veziko-vakuoláris sejtorganellumok (VVO) jelenlétét is. A VVO több, mint 100 szolofürtszeruen összekapcsolódó vezikula által alkotott sejtorganellum (7. ábra), amely kapcsolatot létesít az endotélsejtek érlumen felöli és az azzal ellentétes, abluminális oldala között, biztosítva ezzel a plazmafehérjék transzportját [95]. 7. ábra: Az endotélsejteket áthidaló VVO-k elektromikroszkópos képének háromdimenziós rekonstrukciója. Az endotélsejtek nm-es metszeteinek elektronmikroszkópos képének háromdimenziós rekonstrukcióján jól látszik a VVO-k (zöld) az egész sejtet áthidaló szerkezete. Lefelé az érlumen feloli sejtfelszín, felfelé pedig az abluminális sejtfelszín (piros) látható. Dvorak AM. és mtsai.: J Histochem Cytochem. 49: , A VEGF sejtproliferációs hatásai A VEGF sejtproliferációs hatását számos, mindkét VEGF receptoron keresztül mediált szignáltranszdukciós út biztosítja. A VEGF hatására aktiválódó mitogenaktivált protein kinázok (MAPK1 és MAPK2) a c-jun N-terminális protein kináz (JNK) 28

29 aktiválásán keresztül fokozzák az endotélsejtek mitózisát. A VEGF hatást az MAPK gátló PD98059, illetve a JNK egy funkció nélküli negatív mutánssal való helyettesítése teljesen felfüggeszti [96]. A VEGF a PLC? - PKC szignáltranszdukciós útvonalon keresztül is befolyásolja a sejtek osztódását. A PLC??aktiválódása a diacilglicerol (DAG), illetve az inozitol 1,4,5,-trifoszfát (IP3) képzodésén keresztül vezet a PKC? és a PKC? aktiválódásához, valamint az intracelluláris Ca 2+ mobilizációjához. A PKC inhibitort felhasználó, valamint az izoformaspecifikus antiszensz kísérletek igazolják a PKC? és a PKC? központi szerepét a VEGF mitogén hatásának közvetítésében [97]. A VEGF mitogén hatásának közvetítésében fontos szer epe van a NO által közvetített PKC? gátlásnak is [98]. A PKC? fokozott aktivitása gátolja az endotélsejtek proliferációját [99] VEGF hatása a sejtmigrációra A bazálmembrán degradációja fontos, eleme az endotélsejtek migrációjának és egyúttal az angiogenezisnek is [100]. A VEGF számos ponton befolyásolja az endotélsejtek migrációját. Kimutatták, hogy a VEGF fokozza a kötoszöveti elemek lebontásáért felelos metalloproteáz (MMP), a gelatináz A szintézisét [101]. A VEGF fokozza a FAK tirozin foszforilációját [85, 86]. Az aktív FAK központi szerepet játszik a sejtek adhéziójában, az aktin filamantek szervezodésében és ezen keresztül a sejtmigráció folyamatában [102]. A FAK aktiválását jelentosen befolyásolja a Hsp90 jelenléte is. Hsp90 geldanamicinnel történo gátlása meggátolja a sejtek VEGF indukálta migrációját is [103]. Egyre több az adat, melyek szerint a NO fontos szerepet játszik az endotélsejtek VEGF indukálta migrációjában [104, 105]. Az enos 1177-es szerinjének Akt dependens foszforilációja elengedhetetlen a VEGF indukálta sejtmigráció folyamatában [106]. Másrészt a NO elosegíti a FAK foszforilációját [105]. 29

30 VEGF angiogenezist befolyásoló hatásai Az angiogenezis során a már meglévo erekbol képzodnek újabbak. A különbözo hatásokra (hipoxia, citokinek, mechanikai stressz, stb.) aktiválódó endotélsejtek MMP-okat termelnek. A MMP-k feloldják az erek körüli extracelluláris mátrixot, teret engedve az endotélsejtek osztódására, vándorlására. Az angiogenezisben számos VEGF által szabályozott folyamat (érpermeabilitás fokozódása, endotélsejt proliferáció és migráció) vesz részt. A VEGF angiogenezist szabályozó hatásainak fontos szerepet tulajdonítanak mind, az embrionális fejlodésben mind, pedig a posztnatális életben (sebgyógyulás, menstruációs ciklus, iszkémiás betegségek, tumorok) [107]. Egerekben a VEGF gén egyetlen alléljának inaktiválása is kóros érfejlodéshez és az embrionális élet napján halálhoz vezet [87]. A VEGF 165-ös és 189-es izoformájának hiánya szintén az egerek korai elhullásához vezet [108]. Az egerekben kóros érfejlodés, szívmegnagyobbodás és csökkent szívizomkontraktilitás alakul ki. Régóta ismert, hogy a tumorok méretének növekedésével párhuzamosan no a tumorok érdenzitása is [109]. Ezzel összhangban fokozott VEGF szintézist mutattak ki számos humán tumorban. A VEGF hatásainak gátlása számos tumor növekedését csökkenti. Klinikai vizsgálatok tanúsítják, hogy konzervatív antitumor terápiát humán rekombináns anti-vegf neutralizáló antitesttel kiegészítve mind a nem kissejtes tüdodaganatos [110] mind, pedig a kolorektális daganatos betegek túlélése javul [111] A VEGF antiapoptotikus hatása A VEGF-nek a sejtek túlélését elosegíto hatását elsoként a retina endotélsejtjein igazolták [10]. Ezt követoen a VEGF hasonló, a sejtek túlélését elosegíto hatását más sejteken, így a humán vénás köldökzsinór endotélsejteken (HUVECs) [112] és vese tubuláris epitélsejtjein is igazolták [11]. 30

31 A VEGF a VEGFR2 foszforilációján és az azt követo PI3K aktiváción keresztül aktiválja az Akt-ot, amely a Bcl-2 antagonista (BAD), illetve a kaszpáz-9 gátlásán keresztül fejti ki az antiapoptotikus hatását [84, 113]. A VEGF hosszú távú antiapoptotikus hatását a Bcl-2, illetve a Bcl-2 kapcsolt fehérje A1 szintézisének fokozásán keresztül fejti ki [10]. Ezek az antiapoptotikus fehérjék gátolják a kaszpázok aktivációját és fokozzák az apoptózis inhibitorok (IAP) szintézisét. A VEGF fokozza a survivin és az X-kromoszómához kötött IAP szintézisét, amelyek gátolják a kaszpáz 3, illetve 7 muködését [114]. A VEGF fokozza a FAK és a FAK tirozinkináz 2 (Pyk2) aktivitását és a FAK FAK asszociált fehérje, a paxillin kapcsolódását, elosegítve ezzel az endotélsejtek túlélését [115, 116]. Mindezeken túl más szignáltranszdukciós utak is szerepet játszhatnak a VEGF mediálta antiapoptotikus folyamatokban, így a PLC? - PKC is. Nemrégiben egy PKC aktivátorról, a forbol misztrát acetátról mutatták ki, hogy elosegíti a HUVEC-ek túlélését [117] A VEGF hatása a nitrogén-monoxid és a prosztac iklin szintézisre A VEGF hatására fokozódik a NO és a PGI 2 szintézise, valamint sejtekbol való felszabadulása [6, 117]. Egyúttal a NO és a PGI 2 a VEGF számos biológiai hatását is közvetíti. A NO és a PGI 2 jól ismert vazodilatatív és angiogenezist fokozó hatásaik mellett számos más protektív érhatással is rendelkeznek. Gátolják a simaizomsejtek proliferációját [118, 119] és a trombociták aggregációját [120, 121]. Minden bizonnyal a VEGF is rendelkezik hasonló ér -protektív hatásokkal [122]. A VEGF számos mechanizmuson keresztül befolyásolja a NO, illetve a PGI 2 szintézisét, illetve azok endotélsejtekbol való felszabadulását. Rövidtávú hatásként a VEGF fokozza az enos konstitutív formájának aktivitását a PLC??- IP3 szignáltranszdukciós útvonalon az intracelluláris Ca 2+ szint megemelésén keresztül [8]. A VEGF a Hsp90 aktiválásán keresztül az eno S aktivitás gyors fokozódásához vezet [123]. 31

32 Hosszú távú hatásként a VEGF a PI3K AKT szignáltranszdukciós útvonalon az enos 1177-es szerinjének foszforilálásán keresztül fokozza az enos mrns és fehérje expresszióját [106]. A VEGF fokozza a PGI2 szintézisét a PLC? PKC Raf MEK MAPK PLA2 szignáltranszdukciós útvonalon [124] keresztül. A VEGF egyúttal fokozza a PGI2 endotélsejtekbol való felszabadulását is a PLC??- IP3 szignáltranszdukciós útvonalon az intracelluláris Ca 2+ szint megemelésén át [6] A VEGF szintézisének és a vese iszkémia/reperfúziós károsodásának kapcsolata A vese iszkémia/reperfúziós (I/R) károsodása és az annak következtében kialakuló akut veseelégtelenség számos gyakori kórkép (trauma, égési sérülés, szívsebészeti beavatkozások, vesetranszplantáció) szövodményeként jelentkezhet. A vese I/R károsodásának patomechanizmusa komplex folyamat, amelyben központi szerepet játszanak az erek hemodinamikai változásai. A vese I/R károsodása során az endotél sejtek megduzzadnak [125], beszukül az érlumen, és végül kialakul az úgynevezett no-reflow jelenség [126]. A csökkent vesekeringés elosegíti, illetve fenntartja a vesetubulus sejtjeinek károsodását [127, 128] is. Bár a VEGF-et elsosorban, mint egy potens, a hipoxia által indukált angiogenezist serkento növekedési faktort tartják számon [5], legalább ilyen fontosak az endotélsejtek funkcióit befolyásoló hatásai is. A VEGF ismerten fokozza az endotélsejtek NO és PGI 2 szintézisét [6] ugyanakkor gátolja az endotélsejtek apoptozisát [10] a trombusképzodést [7] a gyulladást [9] és az erek simaizom sejtjeinek proliferációját is [8]. Korábbi in vitro vizsgálatok a hipoxia hatására fokozott VEGF mrns, illetve fehérje szintézist igazoltak a legkülönbözobb sejtes rendszerekben [5, 21]. Hasonlóan az in vitro eredményekhez fokozott VEGF szintézist igazoltak a különbözo szervek I/R károsodása kapcsán is [129, 130, 131, 132]. Meglepo módon azonban a vese akut I/R [133, 134], illetve krónikus hipoxiás [135] károsodása kapcsán a VEGF szintézisének a korábbiaktól meroben eltéro 32

33 jellegérol számoltak be. Ellentétben a más szerveken tapasztaltakkal a vese I/R károsodása kapcsán mind mrns mind, pedig fehérje szinten a VEGF szintézis fokozódásának teljes hiányáról számolnak be [133, 134]. Ugyanakkor az immunhisztológiai vizsgálatok a VEGF bazolaterális elmozdulását írták le a vese tubuláris epitélsejtjeiben [133]. A vese I/R károsodása gyakori kórkép és kezelése csak részben tekintheto megoldottnak. Az irodalmi adatok alapján feltételezheto a VEGF jótékony szerepe az erek és a vese tubulus sejtek integritásának megorzésében, illetve regenerálódásukban a vese I/R károsodását követoen A hisztamin és a VEGF szintézis kapcsolata a vese iszkémia/reperfúziós károsodása során A veseszövetek már az iszkémia idotartalma alatt is károsodnak. Az ezt követo reperfúzió során a szöveteket oxigéndús vér árasztja el, szabadgyökök szabadulnak fel, melyek tovább fokozzák a szövetek károsodását. A vese károsodott sejtjeibol számos mediátor, például hisztamin szabadul fel [136]. Korábban fokozott plazma hisztamin szintet mutattak ki a vese I/R károsodása során is [136]. Az intravénásan beadott diamin oxidáz a hisztamin lebontásáért felelos enzim jelentosen csökkentette az I/R károsodás kiváltotta érpermeabilitást, csökkentette a vese szöveti károsodását és normalizálta a vesefunkciót [136]. A hisztamin számos folyamat szabályozásában játszik szerepet. Befolyásolja a gyulladásos folyamatokat [137], a sejtosztódást [138], és az erek permeabilitását [139]. A vesében korábban már igazolták hisztamin kettes receptorának (HR2) jelenlétét [140]. A hisztamin HR2-án keresztül csökkenti az érellenállást és fokozza a vese vérátáramlását [140]. A hisztamin által szabályzott biológiai folyamatok számos átfedést mutatnak a VEGF hatás aival. A VEGF egy potens érpermeabilitást fokozó növekedési faktor, amely egyúttal az endotélsejtek számos funkcióját is befolyásolja [6, 7, 8, 9, 10]. Ismert, hogy in vitro a hisztamin HR2-án keresztül is fokozza a VEGF 33

34 szintézisét [141]. Ugyanakkor a hisztamin in vivo a VEGF szintézisére gyakorolt hatásáról nincs adat A dehidro-epiandrosztendion és a VEGF szintézis kapcsolata a vese iszkém ia/reperfúziós károsodása során A dehidro-epiandrosztendiont (DHEA) a mellékvesekéreg termeli. Annak ellenére, hogy a DHEA a legnagyobb mennyiségben termelodo szteroid hormon [142] keveset tudunk a pontos biológiai funkcióiról. Számos adat szól a DHEA-nak az erek állapotára kifejtett jótékony hatásáról [143]. Epidemiológiai adatok számolnak be a plazma DHEA szint, az ateroszklerózis és a kardiovaszkuláris megbetegedések közötti kapcsolatról [144]. DHEA gátolja a trombociták aggregációját [145] és az erek simaizomsejtjeinek proliferációját [146]. Ugyanakkor a DHEA fokozza a vazodilatátor NO szintézisét [147, 148] és befolyásolja az erek mikrocirkulációját [149, 150]. A DHEA által szabályzott biológiai folyamatok számos átfedést mutatnak a VEGF erek állapotát befolyásoló hatásaival hatásaival. A vese I/R károsodása során az erek hemodinamikájának változása szorosan összefügg a vese tubuláris sejtek károsodásával [125, 126]. A csökkent vérátáramlás kiválthatja, illetve súlyosbíthatja a vesetubulusok károsodásait [127, 128]. Kimutatták a DHEA jótékony hatását az iszkémiás szív [151] és agyi [152] károsodás kapcsán. Kevés adat van azonban a DHEA kezelésnek a vese I/R károsodására kifejtett hatásairól [153] A patkány VEGF izoformáinak mrns szintu kimutatása A VEGF az angiogenezis [60] mellett, számos biológiai folyamat szabályozásában vesz részt. A VEGF fokozza a NO [6] és a PGI 2 [6] szintézisét, valamint gátolja a sejtek apoptózisát [10, 11] a trombusképzodést [60] és a simaizomsejtek proliferációját [60]. Ezeken a folyamatokon keresztül a VEGF-nek 34

35 számos betegség, így a tumorképzodés, az iszkémiás és a gyulladásos folyamatok patomechanizmusában is fontos szabályzó szerepe van. A patkány VEGF génjének alternatív mrns splicingja során (a humán VEGF génhez hasonlóan) számos izoforma keletkezhet (VEGF 120, VEGF 144, VEGF 164, VEGF 188, VEGF 205 ) [12]. Ezek az izoformák biológiai hozzáférhetoségükben jelentosen a különböznek egymástól. Míg a VEGF 120-as izoformája szabadon szec ernálódik a sejtekbol [48], a VEGF 144-es, 164-es, 188-as és 205-ös izoformája elsosorban a sejtekhez, illetve extracelluláris mátrixhoz (ECM) kötve fordul elo [18, 48, 49, 50]. Ugyanakkor nem ismert a különbözo izoformák szöveti eloszlása, és biológiai funkciója közötti különbség. Az elmúlt években számos stratégiát dolgoztak ki a VEGF és az által szabályozott folyamatok, így a tumorképzodés, tumoráttétképzodés gátlására. Mindazonáltal a különbözo VEGF izoformák specifikus gátlása a mai napig sem megoldott. A VEGF biológiájának jobb megértését, illetve az egyes izoformák specifikus gátlásának kifejlesztését, nagyban elosegítené egy olyan módszer, amely alkalmas a VEGF izoformák egymástól elkülönült detektálása A VEGF génpolimorfizmusok és a kis születési súlyú koraszülöttek retinopátiájának kapcsolata Az elmúlt évtizedekben jelentosen javultak a koraszülöttek túlélési esélyei, ezzel együtt azonban a szövodmények száma is megnott. A fejlett országokban a koraszülöttek retinopátiája (ROP) ma is a gyermekkorban kialakuló vakság leggyakoribb oka. A retina ereinek fejlodése a negyedik gesztációs hónapban indul meg [154]. A ROP incidenciája és súlyossága fordítottan arányos a születési korral. Jelentosen ritkábban alakul ki ROP a 32 hét után született újszülöttekben [155]. A retinális erek fejlodésében több más citokin mellett központi szerepe van a VEGF-nek, amely egy hipoxia indukálta növekedési faktor [156]. A retina erei növekedésük során mindig a fokozott oxigénigényu, relatív hipoxiás területek felé haladnak. A születést követoen a relatív hipoxiás intrauterin környezet a hirtelen 35

36 megváltozik. Ilyenkor a szükségesnél több oxigén jut a retina ereibe. Ennek hatására csökken a VEGF lokális szintje, a retina erei összehúzódnak, sot akár el is záródhatnak. Az ekkor kialakuló érkárosodást tovább fokozzák a hirtelen kialakult hiperoxia miatt képzodött reaktív oxigéngyökök. Az erek fejlodése megáll. Az így kialakult érkárosodás következtében az ismét hipoxiássá váló retinában fokozódik a VEGF szintézise, az ekkor beinduló érképzodés azonban már rendellenes erek kialakulásához és hegképzodéshez vezet. Ez a késobbiekben a retina leválását és vakságot okozhat [156]. Mindezen folyamatokat és így a ROP kialakulását genetikai faktorok is befolyásolják. Ezt bizonyítja az a tény is, miszerint az afro-amerikaiak között jelentosen ritkábban alakul ki ROP [157]. Vizsgálatok igazolják, hogy a VEGF gén egy-egy nukleotidját érinto polimorfizmusai (SNP) befolyásolják a VEGF szintézisét [158, 159]. A VEGF funkcionális, a VEGF szintézisét befolyásoló SNP-inek vizsgálata hasznos lehet a koraszülött ek ROP kockázatának becslésében. 36

37 5. CÉLKITUZÉSEK Kísérleteink során vizsgálatuk a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) szintézisét a vese iszkémia/reperfúziós (I/R) károsodása során, felállítottunk egy a patkány VEGF izoformáinak detektálására alkalmas real time RT -PCR rendszert, illetve vizsgáltuk a VEGF gén promoter genetikai polimorfizmusainak, a kis születési súlyú koraszülöttek retinopátiájának kockázatával való kapcsolatát A VEGF szintézisének vizsgálata vese iszkém ia/reperfúziós patkánymodellben 1. Kimutatható-e VEGF szintézisének mrns, illetve fehérje szintu változása a vese I/R károsodás során? 2. Változik-e a VEGF immunhisztológiai lokalizációja a I/R károsodás során? 3. Hogyan változik az interleukin 1? (IL-1??, illetve az interleukin 6 (IL-6) szintézise a vese I/R károsodás során? 5.2. A hisztamin és a hisztamin kettes receptor antagonista ranitidin kezelés hatásának vizsgálata a VEGF szintézisére vese iszkémia/reperfúziós patkánymodellben 4. Befolyásolja-e a hisztamin, illetve a ranitidin kezelés a patkányok vese I/R károsodását, követo túlélését? 5. Befolyásolja-e a hisztamin, illetve a ranitidin kezelés a patkányok vese I/R károsodása során a VEGF, illetve az IL-6 mrns szintézisét? 6. Befolyásolja-e a hisztamin, illetve a ranitidin kezelés a patkányok vese I/R károsodása során a VEGF fehérje szintézisét? 37

38 5.3. A dehidro-epiandrosztendion kezelés hatásának vizsgálata a VEGF szintézisére vese iszkémia/reperfúziós patkánymodellben 7. Befolyásolja-e a dehidro-epiandrosztendion (DHEA) kezelés a patkányok vese I/R károsodását, követo túlélését? 8. Befolyásolja-e a DHEA kezelés a patkányok vese I/R károsodása során a VEGF, az IL-1? és az IL-6 mrns szintézisét? 9. Befolyásolja-e a DHEA kezelés a patkányok vese I/R károsodása során a VEGF fehérje szintézisét? 5.4. A patkány VEGF izoformáinak mrns szintu kimutatása 10. Kialakítható-e olyan real time RT-PCR rendszer, amely alkalmas a különbözo VEGF izoformák detektálására? 11. Kimutatható-e a patkány szövetekben, a humán mintákban leírt 205-ös VEGF izoforma? 5.5. A VEGF génpolimorfizmusok és a kis születési súlyú koraszülöttek retinopátiája közti kapcsolat vizsgálata 12. Van-e kapcsolat a kis születési súlyú koraszülöttek retinopátia kockázata és a VEGF gén T -460 C, illetve G +405 C genetikai polimorfizmusai között? 38

39 6. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 6.1. In vivo patkány vese iszkémia/reperfúziós kísérletek A kísérletek során felhasznált állatok Kísérleteink során ivarérett, hím Wistar patkányokat használtunk. A patkányokat állandó 21 C homérsékleten, 75%-os páratartalom és 12 óránként váltakozó (világossötét) megvilágítás mellett tartottuk. Az állatok szabadon fogyaszthattak rágcsáló tápot (Ssniff, ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Németország), illetve vizet Mutéti beavatkozás A mutéti beavatkozást intraperitoneális pentobarbitál (50 mg/ttkg, Nembutal, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA) anesztéziában végeztük. A mutét, illetve az azt követo ébredés alatt az állatok rektális homérsékletét 37? 0,5 C-on tartottuk. A mutét során median laparotomiát követoen kipreparáltuk a bal veseereket (a. és v. renalis), majd a vesét egy atraumatikus mikrovaszkuláris ércsipesszel (Rudolf GmbH Medizintechnik, Fridingen, Németország) 50 (hisztamin és ranitidin kezelt hím Wistar patkányok és a hozzájuk tartozó kezeletlen kontroll patkányok), illetve 55 (kezeletlen hím Wistar, valamint dehidro-epiandrosztendion (DHEA) és propilén-glikol (PG) kezelt patkányok) percre kirekesztettük a keringésbol. Az iszkémiás periódus alatt az állatok hasfalát a túlzott folyadékveszteség elkerülése érdekében átmenetileg zártuk. Az iszkémiás periódus vége elott eltávolítottuk az állatok jobb veséjét. Ezután a bal veseerekrol eltávolítottuk az ércsipeszt és zártuk a hasfalat. Mutéti kontrollként altatott, jobboldali nefrektómizált, de intakt, nem iszkemizált bal oldali veséju (áloperált) állatok szolgáltak. Az állatokat a teljes ébredésig obszerváltuk, majd a ketreceikbe helyeztük oket vissza. Vizsgáltuk a megmutött állatok vese iszkémiát követo túlélését. Az állatok túlélését, a mutétet követo egy hétig követtük figyelemmel, mivel korábbi kísérletes 39

40 tapasztalataink szerint az elso hét után még élo állatok között további elhullás nem várható. A továbbiakban vizsgáltuk az iszkemiát követo reperfúzió 2., 16., illetve 24. órájában (T 2, T 16, illetve T 24 ), illetve az áloperált, nem iszkemizált (T 0 ) állatokból vett szérum, illetve a veseminták, molekulárbiológiai és hisztológiai elváltozásait Kezelési protokollok Kezeletlen állatokat használtunk a VEGF és a vese I/R károsodás alapveto kapcsolatainak vizsgálatához. Szintén kezeletlen állatokat használtunk a hisztamin, illetve ranitidin kezelt állatok kezelési kontrolljaként. Az állatok fennmaradó csoportjait hisztaminnal, ranitidinnel, dehidro-epiandrosztendionnal (DHEA), illetve propilén-glikollal (PG) kezeltük. Hisztamin kezelés: az állatokat a mutét elott egy héttel kezdtük el kezelni, napi 4 mg/ttkg hisztamin (ICN Pharmaceuticals Inc., CA, USA) szubkután adásával. A kezelést az egész kísérlet során fenntartottuk. Kontrollként kezeletlen állatok szolgáltak. Ranitidin kezelés: az állatokat a mutét elott egy héttel kezdtük kezelni, napi 4 mg/ttkg rantitidin (ICN Pharmaceuticals Inc., CA, USA) per os adásával (ivóvízben oldva). A kezelést az egész kísérlet során fenntartottuk. A kezelés kontrolljaként kezeletlen állatok szolgáltak. DHEA kezelés: az állatok kezelését Lohman és munkatársai által leírtak alapján végeztük [149]. Az állatok kezelését a mutéti beavatkozás elott egy nappal kezdtük meg és a kísérlet végéig fenntartottuk. Az állatok szubkután injekció formájában napi 4 mg/ttkg DHEA-t kaptak, 0,1 ml PG-ban feloldva (mindketto: Sigma Chemical Co., MO, USA). A kezelés kontrolljaként PG kezelt állatok szolgáltak Szérum kreatinin és karbamid meghatározás 40

41 A szérum kreatinin és karbamid koncentrációjának meghatározását Hitachi 717-es automata spektrofotométeren végeztük el (F. Hoffmann-la Roche Ltd, Basel, Svájc) A veseszövetek hisztológia vizsgálata A vesedarabokat formalinban fixáltuk (4%, ph=7.4). A mintákat paraffinba ágyazás és metszés után hematoxilin-eozinnal festettük meg. A metszetek fénymikroszkópos vizsgálata során a tubuláris, glomeruláris és interstitiális elváltozásokat 0-tól 3-ig pontoztuk (0 = nincs elváltozás, 1 = enyhe fokú elváltozás, 2 = közepes fokú elváltozás, 3 = súlyos fokú elváltozás). A többi kísérlettol eltéroen a hisztaminnal és ranitidinnel kezelt, illetve az azok kezelési kontrolljául szolgáló kezeletlen állatok veséinek tubuláris károsodását 0-4-ig terjedo skálán pontoztuk (0 = nincs tubuláris károdsodás, 1 = a tubulusok <25%-a károsodott, 2 = a tubulusok 26-50%-a károsodott, 3 = a tubulusok 51-75%-a károsodott, 4= a tubulusok >75%-a károsodott) Hisztamin ELISA A szérum hisztamin szintet ELISA teszttel, a gyártó protokollja szerint határoztuk meg (IBL, Hamburg, Németország). A méréseket duplikátumban végeztük. Az ELISA kit adatai: szenzitivitás: 0,25 ng/ml; intraassay variáció: 4,7-11%; interassay variáció: 11,1-12,2% DHEA és dehidro-epiandrosztendion-szulfát radioimmunoassay A patkányok szérum DHEA és dehidro-epiandrosztendion-szulfát (DHEA-S) szintjeit direkt radioimmunoassay (RIA) teszttel határoztuk meg. Az intra- és interassay 41

42 variációs koefficiens a DHEA meghatározásnál 7,2%, illetve 11,3% míg a DHEA-S esetében 7,8%, illetve 10,5% volt [160] Szemikvantitatív és kompetitív RT-PCR mérések RNS izolálás A veseszöveteket feldolgozásig -80 C-on, lízispufferben tároltuk. Az RNS-t a Qiagen protokollja alapján az RNeasy? Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Németország) segítségével izoláltuk. A kinyert RNS mennyiségét és minoségét fotometrálással határoztuk meg. Az RNS mintákat felhasználásig -80 C-on tároltuk Komplementer DNS szintézis A reverz transzkripció (RT) során 1? g RNS-t konvertáltunk komplementer DNS-sé (cdns) 20? l reakció végtérfogatban, 200 U SuperScript II? RNase H - reverz transzkriptáz, 40 U RNaseOUT? inhibitor és 0,5? g oligo dt primer jelenlétében (Gibco/BRL, Eggenstein, Németország). A reakcióelegyet 20 C-on 10 percig, majd 42 C-on 45 percig és végül 99 C-on 5 percig inkubáltuk, majd 4 C-ra lehutöttük és felhasználásig -20 C-on tároltuk Szemikvantitatív PCR (patkány GAPDH, IL-1???IL-6, VEGF) A szemikvantitatív PCR-eket 50? l végtérfogatú [10% 10x PCR puffer, 2 mm MgCl 2, 0,2 mm dezoxi nukleotid trifoszfát (dntp), 0,4-0,4? M primer (sense és antisense primerek), 1,5 U rekombináns Taq polimeráz (Gibco/BRL, Eggenstein, Németország)] reakcióelegyben végeztük 2?l cdns felhasználásával. A patkány specifikus IL-1?, illetve VEGF mrns szekvenciákat az NCBI ( nukleotid adatbázisa és Blast szolgáltatása segítségével választottuk ki (NCBI: 1IL-1??- E01884 és VEGF - AF215725). A primerek tervezéséhez a Primer3? ( primer3.cgi; 42

43 Steve Rozen, Helen J. Skaletsky (1998) Primer3, Whitehead Institute for Biomedical Research), illetve a DNAStar? (DNASTAR, Inc., Madison, USA) szoftvereket használtuk. A patkány specifikus VEGF primereket a különbözo izoformák közös szakaszára (1.-5. exon) illesztettük, ezért azok az össz VEGF mrns mennyiségének mérésére alkalmasak. A patkány glicerin-aldehid-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) és IL-6 specifikus primereket Strehlau J. és munkatársaitól [161], illetve Volk HD. és munkatársaitól [162] vettük át. A PCR-ek során alkalmazott primerek adatait táblázatban foglaltuk össze (1. táblázat). 1. táblázat: A szemikvantitatív PCR-ek során használt primerek adatai. Gén Primerek Annealing Termékhossz VEGF IL-6 IL-1? GAPDH Sense: 5 - gtg cac tgg acc ctg gct tta c -3 Antisense: 5 - ttt tct ggc ttt gtt cta tct ttc -3 Sense: 5 - ctt cca gcc agt tgc ctt ct -3 Antisense: 5 - tcc cga cca ttg ctg ttt cc -3 Sense: 5 - gca ctg cag gct tcg aga tga 3 Antisense: 5 - ggt ggg tgt gcc gtc ttt ca -3 Sense: 5 - ggt gaa ggt cgg agt caa cg -3 Antisense: 5 - caa agt tgt cat gga tga cc o C 398 bp 66 o C 496 bp 57 o C 220bp 55 o C 496 bp A táblázat a szemikvantitatív PCR-ek során használt primerek optimális annealing hojét és a PCR során keletkezo termékek hosszadatait mutatja be. A PCR-okat a primerekre jellemzo annealing homérséklet kivételével azonos körülmények között vitt ük véghez. A kezdeti 5 perces 94 C-on végzett denaturáció után a cdns templátokat 35 cikluson [94 C, 15 mp (denaturáció), 55 o C (GAPDH ) 56 C (VEGF), 57 C (IL-1????66 o C (IL-6) 30 mp (annealing), 72 C 30 mp (extenzió)] keresztül szaporítottuk fel, végül egy 7 percig tartó 72 C-on történo inkubáció során tettük teljessé az extenziót. 43

44 PCR vizsgálatainkat minden esetben duplikátumban, pozitív és negatív kontrollok felhasználásával végeztük. A termékek várt hosszait 100 bp DNS marker (Ready-Load?, Gibco/BRL, Eggenstein, Németország) felhasználásával kontrolláltuk. 44

45 Kompetitív patkány VEGF specifikus PCR tervezése A patkány specifikus kompetitív PCR rendszerünket az NCBI ( nukleotid adatbázisa és Blast szolgáltatása segítségével, a kódoló szekvenciák alapján terveztük meg. A kompetitív VEGF PCR rendszer tervezéséhez felhasznált forrás: Rattus Norvegicus VEGF188 mrns (NCBI AF215725). A primerek tervezéséhez a Primer3? ( primer3.cgi; Steve Rozen, Helen J. Skaletsky (1998) Primer3, Whitehead Institute for Biomedical Research) szoftvert használtuk. Kompetitív PCR rendszerünk tervezésénél a következo alapelveket követtük: 1) a primereket és a kompetitort az elso 5, minden VEGF izoformában közös szakaszra terveztük; 2) a kvantifikálásra kerülo PCR termék, és a kompetitor hossza közti különbség (két termék hosszának 10%-a (40-60 bp) legyen elegendo a termékek agaróz gélen való futtatás a utáni, hossz alapján való elkülönítéséhez. Kompetitor unk tervezése során a kvantifikálandó cdns szakaszra a tervezett sense vagy antisense primerektol upstream irányban terveztünk egy harmadik primert, mely PCR rendszerünkkel kompatibilis (primer olvadási ho, primer-termék olvadási ho különbsége, optimális annealing homérséklet) (8. ábra). 8. ábra: A kompetitív patkány VEGF specifikus PCR rendszer kialakítása során felhasznált primerek egymáshoz viszonyított elhelyezkedésének sematikus ábrája. A VEGF gén kódoló szakasza A VEGF gén kódoló szakasza 22 bázis 68 bázis 20 bázis 398 bázis 330 bázis 24 bázis Az ábrán patkány VEGF specifikus PCR-hez használt kompet itor kialakít ásához tervezett két primerpár sematikus, egymáshoz képesti elhelyezkedését mutatjuk be. A piros, kék, illetve a zöld színu téglalapok a primer párok egyes tagjait jelölik. A VEGF gén kódoló szakaszának piros, kék, illetve a zöld csíkos területei a (piros kék, zöld) primerekkel komplementer szakaszoknak felelnek meg. 45

46 Kompetitorunk ezek után az a PCR termék lett, melyet a harmadik primer, és a hozzá közel eso primer fúziójával eloállított primerrel (42 bp hosszúságú oligo) és az ellenoldali primer rel elvégzett PCR során kaptunk (9. ábra). 9. ábra: A kompetitív patkány VEGF specifikus PCR-hez használt kompetitor felépítésének sematikus ábrája. A VEGF gén kodoló szakasza Az ábrán patkány VEGF specifikus PCR-hez használt kompet itor eloállításának sémáját mutatjuk be. A piros, kék, illetve a zöld színu téglalapok a primer párok egyes tagjait jelölik. A VEGF gén kódoló szakaszának piros, kék, illetve a zöld csíkos területei a hozzájuk tartozó (piros kék, zöld) primerekkel komplementer szakaszoknak felelnek meg. A PCR reakció során nyert PCR terméket (kompetitor) Low Melting Gel? (ICN Pharmaceuticals Inc., CA, USA) agaróz gélben elektroforetikusan szeparáltuk. A gélbol QIAquick? (Qiagen GmbH, Hilden, Németország) extrakciós kittel izoláltuk a felszaporított terméket. Az így kitisztított kompetitort spektrofotometriás módszerrel kvantifikáltuk Kompetitív patkány specifikus PCR-ek (GAPDH, IL-6 és VEGF) A VEGF kompetitív mesterséges templátot az elozoekben leírtak szerint állítottuk elo. A kompetitív IL-6 és GAPDH PCR-ekhez a mesterséges templátot Dr. Volk HD. [162], illetve Dr. Strehlau J. [161] szívességébol kaptuk. A PCR-ek során alkalmazott primerek azonosak a szemikvantitatív PCR-ek során alkalmazottakkal (1. táblázat). A kompetitív PCR-ek során keletkezo vad, illetve mesterséges termékek (a kompetitornak megfelelo) hosszadatait a második táblázatban foglaltuk össze (2. táblázat). 46

47 2. táblázat: A kompetitív PCR termékek hosszadatai. Gén Termékhossz cdns Termékhossz - kompetitor VEGF 398 bp 352 bp IL bp 379 bp GAPDH 496 bp 442 bp A táblázat a kompetitív PCR-ek során keletkezo termékek hosszadatait mutatja be. A kompetitív PCR-eket 50? l végtérfogatú [10% 10x PCR puffer, 2 mm MgCl 2, 0,2 mm dntp, 0,4? M primer (mindkét primer esetén), 1,5 U rekombináns Taq polimeráz (Gibco/BRL, Eggenstein, Németország)] reakcióelegyben végeztük 1-1?l kompetitor, illetve vad cdns templát felhasználásával. Mindhárom reakciót, a primerekre specifikusan jellemzo annealing homérséklet kivételével, azonos paraméterekkel optimalizáltuk: Kezdeti 5 perces 94 C-on végzett denaturáció után a templátokat 35 cikluson [94 C, 15 mp (denaturáció), 55 o C (GAPDH) 56 C (VEGF), 66 o C (IL-6) 30 mp (annealing), 72 C 30 mp (extenzió)] keresztül szaporítottuk fel, végül egy 7 percig tartó 72 C-on történo inkubáció során tettük teljessé az extenziót. PCR vizsgálatainkat minden esetben pozitív és negatív kontrollok felhasználásával ellenoriztük. A termékek várt hosszait 100 bp DNS marker (Ready-Load?, Gibco/BRL, Eggenstein, Németország) felhasználásával kontrolláltuk A szemikvantitatív és a kompetitív PCR-ek értékelése Mind a szemikvantitatív, mind a kvantitatív PCR-ek eredményeit a Gel-Pro szoftver (Media Cybernetics, Inc., MD, USA) segítségével denzitometráltuk és értékeltük. 47

48 A patkány vesék szöveti VEGF szintjének meghatározása Western blottal Minta elokészítés A vesemintáinkhoz lízis puffert [10 mm TRIS-HCl (1 M) ph=8.0, 10? g/ml leupeptin, 0,5 mm EGTA (0,5 M), 2% Na-ortovanadát, 2% NaF, 1% Triton-X 100, 25 mm PMSF (fenil-metil-szulfonil fluorid)] adtunk. A szövetmintákat jégen homogenizáltuk. A homogenizátumot centrifugáltuk (13000 RPM, 5 perc). A felülúszó összfehérje koncentrációját spektrofotometriás módszerrel, Bradford szerint határoztuk meg. A minták fehérje-koncentrációját 1 mg/ml-re állítottuk be. A mintákat felhasználásig -80 C-on tároltuk Western blot kontrollok Technikai kontrollként a Santa Cruz Biotechnology Western blot pozitív kontrollját (sc-4045 WB, Santa Cruz Biothechnology Inc., CA, USA), illetve ismerten VEGF pozitív patkány (Wistar) szívizomszövetet használtunk. Ismerten VEGF negatív szövet hiányában negatív kontrollunk nem volt Antitestek Primer, patkány VEGF specifikus ellenanyagként monoklonális ellenanyagot használtuk (VEGF(C-1), mouse monoclonal IgG 2a, Santa Cruz Biothechnology Inc., CA, USA). Az IgG2a alosztályba tartozó monoklonális antitest a human VEGF elso 140 aminosavára specifikus. A másodlagos antitestként torma-peroxidázzal (HRP) konjugált anti-mouse IgG antitest (Sigma Chemical Co., MO, USA) használtunk. 48

49 SDS-PAGE A mintákhoz treatment puffert [30% glic erol, 20% merkapto-etanol, 0,7 M SDS, 0,25 M Tris-HCl ph=6,8] adtunk, majd a mintákat 3 perc forralással denaturáltuk. A 12,5%-os SDS-poliakrilamid gél zsebeibe denaturált, 15-15?g összfehérjének megfelelo mennyiséget vittünk fel. Koncentráló gélként 4%-os SDS-poliakrilamidot használtunk. Mintáink mellé molekulasúly markert (BenchMark TM, Gibco/BRL, Eggenstein, Németország) és pozitív kontrollt vittünk fel. Az elektroforézist 2 órán keresztül 120 V-on 20 ma-rel végeztük, hutött rendszerben Blottolás A szeparált fehérjéket az SDS-poliakrilamid gélrol a nitrocellulóz membránra (Hybond TM ECL TM, AP Biotech, Buckinghamshire,UK) blottoltuk át (70 V, 220 ma, 80 perc), TRIS-HCl, glicin és metanol tartalmú standard transzfer pufferben, hutött rendszerben. A fehérjetranszfer sikerességét 1% Ponceau S (Sigma Chemical Co., MO, USA) és 25% ecetsav (Reanal, Budapest, Magyarország) tartalmú festékkel ellenoriztük Immunoblotting Az immunoblottinghoz szükséges ellenanyag koncentrációkat elozetesen dot-blot technikával határoztuk meg. A blotmembránt szobahomérsékleten, 1 órán keresztül blokkoló oldatban (5% zsírmentes tejpor, 10% PBS puffer) inkubáltuk. Blokkolás után a membránt további 1 órán keresztül az elso, VEGF specifikus ellenanyaggal (0,4? g/? l koncentrációban) inkubáltuk szobahomérsékleten mosó oldatban (1% zsírmentes tejpor, 0, 1% Tween 20 detergens, 10% PBS puffer). 49

50 Mosások után (3 x 10 perc) a második, HRP jelölt ellenanyaggal, 0,2? g/?l koncentrációt alkalmazva 30 percig inkubáltuk a blotmembránt, majd további mosásokkal (3 x 20 perc) távolítottuk el az ellenanyag feleslegét Az immunoreaktív helyek detektálása Az immunoreaktiv helyek kemilumineszcens szignálját Amersham Pharmacia protokoll szerint ECLplus reagenssel, Hyperfilm ECL -en (AP Biotech, Buckinghamshire, UK) detektáltuk. A Western blot-ok eredményeit a Gel-Pro szoftverrel (Media Cybernetics, Inc., MD, USA) denzitometráltuk Immunhisztológia Az immunhisztológiai vizsgálatokat formalinban (4%, ph=7,4) fixált, majd paraffinba ágyazott mintákon végeztük. A fixációs ido egy hét volt. A mintákat xylolban (2 x 20 perc), majd etil-alkoholban (10-10 perc 100%, 90%, 70%, 50%, 30%-os etanolban) deparaffináltuk. A deparaffinálást, majd desztillált vizes mosást követoen a mintákat tris-pufferben (TBS, ph=8,0) 7 percig, 600 W-on mikrohullámú sütobe helyeztük. A mintákat lehulésüket követoen 10 percig 0,03% hidrogén peroxid oldatban mostuk. Ezután foszfátpufferben (PBS) (Sigma Chemical Co., MO, USA) történo mosás után (5 perc) a mintákat 3% tejport tartalmazó PBS-ben (Sigma Chemical Co., MO, USA) blokkoltuk fél óráig, szobahomérsékleten. Újabb PBS -ben történo mosás után a mintákat 1 órán át inkubáltuk az elsodleges, VEGF elleni monoklonális antitest (VEGF(C-1), mouse monoclonal IgG 2a, Santa Cruz Biothechnology Inc., CA, USA) és 1,5% tejport tartalmazó PBS 1:50 arányú keverékében. Majd újabb PBS-es mosás (3 x 5 percig) után a mintákat szobahomérsékleten, fél óráig inkubáltuk a másodlagos ellenanyag (DAKO, CA, USA) és 1,5% tejport tartalmazó PBS 1:2000 arányú keverékében. 50

51 A mintákat (3 x 5 perc PBS-ben) mosás után a DAB oldószer és DAB 1:50-es hígításában 5 percig inkubáltuk. Ezt követoen a mintákat desztillált vizes mosás után hematoxilinnal festettük meg (Mayers s Lillie s Modification, DAKO, CA, USA). A metszeteket Vecta Mount mounting médiummal (Vector Laboratories Inc., CA, USA) fedtük Az in vivo patkány vese iszkémia/reperfúziós kísérletek statisztikai analízise Az állatok túlélésének statisztikai analíziséhez Kaplan-Mayer analízist (Log-rank test) használtunk (Statistica, StatSoft, OK, USA).A western blot, a szemikvantitatív, a kompetitív RT-PCR és az ELISA és RIA, valamint a szérum kreatinin, karbamid mérések eredményeinek statisztikai analíziséhez ANOVA-t használtunk (Statistica, StatSoft, OK, USA). A hisztológiai adatok elemzéséhez Kruskal-Wallis, majd Mann-Whitney U tesztet végeztünk (Statistica, StatSoft, OK, USA). A Mann-Whitney U teszt eredményeit Holm modszere szerint értékeltük. Az adatokat akkor tekintettük szignifikánsnak, ha p értéke kisebb volt, mint 0, A patkány VEGF izoformáinak mrns szintu kimutatása real time RT-PCRfluoreszcens rezonancia energia transzfer segítségével A VEGF különbözo izoformáinak detektálásához használt real time RT-PCR rendszer tervezése során felmerülo megfontolások A VEGF gén kódoló szakaszának, a VEGF 205-ös izoformájára specifikus 6b exon kivételével, nincsenek a különbözo izoformákra specifikusak exonjai (10. ábra). Ugyanakkor, minden izoformában található csak az adott izoformára jellemzo exonexon határ. Ezért a VEGF izoformáinak detektálására egyetlen lehetoség van: a PCR során felhasznált primer párok egyik tagjának a VEGF gén elso 5 exonján (minden izoformában jelen lévo szakasz) kell elhelyezkedni, míg a másiknak az egyes izoformákra specifikus exon-exon határokon (piros kapoccsal jelölve). Ez alól csak a 51

52 VEGF 205-ös izoformája kivétel, ahol a hatos exont (E6a) követo intronikus szakasz válik kódoló szakasszá az mrns alternatív splicingja során (E6b). Ennek bizonyítéka azonban csak humán mintákban ismert. 10. ábra: A patkány VEGF izoformáinak szerkezete. E1-E5 E8 VEGF 120 E1-E5 E6a E8 VEGF 144 E1-E5 E7 E8 VEGF 164 E1-E5 E6a E7 E8 VEGF 188 E1-E5 E6a E6b? E7 E8 VEGF 205 A különbözo patkány VEGF izoformák a gén exonjainak alternatív splicingja során jönnek létre. A 6b exon pat kány szövetekben való megléte nem bizonyított, ennek létezését a patkány és a humán gén szerkezetének összehasonlítása után valószínusítettük. További nehézséget jelent, hogy az egyes izoformákra specifikus primer párok exon-exon határokra tervezett tagjai (piros kapocs) a PCR során beköthetnek az exonexon határt alkotó, azonban más izoformákban is eloforduló exonokra (zöld és narancssárga) anélkül, hogy az adott exonok egymás mellett helyezkednének el (11. ábra). 52

53 11. ábra: Az ábra a VEGF 120-as izoformáján keresztül mutatja be a VEGF izoformákra specifikus primerek aspecifikus bekötodésének lehetoségeit. E1-E5 E8 VEGF 120 E1-E5 E6a E8 VEGF 144 E1-E5 E7 E8 VEGF 164 E1-E5 E6a E7 E8 VEGF 188 E1-E5 E6a E6b? E7 E8 VEGF 205 Az ábra a VEGF 120-as izoformára specifikus primeren (piros) keresztül mutatja be a VEGF izoformákra specifikus primerek más izoformákon való lehetséges kötodéseit (zöld és narancssárga). Jól látható, hogy a VEGF 120-as izoformájára specifikus primer (piros), minden más izoformán is rendelkezik olyan kötohellyel (zöld), amely a termék hossza alapján nem különítheto el. Bár elméletben a primerek narancssárgával jelölt cdns-hez való bekötodése nem eredményezhet PCR terméket a gyakorlat, mégis ennek az ellenkezojét bizonyította. Az így keletkezo az adott izoformára aspecifikus PCR termékek nem különíthetok el a termékhossz alapján a helyestol. Ezért az egyes izoformákra valóban specifikus PCR reakciók beállításához elengedhetetlen a megfelelo kontrollok biztosítása. Erre a célra két rekonbináns DNS molekulát állítottunk elo. Mindketto tartalmazza a minden VEGF izoformára, illetve a VEGF 205-ös izoformájára jellemzo DNS szakaszokat (elso öt, illetve a 6b exon). Ezen DNS szakaszok mellett az egyik rekombináns molekula a VEGF 120-as és a 188-as izoformájára specifikus, míg a másik a VEGF 144-es és a 164-es izoformájára jellemzo exon-exon határ okat tartalmazza (12. ábra). 53

54 12. ábra: A rekombináns DNS molekulák sematikus ábrája, valamint azok nukleotidsorrendje. VEGF K/120/188/205 a VEGF minden izoformában közös szakasza E 5 E 8 E 6a E 7 E 6b GTGCACTGGACCCTGGCTTTACTGCTGTACCTCCACCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGCACCCACGACAGAAGGGGA GCAGAAAGCCCATGAAGTGGTGAAGTTCATGGACGTCTACCAGCGCAGCTATTGCCGTCCAATTGAGACCCTGGTGG ACATCTTCCAGGAGTACCCCGATGAGATAGAGTATATCTTCAAGCCGTCCTGTGTGCCCCTAATGCGGTGTGCGGGCT GCTGCAATGATGAAGCCCTGGAGTGCGTGCCCACGTCGGAGAGCAACGTCACTATGCAGATCATGCGGATCAAACCT CACCAAAGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTGCAGGCCAGAAAAATGTGACAAGCCAAGGCGGTGACCTGGA GCGTTCACTGTGAGCCTTGTTCAGAGCGGAGGTACGTTGGTGCCGCTGCTGTCTAATTCCTTGGAG VEGF K/144/164/205 a VEGF minden izoformában közös szakasza E 6a E 8 E 5 E 7 E 6b GTGCACTGGACCCTGGCTTTACTGCTGTACCTCCACCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGCACCCACGACAGAAGGGGA GCAGAAAGCCCATGAAGTGGTGAAGTTCATGGACGTCTACCAGCGCAGCTATTGCCGTCCAATTGAGACCCTGGTGG ACATCTTCCAGGAGTACCCCGATGAGATAGAGTATATCTTCAAGCCGTCCTGTGTGCCCCTAATGCGGTGTGCGGGCT GCTGCAATGATGAAGCCCTGGAGTGCGTGCCCACGTCGGAGAGCAACGTCACTATGCAGATCATGCGGATCAAACCT CACCAAAGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTGCAGCCTGGAGCGTATGTGACAAGCCAAGGCGGTGAGCCAG AAAATCACTGTGAGCCTTGTTCAGAGCGGAGGTACGTTGGTGCCGCTGCTGTCTAATTCCTTGGAG A képen a VEGF izoformaspecifikus real time RT-PCR-ek beállításhoz, illetve kvantifikálásához szükséges két rekombináns DNS molekula sematikus ábráját, valamint azok nukleotidsorrendjét ábrázoltuk. Az 5-ös és a 6a exon egymás mellett fekvo szakaszait (E 5, E 6a) narancssárga a 7-es és 8-as exonét (E 7, E8) zöld a 6b exont (E 6b) pedig piros szín jelöli. Az így megépített két rekombináns DNS molekula egyúttal egymás negatív kontrolljául is szolgálnak a real time RT-PCR-ek beállítása során, lehetové téve az aspecifikus kötések kiküszöbölését. A PCR nem tökéletes beállítása esetén ugyanis az 54

55 egyik rekombináns DNS molekulán specifikus kötohellyel rendelkezo primer a másik rekombináns DNS molekulához is beköthet (ahogy azt a 9. ábrán a VEGF 121-es izoformára specifikus primer kapcsán is bemutattuk) aspecifikus termékeket hozva létre. A rekombináns molekulák mindezen túl lehetové teszik a real time RT-PCR-ek kvantifikálását is Rekombináns DNS molekulák eloállítása A rekombináns DNS molekuláknak a minden VEGF izoformában eloforduló szakaszát patkány vesemintából eloállított cdns-bol amplifikáltuk fel PCR során. A PCR-t 50? l végtérfogatú [10% 10x PCR puffer, 2 mm MgCl2, 0,2 mm dntp, 0,4-0,4? M primer, 1,5 U rekombináns Pfx Taq polimeráz (Invitrogen, CA, USA)] reakcióelegyben végeztük 2? l cdns felhasználásával. A PCR során alkalmazott primerek a következok voltak: sense: 5 - gtg cac tgg acc ctg gct tta c -3 és antisense: 5 - ttt tct ggc ttt gtt cta tct ttc -3. A PCR-t a kezdeti 5 perces 94 C-on végzett denaturáció után a 35 cikluson [94 C, 15 mp (denaturáció), 56 C, 30 mp (annealing), 72 C, 30 mp (extenzió)] keresztül végeztük, végül egy 20 percig tartó 72 C-on történo inkubáció során tettük teljessé az ext enziót. A rekombináns DNS molekuláknak a VEGF izoformákra specifikus szakaszának megfelelo, egyszálú DNS szakaszokat a VBC Genomics-tól rendeltük meg (VBC Genomics, Bécs, Ausztria). A szimpla szálú DNS molekulákat PCR reakció során tettük duplaszálúvá. A PCR-t 50?l végtérfogatú [10% 10x PCR puffer, 2 mm MgCl 2, 0,2 mm dntp, 0,4-0,4? M primer, 1,5 U rekombináns Pfx Taq polimeráz (Invitrogen, CA, USA)] reakcióelegyben végeztük 10 pmol egyszálú DNS szakasz felhasználásával. A PCR során alkalmazott primerek a következok voltak: sense: 5 - ctg cag gcc aga aaa atg tga caa gc -3 és antisense: 5 - ctc caa gga att aga cag cag cgg c-3. A PCR-t a kezdeti 5 perces 94 C-on végzett denaturáció után a 35 cikluson [94 C, 15 mp (denaturáció), 61 C, 20 mp (annealing), 72 C, 30 mp (extenzió)] keresztül végeztük, végül egy 20 percig tartó 72 C-on történo inkubáció során tettük teljessé az extenziót. 55

56 Ezután mindkét szakaszt (minden VEGF izoformában eloforduló, illetve az egyes izoformákra specifikus DNS) 37 C-on egy teljes éjszakán át Pst I-el (Sigma Chemical Co., MO, USA) emésztettük. Így a DNS szakaszok megfelelo egymás felé nézo részein ragadós végek alakultak ki. Az emésztett termékeket 2%-os agaróz gélbol tisztítottuk vissza (Qiagen GmbH, Hilden, Németország). A két (rekombináns molekulánként) így kitisztított ragadós véggel rendelkezo DNS szakaszt T4DNA ligázzal (Invitrogen, CA, USA) egyesítettük (25C, 60 perc). Majd PCR-val felsokszoroztuk. A PCR-t 50?l végtérfogatú [10% 10x PCR puffer, 2 mm MgCl 2, 0,2 mm dntp, 0,4-0,4? M primer, 1,5 U rekombináns Pfx Taq polimeráz (Invitrogen, CA, USA)] reakcióelegyben végeztük 2? l DNS felhasználásával. A PCR során alkalmazott primerek a következok voltak: sense: 5 - gtg cac tgg acc ctg gct tta c - 3 és antisense: 5 - ctc caa gga att aga cag cag cg-3. A PCR-t a kezdeti 5 perces 94 Con végzett denaturáció után a 35 cikluson [94 C, 15 mp (denaturáció), 58 C, 20 mp (annealing), 72 C, 30 mp (extenzió)] keresztül végeztük, végül egy 20 percig tartó 72 C-on történo inkubáció során tettük teljessé az extenziót A rekombináns DNS molekulák klónozása A felszaporított PCR temékeket (a két rekombináns DNS molekulát) TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, CA, USA) segítségével klónoztuk. A rekombináns DNS-eket tartalmazó plazmidokat kompetens E. coli-ba (Invitrogen, CA, USA) transzfektáltuk. A baktériumokat 100mg/ml Ampicillint (Bristol Myer, New York, USA) tartalmazó szilárd LB-agaron (Invitrogen, CA, USA) tenyésztettük (37 C, 24 óra), majd klónonként felvettük oket. A klónokat további 24 órán keresztül 100mg/ml ampicillint (Bristol Myer, New York, USA) tartalmazó folyékony LB tápoldatban szaporítottuk el. Ezután a klónokból plazmidot izoláltunk (Invitrogen, CA, USA), majd szekvenáltuk azokat (ABI310-es automata szekvenátor-bigdye Terminator Cycle Sequencing Kit ((Applied Biosystems, CA, USA) - Genoid Kft.) 56

57 A VEGF izoformáinak detektálása real time RT-PCR-fluoreszcens rezonancia energia transzfer segítségével PCR-eket 20? l végtérfogatú [10% LC FastStart DNA Master hybridization Probe, 4 mm MgCl 2, 0,5 n? mindkét primer, 0,17 nm mindkét próba] reakcióelegyben végeztük, 5? l DNS felhasználásával. A VEGF izoformákra specifikus primerek exon-exon határokat áthidaló szakaszain a vizsgált cdns-sel nem komplementer bázisokat, mismatch-eket helyeztünk el az aspecifikus kötések kiküszöbölésére. A VEGF izofor mákra specifikus primerek a következok voltak: sense primer: 5 -aga cgg cag tca cta g-3 (minden VEGF izoformaspecifikus PCR-ben ez a sens primer); antisense primerek: VEGF 120 : 5 -ccg cct tgg ctt gtc atc gtt ttc 3 ; VEGF 144 :5 -ccg cct tgg ctt gtc atc gac gct-3 ; VEGF 164 : 5 -ctc tga aca agg ctc aca gga ctt ttc-3 ; VEGF 188 :5 -ctc tga aca agg ctc aca aga cac gct-3 ; VEGF 205 : 5'- gaa tta gac agc agc ggc acc aac -3 (vastag betukkel a mismatch-eket jelöltük). A real time RT -PCR-fluoreszcens rezonancia energia transzferes (FRET) mérések során az egyik próba 5 végét Light Cycler Red 640 fluoroforral jelöltük: 5 - tgc cca cgt cgg aga gc -3 ; a másik próba 3 végét fluoresceinnel jelöltük: 5 - gca atg atg aag ccc tgg agt g- 3 (Tibmolbiol, Berlin, Németország). A PCR-kat a kezdeti 95 C-on végzett 8 perces denaturáció után cikluson [95 C, 2 mp (denaturáció), 55 o C 10 mp (annealing), 72 C 25 mp (extenzió)] át végeztük. Az izoformaspecifikus real time RT-PCR-eket mindig az egyes izoformákra pozitív és negatív kontrollként szolgáló rekombináns DNS molekulákon végzett PC R-ekkel párhuzamosan végeztük A VEGF gén promoter polimorfizmusainak és a kis születési súlyú koraszülöttek retinopátiája közti kapcsolat vizsgálata A vizsgálatba bevont kis születési súlyú koraszülöttek klinikai adatai 115 ROP miatt krioterápiával, illetve fotokoagulációval nem kezelt (kontroll) és 86 ROP miatt krioterápiával, illetve fotokoagulációval kezelt, kis születési súlyú koraszülött (VLBW) esetében határoztuk meg a VEGF T -460 C-as és a G +405 C-ös 57

58 SNP-ket (3. táblázat). A vizsgált VEGF SNP-k nevezéktanában nincs irodalmi konszenzus. Az általunk vizsgált -460-as, illetve +405-ös lokusz a dolgozat oldalán található géntérképen a es (-460), illetve -633-as (+405) pozícióban található meg. 3. táblázat: A VEGF gén T -460 C-as és a G +405 C -ös polimorfizmusainak vizsgálatába bevont 201 kis születési súlyú koraszülöttek klinikai adatai. ROP miatt krioterápiával v. ROP miatt krioterápiával v. fotokoagulációval nem kezelt kis születési súlyú koraszülöttek fotokoagulációval kezelt kis születési súlyú koraszülöttek Betegszám (fiú/lány) 115 (60/55) 86 (55/31) ROP stádium plusz betegszám gesztációs kor (hét) 29,2 ± 2,9 28,5 ± 2,0 Születési súly 1200 ± ± 300 (gramm) Oxigénterápia idotartalma (nap) 7 [0-47] 15 [0-92] A táblázat a VEGF gén T -460 C-as és a G +405 C -ös gén polimorfizmusainak vizsgálatába bevont 201 beteg klinika adatait tartalmazza. A ROP stádium beosztását a nemzetközi klasszifikációnak megfeleloen állapítottuk meg [163]. A gesztációs kor és a születési súly adatait átlag ± szórás, míg az oxigénterápia hosszát átlag [tartomány] formájában adtuk meg DNS izolálás A mérésekhez az újszülöttek fenilketonuria szurésére használt, szuropapírra cseppentett vérmintáit használtuk. A DNS izolálás során a szuropapírból kivágott, mintegy 10 mm 2 felületu mintára 200?l 5%-os Chelex 100-at mértünk. Ezután a mintákat elobb 90 percig 56 C-on, majd 10 percig 100 C-on inkubáltuk. Az így 58

59 elokészített mintákat szobahomérsékletre hutöttük, majd megkevertük. Végül rpm-en 2 percig centrifugáltuk a mintáinkat. A további vizsgálatokig a felülúszót -20 Con tároltuk A VEGF T -460 C polimorfizmusának detektálása real time PCR-fluoreszcens rezonancia energia transzfer segítségével A VEGF gén T -460 C polimorfizmusának meghatározását real time PCR- FRET technikával végeztük. PCR-eket 20? l végtérfogatú [10% LC FastStart DNA Master hybridization Probe, +2mM MgCl 2, 0, 5 n? mindkét primer, 0,17nM mindkét próba] reakcióelegyben végeztük, 2?l DNS felhasználásával. A primerek és a próbák a következok voltak: sense primer: 5 -aga cgg cag tca cta g-3 ; antisense primer: 5 -aat att gaa gg ggg cag-3 ; az egyik próbát az 5 végén Light Cycler Red 640 fluoroforral jelöltük: 5 LC640-agc ggg gag aag gcc agg g-3 ; a másik próba 3 végét fluoresceinnel jelöltük: 5 -tgt ggg gtt gag ggc gtt-f 3 (Tibmolbiol, Berlin, Németország). A PCR-kat a kezdeti 95 C-on végzett 8 perces denaturáció után cikluson [95 C, 2 mp (denaturáció), 55 o C 5 mp (annealing), 72 C 15 mp (extenzió)] át végeztük. A PCR-eket pozitív és negatív kontrollok felhasználásával ellenoriztük. A PCR termékeink olvadáspont analízisét a következo paraméterek szerint végeztük: 95 o C 10 mp, majd 20 o C/mp sebességu hutés után 15 mp-ig 40 o C-on tartottuk a mintákat. Ezt követoen 20 o C/mp sebességu futéssel 85 o C-ra melegítettük fel a mintákat A VEGF G +405 C polimorfizmusának detektálása PCR-restrikciós fragment hossz polimorfizmus segítségével A VEGF gén G +405 C polimorfizmusának meghatározását PCR-restrikciós fragment hossz polimorfizmus (RFLP) technikával végeztük el. Az Chelex 100-al izolált DNS minták megfelelo szakaszát PCR reakcióval szaporítottuk fel. PCR-eket 59

60 50? l végtérfogatú [10% 10x PCR puffer, 1 mm MgCl 2, 0,2 mm dntp, 0,4-0,4? M primer (sense és antisense primerek), 1,5 U rekombináns Taq polimeráz (Gibco/BRL, Eggenstein, Németország)] reakcióelegyben végeztük 2? l DNS felhasználásával. A primerek tervezéséhez a Primer3? ( primer3.cgi; Steve Rozen, Helen J. Skaletsky (1998) Primer3, Whitehead Institute for Biomedical Research) szoftvert használtuk. A PCR reakció során felhasznált primerek a következok voltak: sense: 5 -ccg acg gct tgg gga gat tg-3 és antisense: 5 -cgg cgg tca ccc cca aaa g-3. A PCR-eket a kezdeti 5 perces 94 C-on végzett denaturáció után a templátokat 40 cikluson [94 C, 15 mp (denaturáció), 60 o C, 30 mp (annealing), 72 C 30 mp (extenzió)] keresztül szaporítottuk fel, végül egy 7 percig tartó 72 C-on történo inkubáció során tettük teljessé az extenziót. PCR reakciókat pozitív és negatív kontrollok felhasználásával végeztük. A termék várt hosszát (197 bázis) 100 bp DNS marker (Ready-Load?, Gibco/BRL, Eggenstein, Németország) felhasználásával kontrolláltuk. A PCR 197 bázis hosszúságú végtermékét BsmF I (5 GGGAC(N)10*3 ) restrikciós endonukleázzal (New England Biolabs, MA, USA) emésztettük. A hasítási termékek 26, illetve 171 bázis hosszúságuak voltak A populációs adatok statisztikai feldolgozása A koraszülött populáció vizsgálata során a születési súly és a gesztációs kor adatainak összehasonlítását a ROP miatt krioterápiával, illetve fotokoagulációval nem kezelt (kontroll) és a ROP miatt krioterápiával, illetve fotokoagulációval kezelt, kis születési súlyú koraszülöttek között Mann-Whitney U teszttel végeztük, az allél és genotípus frekvenciákat? 2 teszttel és Fisher exact teszttel vizsgáltuk (Statistica, StatSoft, OK, USA). A haplotípus analíziseket (az egyes allélek kombinációit), a linkeage-disequilibrium tesztet, a Hardy-Weinberg egyensúly vizsgálatát és ROP miatt kezelt, illetve a nem kezelt populáció allél prevalencia vizsgálatát az Arlequin szoftverrel ( Swiss National Science Foundation) végeztük. 60

61 7. EREDMÉNYEK Adataink közül elsoként mindig az adott állatmodellt igazoló, így az akut vesekárosodást, illetve a kezeléseink eredményességét igazoló adatokat mutatjuk be A VEGF szintézisének vizsgálata vese iszkém ia/reperfúziós patkánymodellben Ivarérett, hím Wistar patkányok szérum, illetve vesemintáinak elváltozásait vizsgáltuk 2 (T 2 ), illetve 24 (T 24 ) órával az 55 perces vese iszkémiáját követoen. Kontrollként áloperált, nem iszkémizált veséju (T 0 ) patkányokat használtunk A szérum kreatinin és karbamid koncentrációjának változásai Az 55 perces bal oldali iszkémiát követoen megemelkedett szérum kreatinin és karbamid szintek jelzik a kialakult akut vesekárosodást (4. táblázat). 4. táblázat: a patkányok szérum kreatinin és karbamid szintjeinek változása a vese iszkémiát követoen 2, illetve 24 órával (T 2, T 24 ). T 0 T 2 T 24 Kreatinin (? mol/l) Karbamid (mmol/l) 48 ± 3 96 ± 7 * 368 ± 16 * # 4,8 ± 1,2 7,8 ± 0,8 * 44,8 ± 4,3 * # A táblázat a patkányok 55 perces vese iszkémiát követo szérum kreatinin és karbamid szintjének változásait mutatja. * p?0,05 vs. T 0 ; # p?0,05 vs. T 2. Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk meg. 61

62 A vesék szövettani elváltozásai A T 0 vesék szövettani vizsgálata ép vesestruktúrát mutatott, minden glomeruláris, tubuláris vagy intersticiális elváltozás nélkül. Az 55 perces vese iszkémiáját követoen a T 2 vesékben a tubuláris epitélsejtek enyhe nekrózisa és fokozott bazolaterális eozin festodése volt megfigyelheto (tubuláris nekrózis: 1,5 (1-2); p<0, 05 vs. T 0 vesék). A T24 vesékben súlyos fokú tubuláris nekrózis volt jelen (tubuláris nekrózis: 3,0 (2-3); p<0,05 vs. T0 és T2 vesék). Glomeruláris vagy intersticiális elváltozás egyik csoportban (T0, T2, T24) sem volt megfigyelheto (13. ábra). 13. ábra: A nem iszkemizált, kontroll (A) és az iszkémizált veseminták 2 (B), illetve 24 (C) óra reperfúziót követo hematoxilin-eozin festett metszetei. A nem iszkemizált (T 0), kontroll állatok veséi (A) ép tubuláris epitélsejteket mutatnak. A tubuláris epitélsejtek enyhe nekrózist és fokozott bazolaterális eozinfestodést mutatnak a T 2 vesékben (B) (nyilak). A tubuláris epitélsejtek súlyos nekrózist mutatnak (csillagok) a T 24 vesékben (C). Az eredeti nagyítás: A-C x400 62

63 VEGF, IL-6 és az IL-1? mrns expresszió változásai a patkány vesékben A vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF), az interleukin 1? (IL-1?? és az interleukin 6 (IL-6) mrns expresszióját szemikvantitatív RT-PCR-rel határoztuk meg a T 0, illetve a T2 és a T24 vesékben. Az állatok 55 perces vese iszkémiáját követoen a?vegf ( ábra) és az IL-1?? (14. és a 17. ábra) mrns expressziója a T 0 vesékhez képest változatlan maradt a T 2 és T 24 mintákban. Az IL-6 (14. és a 16. ábra) mrns expressziója, mintegy 30-szorosára fokozódott a T 2 vesékben (p<0,01 vs. T 0 ). A T 24 vesék IL-6 mrns expressziója nem különbözött a kontroll (T 0 ) vesékétol. 14. ábra: VEGF, IL-6, IL-1? és GAPDH mrns expressziójának változása a kontroll (T0) és az iszkémizált vesemintákban 2, illetve 24 óra reperfúziót (T2, T24) követoen (reprezentatív ábra). VEGF IL-6 IL-1? Kontroll T 0 T 2 T bp 496 bp 220 bp GAPDH 496 bp Az ábra a VEGF, IL-6, IL-1? és GAPDH mrns expressziós vizsgálatok (szemikvantitatív RT -PCR) reprezentatív eredményeit mutatja a kontroll (T 0 ) vesékben, illetve az 55 perces vese iszkémiát követoen a T 2 és a T 24 vesékben. A VEGF és az IL-1? mrns expressziója nem mutat változást. Az IL-6 mrns expressziója fokozott a T2 vesékben. 63

64 15. ábra: A VEGF mrns expressziójának változása a kontroll (T 0 ) és az iszkémizált vesemintákban 2, illetve 24 óra reperfúziót (T 2, T 24 ) követoen. 2 VEGF / GAPDH relatív egységek 1,5 1 0,5 0 kontroll T0 T2 T24 Az ábra a VEGF mrns expressziójának az 55 perces vese iszkémiát követo változásait mutatja a T 2 és a T 24 vesékben (szemikvantitatív RT -PCR). A VEGF mrns expressziója az iszkémiát követoen nem mutat statisztikailag szignifikáns változást. Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk meg. 16. ábra: Az IL-6 mrns expressziójának változása a kontroll (T 0 ) és az iszkémizált vesemintákban 2, illetve 24 óra reperfúziót (T 2, T 24 ) követoen. 40 * IL-6 / GAPDH relatív egységek kontroll T0 T2 T24 Az ábra az IL-6 mrns expressziójának az 55 perces vese iszkémiát követo változásait mutatja a T 2 és a T 24 vesékben (szemikvantitatív RT-PCR). Az IL-6 mrns expressziója fokozott a T2 vesékben (* p<0,01 vs. kontroll). Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk meg. 64

65 17. ábra: Az IL-1? mrns expressziójának vált ozása a kontroll (T 0 ) és az iszkémizált vesemintákban 2, illetve 24 óra reperfúziót (T 2, T 24 ) követoen. 2,5 2 IL-1b / GAPDH reltív egységek 1,5 1 0,5 0 kontroll T2 T24 T0 Az ábra az IL-1? mrns expressziójának az 55 perces vese iszkémiát követo változásait mutatja a T 2 és a T 24 vesékben (szemikvantitatív RT -PCR). Az IL-1? mrns expressziója az iszkémiát követoen nem mutat statisztikailag szignifikáns változást. Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk meg A VEGF fehérje szint változásai a patkány vesékben A kontroll és a posztiszkémiás vesék Western blot analízise egy határozott csíkot eredményezett 23 kd-nál (18. ábra). 18. ábra: VEGF fehérjeszintjének változása a kontroll (T 0 ) és az iszkémizált vesemintákban 2, illetve 24 óra reperfúziót (T 2, T 24 ) követoen (reprezentatív ábra). VEGF Kontroll T0 T2 T24 23kD Az ábra a VEGF fehérjeszintjének (Western blot) reprezentatív eredményeit mutatja a kontroll vesékben, illetve az 55 perces vese iszkémiát követoen a T 2 és a T 24 vesékben. 65

66 Az állatok 55 perces vese iszkémiáját követoen a VEGF fehérjeszintje a kontroll (T0) vesékhez képest magasabb a T2 és a T24 posztiszkémiás vesemintákban (* p<0,01 vs. (T0)) (18., illetve 19. ábra). 19. ábra: A VEGF fehérjeszintjének változása a kontroll (T0) és az iszkémizált vesemintákban 2, illetve 24 óra reperfúziót (T 2, T 24 ) követoen. 400 * VEGF relatív egységek * 0 kontroll T0 T2 T24 Az ábra VEGF fehérje szintjének az 55 perces vese iszkémiát követo változásait mutatja a T 2 és a T 24 vesékben (western blot). A VEGF szintje mind a T 2, mind a T 24 vesékben emelkedett a kontroll vesékhez képest (* p<0,01 vs. kontroll). Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk meg A VEGF szöveti eloszlása a vesében A vesemetszetek kis nagyítású áttekinto képén (A) jól látható a vese kéreg-velo határának intenzív VEGF immunpozitív festodése. Ez a jelenség a kontroll és a posztiszkémiás vesékben egyaránt megfigyelheto. Az immunhisztológiai vizsgálat során VEGF pozitívnak találtuk a vese tubuláris epitélsejtjeit, a Bowman tok parietális falát, a glomeruláris érgomolyagot, a makula denzát és a vesemedence urotéliumát (19. ábra). 66

67 20. ábra: A VEGF lokalizációjának immunhisztológiai vizsgálata a kontroll (T 0 ) és az iszkemizált vesékben. A kontroll vesék (A) kéreg-velo határa intenzíven VEGF immunoreaktivitást mutat. VEGF immunopozitívak a vese tubuláris epitelsejtjei (B-D), gyujtocsatornái (E), a Bowman tok (F) parietális fala (nyílhegy), a glumeruláris kapillárishálózat (F) (nyíl), a makula denza (F) (csillag), az urotélium (G) (nyíl) és az erek (H) simaizomsejtjei (nyíl). A kontroll vesék (B) diffúz citoplazmatikus VEGF immunreaktivitást mutatnak. A T 2 vesékben (C) a VEGF immunreaktivitás a vese tubuláris epitélsejtjeinek basolaterális oldalára lokalizált. A T 24 vesék (D) a kontroll vesékhez hasonlóan diffúz citoplazmatikus VEGF immunreaktivitást mutatnak. Az eredeti nagyítás: A x50; B-H x

68 A kontroll vesék tubuláris epitélsejtjeiben a VEGF immunreaktivitás diffúzan, az egész citoplazmára kiterjedoen jelen volt. Az állatok 55 perces vese iszkémiáját követoen a VEGF immunreaktivitás bazolaterális lokalizációja volt megfigyelheto a T2 vesék tubuláris epitélsejtjeiben mind a vesekéregben mind, pedig a veloállományban. A T24 vesék tubuláris epitélsejtjeinek többségében a VEGF immunreaktivitás megoszlása, a kontrollokéhoz hasonlóan diffúz volt. Néhány vesetubulusban azonban még jelen volt a bazolaterális VEGF immunreaktivitás (19. ábra) A hisztamin és a hisztamin kettes receptor antagonista, ranitidin kezelés hatásának vizsgálata a VEGF szintézisére vese iszkémia/reperfúziós patkánymodellben Hisztamin és ranitidin kezelt, illetve kezeletlen, ivarérett, hím Wistar patkányok szérum, illetve vesemintáinak elváltozásait vizsgáltuk 2 (T2), illetve 16 (T16) órával az 50 perces vese iszkémiáját követoen. Mutéti kontrollként, áloperált, nem iszkémizált veséju (T 0 ) patkányokat használtunk A patkányok vese iszkémiát követo túlélése A 12 kezeletlen, kontroll állatból 2 élte túl az 50 perces vese iszkémiát követo egy hetes vizsgálati periódust. A hisztamin kezelés szignifikánsan rontotta az állatok túlélését. A 10 hisztaminnal kezelt patkányból egy sem élte túl az iszkémiát követo 3. napot. Másrészrol a HR2 antagonista ranitidinnel kezelt állatok túlélése szignifikánsan jobb volt a másik két kezelési csoport állataiénál. A 13 ranitidinnel kezelt patkányból 5 élte túl az iszkémiát követo egy hetes vizsgálati periódust (20. ábra). 68

69 21. ábra: A hisztamin, illetve a ranitidin kezelés hatása a Wistar patkányok 50 perces vese iszkémiát követo egy hetes túlélésére Kontroll Hisztamin Ranitidin Túlélés (%) Ido (napok) * + + A hisztamin (n = 10 db), illetve a ranitidin (n = 13 db) elokezelés hatása a Wistar patkányok 50 perces vese iszkémiát követo túlélésére. Kontrollként (n = 12 db) kezeletlen állatok szolgáltak. A ranitidn elokezelést követoen az állatok túlélése szignifikánsan javult (* p<0,05 vs. kontroll, + p<0,05 vs. hisztamin). A hisztamin kezelés rontotta az állatok túlélését (+ p<0,05 vs. hisztamin) A patkányok szérum kreatinin és karbamid koncentrációjának változásai Az állatok vese iszkémiáját megelozoen (T 0 ) szérum kreatinin, illetve karbamid koncentrációjában nem volt szignifikáns különbség a kezelési csoportok között. Az 50 perces bal oldali vese iszkémiát követoen (T 2 és T 16 ) mindhárom csoportban szignifikánsan megemelkedett a szérum kreatinin és karbamid koncentrációja. Két órával az iszkémiát követoen a hisztaminnal kezelt állatok szérum kreatinin, illetve karbamid koncentrációja szignifikánsan magasabb volt a ranitidinnel kezelt, illetve a kontroll állatokénál, ez a különbség azonban már T16-nál már nem volt megfigyelheto (5. táblázat). 69

70 5. táblázat: A hisztamin és ranitidin kezelt, illetve a kezeletlen állatok szérum kreatinin és karbamid értékei az egyoldali vese iszkémiát megelozoen (T 0 ), illetve azt követoen 2 és16 órával (T2, T 16). Kezelés Mintavételi idopontok T 0 T 2 T 16 Kreatinin (? mol/l) Karbamid (mmol/l) Kontroll 53? 1,1 93?1,2 299? 12,4 # Hisztamin 55? 1,8 127?4,8 * 312? 13,2 # Rranitidin 52? 1,4 104?2, ?9,7 # Kontroll 4,8? 0,28 7,8? 0,07 27,2?1,48 # Hisztamin 5,5? 0,25 9,7?0,58 * 31,2?1,70 # Rranitidin 5,6? 0,15 9,6?0,40 * 28,7?1,36 # A táblázat a szérum kreatinin és karbamid szint változásait mutatja a különbözo kezelési csoportokban az 50 perces vese iszkémiát követoen 2 (T 2 ), illetve 16 (T 16 ) órával. Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk meg. * p?0,05 vs. K, + p?0,05 vs. H, p?0,05 vs. T 0 érték, # p?0,5 vs. T 2 érték A patkányok vese tubuláris károsodásának változásai Az állatok vese iszkémiáját megelozoen (T 0 ) egyik csoportban sem volt detektálható hisztológiai eltérés. Két órával az állatok 50 perces vese iszkémiát követoen enyhe tubuláris károsodás volt megfigyelheto a kontroll, illetve a ranitidinnel kezelt állatokban. A hisztamin kezelt állatokban ez az eltérés sokkal kifejezettebb volt. Tizenhat órával a vese iszkémiát követoen minden csoportban súlyos vesetubulus károsodás volt megfigyelheto. Glomeruláris vagy intersticiális elváltozás egyik vizsgált idopontban sem volt jelen (T 0, T 2, T 16 ) a különbözo csoportokban (6. táblázat). 70

71 6. táblázat: A hisztamin és ranitidin kezelt, illetve a kezeletlen állatok tubuláris károsodása a vese iszkémiát megelozoen (T 0 ), illetve azt követoen 2 és16 órával (T 2, T 16 ). Kezelés Mintavételi idopontok T0 T2 T16 Tubuláris károsodás Kontroll 0 (0-0) 2 (1-3) 4 (4-4) # Hisztamin 0 (0-0) 4 (2-4) * + 4 (4-4) Ranitidin 0 (0-0) 1,5 (1-3) 4 (4-4) # A táblázat a vese tubuláris károsodásának mértékét mutatja az 50 perces vese iszkémiát követoen a különbözo kezelési csoportok T 2 és a T 16 veséiben. Az adatokat medián (tartomány) formájában adtuk meg. * p?0,05 vs. K, + p?0,05 vs. R, p?0,05 vs. T 0 érték, # p?0, 05 vs. T 2 érték A patkányok szérum hisztamin koncentrációjának változásai A vese iszkémiát megelozo, T0 idopontban a hisztaminnal kezelt állatok szérum hisztamin szintje a másik két csoportéhoz képest szignifikánsan magasabb volt. Két órával az 50 perces vese iszkémiát követoen a kontroll és a hisztaminnal kezelt állatok szérum hisztamin szintje szignifikánsan csökkent a T 0 értékhez képest, majd 16 órával az iszkémiát követoen visszatért a kiindulási értékre. Ezzel szemben a ranitidinel kezelt állatok szérum hisztamin szintje minden idopontban a kontroll állatok T 0 értékéhez volt hasonló, nem volt eltérést a különbözo idopontokban vett minták hisztaminszintjei között (7. táblázat). 71

72 7. táblázat: A hisztamin és ranitidin kezelt, illetve a kezeletlen állatok szérum hisztamin értékei a vese iszkémiát megelozoen (T 0 ), illetve azt követoen 2 és16 órával (T 2, T 16 ). Kezelés Mintavételi idopontok T0 T2 T16 Hisztamin (pmol/l) Kontroll 45,7?4,04 21,5?6,48 33,7? 9,88 Hisztamin 68,8?3,13 * 32,9?8,10 59,4?0,95 *# Ranitidin 38,5? 4, ,7?6,44 38,9? 6,04 + A táblázat a szérum hisztamin szint változásait mutatja a különbözo kezelési csoportokban az 50 perces vese iszkémiát követoen 2 (T 2 ), illetve 16 (T 16 ) órával. Az adatokat átlag ± átlag szórása formájában adtuk meg. * p?0,05 vs. K, + p?0,05 vs. H, p?0,05 vs. T 0 érték, # p?0,05 vs. T 2 érték A patkányok VEGF mrns expres sziójának változásai a vesében Az állatok 50 perces vese iszkémiáját megelozoen (T 0 ) gyujtött veseminták VEGF mrns expressziójának kompetitív RT-PCR-rel történo meghatározása során nem volt detektálható különbség a kezelési csoportok között. A kontroll állatokban a VEGF mrns expressziója az egész kísérlet alatt változatlan maradt Két órával a vese iszkémiát követoen a hisztaminnal kezelt állatok VEGF mrns expressziója szignifikánsan magasabb volt, mint a kontroll, illetve a ranitidinnel kezelt állatoké. Tizenhat órával a vese iszkémiát követoen ez a különbség tovább fokozódott. Az állatok ranitidin kezelése a kontrollokéhoz képest nem okozott változást a VEGF mrns expressziójában egészen a vese iszkémiát követo tizenhatodik óráig. Tizenhat órával a vese iszkémiát követoen a ranitidin kezelt állatok VEGF mrns expressziója szignifikánsan csökkent a kontroll, illetve a hisztaminnal kezelt állatokéhoz képest (21. ábra). 72

73 22. ábra: A VEGF mrns expressziójának változása a kontroll, a hisztaminnal és a ranitidinnel kezelt állatokban a vese iszkémiát megelozoen (T 0 ), illetve azt követoen 2 és16 órával (T2, T 16). VEGF / GAPDH relatív egységek 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 Kontroll Histamin Ranitidin * T0 T2 T16 * + # Az ábra az VEGF mrns expressziójának a vese iszkémiát követo változásait mutatja a különbözo kezelési csoportok T 2 és a T 16 veséiben (kompetitív RT-PCR). Az adatokat átlag ± átlag szórása formájában adtuk meg. * p?0,05 vs. K, + p?0,05 vs. H, p?0,05 vs. T 0, # p?0,05 vs. T A patkányok IL-6 mrns expressziójának változásai a vesében Az állatok 50 perces vese iszkémiáját megelozoen gyujtött veseminták IL-6 mrns expressziójának kompetitív RT-PCR-rel történo meghatározása egyik csoportban sem mutatott detektálható mrns expressziót. Két órával az állatok vese iszkémiáját követoen az IL-6 mrns expressziója minden csoportban szignifikánsan megemelkedett a kiindulási értékhez képest. Az IL-6 mrns expressziójának emelkedése a legmagasabb értéket a hisztamin kezelt állatokban érte el. Tizenhat órával a vese iszkémiát követoen az IL-6 mrns expressziója minden csoportban szignifikánsan csökkent a T2 értékekhez képest. T16-nál a ranitidin kezeltek IL-6 mrns expressziója szignifikánsan alacsonyabb volt a többi csoporténál (22. ábra) 73

74 23. ábra: Az IL-6 mrns expressziójának változása a kontroll, a hisztaminnal és a ranitidinnel kezelt állatokban a vese iszkémiát megelozoen (T0), illetve azt követoen 2 és16 órával (T 2, T 16 ). * IL-6 / GAPDH relatív egységek 0,04 0,03 0,02 0,01 Kontroll Hisztamin Ranitidin # # #* 0 T0 T2 T16 Az ábra az IL-6 mrns expressziójának az 50 perces vese iszkémiát követo változásait mutatja a különbözo kezelési csoportok T 2 és a T 16 veséiben (kompetitív RT -PCR). Az adatokat átlag ± átlag szórása formájában adtuk meg. * p?0,05 vs. K, p?0,05 vs. T 0, # p?0,05 vs. T A patkányok VEGF fehérje szintjeinek változásai a vesében A vesék VEGF fehérjeszintjeit Western blot analízissel határoztuk meg. A különbözo kezelési csoportok 50 perces ves e iszkémiát megelozo vese VEGF fehérjeszintjében nem volt szignifikáns különbség. Két órával a vese iszkémiát követoen a kontroll és a hisztaminnal kezelt állatok VEGF fehérje szintjében mintegy kétszeres növekedés állt be. A ranitidinnel kezelt állatokban ez a változás még kifejezettebb volt. Tizenhat órával a vese iszkémiát követoen a kontroll, illetve a ranitidinnel kezelt állatokban további VEGF fehérje szint növekedése már nem volt megfigyelheto. Ezzel szemben a hisztaminnal kezelt állatokban a VEGF fehérje szintje további emelkedést mutatott és elérte a ranitidinnel kezelt állatokban megfigyelt VEGF fehérje szint növekedésének mértékét (23. ábra). 74

75 24. ábra: A vese VEGF szint változása a kontroll, a hisztaminnal és a ranitidinnel kezelt állatokban a vese iszkémiát megelozoen (T0), illetve azt követoen 2 és 16 órával (T2, T16). VEGF, A T0 értékek %-ban Kontroll Hisztamin Ranitidin *+ *# * 0 2 hours 16 hours T2 T16 Az ábra a VEGF fehérje szintjének a vese iszkémiát követo változásait mutatja a különbözo kezelési csoportok T 2 és a T 16 veséiben (Western blot). Az adatokat átlag ± átlag szórása formájában adtuk meg. A VEGF fehérje szintjei a kiindulási T 0 értékek százalékaiban. * p?0,05 vs. K, + p?0,05 vs. H, p?0,05 vs. T 0, # p?0,05 vs. T A dehidro-epiandrosztendion kezelés hatásának vizsgálata a VEGF szintézisére patkány vese iszkémia/reperfúziós modellben Dehidro-epiandrosztendionnal (DHEA), illetve propilén-glikol (PG; kezelési kontroll) kezelt, ivarérett, hím Wistar patkányok szérum, illetve vesemintáinak elváltozásait vizsgáltuk 2 (T2), illetve 24 (T24) órával az 55 perces vese iszkémiáját követoen. Mutéti kontrollként, áloperált, nem iszkémizált veséju (T 0 ) patkányokat használtunk A patkányok vese iszkémiáját követo túlélése Az állatok 55 perces vese iszkémiáját követoen mind a tizenkét PG kezelt állat meghalt az elso hét során. Tizenegy az iszkémiát követo második napon, míg a további egy 75

76 állat az ötödik napon halt meg. Ezzel szemben a 12 DHEA kezelt állatból 10 túlélte a az iszkémiát követo második napot. Nyolc állat halt meg az iszkémiát követo harmadik napon és ketto túlélte az iszkémiát követo elso hetet. A DHEA kezelt állatok túlélése szignifikánsan hosszabb volt (* p<0,05) (24. ábra). 25. ábra: A DHEA kezelés hatása a Wistar patkányok 55 perces vese iszkémiát követo túlélésére G DHEA DHEA G K PG Túlélés (%) * Ido (napok) A DHEA kezelés hatása a Wistar patkányok 55 perces vese iszkémiát követo egy hetes túlélésére (n=12/kezelési csoport). * p<0,05 vs. PG A patkányok szérum kreatinin és karbamid koncentrációjának változásai A szérum kreatinin, illetve karbamid koncentrációk nem különböztek a két kezelési csoportban. Az 55 perces bal oldali vese iszkémiát követoen a megemelkedett szérum kreatinin és karbamid koncentrációk jelzik a mindkét kezelési csoportban kialakult akut vesekárosodást (8. táblázat). 76

77 8. táblázat: A DHEA, illetve PG kezelt állatok szérum kreatinin és karbamid értékei a vese iszkémiát megelozoen (T 0 ), illetve azt követoen 2 és 24 órával (T 2, T 24 ). Kezelés Mintavételi idopontok T0 T2 T24 Kreatinin (? mol/l) Karbamid (mmol/l) PG 58,8 ± 2,84 99,42 ± 7,48 * 378,60 ± 32,46 * # DHEA 55,50 ± 3,39 94,25 ± 5,95 * 380,33 ± 27,11 * # PG 5,78 ± 0,97 7,82 ± 0,71 35,66 ± 4,57 * # DHEA 5,65 ± 0,56 7,36 ± 0,83 39,62 ± 6,55 * # A táblázat a szérum kreatinin és karbamid szintjeinek változását mutatja a különbözo kezelési csoportokban az 55 perces vese iszkémiát követoen 2 (T 2), illetve 24 (T 24) órával. Az adatokat átlag (tartomány) formájában adtuk meg. * p?0,05 vs. T 0; # p?0,05 vs. T A vesék szövettani elváltozásai A két kezelési csoport vese mintái között nem volt szövettanilag észlelheto különbség. Mindkét kezelési csoport T0 veséinek szövettani vizsgálata ép vesestruktúrát mutatott, glomeruláris, tubuláris vagy intersticiális elváltozás nélkül. Az állatok 55 perces vese iszkémiáját követoen a T2 vesékben a tubuláris epitélsejtek enyhe nekrózisa volt megfigyelheto mindkét kezelési csoportban (tubuláris nekrózis: DHEA kezelt állatok: 1,5 (1-2); PG kezelt állatok: 1,5 (1-2); mindketto p<0,05 vs. T 0 vesék). A T 24 vesékben a kezeléstol függetlenül súlyos fokú tubuláris nekrózis volt jelen (tubuláris nekrózis: DHEA kezelt állatok: 3 (2-3); PG kezelt állatok: 3 (2-3); mindketto p<0,05 vs. T 0 és T 2 vesék). Glomeruláris vagy intersticiális eltérés egyik vizsgált idopontban (T 0, T 2, T 24 ) sem volt jelen a különbözo kezelési csoportokban. 77

78 A DHEA kezelés hatása a szérum DHEA és dehidro-epiandrosztendion-szulfát koncentrációjára A szérum DHEA és dehidro-epiandrosztendion-szulfát (DHEA-S) koncentrációk minden vizsgált idopontban magasabbak voltak a DHEA, mint a PG kezelt állatokban. Az 55 perces vese iszkémiát követoen a szérum DHEA koncentrációja a kiindulási, T 0 értekhez képest emelkedett volt a T 2 és a T 24 PG kezelt állatokban. A DHEA kezelt állatok szérum DHEA koncentrációja a T24 állatokban emelkedett volt a T2 állatokéhoz képest (9. táblázat). A vese iszkémiát követoen a PG kezelt állatok szérum DHEA-S koncentrációja nem változott szignifikáns mértékben a T 0 értekhez képest. A szérum DHEA -S koncentrációja a T0 értekhez képest emelkedett volt a T2 és a T24 DHEA kezelt állatokban. 9. táblázat: A DHEA, illetve a PG kezelt állatok szérum DHEA és DHEA-S értékei a vese iszkémiát megelozoen (T 0 ), illetve azt követoen 2 és 24 órával (T 2, T 24 ). Kezelés Mintavételi idopontok T 0 T 2 T 24 DHEA (nmol/l) DHEA -S (nmol/l) PG 0,89 ± 0,07 1,40 ± 0,24 * 1,25 ± 0,34 * DHEA 49,31 ± 5, ,95 ± 11, ,47 ± 6,87 # + PG 7,50 ± 0,76 8,37 ± 1,08 6,92 ± 1,54 DHEA 107,60 ± 13, ,03 ± 15,23 * + 194,33 ± 24,64 * + A táblázat a szérum DHEA és DHEA-S szintjeinek változását mutat ja a különbözo kezelési csoportokban az 55 perces vese iszkémiát követoen 2 (T 2 ), illetve 24 (T 24 ) órával (RIA). Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk meg. * p?0,05 vs. T 0; # p?0,05 vs. T 2; + p?0,05 vs. PG 78

79 A patkányok VEGF mrns expressziójának változásai a vesében A VEGF mrns expresszióját szemikvantitatív RT-PCR-rel határoztuk meg a DHEA és a PG kezelt állatok T0, T2, illetve T24 veséiben. A VEGF mrns expressziója a PG kezelt csoportban az egész kísérlet alatt változatlan maradt. Bár a DHEA kezelt állatokban az 55 perces vese iszkémiáját követoen fokozódott a VEGF mrns expressziója a T 0 értékhez képest, ez azonban nem érte el a szignifikáns mértéket. Míg a két kezelési csoport T 0 veséink VEGF mrns expressziójában nem volt különbség, addig a DHEA kezelt állatok T 2 és T 24 veséinek VEGF mrns expressziója szignifikánsan magasabb volt, mint a PG kezelteké (25. ábra). 26. ábra: A VEGF mrns expressziójának változása a DHEA és a PG kezelt állatokban a vese iszkémiát megelozoen (T 0 ), illetve azt követoen 2 és 24 órával (T 2, T 24 ). VEGF / GAPDH relatív egységek PG DHEA * * 0 T0 T2 T24 Az ábra a VEGF mrns expressziójának az 55 perces vese iszkémiát követo változásait mutatja a különbözo kezelési csoportok T 2 és a T 24 veséiben (szemikvantitatív RT-PCR). Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk meg. * p<0,05 vs. PG 79

80 A patkányok IL-1? mrns expressziójának változásai a vesében Az IL-1? mrns expresszióját szemikvantitatív RT-PCR-rel határoztuk meg a DHEA és a PG kezelt állatok T0, T2, illetve T24 veséiben. Az IL-1? mrns expresszió mindkét kezelési csoportban az egész kísérlet alatt változatlan maradt. A DHEA kezelt állatok T 0 veséjének IL-1? mrns expressziója szignifikánsan alacsonyabb volt a PG kezeltekénél. A T 0 vesékhez hasonlóan a DHEA kezelt állatok T 2 és T 24 veséinek IL-1? mrns expressziója is alacsonyabb volt a PG kezeltekénél, de a különbség nem volt szignifikáns (26. ábra). 27. ábra: A IL-1? mrns expressziójának változása a DHEA és a PG kezelt állatokban a vese iszkémiát megelozoen (T 0 ), illetve azt követoen 2 és 24 órával (T 2, T 24 ). 3 PG DHEA IL-1b / GAPDH relatív egységek 2 1 * 0 T0 T2 T24 Az ábra az IL-1? mrns expressziójának az 55 perces vese iszkémiát követo változásait mutatja a különbözo kezelési csoportok T 2 és a T 24 veséiben (szemikvantitatív RT-PCR). Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk meg. * p<0,05 vs. PG A patkányok IL-6 mrns expressziójának változásai a vesében Az IL-6 mrns expresszióját szemikvantitatív RT-PCR-rel határoztuk meg a DHEA és a PG kezelt állatok T 0, T 2, illetve T 24 veséiben. 80

81 Az állatok 55 perces vese iszkémiáját követoen az IL-6 mrns expressziója szignifikánsan megemelkedett mindkét kezelési csoport T 2 veséiben, majd a T 24 vesékben visszatért a T0 vesék kiindulási értékéhez. Az IL-6 mrns expressziója a DHEA kezelt állatok T0 és T2 veséiben szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a PG kezelt állatokéban. Az IL-6 mrns expressziójában nem volt különbség a kezelési csoportok között (27. ábra). 28. ábra: A IL-6 mrns expressziójának változása a DHEA és a PG kezelt állatokban a vese iszkémiát megelozoen (T 0 ), illetve azt követoen 2 és 24 órával (T 2, T 24 ). IL-6 / GAPDH relatív egységek PG DHEA * * # 0 T0 T2 T24 Az ábra az IL-6 mrns expressziójának az 55 perces vese iszkémiát követo változásait mutatja a különbözo kezelési csoportok T 2 és a T 24 veséiben (szemikvantitatív RT-PCR). Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk meg. * p<0,05 vs. PG # p<0,05 vs. T 0 és T 24 mindkét kezelési csoportban A patkányok VEGF fehérjeszint változásai a vesében A DHEA és a PG kezelt állatok veséinek VEGF fehérje szintjeit Western blot analízissel határoztuk meg. 81

82 Az állatok 55 perces vese iszkémiáját követoen mindkét kezelési csoportban emelkedett vese VEGF fehérje szintet találtunk (mindkét csoportban a T 2 és T 24 p<0,05 vs. T0). Bár a DHEA kezelt állatok VEGF fehérje szintje minden vizsgált idopontban alacsonyabb volt a PG kezeltekénél. Ez a különbség azonban csak T0 idopontban volt szignifikáns (28. ábra). 29. ábra: A VEGF fehérje szint változása a DHEA és a PG kezelt állatokban a vese iszkémiát megelozoen (T0), illetve azt követoen 2 és 24 órával (T2, T24). VEGF relatív egységek PG DHEA * * 0 T0 T2 T24 Az ábra a VEGF fehérje szintjének az 55 perces vese iszkémiát követo változásait mutatja a különbözo kezelési csoportok T 2 és a T 24 veséiben (Western blot). Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk meg. * P<0,05 vs. m indkét kezelési csoport T 0 ; p<0,05 vs. PG A patkány VEGF izoformák mrns expressziójának real time RT-PCR-fluoreszcens rezonancia energia transzferrel történo kimutatása A hím Wistar patkány vesébol izolált cdns-en állítottuk be a VEGF izoformáinak kimutatására alkalmas real time RT-PCR-fluoreszcens rezonancia energia transzfer (FRET) méréseket. Az alábbi ábrák (30. ábra) az egyes izoformák kimutatásának reprezentatív képeit mutatják. 82

83 Kontrollként minden izoforma kimutatásakor a cdns mintával párhuzamosan, egy pozitív és egy negatív kontroll plazmidot (rekombináns DNS molekulák amelyek tartalmazzák a minden VEGF izoformára, illetve a VEGF 205-ös izoformájára jellemzo DNS szakaszok mellett az VEGF 120-as és a 188-as izoformájára specifikus, illetve a VEGF 144-es és a 164-es izoformájára jellemzo exon-exon határokat (12. ábra)) alkalmaztunk. Ez segített kiküszöbölni az álnegatív, illetve az álpozitív eredményeket A VEGF 120 mrns expressziójának kimutatása. 30. ábra: A VEGF120 mrns expressziója a vesében, illetve a pozitív és a negatív kontroll plazmidokban. Pozitív kontroll cdns Fluoreszcencia (F2/F1) Negatív kontroll Ciklusszám Az ábrán a VEGF 120-as izoforma mrns expressziójának real time RT-PCR-FRET-rel történo kimutatásának egy reprezentatív képe látható. Jól látható, hogy a pozitív kontroll plazmid és a vesébol származó cdns minta a 26., illetve 40. ciklus körül lép az amplifikáció exponenciális fázisába. A negatív kontroll plazmid amplifikációja nem indult meg a real time RT -PCR során. 83

84 A VEGF 144 mrns expressziójának kimutatása 31. ábra: A VEGF 144 mrns expressziója a vesében, illetve a pozitív és a negatív kontroll plazmidokban. cdns Fluoreszcencia (F2/F1) Pozitív kontroll Negatív kontroll Ciklusszám Az ábrán a VEGF 144-es izoforma mrns expressziójának real time RT-PCR-FRET-rel történo kimutatásának egy reprezentatív képe látható. Jól látható, hogy a pozitív kontroll plazmid és a vesébol származó cdns minta a 30., illetve 42. ciklus körüli lép az amplifikáció exponenciális fázisába. A negatív kontroll plazmid amplifikációja nem indult meg a real time RT -PCR során. 84

85 A VEGF 164 mrns expressziójának kimutatása 32. ábra: A VEGF 164 mrns expressziója a vesében, illetve a pozitív és a negatív kontroll plazmidokban. cdns Fluoreszcencia (F2/F1) Pozitív kontroll Negatív kontroll Ciklusszám Az ábrán a VEGF 164-es izoforma mrns expressziójának real time RT-PCR-FRET-rel történo kimutatásának egy reprezentatív képe látható. Jól látható, hogy a pozitív kontroll plazmid és a vesébol származó cdns minta a 34., illetve 42. ciklus körüli lép az amplifikáció exponenciális fázisába. A negatív kontroll plazmid amplifikációja nem indult meg a real time RT -PCR során. 85

86 A VEGF 188 mrns expressziójának kimutatása 33. ábra: A VEGF 188 mrns expressziója a vesében, illetve a pozitív és a negatív kontroll plazmidokban. Pozitív kontroll Fluoreszcencia (F2/F1) cdns Negatív kontroll Ciklusszám Az ábrán a VEGF 188-as izoforma mrns expressziójának real time RT-PCR-FRET-rel történo kimutatásának egy reprezentatív képe látható. Jól látható, hogy a pozitív kontroll plazmid és a vesébol származó cdns minta a 28., illetve 36. ciklus körüli lép az amplifikáció exponenciális fázisába. A negatív kontroll plazmid amplifikációja nem indult meg a real time RT -PCR során. 86

87 A VEGF 205 mrns expressziójának kimutatása 34. ábra: A VEGF 205 mrns expressziója a vesében, illetve a pozitív és a negatív kontroll plazmidokban. Pozitív kontroll Fluoreszcencia (F2/F1) cdns Negatív kontroll Ciklusszám Az ábrán a VEGF 205-es izoforma mrns expressziójának real time RT-PCR-FRET-rel történo kimutatásának egy reprezentatív képe látható. Jól látható, hogy a pozitív kontroll plazmid és a vesébol származó cdns minta a 20., illetve 32. ciklus körüli lép az amplifikáció exponenciális fázisába. A negatív kontroll plazmid amplifikációja nem indult meg a real time RT -PCR során. 87

88 7.5. A VEGF gén promoter polimorfizmusainak és a kis születési súlyú koraszülöttek retinopátiája közti kapcsolat vizsgálata A VEGF promoter régió -460-as lokusz vizsgálatának reprezentatív real time PCR- fluoreszcens rezonancia energia transzfer eredményei A koraszülöttek DNS mintáiban real time PCR-FRET vizsgálattal határoztuk meg a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) T -460 C lokuszának polimorfizmusát (34. ábra). 35. ábra: A VEGF -460 lokuszának real time PCR - fluoreszcens rezonancia energia transzfer vizsgálata. A B Fluoreszcencia d (F2/F1)/dT Fluoreszcencia d (F2/F1)/dT Homérséklet ( C) Homérséklet ( C) Reprezentat ív ábrák a vaszkuláris endot eliális növekedési faktor (VEGF) T -460 C lokuszának polimorfizmus vizsgálatáról. (A) Az ábra VEGF T -460 C lokuszára specifikus, jelzett próbák az olvadáspont-analízis során a DNS templátról bekövetkezo disszociációját mutatja. (B) Az ábra a VEGF T -460 C lokuszára specifikus próbák olvadáspont-analízis függvények második deriváltját ábrázolja. 88

89 A VEGF +405-ös lokusz vizsgálatának reprezentatív PCR-RFLP eredményei A koraszülöttek DNS mintáiban PCR - restrikciós fragment hossz polimorfizmus (RFLP) vizsgálattal határoztuk meg a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) G +405 C lokuszának polimorfizmusát (35. ábra). 36. ábra: A VEGF +405 lokuszának PCR-RFLP vizsgálata M 200 bázis Reprezentatív ábra a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) +405-ös lokuszának polimorfizmus vizsgálatáról. A PCR reakció 197 bázis hosszúságú végtermékét BsmF I restirkciós endonukleázzal emésztettük. Az így kapott hasítási termékek 26, illetve 171 bázis hosszúságúak (a 26 bázis hosszúságú hasítási termék a használt agaróz gél feloldóképessége miatt nem látható) és 6. minta: G allélre homozigóta; 4, minta: C allélre homozigóta; 5. és 7. minta: CG heterozigóta. M = DNS marker A VEGF -460-as, illetve +405-ös lokuszának allél, illetve genotípus frekvenciái A VEGF -460-as, illetve +405-ös lokuszának allél, illetve genotípus frekvenciáját a 10. táblázatban foglaltuk össze. 89

90 10. táblázat: A VEGF genetikai polimorpfizmusainak allél és genotípus prevalenciája a ROP fokozott kockázata miatt krioterápiával vagy fotokoagulációval kezelt, illetve nem kezelt kis születési súlyú koraszülöttekben. ROP miatt krioterápiával v. fotokoagulációval nem kezelt kis születési súlyú koraszülöttek ROP miatt krioterápiával, v. fotokoagulációval kezelt kis születési súlyú koraszülöttek VEGF T -460 C genotípus A VEGF -460 C allél frekvenciáját (%) A VEGF T -460 C genotípus 49,5 41 TT TC CC TT TC CC frekvenciáját (%) VEGF G +405 C genotípus A VEGF +405 C allél frekvenciáját (%) A VE GF G +405 C genotípus 30 41* GG GC CC GG GC CC frekvenciáját (%) ** A VEGF genetikai polimorpfizmusainak allél és genotípus prevalenciája a ROP fokozott kockázata miatt kezelt, illetve nem kezelt kis születési súlyú koraszülöttekben. A VEGF +405 C allél hordozók nemre, az oxigénterápia idotartalmára és a gesztációs korra adjusztált odds aránya * [95% CI]: 2,00 [1,02-3,92], p=0,045; a VEGF C +405 C genotípusnak a nemre, az oxigénterápia idotartalmára és a gesztációs korra adjusztált odds aránya ** [95% CI]: 3,37 ([1,17-9,65], p=0, A kis születési súlyú koraszülöttek haplotípus megoszlása A vizsgált 110 kontroll, illetve a 64 ROP-os kis születési súlyú koraszülött haplotípus megoszlását a 11. táblázat mutatja be. 90

91 11. táblázat: A VEGF polimorfizmus-haplotípusok megoszlása a ROP miatt krioterápiával, illetve fotokoagulációval kezelt, illetve nem kezelt kis születési súlyú koraszülöttekben. VEGF T -460 C/ G +405 C haplotípus ROP miatt krioterápiával v. fotokoagulációval nem kezelt kis születési súlyú koraszülöttek (%) (n=115) ROP miatt krioterápiával, v. fotokoagulációval kezelt kis születési súlyú koraszülöttek (%) (n=86) -460 CC/ +405 GG CC/ +405 GC CC/ +405 CC TC/ +405 GG TC/ +405 GC TC/ +405 CC TT/ +405 GG TT/ +405 GC TT/ +405 CC 1 15** A VEGF T C és G +405 C polimorfizmusainak haplotipusai a ROP miatt krioterápiávalvagy fotokoagulációval kezelt, illetve nem kezelt kis születési súlyú koraszülöttekben. Az adatokat a vizsgált betegek százalékában adtuk meg. A nemre, az oxigénterápia hosszára és a gesztációs korra adjusztált odds arányok * [95% CI]: 16,2 [1,96-134], p=0,01, illetve + [95% CI]: 0,25 [0,06 1,10], p=0,067 91

92 8. EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE, KÖVETKEZTETÉSEK 8.1. A patkányvesék iszkémia/reperfúziós károsodása során a VEGF szintézisében bekövetkezo változások megbeszélése Az irodalmi adatok alapján minden eddig megvizsgált in vitro, illetve in vivo rendszerben a hipoxiás, illetve iszkémiás károsodást követoen fokozódott a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) mrns expressziója, illetve fehérje szintje [5, 21, ]. Ezek alapján a vesében is hasonló, a VEGF szintézisének fokozódása lenne várható az iszkémiás inzultust követoen. Ennek ellenére az utóbbi években több olyan közlemény is megjelent, ami a VEGF szintézis változásának teljes hiányáról számol be a posztiszkémiás vesében, mind mrns mind, pedig fehérje szinten [ ]. Ezekben a kísérletekben Kanellis és munkatársai 40 perces vese iszkémiát követoen vizsgálták a reperfúzió elso 80 percében mutatkozó molekuláris biológiai (a VEGF mrns és fehérje szintézis változásait, illetve a VEGF szöveti lokalizációját) elváltozásokat [133, 134]. Az állatmodell és a vizsgálatok némi módosításával mi ugyanezeket a paramétereket vizsgálatuk. Saját kísérletünk során, mind az alkalmazott vese iszkémia idotartalmát (40 perc vs. 55 perc) mind, pedig a vizsgált posztiszkémiás idoperiódust (80 perc vs. 24 óra) megnyújtottuk. Ez utóbbit azért tartottuk fontosnak, mert ritka, hogy egy fehérje szintjében olyan rövid ido alatt, mint 80 perc, változás következzen be. Eredményeink részben megegyeznek Kanellis és munkatársai által a posztiszkémiás vesében találtakkal [133]. Bár a mi RT-PCR rendszerünk (a VEGF izoformák összességében bekövetkezo változástok együttes detektálása) különbözött a Kanellis és munkatársai által használttól (az egyes VEGF izoformákban külön-külön bekövetkezo változások detektálása) mi sem találtunk változást a posztiszkémiás vese VEGF mrns expressziójában. Ugyanakkor fokozott VEGF fehérje szintézist találtunk már a reperfúzió második órájában. Ez a fokozott VEGF fehérje szint még 24 órával az iszkémiás periódust követoen is jól detektálható volt. A Kanellis és munkatársai, illetve az általunk végzett kísérlet megfigyelései közti különbség elsosorban a felhasznált állatmodell különbségeivel, az iszkémiás ido és a vizsgált posztiszkémiás periódus eltéro hosszával magyarázható. 92

93 A posztiszkémiás vesében a VEGF fehérje szintjének fokozódása az mrns expresszió változásának hiánya mellett a poszt-transzkripciós szabályozás fontosságára hívja fel a figyelmet. In vitro a VEGF szintézisének szabályozása kapcsán több, a mi eredményeinket, alátámasztó mechanizmust is leírtak. Kimutatták, hogy a hipoxia, más AU gazdag 3 UTR-rel rendelkezo mrns-ekhez hasonlóan, stabilizálja a VEGF mrns-ét [32]. Ebben a folyamatban az RNS-köto fehérje, a HuR szerepét valószínusítik [33]. A hipoxia során stabilizálódó VEGF mrns féléletideje többszörösére no meg (40 perc vs. 180 perc ) [34]. A stabilizált, hosszabb féléletideju mrns pedig nyilvánvalóan kedvezo a transzláció szempontjából. Mindemellett a VEGF mrns 5 UTR-jén található egy, a transzláció elindításáért felelos szakasz (IRES), ami hipoxiás körülmények között is, amikor más fehérjék szintézise csökken, elosegíti a VEGF fehérje szintézisét [17]. Feltételezésünk szerint tehát a vese sem kivétel és más szervekhez hasonlóan a posztiszkémiás vesében is fokozódik a VEGF szintézise [ ]. Ugyanakkor a ves e VEGF szintézise, minden eddig ismert más szervtol eltéroen, elsosorban poszt -transzkripcionálisan szabályozott. A VEGF szintézisét a hipoxián kívül számos más tényezo is befolyásolja. Számos, az I/R okozta akut vesekárosodás patomechanizmusában is résztvevo citokinrol kimutatták, hogy fokozza a VEGF szintézisét [36, 37, 38]. Modellünkben a VEGF fehérje szintézisének fokozódásával párhuzamosan az interleukin 6 (IL-6) szintézisének gyors fokozódását mutattuk ki a posztiszkémiás vesében. Bár a vesében nem ismert a hipoxia indukált IL-6 szintézis mechanizmusa, a folyamatban feltételezhetjük a nukleáris faktor IL-6 szerepét (NF IL-6). Hipoxia hatására az NF IL-6 az IL-6 promoteréhez kötve fokozza a gén transzkripcióját in vitro [164, 165]. Az IL-6, illetve a VEGF szintézisének párhuzamos változásai a posztiszkémiás vesében az irodalmi adatokkal [37, 38] összhangban felveti a lehetoségét annak, hogy a két citokin szintézise valamilyen módon kapcsolódik egymáshoz a vesében. Ezt a hipotézist támasztja alá az a megfigyelés miszerint az IL-6 hatására foszforilálódik az eukarióta iniciációs factor-4e [166], ami fontos szerepet tölt be a VEGF transzlációjában [167]. Mindezeken túl, az IL-6 fokozza az IRES függo traszláció hatékonyságát [166], amely egyúttal fontos eleme a VEGF hipoxiás körülmények közti transzlációjának is [168]. 93

94 A VEGF szöveti lokalizációjára irányuló immunhisztológiai vizsgálataink fokozott VEGF jelenlétet mutattak a vese kéreg-velo határán, mind a kontroll mind, pedig a posztiszkémiás vesékben. Bá r a VEGF vese kéreg-velo határán lévo fokozott jelenlétének a jelentosége nem ismert, a vese ezen régiója speciális az oxigén ellátottság és az energiafelhasználás szempontjából. A parciális oxigénnyomás még a nem hipoxiás körülmények között is alacsony, az energiafelhasználás pedig magas a vese kéreg-velo határán [169, 170]. Az állandóan alacsony parciális oxigénnyomás és az oxigénigényes folyamatok együttes jelenléte magyarázhatja a fokozott VEGF szintézist a vese kéreg-velo határán. A posztiszkémiás vese tubuláris epitélsejtekben talált átmeneti bazolaterális VEGF akkumulációt Kanellis és munkatársai a VEGF aktív szecernálásával magyarázzák [133]. A saját kísérleti modellünkben is hasonló átmeneti bazolaterális VEGF immunreaktivitás volt megfigyelheto a vese tubuláris epitélsejtjeiben. Jól ismert azonban, hogy az iszkémiás károsodásra a vese tubuláris epitélsejtjei nagyon érzékenyek. Iszkémia hatására alapvetoen megváltozik a vese tubuláris epitélsejtek szerkezete [171]. Az iszkémiás károsodást követoen a VEGF-éhez hasonló, intracelluláris megoszlást mutattak ki más citoszkeletális [172] és nem citoszkeletális [173] fehérjék kapcsán is a vese tubuláris epitélsejtjeiben. Mindezek mellett a mintáink hematoxilin eozin festése is hasonló bazolaterális fehérje akkumulációt mutatott a posztiszkémiás vese tubulusok epitélsejtjeiben. Ezért szemben Kanellis és munkatársaival, mi úgy gondoljuk, hogy a VEGF fokozott jelenléte a T 2 vesék tubuláris epitélsejtjeinek bazolaterális oldalán sokkal inkább a posztiszkémiás sejtkárosodás, mintsem a VEGF aktív szecernálásának következménye. Eredményeinket összefoglalva megállapíthatjuk, hogy a változatlan VEGF mrns expresszió ellenére a VEGF fehérje szintézise fokozott a posztiszkémiás vesében. Adataink ellentétben a más szervek kapcsán tapasztaltakkal - a VEGF szintézis a poszt-transzkripciós szintu szabályozásnak a fontosságára utalnak a posztiszkémiás vesében. A fokozott IL-6 szintézis az in vitro irodalmi adatoknakkal összhangban, szerepet játszhat a VEGF szintézisének szabályzásában. 94

95 8.2. A hisztamin és a hisztamin kettes receptor antagonista ranitidin kezelésnek a posztiszkémiás patkányvese VEGF szintézisére gyakorolt hatásának megbeszélése Adataink demonstrálják, hogy a hisztamin kettes receptorán (HR2) keresztül szerepet játszik a vese akut I/R károsodásának patomechanizmusában. A hisztamin kezelés rontotta az állatok vese iszkémiát követo túlélését és fokozta a vese tubuláris epitélsejtek károsodását. Ezzel szemben az állatok HR2 antagonista ranitidin kezelése javította a vese iszkémiát követo túlélést. Ezekben a folyamatokban szerepe lehet a vese I/R károsodás során fokozódó VEGF szintézisnek is. A hisztamin számos ponton befolyásolja a vese iszkémiás károsodását. A hisztamin aktiválja a fehérvérsejteket [174], a trombocitákat [175] és fokozza az erek permeabilitását [139]. A kombinált hisztamin egyes receptor és HR2 antagonista kezelés csökkenti a vese posztiszkémiás károsodás át [136]. Kísérletünk során a HR2 antagonista ranitidin kezelés javította az állataink vese iszkémiát követo túlélését. Eredményeinkhez hasonlóan a ranitidin jótékony hatását figyelték meg patkányok máj iszkémiáját követoen is. A ranitidin kezelés csökkenti a májsejtek TNF? termelést és a neutrofil granulociták aktiválódását és a [176]. Állataink hisztamin kezelése szignifikáns mértékben megemelte a szérum hisztamin szintjét. Két órával a vese iszkémiát követoen mind a kontroll mind, pedig a hisztaminnal kezelt állatokban lecsökkent a szérum hisztamin szintje, majd 16 órával a vese iszkémiát követoen visszatért a kiindulási értékre. A korábbi vizsgálatok adatai a szérum hisztaminszint iszkémiás károsodást követo változásairól ellentmondásosak. A súlyos vese [136], illetve bél iszkémiát [177] követoen korai, 15 perccel az iszkémiát követoen jelentkezo szérum hisztaminszint növekedés tapasztalható, ugyanakkor az iszkémia idotartalmával arányosan csökkeno hisztaminszintrol számoltak be a bél mukózájában. A mukóza csökkent hisztaminszintjét a hízósejtek iszkémiát követo degranulációja okozta [178]. Az általunk megfigyelt vese iszkémiát követo átmeneti szérum hisztaminszint csökkenést szintén magyarázhatja a hisztamin korai, posztiszkémiás degranulációja, illetve fokozott metabolizmusa. Ezt azonban késobb, feltehetoen a hisztamin újbóli szintézise visszaállítja a kiindulási értékre. Érdekes módon a ranitidinnel kezelt állatok szérum hisztaminszintje nem mutat a konroll vagy a hisztaminnal, kezelt állatokhoz hasonló posztiszkémiás ingadozást jelezve, hogy a ranitidin valamilyen módon befolyásolja a hisztamin metabolizmusát. 95

96 Kísérletünkben, a hisztamin, illetve a ranitidin kezelésnek az IL-6 és a VEGF szintézisére kifejtett hatását vizsgáltuk a vese I/R károsodása kapcsán. Számos adat szól amellett, hogy in vitro az IL-6 és a VEGF befolyásolják egymás szintézisét [37, 38]. Ezek a citokinek fontos szabályzói az endotélsejtek funkcióinak [6, 10], így hatással lehetnek a vese mikrocirkulációra is. Két órával a vese iszkémiát követoen az IL-6 mrns expressziója mindhárom kezelési csoportban fokozódott. A korábbi irodalmi adatokkal megegyezoen a posztiszkémiás vesében a hisztamin kezelés tovább fokozta az IL-6 amúgy is fokozott mrns expresszióját [179]. Ezzel ellentétben tizenhat órával az iszkémiát követoen a ranitidin kezelés szignifikánsan csökkentette az IL-6 mrns expresszióját, megerosítve a hisztamin és HR2 szerepét az IL-6 szintézisének szabályozásában. A VEGF mrns expressziója számos, ha nem minden szervben fokozódik az iszkémiás inzultust követoen [ ]. Ennek ellenére, mint ahogyan ezt saját adataink (kontroll vesék) is alátámasztják, a közelmúltban több cikk is beszámol arról, hogy a VEGF mrns expressziója nem változik a posztiszkémiás vesében [133, 134]. Ugyanakkor a hisztamin kezelt állatok posztiszkémiás veséiben fokozott VEGF mrns expressziót találtuk. Korábban Ghosh és munkatársai kimutatták, hogy a hisztamin a HR2-n keresztül befolyásolja a VEGF szintézisét [180]. A HR2 szerepére hívja fel a figyelmet, hogy az állatok HR2 antagonista ranitidin kezelése csökkentette a VEGF mrns expresszióját. Érdekes módon a változatlan mrns expresszió ellenére, fokozott VEGF fehérje szintet találtunk a kontroll állatok posztiszkémiás veséiben. Ez látszólag ellentmondásban van a korábban Kanellis és munkatársai által a posztiszkémiás vesében leírt változásokkal. Kanellis és munkatársai ugyanis a vese iszkémiás inzultusát követoen a VEGF de novo szintézisének tejes hiányáról számoltak be [133, 134]. Bár az általunk és Kanellis és munkatársai által használt kísérleti modell számos ponton, mint az iszkémia idotartalma (50 vs. 40 perc) és kivitelezése (termokontrolált vs. nem termokontrolált), a használt patkány törzs (Wistar vs. Sprague-Dawley), eltér egymástól a VEGF fehérje szintjében talált különbség legvalószínubb oka, mégis a mintavétel ideje (az iszkémiás periódus után 2, 24 óra vs. 0, 20, 40, 80 perc) [133]. 96

97 A ranitidinnel kezelt állatokban a 16 órával a vese iszkémiát követoen talált csökkent VEGF mrns expresszió ellenére is gyorsan fokozódó VEGF fehérje szintet találtunk a posztiszkémiás vesékben, aminek része lehet az állatok jobb túlélésében is. A kontroll és ranitidinnel kezelt állatokban a változatlan, illetve csökkent VEGF mrns expresszió ellenére kimutatott fokozott VEGF fehérje szint a poszt-transzkripciós szabályozás jelentoségére hívja fel a figyelmet az iszkemizált vesében. Ennek lehetoségét több mechanizmus is alátámasztja. A hipoxia, egy RNS-köto fehérjén, a HuR-on keresztül stabilizálja a VEGF mrns-ét [32, 33], ami kedvezo a VEGF transzlációja szempontjából. Mindemellett a VEGF mrns-ének egy, a transzláció elindításáért felelos szakasza (IRES) biztosítja a hipoxiás körülmények ellenére is a fokozott VEGF szintézist [17]. Feltételezésünk szerint tehát a vese VEGF szintézise, minden eddig ismert más szervtol eltéroen, elsosorban poszt-transzkripc ionálisan szabályozott. A hisztaminnal kezelt állatokban talált fokozott VEGF fehérje szint hátterében, ellentétben a kontroll és a ranitidinnel kezelt állatokkal, a fokozott VEGF mrns expressziónak is szerepe lehet. Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy a hisztamin kettes receptorán keresztül fontos szabályzója a posztiszkémiás vesék károsodásának. A hisztamin fokozta, míg a szelektív HR2 antagonista ranitidin enyhítette a vese I/R károsodásának következményeit. A hisztamin fokozta mind az IL-6, mind a VEGF mrns expresszióját. A ranitidin kezelés csökkentette az IL-6 mrns expresszióját és fokozta a VEGF fehérje szint emelkedését, ami meghatározó eleme lehet a az állatok jobb túlélésének A dehidro-epiandrosztendion kezelésnek a posztiszkémiás patkányvese VEGF szintézisére gyakorolt hatásának megbeszélése Ismert a dehidro-epiandrosztendion (DHEA) kezelés jótékony hatása a szív [151], illetve az agy [152] I/R károsodása kapcsán, kevés azonban az irodalmi adat a DHEA kezelés hatásáról a vese I/R károsodása kapcsán [153]. Mi a rövid távú DHEA kezelés vese iszkémiát követo túlélésére és a vesében lezajló molekuláris biológiai változásokra gyakorolt hatásait vizsgáltuk. 97

98 Vizsgálataink során nem találtunk különbséget sem a DHEA kezelt és a kontroll (PG kezelt) állatok szérum kreatinin, illetve karbamid szintjének posztiszkémiás változásaiban sem a vese hisztopatológiai elváltozásaiban. Ugyanakkor a DHEA kezelés, ugyan mérsékelten, de javította az állatok vese iszkémiáját követo túlélését. Eredményeink részben megegyeznek Arango és munkatársai által a posztiszkémiás vesén megfigyelteknek [153]. Arango és munkatársai a hosszú távú DHEA elokezelés hatásait vizsgálva azt találták, hogy a DHEA elokezelés javítja a posztiszkémiás vese funkcióját és csökkenti a vese szövettani elváltozásainak mértékét. Adataink a DHEA kezelésnek a vese I/R károsodása során (más szervek I/R károsodásához hasonlóan) kifejtett jótékony hatására hívják fel a figyelmet. A DHEA kezelés vese I/R károsodásra kifejtett jótékony hatásában szerepe lehet a DHEA jól ismert antioxidáns hatásának. Arango és munkatársai a kontroll állatok posztiszkémiás veséjéhez képest kevesebb reaktív oxigén, illetve nitrogén gyököt találtak a DHEA elokezelt állatok posztiszkémiás veséiben [152]. A DHEA antioxidáns hatása mellett, azonban jól ismert a DHEA kezelés különbözo citokinek szintézis ét befolyásoló [181, 182], valamint a szöveti mikrocirkulációt ért hipoxiás károsodástól való védo hatása [149, 150] is. A vese iszkémiás károsodásának patomechanizmusában is fontos szerepe van a hemodinamikai változásoknak. A vese keringésének iszkémiát követo csökkenése fenntartja, illetve fokozza a vese tubuláris epitélsejtjeinek károsodását [127, 128]. Nem kizárt tehát, hogy a DHEA kezelésnek a különbözo szervek iszkémiás károsodása kapcsán megfigyelt jótékony hatása a szövetek mikrocirkulációjára kifejtett hatásán keresztül valósul meg. Kísérletünkben, a DHEA kezelésnek a VEGF, IL-1? és IL-6 szintézisére kifejtett hatását vizsgáltuk a vese I/R károsodása kapcsán. Ezek a citokinek fontos szabályzói az endotélsejt funkcióknak [6, 10], az apoptózisnak [11, 183] és a gyulladásnak [184], valamint befolyásolják a szervek mikrocirkulációját is [6, 185,186]. Ezért feltételeztük szerepüket a DHEA kezelés vese károsodására kifejtett hatásának közvetítésében. Kísérletünkben a nem iszkémizált, T 0 vesék VEGF mrns expressziója nem különbözött a DHEA kezelt és a kontroll állatokban. Ugyanakkor a VEGF fehérje szintje szignifikánsan alacsonyabb volt a DHEA kezelt állatok T 0 veséiben, mint a kontroll állatokéiban. A VEGF fehérjeszintjéhez hasonlóan az IL-1??és az IL-6 mrns expressziója szintén alacsonyabb volt a DHEA kezelt állatok T0 veséiben. 98

99 Az irodalomból ismert a VEGF az IL-1??és az IL-6 szintézise közötti kapcsolat in vitro. Az IL-1??[36] és az IL-6 [37, 38] fokozott szintézise együtt jár a VEGF fokozott szintézisével. Ugyanakkor az irodalomból nem ismert az alacsony IL-1?? illetve IL-6 szint és a VEGF szint kapcsolata. Kísérleti adataink szerint az állatok DHEA kezelése egyaránt csökkenti a vese VEGF, IL-1?? valamint IL-6 szintézisét. Ez az általunk vizsgált citokinek szintézise közötti in vivo is meglévo kapcsolatra utal. A posztiszkémiás vesékben változatlan VEGF mrns expressziót és fokozott fehérjeszintet mértünk mindkét kezelési csoportban. A DHEA kezelés hatására azonban a VEGF mrns expresszió, bár nem szignifikáns mértékben, de fokozódott. Ugyanakkor kontroll állatokéhoz képest a DHEA kezelt állatok VEGF fehérje szintje az IL-1? és IL-6 mrns expressziójával párhuzamosan csökkent a posztiszkémiás vesében. Ezek a mérési eredményeink tovább erosítik korábbi megfigyeléseinket, melyek szerint a posztiszkémiás vesében a VEGF szintézise elsosorban poszt-transzkripcionálisan szabályozott folyamat. Több olyan mechanizmus is ismert, amely elosegíti a VEGF fehérje szintézisét, akár hipoxiás körülmények között is, amikor más fehérjék szintézise alapvetoen csökkent. Maga a hipoxia/iszkémia stabilizálja a VEGF mrns-ét [34]. Ez részben, a VEGF mrns-ének 3 UTR-ján található AU gazdag régiókhoz kötodo RNS-kötofehérjén, a HuR -on keresztül valósul meg [32]. Ezen kívül a VEGF mrns-ének 5 UTR-jén elhelyezkedo IRES is elosegíti a VEGF fehérjeszintézisét [17]. A magasabb VEGF mrns expresszió ellenére a VEGF fehérje szintje kevésbé fokozódik a DHEA kezelt állatok veséiben, mint a kontroll állatok esetében. Az elobbiekben felsorolt mechanizmusok nem magyarázzák a DHEA kezelés VEGF mrns és fehérje szintézisére gyakorolt ellentétes hatását. Ugyan nem zárható ki, hogy a DHEA kezelés ellentétes hatása csak látszólagos és a fokozott VEGF mrns expresszió hatása a fehérje szintézisre csak egy késobbi, általunk már nem vizsgált idopontban nyilvánul meg. Ez azonban nem túl valószínu, mivel a jelen modellben a VEGF transzlációs ideje 1-2 óra és a már fokozott fehérjeszint tartósan fennmarad. Így nem valószínu, hogy az iszkémiát követo 2. órában talált fokozott VEGF mrns expresszió több, mint 24 órával az iszkémiát követoen érzékeltetné hatását. Fontos megállapítanunk, hogy a nem iszkémizált vesékhez hasonlóan a posztiszkémiás vesékre is jellemzo, hogy a VEGF fehérje szintjével párhuzamosan változik 99

100 az IL-1? és az IL-6 mrns expressziója a DHEA kezelt állatokban. Ez tovább erosíti azt a megállapításunkat, hogy ezeknek a citokineknek a szabályozása szoros kapcsolatban áll egymással. Eredményeinket összefoglalva megállapítjuk, hogy az állataink DHEA kezelése a vese csökkent VEGF fehérje, illetve IL-1? és IL-6 mrns expresszióhoz vezet mind a nem iszkémizált mind, pedig az iszkémizált vesékben. Adataink a korábbi in vitro eredményekkel összhangban a vizsgált citokinek (VEGF, IL-1? IL-6) szintézisének szoros kapcsolatára utalnak. DHEA kezelés túlélésre kifejtett hatása feltevésünk szerint kettos: egyrészt az irodalomból ismert antioxidáns hatása révén kedvezo lehet, másrészt a vese mikrocirkulációja szempontjából jótékony hatású VEGF szintjének csökkentése révén kedvezotlen a túlélés szempontjából. Ez részben magyarázhatja a DHEA kezelésnek az állatok túlélésére gyakorolt mérsékelten kedvezo hatását. 100

101 8.4. A patkány VEGF izoformák detektálására kialakított real time RT-PCRfluoreszcens rezonancia energia transzfer rendszer eredményeink megbeszélése Sikerült kifejlesztenünk egy olyan real time RT-PCR- fluoreszcens rezonancia energia transzfer (FRET) rendszert, amely alkalmas a különbözo patkány VEGF izoformák egymástól elkülönült, mrns szintu detektálására. A korábbiakban a VEGF detektálására két különbözo stratégia állt rendelkezésre. Az egyik esetben a primerek mindegyike a VEGF elso öt exonjának (a VEGF elso öt exonja minden izoformában jelen van) egy-egy szakaszával komplementer [187]. Az ezekkel a primerekkel végzet PCR a VEGF összes izoformájában együttesen bekövetkezo mrns expresszió változásról ad felvilágosítást. Ennek a rendszernek az a hátránya, hogy a különbözo VEGF izoformák mrns expressziója összemosódik. A másik stratégia során az egyik primer a VEGF elso öt exonjának valamelyikével a másik primer pedig, a VEGF nyolcas exonnjával komplementer (az elso öt és a nyolcas exon minden izoformában jelen van) [133]. Ebben az esetben egy PCR reakció során, elvileg a mintában lévo összes izoforma detektálásra kerül és azok az agaróz gélben való futtatás során hosszuk alapján elkülöníthetok egymástól. Ebben a rendszerben azonban az egyes izoformák között kompetició van, az egyes izoformák gátolhatják egymás amplifikációját a PCR során. Ezért ez a rendszer nem alkalmas a különbözo minták közötti mennyiségi összehasonlításra. Az általunk fejlesztet rendszerben az egyik primer a VEGF elso öt exonjának valamelyikével, míg a másik primer az egyes izoformákra specifikus exon-exon határokkal komplementer. Ez a rendszer alkalmas a VEGF izoformáinak egymástól teljesen független detektálására. Rendszerünk kiküszöböli a korábbi mérési stratégiák hibáit, alkalmas a VEGF izoformáinak tényleges mennyiségét meghatározni a különbözo szövetekben. Mindez lehetové teszi, hogy a különbözo kísérleti rendszerekben külön-külön vizsgáljuk meg az egyes VEGF izoformák mennyiségét, egymáshoz viszonyított arányát. Így vizsgálhatóvá váltak az egyes izoformák közti tényleges biológiai különbségek. Méréseink során sikerült kimutatni egy új patkány VEGF izoformát, a már ismert humán 206-os VEGF izoforma megfelelojét. A molekula teljes jellemzéséhez azonban hátra van a teljes patkány VEGF 205-ös izoforma cdns könyvtárból való izolálása, a molekula klónozása és szekvenálása. E nélkül csak abban lehetünk biztosak, hogy a humán VEGF 6b 101

102 exonhoz hasonlóan a patkányok ezzel homológ intronikus szakasza is kódoló szakasszá válik gén alternatív splicingja során A VEGF promoter polimorfizmus ainak és a kis születési súlyú koraszülöttek retinopátia kockázatának megbeszélése A VEGF +405 C allélja, valamint a -460 TT/ +405 CC haplotípus elofordulása szignifikánsan gyakoribb volt a krioterápiát vagy fotokoagulációs kezelést igénylo retinopátiában szenvedo kis születési súlyú koraszülöttekben (VLBW). Ez függetlennek bizonyult a koraszülötteknél alkalmazott oxigénterápiától és a születési kortól egyaránt, melyek a ROP jól ismert rizikótényezoi [156]. Adataink a vizsgált VEGF polimorfizmusoknak a kis születési súlyú koraszütöttek retinopátiájának kialakulásában betöltött szerepére utalnak. Eredményeinkkel összhangban, a diabéteszes retinopátia kapcsán - melynek patomechanizmusa hasonlít a ROP-éhoz - is leírták a +405 C allél fokozott elofordulási gyakoriságát [159]. Továbbá a diabéteszes retinopátiások haplotípus analízise is felhívta a figyelmet a VEGF T -460 C és a VEGF G +405 C SNP-k jelentoségére. Irodalmi adatok utalnak arra, hogy a különbözo VEGF genotípusok és a ROP rizikója közötti kapcsolatot a gentípusnak a VEGF szintézisére kifejtett hatásai teremtik meg. Atawa és munkatársai a homozigóta VEGF +405 C allélt hordozók szérumát vizsgálva fokozott VEGF szintet igazoltak [159]. Watson és munkatársai ugyanakkor alacsonyabb VEGF szinteket találtak a homozigóta VEGF +405 C allél hordozók LPS-sel indukált fehérvérsejtjeinek felülúszójában [158]. A két cikk közti különbséget a felhasznált modell és a metodikai különbségek magyarázhatják. Adataink alapján az sem zárható ki, hogy a ROP rizikója független a VEGF T -460 C és a VEGF G +405 C SNP-knek a VEGF szintézisét befolyásoló hatásaitól. Nem szabad ugyanis megfeledkeznünk arról sem, hogy a VEGF génhez szoros közelségben számos más a ROP patomechanizmusában esetleg szintén szerepet játszó gén (EGE-R, FGF-R, HSP72) is van. Eredményeink nem zárják ki, hogy más géneknek az általunk vizsgált SNP-kel való kapcsolt öröklodése az eredményeink hátterében lévo valódi ok. Mindazonáltal adataink arra utalnak, hogy a VEGF G +405 C és T -460 C SNP-k vizsgálata hasznos információt ad a kis születési súlyú koraszülöttek ROP rizikójának becslésére. 102

103 9. EREDMÉNYEK ÖSSZEGZÉSE Vizsgálataink eredményeit a célkituzések címu fejezetnek ( ) megfeleloen az alábbiakban összegezzük A VEGF szintézisének vizsgálata vese iszkémia/reperfúziós patkánymodellben 1. A vese I/R patkánymodellünkben változatlan VEGF mrns expresszió mellett fokozott VEGF fehérje szintet találtunk a posztiszkémiás vesékben. Adataink a VEGF szintézis ének poszt-transzkripciós szintu szabályzására utalnak az iszkémizált vesében. 2. Fokozott VEGF immunoreaktivitást találtunk a vese kéreg-velo határán. Mivel a VEGF szintézis legerosebb induktora a hipoxia, a vese kéreg-velo határának alacsony parciális oxigénnyomása és magas energiafelhasználása magyarázhatja a fokozott VEGF immunopozitivitását. A nem iszkemizált, kontroll vesék tubuláris epitélsejtjeiben a VEGF immunreaktivitás diffúzan, az egész citoplazmára kiterjedoen jelen volt. A posztiszkémiás vesében a VEGF immunoreaktivitás, átmeneti bazolaterális elmozdulását figyeltük meg a T 2 vesék tubuláris epitélsejtjeiben. Mivel a vese hematoxilin-eozin festése is hasonló képet mutatott, a VEGF immunoreaktivitás bazolaterális elmozdulását a posztiszkémiás sejtkárosodás nem specifikus jelének tart juk. 3. Az interleukin 6 (IL-6) mrns expressziója, illetve a VEGF fehérje szintje párhuzamosan fokozódott a posztiszkémiás vesékben. Ez az irodalommal összhangban a két citokin szintézisének szoros kapcsolatára utal A hisztamin és a hisztamin kettes receptor antagonista ranitidin kezelés hatásának vizsgálata a VEGF szintézisére vese iszkémia/reperfúziós patkánymodellben 4. Az állatok hisztamin kezelés e rontotta, míg a hisztamin kettes receptor antagonista ranitidin kezelése javította a vese iszkémiát követo túlélést. 103

104 5. A kontroll állatokban a vese VEGF mrns expressziója a kísérlet alatt nem változott. A hisztamin kezelt állatok posztiszkémiás veséiben a VEGF mrns expressziója fokozódott. A ranitidin kezelt állatok VEGF mrns expressziója tizenhat órával a vese iszkémiát követoen a kiindulási értékhez képest csökkent. Az IL-6 mrns expressziója egyik kezelési csoportban sem volt detektálható a vese iszkémiát megelozoen. Két órával a vese iszkémiát követoen az IL-6 mrns expressziója minden csoportban megemelkedett, a legmagasabb értéket a hisztamin kezelt állatokban érte el. Tizenhat órával a vese iszkémiát követoen a ranitidin kezelt állatok IL-6 mrns expressziója volt a legalacsonyabb, de minden csoportban csökkent a T 2 értékekhez képest. 6. Fokozott VEGF fehérje szintet találtunk minden kezelési csoport posztiszkémiás veséiben. A ranitidinnel kezelt állatokban volt a legdinamikusabb VEGF szintézisének fokozódás a. Adataink demonstrálják, hogy a hisztamin kettes receptorán keresztül szerepet játszik a vese akut I/R károsodásának mechanizmusában. Ezekben a folyamatokban szerepe lehet a vese I/R károsodás során fokozódó VEGF szintézisnek is A dehidro-epiandrosztendion kezelés hatásának vizsgálata a VEGF szintézisére vese iszkémia/reperfúziós patkánymodellben 7. DHEA kezelés javította az állatok vese iszkémiáját követo túlélését. Eredményeink összhangban vannak mások vese I/R modellben kapott eredményeivel. 8. Kísérletünk során a DHEA kezelés fokozta a posztiszkémiás vesék VEGF mrns expresszióját, ugyanakkor minden idopontban csökkentette az IL-1??és az IL-6 mrns expresszióját. 9. Bár a posztiszkémiás vesékben, mindkét csoportban fokozott VEGF fehérjeszintet találtunk a DHEA kezelés minden idopontban csökkentette a vesék VEGF szint emelkedésének mértékét. A DHEA kezelés túlélésre kifejtett hatása feltevésünk szerint kettos: egyrészt antioxidáns hatása révén kedvezo, másrészt a vese mikrocirkulációja szempontjából jótékony hatású VEGF szintjének relatív csökkentése révén kedvezotlen a túlélés szempontjából. 104

105 9.4. A patk ány VEGF izoformáinak mrns szintu kimutatása 10. Készítettünk két olyan rekombináns DNS molekulát, amelyeket kontrollként használva sikerült kialakítani egy, a különbözo VEGF izoformákra specifikus real time PCR-fluoreszcens rezonancia energia transzfer rendszert. Ez a rendszer alkalmas az egyes patkány VEGF izoformáknak a különbözo szövetekboli mennyiségi meghatározására. 11. Feltételezésünkkel összhangban sikerült patkány veseszövetbol kimutatni a humán mintákban már leírt 205-ös VEGF izoformát A VEGF génpolimorfizmusok és a kis születési súlyú koraszülöttek retinopátiája közti kapcsolat vizsgálata 12. A VEGF +405 C allélja, valamint a -460 TT/ +405 CC haplotípus elofordulása gyakoribb volt a krioterápiát vagy fotokoagulációs kezelést igénylo retinopátiában szenvedo kis születési súlyú koraszülöttekben (VLBW). Adataink alapján a VEGF G +405 C és T -460 C polimorfizmusok vizsgálata segíthet a kis születési súlyú koraszülöttek ROP rizikójának becslésekor. 105

106 10. IRODALOMJEGYZÉK 1. Damert A, Miquerol L, Gertsenstein M, Risau W, Nagy A. Insufficient VEGFA activity in yolk sac endoderm compromises haematopoietic and endothelial differentiation. Development. 129: , Takeshita S, Rossow ST, Kearney M, Zheng LP, Bauters C, Bunting S, Ferrara N, Symes JF, Isner JM. Time course of increased cellular proliferation in collateral arteries after administration of vascular endothelial growth factor in a rabbit model of lower limb vascular insufficiency. Am J Pathol. 147: , Senger DR, Ledbetter SR, Claffey KP, Papadopoulos-Sergiou A, Peruzzi CA, Detmar M. Stimulation of endothelial cell migration by vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor through cooperative mechanisms involving the alphavbeta3 integrin, osteopontin, and thrombin. Am J Pathol. 149: , Ferrara N. Vascular endothelial growth factor. Eur J Cancer. 32A: , Shweiki D, Itin A, Soffer D, Keshet E. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature. 359: , Murohara T, Horowitz JR, Silver M, Tsurumi Y, Chen D, Sullivan A, Isner JM. Vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor enhances vascular permeability via nitric oxide and prostacyclin. Circulation. 97: , Waltham M, Burnand KG, Collins M, McGuinness CL, Singh I, Smith A. Vascular endothelial growth factor enhances venous thrombus recanalisation and organisation. Thromb Haemost. 89: , Laitinen M, Zachary I, Breier G, Pakkanen T, Hakkinen T, Luoma J, Abedi H, Risau W, Soma M, Laakso M, Martin JF, Yla-Herttuala S. VEGF gene transfer reduces intimal thickening via increased production of nitric oxide in carotid arteries. Hum Gene Ther. 8: , Scalia R, Booth G, Lefer DJ. Vascular endothelial growth factor attenuates leukocyteendothelium interaction during acute endothelial dysfunction: essential role of endotheliumderived nitric oxide. FASEB J. 13: , Alon T, Hemo I, Itin A, Pe'er J, Stone J, Keshet E. Vascular endothelial growth factor acts as a survival factor for newly formed retinal vessels and has implications for retinopathy of prematurity. Nat Med. 1: ,

107 11. Kanellis J, Fraser S, Katerelos M, Power DA. Vascular endothelial growth factor is a survival factor for renal tubular epithelial cells. Am J Physiol Renal Physiol. 278: F905-F915, Tischer E, Mitchell R, Hartman T, Silva M, Gospodarowicz D, Fiddes JC, Abraham JA. The human gene for vascular endothelial growth factor. Multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing. J Biol Chem. 266: , Kimura H, Weisz A, Kurashima Y, Hashimoto K, Ogura T, D'Acquisto F, Addeo R, Makuuchi M, Esumi H. Hypoxia response element of the human vascular endothelial growth factor gene mediates transcriptional regulation by nitric oxide: control of hypoxia-inducible factor-1 activity by nitric oxide. Blood. 95: , Huez I, Creancier L, Audigier S, Gensac MC, Prats AC, Prats H. Two independent internal ribosome entry sites are involved in translation initiation of vascular endothelial growth factor mrna. Mol Cell Biol. 18: , Hyder SM, Nawaz Z, Chiappetta C, Stancel GM Identification of functional estrogen response elements in the gene coding for the potent angiogenic factor vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 60: , Abraham JA, Whang JL, Tumolo A, Mergia A, Friedman J, Gospodarowicz D, Fiddes JC. Human basic fibroblast growth factor: nucleotide sequence and genomic organization. EMBO J. 5: , Derynck R, Jarrett JA, Chen EY, Eaton DH, Bell JR, Assoian RK, Roberts AB, Sporn MB, Goeddel DV. Human transforming growth factor-beta complementary DNA sequence and expression in normal and transformed cells. Nature. 316: , Ferrara N, Houck K, Jakeman L, Leung DW. Molecular and biological properties of the vascular endothelial growth factor family of proteins. Endocr Rev. 13: 18-32, Poltorak Z, Cohen T, Sivan R, Kandelis Y, Spira G, Vlodavsky I, Keshet E, Neufeld G. VEGF145, a secreted vascular endothelial growth factor isoform that binds to extracellular matrix. J Biol Chem. 272: , Goldberg-Cohen I, Furneauxb H, Levy AP. A 40-bp RNA element that mediates stabilization of vascular endothelial growth factor mrna by HuR. J Biol Chem. 277: , Ladoux A, Frelin C. Hypoxia is a strong inducer of vascular endothelial growth factor mrna expression in the heart. Biochem Biophys Res Commun. 195: , Wiener CM, Booth G, Semenza GL. In vivo expression of mrnas encoding hypoxiainducible factor 1. Biochem Biophys Res Commun. 225: ,

108 23. Wang GL, Semenza GL. Characterization of hypoxia-inducible factor 1 and regulation of DNA binding activity by hypoxia. J Biol Chem. 268: , Liu Y, Cox SR, Morita T, Kourembanas S. Hypoxia regulates vascular endothelial growth factor gene expression in endothelial cells. Identification of a 5' enhancer. Circ Res. 77: , Jiang BH, Agani F, Passaniti A, Semenza GL. V-SRC induces expression of hypoxiainducible factor 1 (HIF-1) and transcription of genes encoding vascular endothelial growth factor and enolase 1: involvement of HIF-1 in tumor progression. Cancer Res. 57: , Sasaki H, Ray PS, Zhu L, Galang N, Maulik N. Oxidative stress due to hypoxia/reoxygenation induces angiogenic factor VEGF in adult rat myocardium: possible role of NFkappaB. Toxicology. 155: 27-35, Schafer G, Cramer T, Suske G, Kemmner W, Wiedenmann B, Hocker M. Oxidative stress regulates vascular endothelial growth factor-a gene transcription through Sp1- and Sp3- dependent activation of two proximal GC-ric h promoter elements. J Biol Chem. 278: , Salnikow K, Kluz T, Costa M, Piquemal D, Demidenko ZN, Xie K, Blagosklonny MV. The regulation of hypoxic genes by calcium involves c-jun/ap-1, which cooperates with hypoxia-inducible factor 1 in response to hypoxia. Mol Cell Biol. 22: , Brenneisen P, Blaudschun R, Gille J, Schneider L, Hinrichs R, Wlaschek M, Em ing S, Scharffetter-Kochanek K Essential role of an activator protein-2 (AP-2)/specificity protein 1 (Sp1) cluster in the UVB-mediated induction of the human vascular endothelial growth factor in HaCaT keratinocytes. Biochem J. 369: , Takagi H, King GL, Robinson GS, Ferrara N, Aiello LP. Adenosine mediates hypoxic induction of vascular endothelial growth factor in retinal pericytes and endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 37: , Mukhopadhyay D, Tsiokas L, Zhou XM, Foster D, Brugge JS, Sukhatme VP. Hypoxic induction of human vascular endothelial growth factor expression through c-src activation. Nature. 375: , Stein I, Neeman M, Shweiki D, Itin A, Keshet E. Stabilization of vascular endothelial growth factor mrna by hypoxia and hypoglycemia and coregulation with other ischemiainduced genes. Mol Cell Biol. 15: , Levy NS, Chung S, Furneaux H, Levy AP. Hypoxic stabilization of vascular endothelial growth factor mrna by the RNA-binding protein HuR. J Biol Chem. 273: ,

109 34. Liu LX, Lu H, Luo Y, Date T, Belanger AJ, Vincent KA, Akita GY, Goldberg M, Cheng SH, Gregory RJ, Jiang C. Stabilization of vascular endothelial growth factor mrna by hypoxia-inducible factor 1. Biochem Biophys Res Commun. 291: , Stein I, Itin A, Einat P, Skaliter R, Grossman Z, Keshet E. Translation of vascular endothelial growth factor mrna by internal ribosome entry: implications for translation under hypoxia. Mol Cell Biol. 18: , Levitas E, Chamoun D, Udoff LC, Ando M, Resnick CE, Adashi EY. Periovulatory and interleukin-1 beta-dependent up-regulation of intraovarian vascular endothelial growth factor (VEGF) in the rat: potential role for VEGF in the promotion of periovulatory angiogenesis and vas cular permeability. J Soc Gynecol Investig. 7: 51-60, Dankbar B, Padro T, Leo R, Feldmann B, Kropff M, Mesters RM, Serve H, Berdel WE, Kienast J. Vascular endothelial growth factor and interleukin-6 in paracrine tumor-stromal cell interactions in multiple myeloma. Blood. 95: , Gloddek J, Pagotto U, Paez Pereda M, Arzt E, Stalla GK, Renner U. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide, interleukin-6 and glucocorticoids regulate the release of vascular endothelial growth factor in pituitary folliculostellate cells. J Endocrinol. 160: , Akagi M, Kawaguchi M, Liu W, McCarty MF, Takeda A, Fan F, Stoeltzing O, Parikh AA, Jung YD, Bucana CD, Mansfield PF, Hicklin DJ, Ellis LM. Induction of neuropilin-1 and vascular endothelial growth factor by epidermal growth factor in human gastric cancer cells. Br J Cancer. 88: , Stavri GT, Zachary IC, Baskerville PA, Martin JF, Erusalimsky JD.Basic fibroblast growth factor upregulates the expression of vascular endothelial growth factor in vascular smooth muscle cells. Synergistic interaction with hypoxia. Circulation. 92: 11-14, Gille J, Swerlick RA, Caughman SW. Transforming growth factor -alpha-induced transcriptional activation of the vascular permeability factor (VPF/VEGF) gene requires AP- 2-dependent DNA binding and transactivation. EMBO J. 16: , Benckert C, Jonas S, Cramer T, Von Marschall Z, Schafer G, Peters M, Wagner K, Radke C, Wiedenmann B, Neuhaus P, Hocker M, Rosewicz S. Transforming growth factor beta 1 stimulates vascular endothelial growth factor gene transcription in human cholangiocellular carcinoma cells. Cancer Res. 63: , Gruden G, Araf S, Zonca S, Burt D, Thomas S, Gnudi L, Viberti G. IGF-I induces vascular endothelial growth factor in human mesangial cells via a Src -dependent mechanism. Kidney Int. 63: ,

110 44. Finkenzeller G, Marme D, Weich HA, Hug H. Platelet-derived growth factor-induced transcription of the vascular endothelial growth factor gene is mediated by protein kinase C. Cancer Res. 52: , M, Edwards NA, Merrill MJ. Differential expression of vascular endothelial growth factor (vascular permeability factor) forms in rat tissues. Growth Factors. 12: 11-15, Anthony FW, Wheeler T, Elcock CL, Pickett M, Thomas EJ. Short report: identification of a specific pattern of vascular endothelial growth factor mrna expression in human placenta and cultured placental fibroblasts. Placenta. 15: , Cheung CY, Singh M, Ebaugh MJ, Brace RA. Vascular endothelial growth factor gene expression in ovine placenta and fetal membranes. Am J Obstet Gynecol. 173: , Houck KA, Leung DW, Rowland AM, Winer J, Ferrara N. Dual regulation of vascular endothelial growth factor bioavailability by genetic and proteolytic mechanisms. J Biol Chem. 267: , Ferrara N, Henzel WJ. Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 161: , Park JE, Keller GA, Ferrara N. The vascular endothelial growth factor (VEGF) isoforms: differential deposition into the subepithelial extracellular matrix and bioactivity of extracellular matrix-bound VEGF. Mol Biol Cell. 4: , Neufeld G, Cohen T, Gitay-Goren H, Poltorak Z, Tessler S, Sharon R, Gengrinovitch S, Levi BZ. Similarities and differences between the vascular endothelial growth factor (VEGF) splice variants. Cancer Metastasis Rev. 15: , de Vries C, Escobedo JA, Ueno H, Houck K, Ferrara N, Williams LT. The fms-like tyrosine kinase, a receptor for vascular endothelial growth factor. Science. 255: , Terman BI, Dougher-Vermazen M, Carrion ME, Dimitrov D, Armellino DC, Gospodarowicz D, Bohlen P. Identification of the KDR tyrosine kinase as a receptor for vascular endothelial cell growth factor. Biochem Biophys Res Commun. 187: , Charnock-Jones DS, Sharkey AM, Boocock CA, Ahmed A, Plevin R, Ferrara N, Smith SK. Vascular endothelial growth factor receptor localization and activation in human trophoblast and choriocarcinoma cells. Biol Reprod. 51: ,

111 55. Takahashi T, Shirasawa T, Miyake K, Yahagi Y, Maruyama N, Kasahara N, Kawamura T, Matsumura O, Mitarai T, Sakai O. Protein tyrosine kinases expressed in glomeruli and cultured glomerular cells: Flt-1 and VEGF expression in renal mesangial cells. Biochem Biophys Res Commun. 209: , Barleon B, Sozzani S, Zhou D, Weich HA, Mantovani A, Marme D. Migration of human monocytes in response to vascular endothelial growth factor (VEGF) is mediated via the VEGF receptor flt-1. Blood. 87: , Katoh O, Tauchi H, Kawaishi K, Kimura A, Satow Y. Expression of the vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor gene, KDR, in hematopoietic cells and inhibitory effect of VEGF on apoptotic cell death caused by ionizing radiation. Cancer Res. 55: , Yang K, Cepko CL. Flk-1, a receptor for vascular endothelial growth factor (VEGF), is expressed by retinal progenitor cells. J Neurosci. 16: , Petrova TV, Makinen T, Alitalo K. Signaling via vascular endothelial growth factor receptors. Exp Cell Res. 253: , Zachary I, Gliki G. Signaling transduction mechanisms mediating biological actions of the vascular endothelial growth factor family. Cardiovasc Res. 49: , Wiesmann C, Fuh G, Christinger HW, Eigenbrot C, Wells JA, de Vos AM. Crystal structure at 1.7 A resolution of VEGF in complex with domain 2 of the Flt-1 receptor. Cell. 91: , Kendall RL, Wang G, Thomas KA Identification of a natural soluble form of the vascular endothelial growth factor receptor, FLT-1, and its heterodimerization with KDR. Biochem Biophys Res Commun. 226: , Keyt BA, Nguyen HV, Berleau LT, Duarte CM, Park J, Chen H, Ferrara N. Identification of vascular endothelial growth factor determinants for binding KDR and FLT -1 receptors. Generation of receptor -selective VEGF variants by site-directed mutagenesis. J Biol Chem. 271: , Shinkai A, Ito M, Anazawa H, Yamaguchi S, Shitara K, Shibuya M. Mapping of the sites involved in ligand association and dissociation at the extracellular domain of the kinase insert domain-containing receptor for vascular endothelial growth factor. J Biol Chem. 273: , Tanaka K, Yamaguchi S, Sawano A, Shibuya M. Characterization of the extracellular domain in vascular endothelial growth factor receptor-1 (Flt-1 tyrosine kinase). Jpn J Cancer Res. 88: ,

112 66. Fuh G, Li B, Crowley C, Cunningham B, Wells JA. Requirements for binding and signaling of the kinase domain receptor for vascular endothelial growth factor. J Biol Chem. 273: , Kendall RL, Thomas KA. Inhibition of vascular endothelial cell growth factor activity by an endogenously encoded soluble receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 90: , Kendall RL, Wang G, Thomas KA. Identification of a natural soluble form of the vascular endothelial growth factor receptor, FLT-1, and its heterodimerization with KDR. Biochem Biophys Res Commun. 226: , Gitay-Goren H, Soker S, Vlodavsky I, Neufeld G. The binding of vascular endothelial growth factor to its receptors is dependent on cell surface-associated heparin-like molecules. J Biol Chem. 267: , Soker S, Gollamudi-Payne S, Fidder H, Charmahelli H, Klagsbrun M. Inhibition of vascular endothelial growth factor (VEGF)-induced endothelial cell proliferation by a peptide corresponding to the exon 7-encoded domain of VEGF165. J Biol Chem. 272: , Soker S, Takashima S, Miao HQ, Neufeld G, Klagsbrun M. Neuropilin-1 is expressed by endothelial and tumor cells as an isoform-specific receptor for vascular endothelial growth factor. Cell. 92: , Jonca F, Ortega N, Gleizes PE, Bertrand N, Plouet J. Cell release of bioactive fibroblast growth factor 2 by exon 6-encoded sequence of vascular endothelial growth factor. J Biol Chem. 272: , Cohen T, Gitay-Goren H, Sharon R, Shibuya M, Halaban R, Levi BZ, Neufeld G. VEGF121, a vascular endothelial growth factor (VEGF) isoform lacking heparin binding ability, requires cell-surface heparan sulfates for efficient binding to the VEGF receptors of human melanoma cells. J Biol Chem. 270: , Gengrinovitch S, Berman B, David G, Witte L, Neufeld G, Ron D. Glypican-1 is a VEGF165 binding proteoglycan that acts as an extracellular chaperone for VEGF165. J Biol Chem. 274: , Waltenberger J, Claesson-Welsh L, Siegbahn A, Shibuya M, Heldin CH.Different signal transduction properties of KDR and Flt1, two receptors for vascular endothelial growth factor. J Biol Chem. 269: ,

113 76. Cunningham SA, Arrate MP, Brock TA, Waxham MN. Interactions of FLT-1 and KDR with phospholipase C gamma: identification of the phosphotyrosine binding sites. Biochem Biophys Res Commun. 240: , Ito N, Wernstedt C, Engstrom U, Claesson-Welsh L. Identification of vascular endothelial growth factor receptor-1 tyrosine phosphorylation sites and binding of SH2 domaincontaining molecules. J Biol Chem. 273: , Hiratsuka S, Minowa O, Kuno J, Noda T, Shibuya M. Flt-1 lacking the tyrosine kinase domain is sufficient for normal development and angiogenesis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 95: , Chou MT, Wang J, Fujita DJ. Src kinase becomes preferentially associated with the VEGFR, KDR/Flk-1, following VEGF stimulation of vascular endothelial cells. BMC Biochem. 3: 32-43, Takahashi N, Seko Y, Noiri E, Tobe K, Kadowaki T, Sabe H, Yazaki Y. Vascular endothelial growth factor induces activation and subcellular translocation of focal adhesion kinase (p125fak) in cultured rat cardiac myocytes. Circ Res. 84: , Dougher-Vermazen M, Hulmes JD, Bohlen P, Terman BI. Biological activity and phosphorylation sites of the bacterially expressed cytosolic domain of the KDR VEGFreceptor. Biochem Biophys Res Commun. 205: , Takahashi T, Ueno H, Shibuya M. VEGF activates protein kinase C-dependent, but Rasindependent Raf-MEK-MAP kinase pathway for DNA synthesis in primary endothelial cells. Oncogene. 18: , D'Angelo G, Martini JF, Iiri T, Fantl WJ, Martial J, Weiner RI. 16K human prolactin inhibits vascular endothelial growth factor-induced activation of Ras in capillary endothelial cells. Mol Endocrinol. 13: , Kroll J, Waltenberger J. The vascular endothelial growth factor receptor KDR activates multiple signal transduction pathways in porcine aortic endothelial cells. J Biol Chem. 272: , Gerber HP, McMurtrey A, Kowalski J, Yan M, Keyt BA, Dixit V, Ferrara N. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3'-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J Biol Chem. 273: ,

114 86. Matsumoto Y, Tanaka K, Hirata G, Hanada M, Matsuda S, Shuto T, Iwamoto Y. Possible involvement of the vascular endothelial growth factor-flt-1-focal adhesion kinase pathway in chemotaxis and the cell proliferation of osteoclast precursor cells in arthritic joints. J Immunol. 168: , Carmeliet P, Ferreira V, Breier G, Pollefeyt S, Kieckens L, Gertsenstein M, Fahrig M, Vandenhoeck A, Harpal K, Eberhardt C, Declercq C, Pawling J, Moons L, Collen D, Risau W, Nagy A. Abnormal blood vessel development and lethality in embryos lacking a single VEGF allele. Nature. 380: , Fong GH, Rossant J, Gertsenstein M, Breitman ML. Role of the Flt-1 receptor tyrosine kinase in regulating the assembly of vascular endothelium. Nature. 376: 66-70, Shalaby F, Rossant J, Yamaguchi TP, Gertsenstein M, Wu XF, Breitman ML, Schuh AC. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. Nature. 376: 62-66, Connolly DT, Olander JV, Heuvelman D, Nelson R, Monsell R, Siegel N, Haymore BL, Leimgruber R, Feder J. Human vascular permeability factor. Isolation from U937 cells. J Biol Chem. 264: , Stacker SA, Vitali A, Caesar C, Domagala T, Groenen LC, Nice E, Achen MG, Wilks AF. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. J Biol Chem. 274: , Wu HM, Yuan Y, Zawieja DC, Tinsley J, Granger HJ. Role of phospholipase C, protein kinase C, and calcium in VEGF-induced venular hyperpermeability. Am J Physiol. 276: H535-H542, Esser S, Wolburg K, Wolburg H, Breier G, Kurzchalia T, Risau W. Vascular endothelial growth factor induces endothelial fenestrations in vitro. J Cell Biol. 140: , Fischer S, Clauss M, Wiesnet M, Renz D, Schaper W, Karliczek GF. Hypoxia induces permeability in brain microvessel endothelial cells via VEGF and NO. Am J Physiol. 276: C812-C820, Qu-Hong, Nagy JA, Senger DR, Dvorak HF, Dvorak AM. Ultrastructural localization of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor (VPF/VEGF) to the abluminal plasma membrane and vesiculovacuolar organelles of tumor microvascular endothelium. J Histochem Cytochem. 43: ,

115 96. Pedram A, Razandi M, Levin ER. Extracellular signal-regulated protein kinase/jun kinase cross-talk underlies vascular endothelial cell growth factor-induced endothelial cell proliferation. J Biol Chem. 273: , Wellner M, Maasch C, Kupprion C, Lindschau C, Luft FC, Haller H. The proliferative effect of vascular endothelial growth factor requires protein kinase C-alpha and protein kinase C-zeta. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19: , Shizukuda Y, Tang S, Yokota R, Ware JA. Vascular endothelial growth factor-induced endothelial cell migration and proliferation depend on a nitric oxide-mediated decrease in protein kinase Cdelta activity. Circ Res. 85: , Harrington EO, Loffler J, Nelson PR, Kent KC, Simons M, Ware JA. Enhancement of migration by protein kinase Calpha and inhibition of proliferation and cell cycle progression by protein kinase Cdelta in capillary endothelial cells. J Biol Chem. 272: , Risau W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386: , Lamoreaux WJ, Fitzgerald ME, Reiner A, Hasty KA, Charles ST. Vascular endothelial growth factor increases release of gelatinase A and decreases release of tissue inhibitor of metalloproteinases by microvascular endothelial cells in vitro. Microvasc Res. 55: 29-42, Abedi H, Zachary I. Signalling mechanisms in the regulation of vascular cell migration. Cardiovasc Res. 30: , Rousseau S, Houle F, Kotanides H, Witte L, Waltenberger J, Landry J, Huot J. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-driven actin-based motility is mediated by VEGFR2 and requires concerted activation of stress-activated protein kinase 2 (SAPK2/p38) and geldanamycin-sensitive phosphorylation of focal adhesion kinase. J Biol Chem. 275: , Noiri E, Hu Y, Bahou WF, Keese CR, Giaever I, Goligorsky MS. Permissive role of nitric oxide in endothelin-induced migration of endothelial cells. J Biol Chem. 272: , Goligorsky MS, Abedi H, Noiri E, Takhtajan A, Lense S, Romanov V, Zachary I. Nitric oxide modulation of focal adhesions in endothelial cells. Am J Physiol. 276: C1271-C1281, Dimmeler S, Dernbach E, Zeiher AM. Phosphorylation of the endothelial nitric oxide synthase at ser-1177 is required for VEGF-induced endothelial cell migration. FEBS Lett. 477: ,

116 107. Plate KH, Breier G, Risau W. Molecular mechanisms of developmental and tumor angiogenesis. Brain Pathol. 4: , Carmeliet P, Ng YS, Nuyens D, Theilmeier G, Brusselmans K, Cornelissen I, Ehler E, Kakkar VV, Stalmans I, Mattot V, Perriard JC, Dewerchin M, Flameng W, Nagy A, Lupu F, Moons L, Collen D, D'Amore PA, Shima DT. Impaired myocardial angiogenesis and ischemic cardiomyopathy in mice lacking the vascular endothelial growth factor isoforms VEGF164 and VEGF188. Nat Med. 5: , Folkman J. Tumor angiogenesis. Adv Cancer Res. 43: , Shepherd FA. Angiogenesis inhibitors in the treatment of lung cancer. Lung Cancer. 34: S81-S89, Berlin JD. Targeting vascular endothelial growth factor in colorectal cancer. Oncology. 16: S13-S15, Tran J, Rak J, Sheehan C, Saibil SD, LaCasse E, Korneluk RG, Kerbel RS. Marked induction of the IAP family antiapoptotic proteins survivin and XIAP by VEGF in vascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 264: , Thakker GD, Hajjar DP, Muller WA, Rosengart TK. The role of phosphatidylinositol 3- kinase in vascular endothelial growth factor signaling. J Biol Chem. 274: , Tran J, Rak J, Sheehan C, Saibil SD, LaCasse E, Korneluk RG, Kerbel RS. Marked induction of the IAP family antiapoptotic proteins survivin and XIAP by VEGF in vascular endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 264: , Abedi H, Zachary I. Vascular endothelial growth factor stimulates tyrosine phosphorylation and recruitment to new focal adhesions of focal adhesion kinase and paxillin in endothelial cells. J Biol Chem. 272: , Liu ZY, Ganju RK, Wang JF, Schweitzer K, Weksler B, Avraham S, Groopman JE. Characterization of signal transduction pathways in human bone marrow endothelial cells. Blood. 90: , Ilan N, Mahooti S, Madri JA. Distinct signal transduction pathways are utilized during the tube formation and survival phases of in vitro angiogenesis. J Cell Sci. 111: , Sarkar R, Gordon D, Stanley JC, Webb RC. Dual cell cycle-specific mechanisms mediate the antimitogenic effects of nitric oxide in vascular smooth muscle cells. J Hypertens. 15: ,

117 119. Kothapalli D, Stewart SA, Smyth EM, Azonobi I, Pure E, Assoian RK. Prostacylin receptor activation inhibits proliferation of aortic smooth muscle cells by regulating camp response element-binding protein- and pocket protein-dependent cyclin a gene expression. Mol Pharmacol. 64: , Radomski MW, Palmer RM, Moncada S. An L-arginine/nitric oxide pathway present in human platelets regulates aggregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 87: , Moncada S, Herman AG, Higgs EA, Vane JR. Differential formation of prostacyclin (PGX or PGI2) by layers of the arterial wall. An explanation for the anti-thrombotic properties of vascular endothelium. Thromb Res. 11: , Zachary I, Mathur A, Yla-Herttuala S, Martin J. Vascular protection: A novel nonangiogenic cardiovascular role for vascular endothelial growth factor. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20: , Garcia-Cardena G, Fan R, Shah V, Sorrentino R, Cirino G, Papapetropoulos A, Sessa WC. Dynamic activation of endothelial nitric oxide synthase by Hsp90. Nature. 392: , Wheeler-Jones C, Abu-Ghazaleh R, Cospedal R, Houliston RA, Martin J, Zachary I. Vascular endothelial growth factor stimulates prostacyclin production and activation of cytosolic phospholipase A2 in endothelial cells via p42/p44 mitogen-activated protein kinase. FEBS Lett. 420: 28-32, Flores J, DiBona DR, Beck CH, Leaf A. The role of cell swelling in ischemic renal damage and the protective effect of hypertonic solute. J Clin Invest. 51: , Summers WK, Jamison RL. The no reflow phenomenon in renal ischemia. Lab Invest. 25: , Basile DP, Donohoe D, Roethe K, Osborn JL. Renal ischem ic injury results in permanent damage to peritubular capillaries and influences long-term function. Am J Physiol Renal Physiol. 281: F887-F899, Sutton TA, Fisher CJ, Molitoris BA. Microvascular endothelial injury and dysfunction during ischemic acute renal failure. Kidney Int. 62: , Banai S, Shweiki D, Pinson A, Chandra M, Lazarovici G, Keshet E. Upregulation of vascular endothelial growth factor expression induced by myocardial ischaemia: implications for coronary angiogenesis. Cardiovasc Res. 28: , Bernaudin M, Tang Y, Reilly M, Petit E, Sharp FR. Brain genomic response following hypoxia and re-oxygenation in the neonatal rat: Identification of genes that might contribute to hypoxia-induced ischemic tolerance. J Biol Chem. 277: ,

118 131. Christou H, Yoshida A, Arthur V, Morita T, Kourembanas S. Increased vascular endothelial growth factor production in the lungs of rats with hypoxia-induced pulmonary hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 18: , Rissanen TT, Vajanto I, Hiltunen MO, Rutanen J, Kettunen MI, Niemi M, Leppanen P, Turunen MP, Markkanen JE, Arve K, Alhava E, Kauppinen RA, Yla-Herttuala S. Expression of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor-2 (KDR/Flk-1) in ischemic skeletal muscle and its regeneration. Am J Pathol. 160: , Kanellis J, Mudge SJ, Fraser S, Katerelos M, Power DA. Redistribution of cytoplasmic VEGF to the basolateral aspect of renal tubular cells in ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 57: , Kanellis J, Paizis K, Cox AJ, Stacker SA, Gilbert RE, Cooper ME, Power DA. Renal ischemia-reperfusion increases endothelial VEGFR-2 without increasing VEGF or VEGFR-1 expression. Kidney Int. 61: , Schweda F, Blumberg FC, Schweda A, Nabel C, Holmer SR, Riegger GA, Pfeifer M, Kramer BK. Effects of chronic hypoxia on renal PDGF-A, PDGF-B, and VEGF gene expression in rats. Nephron. 86: , Kaneko H, Koshi S, Hiraoka T, Miyauchi Y, Kitamura N, Inoue M. Inhibition of postischemic reperfusion injury of the kidney by diamine oxidase. Biochim Biophys Acta. 1407: , Juhlin L, Baekken T. Histamine induced increase of basophil and eosinophil leukocytes in inflammatory exudates. Acta Derm Venereol. 45: , Bell L, Madri JA. Effect of platelet factors on migration of cultured bovine aortic endothelial and smooth muscle cells. Circ Res. 65: , Mortillaro NA, Granger DN, Kvietys PR, Rutili G, Taylor AE. Effects of histamine and histamine antagonists on intestinal capillary permeability. Am J Physiol. 240: G381-G386, Radke KJ, Selkurt EE, Willis LR. The role of histamine H1 and H2 receptors in the canine kidney. Ren Physiol. 8: , Ghosh AK, Hirasawa N, Ohuchi K. Enhancement by histamine of vascular endothelial growth factor production in granulation tissue via H(2) receptors. Br J Pharmacol. 134: ,

119 142. Baulieu EE, Corp'echot C, Dray F, Emiliozzi R, Lebeau MC, Mauvais -Jarvis P, Robel P. An adrenal-secreted "androgen": dehydroisoandrosterone sulfate. Its metabolism and a tentative generalization on the metabolism of other steroid conjugates in man. Recent Prog Horm Res. 21: , Kawano H, Yasue H, Kitagawa A, Hirai N, Yoshida T, Soejima H, Miyamoto S, Nakano M, Ogawa H. Dehydroepiandrosterone supplementation improves endothelial function and insulin sensitivity in men. J Clin Endocrinol Metab. 88: , Feldman HA, Johannes CB, Araujo AB, Mohr BA, Longcope C, McKinlay JB. Low dehydroepiandrosterone and ischemic heart disease in middle-aged men: prospective results from the Massachusetts Male Aging Study. Am J Epidemiol. 153: 79-89, Jesse RL, Loesser K, Eich DM, Qian YZ, Hess ML, Nestler JE. Dehydroepiandrosterone inhibits human platelet aggregation in vitro and in vivo. Ann N Y Acad Sci. 774: , Williams MR, Ling S, Dawood T, Hashimura K, Dai A, Li H, Liu JP, Funder JW, Sudhir K, Komesaroff PA. Dehydroepiandrosterone inhibits human vascular smooth muscle cell proliferation independent of ARs and ERs. J Clin Endocrinol Metab. 87: , Simoncini T, Mannella P, Fornari L, Varone G, Caruso A, Genazzani AR. Dehydroepiandrosterone modulates endothelial nitric oxide synthesis via direct genomic and nongenomic mechanisms. Endocrinology. 144: , Liu D, Dillon JS. Dehydroepiandrosterone activates endothelial cell nitric-oxide synthase by a specific plasma membrane receptor coupled to Galpha(i2,3). J Biol Chem. 277: , Lohman R, Yowell R, Barton S, Araneo B, Siemionow M. Dehydroepiandrosterone protects muscle flap microcirculatory hemodynamics from ischemia/reperfusion injury: an experimental in vivo study. J Trauma. 42: 74-80, Ayhan S, Tugay C, Norton S, Araneo B, Siemionow M. Dehydroepiandrosterone protects the microcirculation of muscle flaps from ischemia-reperfusion injury by reducing the expression of adhesion molecules. Plast Reconstr Surg. 111: , Mitchell LE, Sprecher DL, Borecki IB, Rice T, Laskarzewski PM, Rao DC. Evidence for an association between dehydroepiandrosterone sulfate and nonfatal, premature myocardial infarction in males. Circulation. 89: 89-93, Aragno M, Parola S, Brignardello E, Mauro A, Tamagno E, Manti R, Danni O, Boccuzzi G. Dehydroepiandrosterone prevents oxidative injury induced by transient ischemia/reperfusion in the brain of diabetic rats. Diabetes. 49: ,

120 153. Aragno M, Cutrin JC, Mastrocola R, Perrelli MG, Restivo F, Poli G, Danni O, Boccuzzi G. Oxidative stress and kidney dysfunction due to ischemia/reperfusion in rat: attenuation by dehydroepiandrosterone. Kidney Int. 64: , Provis JM. Development of the primate retinal vasculature. Prog Retin Eye Res. 20: , Wheatley CM, Dickinson JL, Mackey DA, Craig JE, Sale MM. Retinopathy of prematurity: recent advances in our understanding. Br J Ophthalmol. 86: , Smith LE. Pathogenesis of retinopathy of prematurity. Acta Paediatr Suppl. 437: S26- S28, Ng YK, Fielder AR, Shaw DE, Levene MI. Epidemiology of retinopathy of prematurity. Lancet. 2: , Watson CJ, Webb NJ, Bottomley MJ, Brenchley PE. Identification of polymorphisms within the vascular endothelial growth factor (VEGF) gene: correlation with variation in VEGF protein production. Cytokine. 12: , Awata T, Inoue K, Kurihara S, Ohkubo T, Watanabe M, Inukai K, Inoue I, Katayama S. A common polymorphism in the 5'-untranslated region of the VEGF gene is associated with diabetic retinopathy in type 2 diabetes. Diabetes. 51: , Vasarhelyi B, Bencsik P, Treszl A, Bardoczy Z, Tulassay T, Szathmari M. The effect of physiologic hyperinsulinemia during an oral glucose tolerance test on the levels of dehydroepiandrosterone (DHEA) and its sulfate (DHEAS) in healthy young adults born with low and with normal birth weight. Endocr J. 50: , Strehlau J, Pavlakis M, Lipman M, Shapiro M, Vasconcellos L, Harmon W, Strom TB. Quantitative detection of immune activation transcripts as a diagnostic tool in kidney transplantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 94: , Siegling A, Lehmann M, Platzer C, Emmrich F, Volk HD. A novel multispecific competitor fragment for quantitative PCR analysis of cytokine gene expression in rats. J Immunol Methods. 177: 23-28, An international classification of retinopathy of prematurity. Prepared by an international committee. Br J Ophthalmol. 68: , Matsui H, Ihara Y, Fujio Y, Kunisada K, Akira S, Kishimoto T, Yamauchi-Takihara K. Induction of interleukin (IL) -6 by hypoxia is mediated by nuclear factor (NF)-kappa B and NF-IL6 in cardiac myocytes. Cardiovasc Res. 42: , Yan SF, Tritto I, Pinsky D, Liao H, Huang J, Fuller G, Brett J, May L, Stern D. Induction of interleukin 6 (IL-6) by hypoxia in vascular cells. Central role of the binding site for nuclear factor-il-6. J Biol Chem. 270: ,

121 166. Yamagiwa Y, Marienfeld C, Meng F, Holcik M, Patel T.Translational regulation of x- linked inhibitor of apoptosis protein by interleukin-6: a novel mechanism of tumor cell survival. Cancer Res. 64: , Crew JP, Fuggle S, Bicknell R, Cranston DW, de Benedetti A, Harris AL. Eukaryotic initiation factor-4e in superficial and muscle invasive bladder cancer and its correlation with vascular endothelial growth factor expression and tumour progression. Br J Cancer. 82: , Stein I, Itin A, Einat P, Skaliter R, Grossman Z, Keshet E. Translation of vascular endothelial growth factor mrna by internal ribosome entry: implications for translation under hypoxia. Mol Cell Biol. 18: , Brezis M, Rosen S. Hypoxia of the renal medulla-its implications for disease. N Engl J Med. 332: , Brezis M, Epstein FH. Cellular mechanisms of acute ischemic injury in the kidney. Annu Rev Med. 44: 27-37, Ashworth SL, Molitoris BA. Pathophysiology and functional significance of apical membrane disruption during ischemia. Curr Opi n Nephrol Hypertens. 8: , Brown D, Lee R, Bonventre JV. Redistribution of villin to proximal tubule basolateral membranes after ischemia and reperfusion. Am J Physiol. 273: F1003-F1012, Aufricht C, Ardito T, Thulin G, Kashgarian M, Siegel NJ, Van Why SK. Heat-shock protein 25 induction and redistribution during actin reorganization after renal ischemia. Am J Physiol. 274: F215-F222, Akdis CA, Blaser K. Histamine in the immune regulation of allergic inflammation. J Allergy Clin Immunol. 112: 15-22, Shah BH, Lashari I, Rana S, Saeed O, Rasheed H, Arshad Saeed S. Synergistic interaction of adrenaline and histamine in human platelet aggregation is mediated through activation of phospholipase, map kinase and cyclo-oxygenase pathways. Pharmacol Res. 42: , Okajima K, Harada N, Uchiba M. Ranitidine reduces ischemia/reperfusion-induced liver injury in rats by inhibiting neutriphil activation. J Pharmacol Exp Ther. 301: , Caty MG, Schmeling DJ, Friedl HP, Oldham KT, Guice KS, Till GO. Histamine: a promoter of xantine oxidase activity in intestinal ischemia/reperfusion. J Pediatr Surg. 25: , Fujiskai J, Fujimoto K, Oohara A, Sakata T, Hirano M, Ohyama T, Iwakiri R, Yamaguchi M. Roles of histamine and diamine oxidase in mucosa of rat small intestine after ischemia-reperfusion. Dig Dis Sci. 38: , Formázott: Magyar 121

122 179. Delneste Y, Lassalle P, Jeannin P, Joseph M, Tonnel AB, Gosset P. Histamine induces IL-6 production by human endothelial cells. Clin Exp Immunol. 98: , Ghosh AK, Hirasawa N, Ohuchi K. Enhancement by histamine of vascular endothelial growth factor production in granulation tissue via H(2) receptors. Br J Pharmacol. 134: , Kimura M, Tanaka S, Yamada Y, Kiuchi Y, Yamakawa T, Sekihara H. Dehydroepiandrosterone decreases serum tumor necrosis factor -alpha and restores insulin sensitivity: independent effect from secondary weight reduction in genetically obese Zucker fatty rats. Endocrinology. 139: , Straub RH, Konecna L, Hrach S, Rothe G, Kreutz M, Scholmerich J, Falk W, Lang B. Serum dehydroepiandrosterone (DHEA) and DHEA sulfate are negatively correlated with serum interleukin-6 (IL-6), and DHEA inhibits IL-6 secretion from mononuclear cells in man in vitro: possible link between endocrinosenescence and immunosenescence. J Clin Endocrinol Metab. 83: , Hebert MJ, Gullans SR, Mackenzie HS, Brady HR. Apoptosis of endothelial cells is associated with paracrine induction of adhesion molecules: evidence for an interleukin-1betadependent paracrine loop. Am J Pathol. 152: , Kasama T, Kobayashi K, Yajima N, Shiozawa F, Yoda Y, Takeuchi HT, Mori Y, Negishi M, Ide H, Adachi M. Expression of vascular endothelial growth factor by synovial fluid neutrophils in rheumatoid arthritis (RA). Clin Exp Immunol. 121: , Fee D, Grzybicki D, Dobbs M, Ihyer S, Clotfelter J, Macvilay S, Hart MN, Sandor M, Fabry Z. Interleukin 6 promotes vasculogenesis of murine brain microvessel endothelial cells. Cytokine. 12: , Voronov E, Shouval DS, Krelin Y, Cagnano E, Benharroch D, Iwakura Y, Dinarello CA, Apte RN. IL-1 is required for tumor invasiveness and angiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100: , Del Prete D, Forino M, Gambaro G, D'Angelo A, Baggio B, Anglani F. A comparative kinetic RT/-PCR strategy for the quantitation of mrnas in microdissected human renal biopsy specimens. Exp Nephrol. 6: ,

123 11. ÁBRÁK ÉS TÁBLÁZATOK JEGYZÉKE Ábrák. 1. ábra: A humán VEGF gén promoterének, kodoló szakaszának és részleges 3 UTR-jának, illetve FR-jának szerkezete. 2. ábra: A humán VEGF izoformániak szerkezete. 3. ábra: A VEGF receptorainak sematikus ábrája. 4. ábra: A VEGF homodimerek háromdimenziós modellje. 5. ábra: A neutropilin-1 sematikus szerkezete. 6. ábra: A VEGFR1 és a VEGFR2 fobb szignáltranszdukciós útvonalai. 7. ábra: Az endotélsejteket áthidaló VVO-k elektromikroszkópos képének háromdimenziós rekonstrukciója. 8. ábra: A kompetitív patkány VEGF specifikus PCR rendszer kialakítása során felhasznált primerek egymáshoz viszonyított elhelyezkedésének sematikus ábrája. 9. ábra: A kompetitív patkány VEGF specifikus PCR -hez használt kompet itor felépítésének sematikus ábrája. 10. ábra: A patkány VEGF izoformáinak szerkezete. 11. ábra: Az ábra a VEGF 120-as izoformáján keresztül mutatja be a VEGF izoformákra specifikus primerek aspecifikus bekötodésének lehetoségeit. 12. ábra: A rekombináns DNS molekulák sematikus ábrája, valamint azok nukleotidsorrendje. 13. ábra: A kontroll (A) és az iszkémizált veseminták 2 (B), illetve 24 (C) óra reperfúziót követo hematoxilin-eozin festett metszete. 14. ábra: VEGF, IL-6, IL-1? és GAPDH mrns expressziójának változása a kontroll (T 0 ) és az iszkémizált vesemintákban 2, illetve 24 óra reperfúziót (T2, T24) követoen. Reprezentatív ábra. 15. ábra: A VEGF mrns expressziójának változása a kontroll (T0) és az iszkémizált vesemintákban 2, illetve 24 óra reperfúziót (T 2, T 24 ) követoen. 16. ábra: Az IL-6 mrns expressziójának változása a kontroll (T 0 ) és az iszkémizált vesemintákban 2, illetve 24 óra reperfúziót (T2, T24) követoen. 17. ábra: Az IL-1? mrns expressziójának változása a kontroll (T 0 ) és az iszkémizált vesemintákban 2, illetve 24 óra reperfúziót (T 2, T 24 ) követoen. 123

124 18. ábra: VEGF fehérjeszintjének változása a kontroll (T 0 ) és az iszkémizált vesemintákban 2, illetve 24 óra reperfúziót (T 2, T 24 ) követoen. Reprezentatív ábra. 19. ábra: A VEGF szintjének változása a kontroll (T0) és az iszkémizált vesemintákban 2, illetve 24 óra reperfúziót (T 2, T 24 ) követoen. 20. ábra: A VEGF lokalizációjának immunhisztológiai vizsgálata a kontroll (T0) és az iszkémizált vesékben. 21. ábra: A hisztamin, illetve a ranitidin kezelés hatása a Wistar patkányok 50 perces vese iszkémiát követo egy hetes túlélésére. 22. ábra: A VEGF mrns expressziójának változása a kontroll, a hisztaminnal és a ranitidinnel kezelt állatokban a vese iszkémiát megelozoen (T0), illetve azt követoen 2 és16 órával (T 2, T 16 ). 23. ábra: Az IL-6 mrns expressziójának változása a kontroll, a hisztaminnal és a ranitidinnel kezelt állatokban a vese iszkémiát megelozoen (T0), illetve azt követoen 2 és16 órával (T 2, T 16 ). 24. ábra: A vese VEGF szint változása a kontroll, a hisztaminnal és a ranitidinnel kezelt állatokban a vese iszkémiát megelozoen (T 0 ), illetve azt követoen 2 és 16 órával (T 2, T 16 ). 25. ábra: A DHEA kezelés hatása a Wistar patkányok 55 perces vese iszkémiát követo túlélésére. 26. ábra: A VEGF mrns expressziójának változása a DHEA és a PG kezelt állatokban a vese iszkémiát megelozoen (T0), illetve azt követoen 2 és 24 órával (T2, T24). 27. ábra: A IL-1? mrns expressziójának változása a DHEA és a PG kezelt állatokban a vese iszkémiát megelozoen (T 0 ), illetve azt követoen 2 és 24 órával (T 2, T 24 ). 28. ábra: A IL-6 mrns expressziójának változása a DHEA és a PG kezelt állatokban a vese iszkémiát megelozoen (T 0 ), illetve azt követoen 2 és 24 órával (T 2, T 24 ). 29. ábra: A VEGF fehérje szint változása a DHEA és a PG kezelt állatokban a vese iszkémiát megelozoen (T0), illetve azt követoen 2 és 24 órával (T2, T24). 30. ábra: A VEGF 120 mrns expressziója a vesében, illetve a pozitív és a negatív kontroll plazmidokban. 31. ábra: A VEGF 144 mrns expressziója a vesében, illetve a pozitív és a negatív kontroll plazmidokban. 32. ábra: A VEGF164 mrns expressziója a vesében, illetve a pozitív és a negatív kontroll plazmidokban. 33. ábra: A VEGF188 mrns expressziója a vesében, illetve a pozitív és a negatív kontroll plazmidokban. 124

125 34. ábra: A VEGF 204 mrns expressziója a vesében, illetve a pozitív és a negatív kontroll plazmidokban. 35. ábra: A VEGF -460 lokuszának real time PCR - fluoreszcens rezonancia energia transzfer vizsgálata. 36. ábra: A VEGF +405 lokuszának PCR-RFLP vizsgálata Táblázatok. 1. táblázat: A szemikvantitatív PCR-ek során használt primerek adatai. 2. táblázat: A kompetitív PCR termékek hosszadatai. 3. táblázat: A VEGF gén T -460 C-as és a G +405 C -ös polimorfizmusainak vizsgálatába bevont 201 kis születési súlyú koraszülött klinikai adatai. 4. táblázat: a patkányok szérum kreatinin és karbamid szintjeinek változása a vese iszkémiát követoen 2, illetve 24 órával (T2, T24). 5. táblázat: A hisztamin és ranitidin kezelt, illetve a kezeletlen állatok szérum kreatinin és karbamid értékei az egyoldali vese iszkémiát megelozoen (T 0 ), illetve azt követoen 2 és16 órával (T2, T 16). 6. táblázat: A hisztamin és ranitidin kezelt, illetve a kezeletlen állatok tubuláris károsodása a vese iszkémiát megelozoen (T0), illetve azt követoen 2 és16 órával (T2, T16). 7. táblázat: A hisztamin és ranitidin kezelt, illetve a kezeletlen állatok szérum hisztamin értékei a vese iszkémiát megelozoen (T 0 ), illetve azt követoen 2 és16 órával (T 2, T 16 ). 8. táblázat: A DHEA, illetve PG kezelt állatok szérum kreatinin és karbamid értékei a vese iszkémiát megelozoen (T 0 ), illetve azt követoen 2 és 24 órával (T 2, T 24 ). 9. táblázat: A DHEA, illetve a PG kezelt állatok szérum DHEA és DHEA-S értékei a vese iszkémiát megelozoen (T 0 ), illetve azt követoen 2 és 24 órával (T 2, T 24 ). 10. táblázat: A VEGF genetikai polimorpfizmusainak allél és genotípus prevalenciája a ROP fokozott kockázata miatt krioterápiával vagy fotokoagulációval kezelt, illetve nem kezelt kis születési súlyú koraszülöttekben. 11. táblázat: A VEGF polimorfizmus-haplotípusok megoszlása a ROP fokozott kockázata miatt krioterápiával, illetve fotokoagulációval kezelt, illetve nem kezelt kis születési súlyú koraszülöttekben. 125

126 12. PUBLIKÁCIÓS LISTA 1. Vannay Á, Fekete A, Ádori C, Tóth T, Losonczy G, László L, Vásarhelyi B, Tulassay T, Szabó A. Divergence of renal VEGF mrna expression and protein level in postischemic rat kidneys. Exp Physiol (IF: 1,22) 2. Vannay Á, Fekete A, Müller V, Strehlau J, Viklicky O, Veres T, Reusz G, Tulassay T, Szabó AJ. Effects of histamine and the H2 receptor antagonist ranitidine on ischemiainduced acute renal failure: involvement of IL-6 and vascular endothelial growth factor. Kidney Blood Press Res. 27: , (IF: 1,025) 3. Fekete A, Vannay Á, Vér Á, Vásárhelyi B, Müller V, Ouyang N, Reusz G, Tulassay T, Szabó AJ. Sex differences in the alterations of Na(+), K(+)-ATPase following ischaemiareperfusion injury in the rat kidney. J Physiol. 555: , (IF: 4,352) 4. Fekete A, Treszl A, Toth-Heyn P, Vannay Á, Tordai A, Tulassay T, Vásárhelyi B. Association between heat shock protein 72 gene polymorphism and acute renal failure in premature neonates. Pediatr Res. 54: , (IF: 3,064) 5. Müller V, Losonczy G, Heemann U, Vannay Á, Fekete A, Reusz G, Tulassay T, Szabó AJ. Sexual dimorphism in renal ischemia-reperfusion injury in rats: possible role of endothelin. Kidney Int. 62: , (IF: 5,016) 6. Szabó AJ, Tulassay T, Melegh B, Szabó T, Szabó A, Vannay Á, Fekete A, Süveges Z, Reusz G. Hyperhomocysteinaemia and MTHFR C677T gene polymorphism in renal transplant recipients. Arch Dis Child. 85: 47-49, (IF: 2,129) 126

127 13. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetet szeretnék mondani Prof. Tulassay Tivadarnak, hogy tudományos munkámat tanácsaival irányította. Négy évvel ezelott az o irányítása alatt kezdtem el Ph.D. munkámat. Bevont az Intézetben már folyamatban levo tudományos témákba, illetve önálló kutatási feladatokkal látott el. Az általa létrehozott szellemi muhely adott lehetoséget arra, hogy nemzetközi színvonalú kutatási programokban vehessek részt. Köszönöm témavezetomnek, Dr. Szabó Andrásnak, hogy tudományos pályámon elindított. Segítségével tanultam meg a helyes kérdésfelvetés, az adatgyujtés, az elemzés és az értékelés módszereit. A módszerek beállításához és a mérések végzéséhez szükséges vegyszerek anyagi hátterét is o biztosította. Köszönöm Dr. Szabó Attilának és Dr. Müller Veronikának, hogy bevezettek az állatokkal végzett in vivo munkába. Az is zkémia/reperfúziós vizsgálatok végzésekor adott tanácsaik nélkülözhetetlenek voltak a hatékony kutatómunka szempontjából. Prof. Reusz György segített hannoveri tanulmányutam megszervezésében és anyagi támogat ásában. Szintén köszönöm Dr. Juergen Strehlau-nak, hogy tanulmányutam során bekapcsolódhattam kutatócsoportjának munkájába. Ennek kapcsán sajátítottam el a molekuláris biológiai vizsgálatok végzéséhez szükséges ismereteket, készséget. Dr. Vásárhelyi Barna a Gyermekklinika kutatólaboratóriumában segített a kapott eredmények értékelésében és közlésében, a betegek mintáinak a gyujtésében és a humán genetikai vizsgálatok tervezésében és kivitelezésében. Köszönettel tartozom Dr. László Lajosnak és Ádori Csabának az immumhisztológiai mérések során nyújtott segítségért. Prof. Losonczy György az eredmények publikálásakor segített. Köszönöm az I. sz. Gyermekklinika kutatóinak, Dr. Fekete Andreának, Dr. Treszl Andrásnak, Dr. Héninger Erikának, Bányász Ilonának, Szebeni Beának, Dr. Rusai Krisztinának, Dr. Derzbach Lászlónak, Dr. Balogh Ádámnak, Dr. Kocsis Istvánnak, Dr. Gyorffy Balázsnak, Dr. Krikovszky Dórának és Dr. Tory Kálmánnak a kísérletes munkám során nyújtott baráti támogatást, a technikai segítséget, az együttmuködést és az ösztönzo ötleteket. Külön köszönettel tartozom Bernáth Máriának, Czárán Istvánnénak és Kertay Daisynek kísérleteim során nyújtott kituno technikai segítségükért. Végül köszönettel tartozom az I.sz. Gyermekklinika valamennyi munkatársának, hogy segíto, baráti légkörben végezhettem doktori munkámat. 127