Huzella Tivadar Emlékelőadás

Átírás

1 Huzella Tivadar Emlékelőadás Az extracelluláris vezikuláris kompartment Buzás Edit Semmelweis Egyetem Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet Budapest

2 Prof. Huzella Tivadar Prof. Huzella Tivadar Published flow cytometric studies on microvesicles in autoimmune diseases Nagyvárad, jún Alsógöd, júl. 11. Orvos, hisztológus, biológus, egyetemi tanár.

3 Published flow cytometric Prof. studies Huzella on microvesicles Tivadar in autoimmune diseases A hazai mikroszkópos anatómia, a szövettan, a fejlődéstan és az általános biológia kiemelkedő, nemzetközi szinten elismert alakja Szövettenyészeteket hozott létre, "mikrochirurgiás" műtéteket végzett, és a sejtosztódást mozgófilmre véve a hazai mikrokinematográfia megalapítója lett. Nagy jelentőségűek a sejtközötti állomány (biomátrix) biológiájára és a rostképződésre vonatkozó kutatásai Az 1933-os cambridgei és az 1936-os koppenhágai nemzetközi kísérletes sejttani kongresszusok elnöke, 1939 Anatomische Gesellschaft kongresszus főszervezője (Budapest)

4 Prof. Huzella Tivadar Ki javíthatná meg az emberek erkölcsét, ki tehetné azt életrevalóbbá, boldogítóvá, ha nem az orvos, akinek orvosi gondolkozását, orvosi működését nem máról holnapra változó erkölcsi felfogás szabályozza, hanem a jónak és rossznak megítélésében az élet örök principiuma az állandó mérték-egysége Huzella_Tivadar_az_etikaert_a_bekeert.pdf

5 Prof. Huzella Tivadar Theresa Niederberger - Gene Center Munich 5

6 Extracelluláris mátrix Az extracelluláris mátrix proteoglikánjaival (aggrekánnal) szembeni T sejt válasz és autoimmunitás vizsgálata

7 Extracelluláris mátrix aggrekán T sejt epitóp szerkezet, aggrekán arthritis jellemzése arthritogén T sejt hibridoma izolálása aggrekán epitóp-specifikus T sejt epitóp hierarchia leírása glükózaminoglikán oldalláncok szerepének igazolása arthritisben mátrix bontó glikozidázoknak mint az RA új prediktorainak azonosítása Az extracelluláris mátrix proteoglikánjaival (aggrekánnal) szembeni T sejt válasz és autoimmunitás vizsgálata

8 Extracelluláris vezikulák vizsgálata (2005-)

9 Az extracelluláris vezikuláris kompartment nyugvó és aktivált sejt nm exoszómák apoptotikus testek 1-5 m apoptotikus sejt mikrovezikulák 100 nm-1 m aktivált és tumor sejt Theresa Niederberger - Gene Center Munich 9 György et al. Cell Mol Life Sci. 2011, 68:

10 A vezikulaképzés evolúciósan konzervált Vesicle secretion is an evolutionary conserved process Gram-negatív baktériumok Gram-pozitív Bacillus anthracis Eukaryota paraziták (Trypanosoma, Leishmania ) Gombák (Ascomycetes és Basidiomycetes) Ember

11 Adaptive Adaptív sejtválasz cellular responses típusok öregedés szolubilis mediátor kibocsátás adhézió differenciálódás migráció vezikula kibocsátás apoptózis Theresa Niederberger - Gene Center Munich 11 György et al. Cell Mol Life Sci. 2011, 68:

12 Extracelluláris vezikulák Vezikulák (> 30 nm) Nat Immunol. 7, (2006)

13 Published Az flow extracelluláris cytometric studies on microvesicles vezikulák in autoimmune funkciói diseases Komplex intercelluláris információ-átvitel: molekulák nagy koncentrációban célbajuttatása, degradációtól való védelme (mrns, mir) Veszélyes molekulák eltávolítása (pl. MAC) A donor sejt funkcióinak támogatása, térben kiterjesztése (antigénbemutatás (MHC és Ag transzfer, tumor terjedés)

14 Az extracelluláris vezikulák funkciói Exoszomális mrns- és mirns transzfer Nat. Cell Biol. 9: 654-9, 2007 A keringő glioblastoma eredetű mikrovezikulák diagnosztikus biomarkerek. Nat Cell Biol 10: , 2008 Onkogén EGFRvIII receptorok horizontális transzfere Nat Cell Biol. 10: , 2008 sirns agyba juttatása iv. oltott exoszómákkal Nat Biotechnol , 2011

15 Extracelluláris vezikula alapú diagnosztika Prostata carcinoma (n=933)

16 Saját vizsgálataink 1. Elsőként végeztünk összehasonlító vizsgálatokat a különböző vezikula populációk esetében (MS és meta-analízis) 2. A vizsgálati eredményeket befolyásoló preanalitikai tényezők szerepének standardizálása 3. Mikrovezikulák vizsgálatára alkalmas módszerek bevezetése és az analízist zavaró tényezők azonosítása 4. Az eredmények alapján a mikrovezikula alapú diagnosztikus eljárásokat kísérlünk meg kifejleszteni.

17 1. Thymus sejt eredetű mikrovezikulák és apoptotikus testek vizsgálata (MS) apoptotikus test (1-5 m) mikrovezikula ( nm) Enzimek (kinázok pl. Lck), transzporterek, citokinek, ion csatorna fehérjék, G proteinnel kapcsolt receptorok, transzmembrán receptorok Turiák L Misják P. J Proteomics. 2011;74:

18 Meta-analízis Exoszóma Mikrovezikula 134 studies in the ExoCarta database 97 studies, PubMed Denzitás grádiens UC MS >5 emlős protein Kritériumok Differenciálcentrifugálás MS > 5 emlős fehérje 6 vizsgálat 7 vizsgálat Admyre et al Bard et al Graner et al Looze et al.2009 Matthivanan et al Wubbolts et al ~ 350 átfedő fehérje Aoki et al Banfi et al Dean et al Garcia et al Prokopi et al.2009 Peterson et al Turiak-Misjak et al Szabó G Tamás

19 Aktin jelátviteli fehérjék mikrovezikulákban Transporter Enzyme Peptidase Kinase Other Molecular group Transmembrane receptor Microvesicular proteins Actin nucleation and polymerization Formation of filopodia Actin polymerization Formation of lamellopodia Stabilization of actin filaments Contraction Relaxation of contractile forces Actin polymerization Stress fibers, focal adhesion, cell motility Fagocytosis, cell migration

20 Aktin jelátviteli fehérjék exoszómákban Transporter Enzyme Peptidase Kinase Other Molecular group Transmembran e receptor Exosomal proteins Actin nucleation and polymerization Actin polymerization Stabilization of actin filaments Contraction Actin polymerization Formation of filopodia Formation of lamellopodia Relaxation of contractile forces Stress fibers, focal adhesion, cell motility Fagocytosis, cell migration

21 Aktin jelátviteli fehérjék Transporter Enzyme Peptidase Kinase Other Molecular group Transmembrane receptor Microvesicular proteins Exosomal proteins Actin nucleation and polymerization Formation of filopodia Actin polymerization Formation of lamellopodia Stabilization of actin filaments Contraction Relaxation of contractile forces Actin polymerization Stress fibers, focal adhesion, cell motility Proteins present in both types of vesicles Fagocytosis, cell migration

22 Integrin jelátviteli fehérjék mikrovezikulákban Transporter Enzyme Microvesicular proteins Peptidase Kinase Other Molecular group Transmembrane receptor Integrin signaling Growth factor receptor signaling ERK/MAPK-mediated transcription JNK/SAPKmediated transcription Cytoskeletal rearrangegement PI3K signaling Wnt signaling Cell adhesion, migration, activation Cell motion

23 Integrin jelátviteli fehérjék exoszómákban Transporter Enzyme Exosomal proteins Peptidase Kinase Other Molecular group Transmembrane receptor Integrin signaling Growth factor receptor signaling ERK/MAPK-mediated transcription JNK/SAPKmediated transcription Cytoskeletal rearrangegement PI3K signaling Wnt signaling Cell adhesion, migration, activation Cell motion

24 Integrin jelátviteli fehérjék Transporter Enzyme Microvesicular proteins Exosomal proteins Proteins present in both types of vesicles Peptidase Kinase Other Molecular group Transmembrane receptor Integrin signaling Growth factor receptor signaling JNK/SAPKmediated transcription PI3K signaling Wnt signaling Cell adhesion, migration, activation ERK/MAPK-mediated transcription Cytoskeletal rearrangegement Cell motion

25 2. Preanalitikai tényezők szerepe vérplazma mikrovezikulák vizsgálata során Alvadásgátlás szerepe Sejt- és vérlemezke-mentesítés szerepe Sejtek és apoptotikus testek 1x 300g 10 International Society of Thrombosis and Haemostasis standardizációs workshopjában való részvétel György et al., Szántó et al. közlemények előkészületben

26 3. A mikrovezikulák áramlási citometriás mérésének standardizálása

27 György et al. Blood. 2011;117:e Size A mikrovezikulák determination of méretének microvesicles/microparticles meghatározása I. 1. Transmissziós elektronmikroszkópia (TEM) 500 nm Vérplazma mikrovezikulák (50,000x) 500 nm Synoviális folyadék mikrovezikulák (50,000x)

28 Size A mikrovezikulák determination of méretének microvesicles/microparticles meghatározása II. György et al. Blood. 2011;117:e Atomerő mikroszkópia (AFM), shaded topography 500 nm 500 nm Vérplazma mikrovezikulák Synoviális folyadék mikrovezikulák

29 Plasma MV Plasma MV Syn. Fluid MV Syn. Fluid MV György et al. Blood. 2011;117:e Size A determination mikrovezikulák of méretének microvesicles/microparticles meghatározása III. A mikrovezikulák mérete a TEM és AFM képek alapján Dinamikus fényszóráselemzés (DLS) TEM TEM diameter (nm) AFM diameter (nm) AFM Radius (nm) Plazma MV-k radius (nm) Synoviális MV-k diameter (nm) diameter (nm) Mikrovezikulák méreteloszlása: nm

30 Az immunkomplexek méretének meghatározása Size determination of immune complexes I. 200 nm 1 µm Laktoferrin anti-laktoferrin (topography) 250 nm Laktoferrin anti-laktoferrin (shaded topography) Mesterségesen előállított immunkomplexek György et al. Blood. 2011;117:e39-48.

31 Number of particles Az immunkomplexek méretének meghatározása Size determination of immune complexes II. AFM Természetes immunkomplexek (DLS) Diameter (nm) Radius (nm) Radius (nm) Radius (nm) Radius (nm) Radius (nm) Mesterségesen előállított immunkomplexek (DLS) György et al. Blood. 2011;117:e39-48.

32 Álpozitív CAUTION! áramlási False citometriás signals! jelek Mikrovezikula kapun belül immunkomplexek antitest aggregátumok

33 Nanoparticle tracking analysis (NTA)

34 Nanoparticle tracking analysis (NTA) Nanoparticle tracking analysis (NTA) Vérplazma mikrovezikulák Immunkomplexek György et al. kézirat előkészületben

35 A synoviális folyadék mikrovezikulák méreteloszlása (NTA) MV tartomány MV tartomány MV csúcs MV csúcs Osteoarthritis Rheumatoid arthritis György et al. kézirat előkészületben

36 Synoviális folyadék mikrovezikulák EM képe 1 µm 1 µm Rheumatoid arthritis, 50,000x Osteoarthritis 50,000x Amorf, nem vezikula jellegű komponensek a mikrovezikula preparátumokban György et al. kézirat előkészületben

37 György et al. Blood. 2011;117:e Mikrovezikulák-fehérje aggregátumok elkülönítésére javasolt módszer: Differentation differenciál between detergens MVs lízis and ICs Mikrovezikulák Immunkomplexek + Triton X100 (Tx előtt) (Tx után) Referencia gyöngy = MV szám 400 nm 400 nm

38 4. Mikrovezikula Synovial fluid mintázat MVs RA-ban CD3 + és CD8 + mikrovezikulák jellemzőek RA-ra György et al. kézirat előkészületben

39 Összefoglalás Conclusions EM, AFM, DLS, NTA: mikrovezikula átmérő: nm A fehérje komplexek biofizikai paraméterei átfednek a mikrovezikulák értékeivel (méret, fényszórás, ülepedés) A fehérje komplexek mikrovezikula-szerű jelet adhatnak detektálás során A fehérje komplexek szennyezhetik a mikrovezikula preparátumokat Az általunk bevezetett differenciál detergens lízis módszer lehetőséget teremt a mikrovezikulák fehérje aggregátumoktól való elkülönítésére, és alkalmazása a patomechanizmus új összefüggéseire hívhatja fel a figyelmet.

40 Az eredmények Relevance relevanciája Fokozott immunkomplex termelődés: fertőzések autoimmun megbetegedések hematologiai betegségek tumor MV-t utánozó jelet ad FACS során: avidin-biotin komplexek indirekt immunfestés antitestek önaggregációja

41 Comment on György et al, page e39, Blood, 27 January, Volume 117, Number Theresa Niederberger - Gene Center Munich 41

42 Vérplazma mikrovezikulák FACS analízise Published flow cytometric studies on microvesicles in autoimmune diseases Cardiovasculáris megbetegedések Autoimmun megbetegedések Haematológiai megbetegedések Daganatos megbetegedések Egyéb kórképek A mikrovezikulák száma emelkedett ~ 150 közlemény György et al. Cell Mol Life Sci. 2011, 68:

43 Folyamatban lévő és tervezett munkák Thymus vezikulák szerepének vizsgálata a centrális T sejt tolerancia kialakításásban Diagnosztikus fejlesztés A vezikulák autoimmun preventív vakcinációra történő felhasználási lehetőségének vizsgálata Poszttranszlációsan módosult vezikulák biológiai szerepének vizsgálata

44 Köszönetnyilvánítás SE GSI György Bence Szabó G Tamás Nagy György Misják Petra Aradi Borbála Pásztói Mária Pálóczi Krisztina Szántó Balázs Pállinger Éva Pap Erna László Valéria Pál Zsuzsanna Falus András Külföldi együttműködések: Universität Zürich: Steffen Gay Nanosight Ltd. Amesbury, UK Francoise Dignat George Marseille, INSERM Hazai együttműködések: KOKI: SE : KKKI: SZBK: Szegedi Egyetem: ORFI: Kittel Ágnes Módos Károly, Voszka István, Dérfalvi Beáta, Ligeti Erzsébet, Tímár Csaba, Lőrincz Ákos Vékey Károly, Turiák Lilla Deli Mária Tóth Kálmán, Csete Mária, Sipos Áron, Szalai Anikó Polgár Anna