Preklinikai vizsgálatok

Átírás

1 Preklinikai vizsgálatok Bölcskei Kata Pécsi Tudományegyetem Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet Állatkísérletek etikai alapelvei 1

2 Etikai alapelvek 3R: REPLACEMENT=HELYETTESÍTÉS: számítógépes modellezéssel vagy minél alacsonyabb rendű állattal (relatív helyettesítés) REDUCTION=CSÖKKENTÉS: minél kevesebb állatra legyen szükség az eredmények eléréséhez és/vagy adott számú állat felhasználásából minél több információt nyerjünk (anélkül, hogy több fájdalmat és szenvedést okoznánk) REFINEMENT=TÖKÉLETESÍTÉS: olyan kísérleti modellek használata, amelyben az állatokat minél kevesebb fájdalom és szenvedés éri + az állatok fajuknak megfelelő tartása és gondozása, jóllétének biztosítása - a kísérletnek szakmailag megalapozottnak kell lennie és várható tudományos hasznának arányban kell lennie az állatoknak okozott fájdalommal és szenvedéssel - megfelelő anesztézia alkalmazása olyan beavatkozások során, ahol az állat a pillanatnyinál hosszabb ideig van fájdalomnak kitéve - azokat az állatokat, amelyek a kísérletet követően hosszan tartó fájdalomnak, szenvedésnek, maradandó egészségkárosodásnak lennének kitéve, a kísérlet végeztével fájdalommentes eutanáziában kell részesíteni Jogi szabályozás Állatkísérletet kizárólag előzetes hatósági engedéllyel lehet folytatni! 40/2013. (II. 14.) Kormányrendelet 2010/63/EU EU Direktíva alapján - a kísérletekben felhasználható állatfajok és azok eredete - előírja az etikai alapelvek betartását - engedélyezett eutanázia módszerek fajonként - az állatok tenyésztésére, tartására és felhasználására vonatkozó működési követelmények: Munkahelyi állatjóléti bizottság felállítása (MÁB) személyzetre vonatkozó követelmények (végzettség, képzés) részletes állattartási és gondozási követelmények (fajonként) nyilvántartás vezetése - engedélyezés menete, elbírálás szempontjai - engedélyezés iránti kérelem tartalmi követelményei 2

3 Állatkísérletre felhasznált állatok aránya az EU-ban (2008) 59% egér 17% patkány 6% egyéb rágcsálók 9% halak, kétéltűek, hüllők 6% madarak < 2% páros/páratlan ujjú patás állatok < 1 % ragadozók < 0.1 % majmok Preklinikai vizsgálatok HATÉKONYSÁG - számos különböző állatmodell választható hatékonyság vizsgálatára - a Fázis II klinikai vizsgálatok sikere nagyban függhet attól, mennyire jó állatmodelleket használtak a preklinikai vizsgálatok során komplex pathomechanizmusú humán betegségeket nehéz állatokban modellezni: - egy modellben kimutatott hatékonyság többnyire nem elegendő - szükséges a modellek folyamatos tökéletesítése 3

4 Gyógyszerjelölt molekulák elbukásának okai II. fázis III. fázis Preklinikai vizsgálatok HATÉKONYSÁG Módszerek a hatékonyság vizsgálatára IN VITRO: sejt- vagy szövettenyészeten EX VIVO: izolált szerveken IN VIVO: hatékonyság vizsgálata egészséges állatokon VAGY betegségek kísérletes állatmodelljein 4

5 Preklinikai vizsgálatok HATÉKONYSÁG megbízhatóság: a mért paraméterek reprodukáhatósága és alacsony variabilitása farmakológiai érzékenység validitás: in vivo modellek esetén: etiológia, pathomechanizmus, tünetek és terápiás válasz szempontjából megfelel a humán betegségnek prediktivitás: a modellben kimutatott hatékonyság előrevetíti a klinikai hatékonyságot kísérleti elrendezés: kontrollált + a kezelés módja is időzítése is lehetőleg a klinikai szituációt modellezze Preklinikai vizsgálatok HATÉKONYSÁG A hatóanyag dózis-hatás görbéit és EC 50 /ED 50 több különböző modellben, lehetőleg különböző fajokon is meghatározzák a humán terápiás dózist ezekből az értékekből kell megbecsülni ( scale up ) - a hatóanyag koncentrációja érje el a terápiás szintet a célszervben - farmakokinetikai különbségeket figyelembe kell venni - általában a testfelülettől függ a dózis, nem a testsúlytól (testsúly/tesfelület arány: egér=3, patkány=6, humán=37) 5

6 Preklinikai vizsgálatok BIZTONSÁG A forgalomba hozatali engedélyhez a gyógyszerbiztonsági vizsgálatokat szigorúan szabályozott követelmények szerint kell elvégezni Általános toxikológiai vizsgálatok: legalább 1 rágcsáló és 1 nem-rágcsáló fajon elvégezni akut toxicitás ismételt dozírozású toxicitás (szubakut: 2 hét, szubkrónikus: 3 hónap, krónikus: 6 [US: 9] hónap) carcinogenicitás lokális tolerabilitás (pl. irritáció, szenzibilizáció) reproduktív toxicitás genotoxicitás (mutagenicitás) Biztonsági farmakológiai vizsgálatok: életfontosságú szervek működésére gyakorolt hatás (keringés, légzés, KIR) Preklinikai vizsgálatok BIZTONSÁG Korai gyógyszerbiztonsági vizsgálatok (non GLP) - akár a lead kiválasztása során, hogy kizárjanak olyan struktúrákat, amelyek nagy valószínűséggel okoznak mellékhatást pl. in vitro herg gátlás (szív K + csatorna) - a lead optimizáció során: a terápiás szélesség felmérése - szintén fontos szempont, hogy a mellékhatások befolyásolhatják az állatok viselkedését, ami a hatékonysági vizsgálatok értékelését zavarhatja mellékhatások életfontosságú szerveken: minden hatóanyag esetén megvizsgálni mechanizmus-alapú mellékhatások: célzott vizsgálatok, a target egyéb funkcióitól, expressziójától függően 6

7 PREKLINIKAI MODELLEK ÁTTEKINTÉS IN VITRO a hatékonyság a targetet expresszáló sejtvonalakon vagy natív sejteken végzett funkcionális tesztekkel vizsgálható PÉLDÁK a mérhető paraméterekre: - ionáramok, potenciálváltozások mérése elektrofiziológiai módszerekkel - membrán depolarizáció fluorimetriás detektálása - intracelluláris Ca 2+ fluorimetriás mérése - 45 Ca 2+ radioizotóp beáramlás mérése - G-protein aktiváció detektálása (pl. [ 35 S]GTPγS kötődés) - second messenger-ek szintjének mérése (pl. camp) - felszabaduló mediátorok mérése (pl. neurotranszmitterek) 7

8 R= (F340/F380) Intracelluláris Ca 2+ szint fluorimetriás mérése trigeminus ganglion sejteken - Fura-2-AM fluoreszcens, Ca 2+ indikátor festék - stimulus: 300 nm capsaicin 0,6 0,4 0,2 0,0 330 nm CAP time (sec) EX VIVO izolált szerv-fürdő: a frissen eltávolított szerv 37 C-os oxigenizált tápoldatban működőképesen tartható és vizsgálható PÉLDÁK a mérhető paraméterekre: bármely szerv: mediátorfelszabadulás szív (következő dia!) simaizom-szervek (erek, GI, húgyhólyag etc.): - kontrakció-relaxáció izometriás vagy izotóniás regisztrációja agyszelet, izolált bőr-ideg preparátum: - elektrofiziológiai módszerekkel: érzékenység különböző ingerekre, küszöbmérés, akciós potenciál frekvencia 8

9 Langendorff izolált szív preparátum a szív az aortába helyezett kanülön keresztül van perfundálva (retrográd) + a bal kamrába a mitrális billentyűn keresztül ballon van behelyezve Mérhető paraméterek: coronaria áramlás, EKG kontraktilitás, bal kamra systolés/ diastolés funkció Neuropeptid felszabadulás izolált tracheából 1 μm capsaicin stimulus 9

10 Izolált bőr-ideg preparátum IN VIVO: mérések ALTATOTT állatokon a. és v. femoralis kanülálás PÉLDÁK: - hemodinamikai mérések kanülök behelyezésével: a. femoralis, bal kamra (a. carotison keresztül), a. pulmonaris (v. jugularison keresztül): vérnyomás, bal kamra funkció, perctérfogat - vérátáramlás mérése Laser Doppler flowmetriával - EKG mérés - direkt légzésfunkció mérés trachea kanülön keresztül - elektrofiziológiai mérések perifériás idegeken és KIR-ben nyomás transducer 10

11 vérnyomás közép vérnyomás MAP szívfrekvencia testhőmérséklet IN VIVO: gyulladásos tünetek mérése altatott állaton - ÖDÉMA FENT: fülvastagságmérés mikrométerrel JOBBRA: lábtérfogatmérés pletizmométerrel 11

12 IN VIVO: gyulladásos tünetek mérése altatott állaton - PLAZMA PROTEIN EXTRAVAZÁCIÓ (PPE) - Evans Blue festék i.v.: albuminhoz kötődik csak ott tudni kilépni az erekből, ahol PPE történik más módszerrel: 125 I-jelölt albumin i.v. γ sugárzás mérése IN VIVO: gyulladásos tünetek mérése altatott állaton - PLAZMA PROTEIN EXTRAVAZÁCIÓ (PPE) - i.v. adott micellába zárt fluoreszcens festék (indocyanin green) akkumulációjának detektálása optikai imaging-gel - micella csak ott tud a szövetekbe jutni, ahol extravazáció van 12

13 IN VIVO: gyulladásos tünetek mérése altatott állaton VAZODILATÁCIÓ vazodilatáció véráramlás növekedése Laser Doppler flowmetria, Laser Doppler imaging IN VIVO: gyulladásos tünetek mérése altatott állaton - reaktív oxigén szabadgyökök (ROS) termelődése ROS érzékeny lumineszcens reagens injekciója in vivo biolumineszcencia imaging 13

14 IN VIVO: vitális funkciók mérése ÉBER állatokon hemodinamika: krónikus kanül implantació, krónikus EKG elektród implantáció mérés idején hagyományos transducerhez kapcsolva TELEMETRIA: a kanülök vagy EKG elektródák egy beültetett transducerhez vannak kötve, ami rádiofrekvenciás szignálokkal továbbítja a mért értékeket folyamatos monitorozás a saját ketrecében - a testhőmérséklet szintén monitorozható ugyanígy IN VIVO: vitális funkciók mérése ÉBER állatokon légzésfunkció: non-invazív légzésfunkció mérés: TELJES TEST PLETIZMOGRÁF a kamrába anyagok porlaszthatóak be pl. bronchiális hiperreaktivitás vizsgálatára 14

15 Kardiovaszkuláris betegségmodellek - példák HIPERTENZIÓ: spontán hipertenzív patkányok (WKY), Dahl sóérzékeny patkányok indukált: deoxikorticoszteron acetát (DOCA), angiotenzin II, L-NAME (NO szintáz gátló) MIOKARDIÁLIS ISCHAEMIA: a. coronaria ág lekötése SZÍVELÉGTELENSÉG: aorta banding, ischaemiával kiváltott ATHEROSCLEROSIS: nyúl, disznó: magas kolesztein-tartalmú táp örökletesen hiperkoleszterinémiás nyúl törzs apoe / egér, LDL receptor / egér Léguti betegségmodellek - példák AKUT GYULLADÁS: bakteriális endotoxin (LPS) inhaláció ASZTMA: szenzitizáció allergénekkel (ovalbumin, poratka allergén etc.) COPD: krónikus cigarettafüst expozíció 15

16 IN VIVO: nocicepció vizsgálata ÉBER állatokban fájdalom: kellemetlen szenzoros és emocionális tapasztalat állatokban közvetlenül nem mérhető (még) nocicepció: periférás és centrális idegi folyamatok, amelyek a potenciálisan szövetkárosító ingereket kódolják fájdalomkeltő inger elhárító válasz TERMOnocicepció hő stimuláció MECHANOnocicepció mechanikai stimuláció különböző jellegű: nyomás, pontszerű KEMOnocicepció irritáns anyag alkalmazása TERMONOCICEPCIÓ Hargreaves teszt: fókuszált fény/infravörös sugár lábelhúzás latenciaideje Emelkedő hőmérsékletű forró lap: szobahőről elhárító reakcióig fűtjük nociceptív küszöbhőmérséklet 16

17 TERMONOCICEPCIÓ Emelkedő hőmérsékletű vízfürdő: 30 C-ról elhárító reakcióig nociceptív küszöbhőmérséklet MECHANONOCICEPCIÓ Randall-Selitto teszt: emelkedő NYOMÁS mechanonocieptív küszöb 17

18 MECHANONOCICEPCIÓ Dynamic Plantar Aesthesiometer: emelkedő erejű pontszerű stimulus mechanonocieptív küszöb MECHANONOCICEPCIÓ von Frey szálak: különböző vastagságú hajlékony szálak: statikus pontszerű stimulus mechanonocieptív küszöb ( fel-le módszerrel) 18

19 Fájdalommodellek AKUT HIPERALGÉZIA - nociceptorok közvetlen stimulációja/ szenzibilizációja (pl. capsaicin, mustárolaj, formalin) - hőtrauma (forrázás) SZUBAKUT GYULLADÁS: -intraplantáris carragenin vagy zymosan (1-2 óra múlva) KRÓNIKUS GYULLADÁS: - intraplantáris CFA (Complete Freund s Adjuvant = inaktivált Mycobacterium, olajos szuszpenzióban) Fájdalommodellek ARTRITISZ MODELLEK: - intraarticuláris injekció: kaolin-carragenin, CFA, zymosan - reumatoid artritisz modellek: szisztémás+lokális CFA kezelés kollagén-antitest indukált artritisz K/BxN transzgén egér, K/BxN szérum transzfer artritisz OSZTEOARTRITISZ MODELL: - monojódacetát (MIA) intraarticuláris injekció: chondrocyták működését gátolja porc degeneráció 19

20 Noxious heat threshold ( o C) heat injury: 51 o C 20 s solvent i.p. SB mg/kg i.p. SB mg/kg i.p. SB mg/kg i.p treatment * * * * * Control min after heat injury Neuropátiás fájdalommodellek TRAUMÁS mononeuropátia: - n. ischiadicus sérülés: részleges lekötés krónikus konstrikció - L5-L6 spinalis ideg lekötés - spared nerve injury DIABETESES polineuropátia - streptozotocin (STZ)- indukált kísérletes diabetes TOXIKUS polineuropátia - citotoxikus szerek: cisplatin, paclitaxel 20

21 L5 spinalis ideg lézió IN VIVO: viselkedési vizsgálatok éber állatokon OPEN FIELD TEST: spontán lokomotor aktivitás 21

22 LABORAS: automatizált viselkedéskövető rendszer saját ketrecben: számos normális és kóros viselkedésmintázatot tud elkülöníteni Motoros koordináció, izomerő JOBB: ROTA-ROD LENT: horizontal grid teszt 22

23 ELEVATED PLUS MAZE, ELEVATED ZERO MAZE: szorongás (kép forrása: ugobasile.com) LIGHT-DARK BOX: szorongás, fotofóbia 23

24 Társas interakció teszt kép forrása: ugobasile.com MORRIS WATER MAZE: tanulás 24

25 Pszichiátriai betegségmodellek - példák DEPRESSZIÓ: Indukció: - ismételt, elháríthatatlan stressz expozíció learned helplessness modell - krónikus enyhe stressz, szociális stressz, anyai depriváció - gyógyszer-indukált: rezerpin, pszichostimuláns megvonás Tesztek: forced swim teszt, tail suspension teszt, szacharóz preferencia, szorongás-tesztek Pszichiátriai betegségmodellek - példák SKIZOFRÉNIA: Indukció: - gyógyszer-indukált: amfetamin, PCP - leválasztás utáni szociális izoláció - fejlődési: intrauterin methilazoximetanol (MAM) kezelés, neonatális hippocampus lézió Tesztek: locomotoros aktivitás, kognitív tesztek, társas interakció, szenzorimotoros gating 25