előállítása a mikrovilág képviselőinek élettani tulajdonságait ismerő szakértők közreműködésével 150 ábra ( )

Átírás

1 GYÓGYSZERIPARI MIKROBIOLÓGIA Piacképes gyógyászati és élelmiszeripari termékek előállítása a mikrovilág képviselőinek élettani tulajdonságait ismerő szakértők közreműködésével 150 ábra ( )

2 Az ipari-mikrobiológia, profitot termelő alkalmazott tudomány (1870) Il n y a pas des sciences appliquées. Mais il y a des applications de la science Louis Pasteur 1876 If you take care of your microbial friends, they will take care of your future David Perlman 1960

3 KÜZDELEM A MIKROBIÁLIS KÓROKOZÓK ELLEN antibiotikumok felfedezése Mikroorganizmus által létrehozott hatásos anyag a mikroorganizmusok szaporodásának akadályozására (antibiózis) P. Vuillemin 1889 (a szimbiózis ellentéte) Roberts 1870 Penicillium glaucum tenyészete mellett nem nő a baktérium 2500 éves kínai feljegyzés szerint, szóján növekedő penész sikerrel alkalmazható a furunkulus ellen

4 Kemoterápia Paul Ehrlich ( ) 1906 Nobel-díj Corpora non agunt nisi fixata P. Ehrlich O. Hata 606 Salvarsan arzén származék A lues feltételezett korokozója leküzdésére Treponema pallidum Τρεπο νεµω (forgó fonal) mérete 0.2 µm x 5 µm!

5 SALVARZÁN gátolja a piruvát dehidrogenáz komplex működését, (liponsavval a hatás felfüggeszthető!) liponsav hiányt okozva akadályozza az acetil-s-coa képződését piruvátból

6 A salvarzán hatásmódja

7

8 Prontosil Mietzsch & Klarer Domagk 1935 PAB analog

9 A tetrahidrofólsav képződést zavarja a szulfonamid jelenléte, a dehidrofólsav reduktáz működését pedig a trimetoprim

10 2,4-diamino-5(3,4,5-trimetoxibenzil)-pirimidin

11 pyrimetamin, a 2,4-diamino-5(p-klórfenil)-6-etil-pirimidin.

12 A tetrahidrofólsav kiemelkedő élettani jelentőségét igazolja többek között a timin képzésben vagy a hem bioszintézisben játszott szerepe

13 A szulfonamidok baktérium-spektruma Gram-pozitív és Gram-negatív mikroorganizmusokon kívül az Actinomyces, Toxoplasma és Coccidium fajok, valamint a Plasmodium malariae ellen is felhasználhatók, sőt néhány Rickettsia szaporodását is gátolja Gyenge hatású viszont az Escherichia, Pseudomonas, Proteus, Klebsiella, Brucella, Aerobacter fajokkal szemben.

14 PAB analógként a tetrahidrofólsav képződést akadályozza

15 Para-amino-szalicil sav p-amino-benzoesav analógként a tetrahidrofólsav képződést zavarja

16 Izo-nikotinsav-hidrazid (piridoxálfoszfát) piridoxamin, nikotinsavamid analóg

17 A triptofán szintetáz aktív centrumában működő piridoxál-foszfát Schiff bázist alkotva a szerinnel, képes reagálni az indol glicerofoszfáttal. Az INH zavarja ezt a reakciót.

18 A hatóanyag eloszlása a szevezetben

19 A giráz működését zavarja

20 az RNS magra feltekeredett DNS fellazítását végző giráz működését gátolja PEFLOXACIN 1-etil-6-fluoro-7-(4-metil-1-piperazinil)4-oxo-1,4-dihidro-3-kinolin karbonsav

21 Nalidix sav

22

23 Girázgátló hatású antibiotikum! Streptomyces spheroides, S. niveus, S. griseoflavus, S. griseus, valamint több nem azonosított Streptomyces törzs termékeként is leírták. Benzoesav származékkal szubsztituált kumarin származék, amihez egy novióz kapcsolódik. Mindkét aromás komponense shikiminsavból, a cukor komponens pedig UTP-glükózból képződik. novióz kumarin származék benzoesav származék

24 A terápiás szélesség megállapítása

25 Anyagfelhalmozódás szövetenként eltérő Vér-agy gát működése Placenta elkülönítő hatása Anyaglebomlás útja (mellékhatások) Köztestermékek biológiai hatása, toxicitás kiürülése A hatóanyag távozás: Vizelet, fécesz, verejték, légzőszerv

26

27

28 Hatóanyag bevitel Infúzióval Emésztő csatornán Intravénásan Intramuszkulárisan Subcutan Inhalálás útján Hám felszínére juttatva (kenőcs, gél, tapasz)

29 Antibiotikumok aranykora Hatásmód szerint megkülönböztethetünk baktérium sejtfalszintézist gátló, membránkárosító, fehérjeszintézist gátló, DNS képződést gátló, RNS szintézist gátló vegyületeket. Kémiai szerkezet szerint megkülönböztethetők az azetidinon (ß-laktám) szerkezetűek aminoglikozidok, tetraciklinek, makrolidok, ansa-láncúak, oligopeptidek, antraciklinek, poliéterek, spirolaktonok, ciklopentano-perhidrofenantrén vázúak, poliének, poliketid vázból épülők, antimetabolitok (anyagcsere köztestermékek, nukleotidok és aminosavak analógjai),

30 Különböző antibiotikumokat termelő mikroorganizmusok rendszertani csoportjai Antibiotikum Gombák Streptomyces Micromonospora Nocardia Baktériumok Aminoglikozidok Anthraciklink Ansaláncuak Bleomycinek Chloramphenicol Cycloserin βlaktámtípusúak Makrolidok Tetraciklinek +++ Poliének Fungisztatikumok ++ +

31

32

33

34

35 Fonalas prokarióták által termelt hatóanyagok Ipari szempontból Jelentősebb törzsek neve A hatásos anyag neve Streptomyces rimosus Oxitetraciklin Streptomyces griseus Sztreptomicin (Actidion) Streptomyces aureofaciens Aureomicin Streptomyces venezuelae Klóramfenikol Streptomyces noursei Nisztatin (Actidion) Streptomyces kanamyceticus Kanamicin Streptomyces fradiae Neomicin (Actidion) Streptomyces erythreus Eritromicin Streptomyces cinnamonensis Monensin

36 A Sermonti és Hopwood által részletesen vizsgált Streptomyces coelicolor géntérképének felderítettsége. Mai típustörzse S. violaceoruber (ATCC 14980). A Streptomyces lividans vektorgazdaként került Hopwood laboratóriumába. Escherichia coli-ban és a Streptomyces lividans--ban is jól működő, bifunkcionális plazmidjaik megalkotása Streptomyces lividans légmicéliumának átalakulása spóralánccá A Streptomyces-plazmid restrikciós térképe. A restrikciós enzimek hasítóhelyeit. Ez a plazmid a Streptomyces coelicolor A3, a Streptomyces lividans 66 és a Streptomyces parvulus ATCC törzsekben képes replikálódni.

37

38 A penicillin bomlékonysága

39

40 A kutató munka igazolta a fonalas gombafajok genetikai állományában a penámváz szintézisére szolgáló enzimek génjeinek jelenlétét ASCOMYCETES (perfekt) DEUTEROMYCETES (imperfekt) Emericella nidulans Aspergillus nidulans Eurotium Penicillium notatum (chrysogen Sartorya Epidermophyton Eupenicillium Trichophyton Talaromyces Microsporum Carpenteles Malbranchea Thermoascus Polypaecilum Gymnoascu Arthroderma Nanizza

41 Aminosavösszetétel egyezése

42 A fonalas gombák DNS állományában a Cephalosporin váz képzéséhez szükséges enzimek jelenlétét igazolták Az N penicillin képződéséhez szűkséges; ACV tripeptid szintetáz (ACVs), és izopenicillin N szintetáz (IPNs) enzimeken kívül; az izopenicillin epimeráz továbbá a gyűrűtágító rendszer, az expandáz, dezacetoxicephalosporin C szintetáz valamint a befejező lépéseket katalizáló hidroxiláz, aciláz karbamoil transzferáz, és a metiltranszferáz jelenléte is bizonyított. ASCOMYCETES DEUTEROMYCETES Emericellopsis Cephalosporium acremonium (Acremonium chrysogenum) Byssochlamys Paecilomyces persicinus Arachnomyces Scopulariopsis Anixiopsis Diheterospora Spiroidium

43

44 Penicillium notatum Penicillium chrysogenum A két faj között észlelhető anatómiai eltérés

45 Az antibiotikum képződése a Penicillum chrysogenum fiziológiailag aktív csúcssejtjében folyik

46

47

48 A penám váz képződésének a szerveződése

49

50

51 Prökaróta és eukarióta Izopenicillin-N szintetáz kémia szerkezeztének (aminosav-szekvencia) összehasonlítása Az aminosavak bekeretezése hívja fel az olvasó figyelmét a kis mértékben eltérő szerkezetre!

52 Azetidinon származékok képződésének a vázlata penám és kefém termékek képződése

53 ß-laktám antibiotikumok képződése különböző mikroszervezetek fiziológiailag aktív sejtjeiben Penicillin-G Cephalosporin-C Cephamycin-C Penicillium chrysogenum Acremonium chrysogenum Streptomyces clavuligerus

54 Az építő elemek (a három aminosav) szintézise

55 L α-aminoadipinfélaldehid a prokariótákban a lizin metabolizmus köztes terméke

56 Lizin bioszintézis köztes terméke a gombákban

57 Folyamatábra

58 Magyarázó szöveg a penicillin gyártás folyamatábrájához (1) termelőképesség szempontjából "nemesített ipari törzs" (2) agar tenyészet, vagy rizs szemeken spórázó tenyészet (3) termelőképesség szempontjából minősített spóraszuszpenzió (4) oltóanyagtenyésztő bioreaktor, keverővel ellátott, aerob inokulum-fermentor (5) ph szabályozott, kevert aerob termelő fermentor prekurzor [fenilecetsav] adagolással (6) a semleges fermentlé szúrése vákuum dobszűrővel (7) hűthető tároló tartály (8,9,10) szeparátort igénylő extrakciós lépések (11) penicillin-só kristályosító (12) szűrőcentrifuga (13) vákuum szárítószekrény (14) granuláló (15) átkristályosító (16) szűrő (17) prokainsó képzés (18) penicillin-nátrium-só steril átkristályosítása (19) steril szűrők (20) vákuum szárító (liofilező) (21) steril penicillin tároló (22) Kiszerelés gyógyszertári forgalmazhatóság céljára.

59

60

61 Miért nem toxikus a penicillin?

62

63 A pentapeptid D-Ala D-Ala végződésének az összehasonlítása a G-PENICILLIN szerkezetével

64

65 penicillináz

66 Az azetidinon származékok első kifejlesztői a létért való küzdelemben a pokarióták voltak Streptomyces clavuligerus, Nocardia lactamdurans, Lysobacter lochenigenus, Flavobacterium A fonalas gombák a prokariótáktól vették át a génállományt A Streptomyces clavuligerus Cephamycin-C termelésére képes

67 Cephamicin képződés izopenicillin N-ből a prokariótákban

68 Streptomyces clavuligerus cefamycin mellett a penicillinázt inaktíváló hatásos vegyületet is szintetizál

69

70 Nem csekély sikert könyvelhet a két, biológiai szempontból akltív vegyület forgalmazója

71

72 A ß-laktám szerkezet jelentősége alkalmas szubsztituens jelenlétében a ß-laktám gyürű is elegendő a hatás kiváltásához

73 nocardicinek

74 monobactámok

75 G-penicillin kémiai szintézise 1949-ben csupán 1%-os hatásfokkal!!!

76 A penám és cefém váz felhasználása A félszintézis jelentősége A bakteriális spektrum szélesítése A felszívódás javítása A saválló tulajdonság javítása Penicillináz rezisztencia fokozása

77

78 6-APS A penicillin félszintézis kindulási anyaga

79 A képződő penám váz könnyen dimerizálódik, illetve a jelenlevő CO 2 - dal reagálva inaktíválódik

80 A penicillináz rezisztens methicillin szerkezete

81 A vérszint alakulása

82 Ampicillin D-fenilglicin származék előállítása

83 Oxacillin előállítása félszintézissel

84

85 cefoperazon

86 A Streptomyces orientalis törzs termékeként izolált Vancomycin a glikopeptid antibiotikum-csoport gyógyszerként forgalomba került tagja

87 Az antibiotikumcsoport néhány tagja

88 Rezisztenciát okoz a D-Ala végződés tejsavra való cserélődése

89

90 Ezt az egyszerű szerkezetű, (D-4-amino-3-izoxazolidon) Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok növekedését gátló, főleg antituberkulotikumként felhasználásra került antibiotikumot az ötvenes évek derekán, négy egymástól független kutatócsoport, négy különböző Streptomyces törzs fermentlevében találta Harned: S. orchidaceus. Shull: S.lavendulae. Harris: S. garyphalus. Kuzikava: S. roseochromogenes

91 A foszfonomicin gátolja a PEP részvételét a bioszintézisben A Merck kutatói több Streptomyces törzs (S. fradiae, S.viridochromogenes, S. wedmorensis) tenyészlevében is megtalálták.

92 Membránt károsító cirkuláris peptidek Bacitracin Gramicidin S cyclosporin-a

93 A Bacillus licheniformis tenyészlevében felszaporodó hatóanyag foszfatázgátlóként akadályozza a muraminsav-pentapeptid távozását a prokarióta citoplazmájából

94 Tiotempláton szintetizálódik

95 Gramicidin S depsipeptid szerkezete (2 pentapeptid) a termék polaritását a 2 ornitin egyirányba ható aminocsoportja képviseli L Pro L Val L Orn L Leu D Phe D Phe L Leu L Orn L Val L Pro

96 A Bacillus brevis termelte decapeptid, a GRAMICIDIN-S szintézise oszlopreaktorban, rögzített enzimekkel (Wang et al. M.I.T.)

97 Gombák növekedését gátló hatóanyagok felhasználása más farmakológiai feladatok megoldására Immunszupressziv hatás Koleszterinszint szabályozás

98 A 33 tagu gyürüs peptid aminosav összetétele: A 33 tagu gyürüs peptid aminosav összetétele: 1:N-metil-γ-butenil-γ-metil-L-treonin, 2:aminovajsav; 3:szarkozin; 4:metilvalin; 5:valin; 6:metil-leucin; 7:alanin; 8:D-alanin; 9:metil-leucin; 10:metil-leucin; 11:metil-valin (Az egyetlen D-alanin kivételével minden aminósav L )

99 A Trichoderma polysporum tenyészet termelte depsipeptid, a cyclosporin-a immunszupresszív aktivitású

100

101

102

103 Immunszupresszív hatású bioaktív makrolidok Az intravénásan illetve szájon keresztül is adható vegyület Streptomyces tsukubaensis tenyészlevéből izolálható. Gátolja a T-sejtek aktíválását. A citoszolban kialakuló komplex gátolja a calcineurin aktívitását, a kalcium-függő szerin/treonin foszfatáz hatásos működését. Az intracelluláris receptora azonban nem azonos a ciklosporint kötő fehérje szakasszal,

104 A -vastatin vegyületcsoport a 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA redukcióját (már 1 nm) kompetitíven gátolva akadályozza a mevalon-sav képződését, a mevalon-sav hiány viszont akadályozza a(z ergo)szterin szintézist. Ezért gátolja a gombák növekedését A mevalonsav oxidoreduktázt gátló "-vastatin" vegyületek a zsírsav szintézis enzimeit alkalmazva malonil-coa építőelemek felhasználásával sztearinsav méretű 8,14,16-trienil-β,δ-dihidroxi-oktadecén-savon keresztül készülnek

105

106 Riboszómális fehérjeszintézist gátló biológiailag aktiv termékek

107

108 Az aminoglikozid antibiotikum csoport Waksman által elsőként talált képviselője A riboszóma 30S alegységében az S-12 fehérjéhez kötődik. Katalitikusan hidrogénezhető pl. nehézhidrogénnel, triciummal

109 A rezisztencia oka lehet a templát módosulása is!

110

111

112 Escherichia coli-ban egy aminosavat tartalmazó peptidlánc másodperc alatt készül el. Egy mrns egyidőben 4-5 riboszómához kapcsolódhat egymástól 97 nukleotídnyi távolságra. A mrns életidejét működésben létének köszönheti. Általában átlagban 50 ciklust ér meg, ha folyamatosan szolgálatban van, azaz működő riboszómákkal van kapcsolatban, mert a riboszómához kapcsolt mrns-t a ribonukleáz nem képes bontani.

113 Micromonospora purpurea terméke

114

115

116 Streptomycin szintézis

117 MAKROLID SZERKEZETŰ ANTIBIOTIKUMOK

118 A Streptomyces erythreus által termelt makrolid szerkezetű antibiotikumok első képviselője

119

120 TETRACIKLINEK

121

122

123

124

125

126

127 Oxitetraciklin spontán lebomlása

128 α-doxycyclin előállítása oxytetracyclinből

129 vérszint alakulása α doxycyclin adagolása után

130 Riboszómális fehérjeszintézist gátolja az eukariótákban Streptomyces törzsek tenyészlevéből izolálható

131

132 [7-klór-4,6,2 -trimetoxi-6 -metil-2 - grizén-3,4 -dion] képződése Penicillium griseofulvum tenyészetében

133

134 Ansaláncú antibiotikumok

135 Rifamycinek a Nocardia mediterranea tenyészlevében

136 A rifamycinek biológiai aktivitásának összehasonlítása MIC érték in vitro Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus fertőzés kivédése mérőtörzs használatakor egérben in vivo végzett méréssel mg.ml-1 mg/kg i.m. adva mg/kg per os adagolva rifamycin-b 0, rifamycin-o 0, rifamycin-s 0, rifamycin-sv 0, rifamp(ic)in 0,002 0,12 0,11

137 Rifamicin ansa láncú antibiotikum-csoport

138 A rifamycin váz szintézise tiotempláton folyik a zsírsavszintézishez hasonlóan, metilmalonil-coa elemekből. A bioszintézis az aromás mag képződésével indul.

139

140

141 FUNGISZTATIKUMOK

142 Polién fungisztatikumok mikozamin

143 Streptomyces noursey által termelt polién szerkezeti képlete (C 47 H 75 O 17 N) az építőelemeinek feltüntetésével

144 Mikózamin képződése glükózból

145

146 Fumagillin Aspergillus fumigatus

147 Új antibiotikum előállítás (kutatás) műveletei Talajminta, élőhelyekről populáció gyűjtése Ismételt szélesztés szilárd táptalajra, majd az önálló telepeket tartalmazó lemez fertőzése Homogén tenyészet izolálása a tesztorganizmus növekedését gátló telepről Levegőztethető tenyészet indítása nitrogén- és szénforrást tartalmazó folyékony táptalajon. A tenyészet biológiai aktivitásának meghatározása

148 Inokulum oltáshoz használható tenyészet előállítása, az optimális paraméterek megállapítása A termelés szempontjából optimális fizikai és kémiai körülmények keresése A hatásos aktivitás mennyiségi meghatározása, tárolhatóságának (stabilitásának) vizsgálata, az aktivitás fél-életidejének meghatározása, Biológiai homogenitásának vizsgálata. A termék kinyerése

149 Kromatográfiás módszerrel a biológiai aktivitás homogenitásának vizsgálata (bioautográfia) Baktérium spektrum vizsgálata (Gram+, Gram, élesztő) A hatóanyag kémiai természetének vizsgálata, meglevő anyagokkal való összehasonlítás Toxicitás-vizsgálat, állati vagy növényi sejteken Hatásmód vizsgálata A metabolizmus vizsgálata a gazdaszervezetben és a pusztítandó baktériumban Rezisztencia kialakulásának vizsgálata A hatásos anyagot termelő törzs élettani képességeinek vizsgálata, javítása Előnyösebb hatású származékok előállítása

150