kiindulási vegyületből egy vagy több enzim specifikus a célvegyületnek tekintett piacképes hasznos termékhez juthatunk.

Átírás

1 MSc-BIOTERMÉK TECHNOLÓGIA frissítve: Az ismertetendő eljárásokban különféle szerves vagy szervetlen kiindulási vegyületből egy vagy több enzim specifikus katalitikus aktivitását hasznosítva a célvegyületnek tekintett piacképes hasznos termékhez juthatunk.

2

3 A felsőoktatási intézmény irányító szervezete elvárja az oktatók és a hallgatók öntevékeny együttműködését. Arisztotelesz aforizmája szerint: A műveltség jó sorsban ékesség, balsorsban menedék Az értelmiségi személy számára a tudás birtokba vétele örömöt jelent: FELIX QUI POTUIT COGNOSCERE CAUSAS (Boldog, aki a dolgok okait ismerni tanulta) Vergilius:Georgicon II 489

4 DEBRECENI EGYETEM* UNIVERSITAS DEBRECINENSIS UNIVERSITAS MAGISTRORUM et SCHOLARIUM A hallgatók és oktatók együttműködő, az államtól és egyháztól független, autonóm gyülekezete Bologn Bologna 1100, Párizs 1150, Cambridge 1230, Oxford 1249, Prága 1337, Bécs 1354, (Pécs ), Krakkó 1364, Heidelberg 1385, Wittenberg 1502, Nagyszombat 1635(Buda 1777 Pest 1784), Kolozsvár 1872(Báthory 1570?), Debrecen 1912(1538), Pozsony A felsőoktatási intézmények feladata az évenként megjelenő korosztályok tehetséges képviselőinek a kiválasztása, testi és szellemi adottságaiknak, képességeiknek hasznosítható tudássá fejlesztése. A külső körülmények befolyásolásával gazdasági előnyre törekvő M.Sc. BIOMÉRNÖK számára fontos az élő rendszerek fennmaradását és zavartalan működését befolyásoló mechanizmus ismerete, továbbá az, hogy a szabályozó rendszerbe történő milyen beavatkozás hozhat, illetve hozott erkölcsi és anyagi hasznot a téma művelői számára. * Az egyetem fogalom (szó) megalkotója Verseghy Ferenc nyelvújító (1805) frissítve:

5 Az ezredfordulótól a számítógép adta lehetőséget kihasználva az előadásokat kiegészítő írásos anyag valamint az előadáson vetített ábrák letölthetők a honlapról Az elsajátítandó ismeretanyag az Universitas hallgatóinak srgítségével folyamatosan fejlesztett formában tanulmányozható. (Az előadandó téma könnyebb megérthetősége érdekében célszerű néhány fizikai, kémiai, biokémiai, genetikai és mikrobiológiai alapismeret felelevenítése)

6 Gyulladásgátló kortikoidok gazdaságos előállítása. piacképes gyógyászati termék:a prednizolon 19 Szteroid alapváz (androsztén váz) gazdaságos nyerése természetes alapanyagból 36 Ösztrogén váz előállítása prokirális kiindulási anyagból 48 6-aminopnicillansav eőállítának jelentősége 65 Izfokozóként L-glutaminsav és tápkiegészítőként használható esszenciális aminosavak előállítása 86 Nádcukrot (répacukrot) kiváltó IZOCUKOR nyerése keményitőből (Bioetanol program) 106 Környezetszennyezés felsziámolása mikroszervezetek biológiai aktivitásának felhasználásával 118 Schardinger (ciklo)dextrin 127

7 Propilénoxid (oxirán) előállítása propilénből a légköri oxigén felhasználásával

8 sztereoizomeria xx strukturizomeria xx ábrázolási változatok (áttekintése) felelevenítése xx a kiralitás ábrázolása Energetikailag a természetben a székforma az előnyösebb

9 Kiralitás D Konfiguráció L HO C=O HO C=O H 2 N C H H C NH 2 H C H H C H H H H C=O O=C H HO C H H C OH H C OH HO C H H H Izomerizáció az akirális dioxiacetonon bemutatva A szénatom tetraéderes szerkezetű! H 2 C-OH C=O H 2 C-OH

10 Anomerizáció Az anomerek átalakulása spontán folyamat az egyensúlyi állapot eléréséig [a] 20 D= , α-d-glükopiranóz β-d-glükopiranóz [a] 20 D= A vízben oldott monomer forgatóképessége folyamatosan változik amíg el nem éri az egyensúlyi állapot ( 1 / 3 α-d-glükóz 2 / 3 β-d-glükóz) adta értéket, a ot a dextróz (jobbra) forgató képességét Epimerizáció katalitikus folyamat Egy szénatom konfigurációja különbözik: galaktóz glükóz OH H C E-NAD + O=C E-NADH C E-NAD + H OH átmeneti 4-keto termék UDP-galaktóz UDP-glükóz

11 A hidrolízist követő anomerizáció határozza meg a reakciósebességet

12 Szakaszos eljárás A reakcióközeg összetétele időről időre változik, a szubsztrátum fogy, a termék mennyisége növekedőben van,

13

14 AZ EMLŐS SZERVEZETBEN KOLESZTERINBŐL KÉPZŐDŐ ÉLETTANILAG JELENTŐS VEGYÜLETEK GESZTAGÉNek képviselője Progeszteron C-3 helyen karbonil konjugált kettős kötéssel C-17-hez szénhidrogén lánc kapcsolódik C-20 karbonillal KORTIKOIDok képviselője Dezoxikortikoszteron C-3 helyen karbonil konjugált kettős kötéssel C-17-hez szénhidrogén lánc kapcsolódik C-20 karbonillal C-21 hidroxilezve GLÜKOKORTIKOID képviselő Hidrokortizon C-3 helyen karbonil konjugált kettős kötéssel C-17-hez szénhidrogén lánc kapcsolódik C-20 karbonillal és α-helyzetű hidroxil csoport C-11 β-helyzetű hidroxil csoport képviselő Kortizon C-3 helyen karbonil konjugált kettős kötéssel C-17-hez z szénhidrogén lánc kapcsolódik C-20 karbonillal és α-helyzetű hidroxil csoport C-11 karbonil MINERALOKORTIKOIDok képviselője Aldosteron C-3 helyen karbonil konjugált kettős kötéssel C-17-hez szénhidrogén lánc kapcsolódik C-20 karbonillal C-21 hidroxilezve C-11 β-helyzetű hidroxil csoport ANDROGÉNek képviselője Testosteron C-3 helyen karbonil konjugált kettős kötéssel C-17-hez csak β-helyzetű hidroxil csoport kapcsolódik ÖSZTROGÉNek képviselője Ösztradiol C-3 helyen fenolos hidroxil az aromás A gyürűn C-17-hez csak β-helyzetű hidroxil csoport kapcsolódik

15

16 Fontosabb hormonhatású szteroidok

17 Biomérnök mesterszak-záróvizsgatétel 1 Biotermék technológia Gyulladásgátló kortikoidok gazdaságos előállítása. Eladható gyógyászati termék: a hidrokortizonból nyerhető prednizolon

18 Az átalakítási reakció szempontjából ideális mikroorganizmus kiválasztása: Csak a kívánt reakciót katalizálja. A mellékreakciókat katalizáló enzimek képződése visszaszorítható legyen, Rosszabb esetben a melléktermék képződése szelektíven gátolható legyen. Reverzibilis reakció esetén az egyensúly a kívánt irányba mozdítható legyen Ha lehet, a kívánt reakciót katalizáló enzim konstitutívan derepresszált legyen, Rosszabb esetben képződése indukálható legyen A kofaktor szint a tenyésztési körülmények változtatásával optimalizálható legyen.

19 A mikrobiológiai átalakítást végző enzim működését befolyásolja - a szubsztrátum koncentráció hatása - a termék koncentráció hatása - az enzim (szubsztrátum) specifikus volta - ph hatása a reakciósebességre - ph hatása a reakció irányára - hőmérséklet hatása a reakciósebességre - az aktuális kofaktor koncentráció (NAD + NADH; NADP + NADPH; FAD FADH 2 ; etc.) (a kofaktorellátottság szintje élettanilag meghatározott!) - az enzim működését befolyásoló (egyéb tényezők) gátló ill. serkentő anyagok jelenléte

20 Szubsztrátum ellátottságot befolyásoló tényezők: - a sejtburok áteresztőképességének alakulása - a szubsztrátum, illetve a termék aktuális koncentrációja a reakcióelegyben (környezetben), a szubsztrátum, illetve a termék vízoldékonysága Kofaktorellátottságot befolyásoló tényezők: -kofaktort regeneráló rendszer aktivitása (ph, hőmérséklet, nyomás etc.) - anaerob ill. aerob körülmények hatása -a szubsztrátumellátottságot meghatározó rendszer működésének a hatása -a kofaktor más irányú felhasználási lehetősége az anyagcserében

21 Az átalakítást katalizáló enzim képződését befolyásoló tényezők: -indukálhatóság esetén optimális (szelektív) induktor alkalmazása -represszálhatóság vizsgálata -derepresszió alkalmazása -konstitutív mutáns előállítása -zavaró mellékreakció hatásának a befolyásolása, felfüggesztése.

22 (Gyulladásgátló) Prednizolon előállítása hidrokortizonból Corynebacterium simplex tenyészettel

23 Prednizolonképződés mellett megoldandó a melléktermék elválasztása PREDNIZOLON előállítás Reichstein-S vegyületből (17,21 dihidroxi progeszteronból)

24 Reichstein S nyerése 3β,17α,21-trihidroxi-5- pregnen-20-on.21- acetátból Az Openauer oxidáció - nak nevezett reakció O 2 jelenlétét igényli Szerves oldószer nem akadályozza a S. griseocarneus által katalizált reakciót! A képződő hidrogénperoxidot a kataláz lebontja Reichstein féle S vegyület A melléktermék képződést a szerves oldószer akadályozza

25 Szteroidok (C 11 ) hidroxilezése

26 A (C 11 ) hidroxilezés térszerkezeti vizsgálata izotópok(deuteriun, Tricium) alkalmazásával α helyzetben hidroxilező Rhizopus nigricans tenyészetében

27 Progeszteron 11α hidroxilezése (O 2 )! α helyzetben hidroxilező Rhizopus nigricans - az oxigén aktíválása, Molekuláris oxigén reagál az - a szubsztrátum aktíválása elektrongazdag centrummal - az oxigén átvitel, (hidroperoxid képződés) --a redukált koenzim szerepe -a koenzim regenerálása.

28 Oxigénfunkció kiépítése a szteroid váz elektrongazdag régiójában progeszteron Hidroxilezés immobil enzimforrással A túloxidált termék leválasztása analitikai adat alapján

29 Menadion szerepe a 1 dehidrogénezés folyamatában (A telítést NADH igényes enzim végzi)

30 Menadion helyett fenazin metoszulfát is hsználható

31 1α Penicillium fajjal 1α-hidroxi-4-androsztén-3,17-dion dehidroepiandroszteronból Nocardia fajokkal pregnán-származékok 1α-hidroxilezése A SZTERIN VÁZ HIDROXILEZÉSE 1β Rhizoctonia ferrugene Reichstein féle S vegyület 1β- és 2β-hidroxilezése Absidia orchidis digitoxigenin 1β- és 5β-hidroxilezése 2α 2β Nocardia corallina az ethiszteront 1α és 2α-helyzetben hidroxilezi Nocardia italica a noretiszteront 2α és 16α-helyzetben hidroxilezi Rhizoctonia ferrugene 1β- és 2β-hidroxilezés 5β Absidia orchidis digitoxigenin 1β- és 5β-hidroxilezése 6β 7α Mucor félék melléktermékként hidroxilez 6β helyzetben Rhizopus arrhizus a progesteront hidroxilezi 6β- és 11α -helyzetben Chaetomium a prednizont hidroxilezi 6β-helyzetben Phycomyces blakesleeanus a progesteront hidroxilezi 7α-helyzetben 7β Proactinomyces a koleszterin 7β-hidroxilezése (Horváth-Krámli 1948) 8β Cercospora melonis Reichstein-S vegyület 8β-hidroxilezése 9α Helicostylum piriforme Reichstein féle S vegyület hidroxilezése Actinomycetales,Eubacteriales 1,2 dehidrogenáz hiány esetén különben bomlás követi 10β 11α Rhizopus nigricans és egyéb gombák 19-nortesztoszteron 10β- és 11α-hidroxilezése Rhizopus nigricans ATCC 6227 progeszteron 11α-hidroxilezése (14α) Aspergillus ochraceus NRRL 405 progeszteron 11α-hidroxilezése (14α) 11β Curvularia lunata hidrokortizon előállítása Cunninghamella blakesleeana hidrokortizon előállítása 12a Wojnowicia graminis testoszteronból 12α- és 14α-hidroxilezett terméket készít 12β Fusarium lini digitoxygenin digoxigeninné alakítása Streptomyces purpurascens digitoxin digoxinná hidroxilezése 14α 15α Mucor félék Reichstein féle S vegyület 14α-hidroxilezés Colletotrichum antirrhini progesteron 15α származéka Giberella baccata dezoxicorticosteron 15α-hidroxilezése 15β Phycomyces blacesleeanus progesteron 15β-hidroxilezése Lenzites abietina desoxicorticosteron 15β-hidroxilezése Bacillus megaterium Reichstein S vegyület 15β-hidroxilezése 16α Streptomyces roseochromogenus 9α-fluoro hidrokortizon 16α-hidroxilezése 16β Helicostylum piriforme digitoxigenin 16β-hidroxilezett származéka 17α Trichotecium roseum desoxicorticosteron 17α-hidroxilezése 18 Corinespora cassiicola corticosteron aldosteronná alakítása 19 Corticium sasakii a 19-metil hidroxilezése 21 Ophiobolus herpotrichus csak a természetes d-enantiomert hidroxilezi

32 A mikróbák természetesen nem szűkítik tevékenységüket egyetlen reakció elvégzésére, hanem a térszerkezeti analógiák szerint a szteroid váz más pontjain is végrehajthatnak hidroxilezést, sőt a mikróba enzimkészletének megfelelően egyéb reakciók végrehajtására is sor kerülhet. A gazdaságossági szempontok figyelembevételével a technológia kialakításakor kell feloldani ezt a nemkívánatos helyzetet: 1.) a mikróba kiválasztásával, 2.) a technológiai körülmények megválasztásával, 3.) a szubsztrátumon végzett kémiai átalakítással biztosíthatjuk a célvegyület képződését.

33 Curvularia fajok szerepe a kortikoid szintézisben

34 A Curvularia fallax törzsben a hidroxilező komplex a 18 és 19-es cisz állású β helyzetű metil csoportok jelenléte miatt csak α oldalról közelítheti meg a szterán vázat, amiből következik a 7α és a 14α oxigén funkció kialakítása. A hidroxilező enzimkomplex ugyanis a C 3 és a C 20 karbonilhoz közeledve végzi feladatát. A 17α helyzetű tercier hidroxil csoport acetilezése viszont akadályozza a szeroid váz α oldalról való megközelítését, ami elősegíti a 11β helyzetű hidroxil csoport megjelenését

35 Curvularia lunata és Curvulari fallax biokonverziós teljesítményének összehasonlítása Eltérő eszteráz aktivitás! Primer, szekunder, tercier OH csoport, ph függő ACILVÁNDORLÁS! A hidroxilezés indukálható!! androsztendionnal

36 Prednizolon előállítás Curvularia fajokkal kombinált eljárással 3β,17α,21- trihidroxi-5- pregnen-20- on.3,17,21- triacetátból

37 A 9α-fluor származék stabilitás szempontjából előnyös, mert a szterin váz bontását katalizáló 9α oxigenáz nem talál működési területet

38 Biotermék technológia Biomérnök mesterszak záróvizsgatétel 2 szteroid alapváz (androsztén váz) gazdaságos nyerése természetes alapanyagból

39 A konverziós feladat teljesítésére alkalmas törzs kiválasztása Célfeladat: koleszterin lebontás

40 koleszterin szitoszterin ergoszterin

41 A koleszterinszint befolyásolása fungisztatikummal

42 izoprén-oligomer szintézis acetil-coa-ból A szterin bioszintézis teljesítményét meghatározó redukció amit gátolnak a sztatinok a gomba membrán nélkülözhetetlen építőeleme a szkvalenból képződő szterin az ergoszterin 2 acetil-coa acetoacetil-coa-szintetáz >CoA-SH acetoacetil-coa < acetil-coa hidroximetil-glutaril-coa-szintetáz >CoA-SH COOH H-C-H β-hidroxi-β-metilglutaril-coa HO-C-CH 3 < NADPH H-C-H hidroximetil-glutaril-coa-reduktáz >CoA-SH O=C-S-CoA >2 NADP + H H OH H 3 R-mevalonát HO-C--C--C---C--COOH mevalonát-kináz < ATP H H CH 3 H >ADP H H OH H 5-foszfo-mevalonát H2O3-P-O-C--C--C---C--COOH < ATP H H CH 3 H mevalonátfoszfát-kináz >ADP H H OH H 5-pirofoszfo-mevalonát PP--O-C--C--C---C--COOH < ATP H H CH 3 H 5-pirofoszfo-mevalonát dekarboxiláz >CO >ADP H izomeráz H-C-H H-C-H dimetilallil-pirofoszfát + izopentenil-pirofoszfát C-CH 3 C.CU 3 C-H H-C-H dimetilallil H-C-O--PP H-C-O--PP transzferáz H H CH 3 geranil-pirofoszfát PP--O-HCH-HC=C-HCH-HCH-HC=C CH 3 CH 3 geranil PP transzferáz izoprenil PP transzferáz oligoizoprén szintáz farnezil-pirofoszfát >baktoprenol-foszfát tetraizoprenil-pirofoszfát < NADPH tetraizoprenil- retinál -PP reduktáz >4 NADP+ fitanil-pirofoszfát karotinok szkvalén szintáz < NADPH >NADP + szkvalén

43 3-hidroxi-3-metil-glutaril-CoA mevalon-sav NADPH-reduktáz gátlása Koleszterinszint csökkentő hatású!

44 A szénhidrogén oldallánc metabolizmusa Az indukálható omega-oxigenáz által aktívált oxigén a szénhidrogén elektronban leggazdagabb szénatomját támadja ~CH 2 CH 3 + O~~O >>>>>>> ~CH 2 CH 2 -O-OH A hidroperoxidot { NADPH + H + } vízképzéssel bontja ~CH 2 CH 2 -O-OH >>>>>> ~CH 2 CH 2 -OH + H 2 O A NAD igényes alkohol oxidáz dehidrogénezi ~CH 2 CH 2 -OH >>>>>>>> ~CH 2 CH=O A NAD igényes aldehiddehidrogenáz savvá oxidálja ~CH 2 CH=O >>>>>>>>> ~CH 2 COOH Végül a tioforáz (acil-coa szintetáz) acil-s-coa származékká alakítja ~CH 2 COOH >>>CoA SH>>>> ~CH 2 CO S CoA + H 2 O Ezután következhet a β-lebontás (aerob anyagcsere (O 2 ellátottság) a kofaktorok regenerálásához)

45 Zsírsavlebontó komplex (mikroszómában) R-CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -COOH <<<<<<<ATP CoA-SH> {D gén} acil-coa-szintetáz >>>>>>AMP +PP R-CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CO-S-CoA β-lebontás <<<<<<<FAD {E gén} acil-coa-dehidrogenáz >>>>>>>FADH2 R-CH 2 -CH 2 -CH=CH-CO-S-CoA {B gén} enoil-coa-hidratáz H 2 O>>>>>> [L-ß-OH] OH R-CH 2 -CH 2 -CH-CH 2 -CO-S-CoA <<<<<<<NAD+ {B-gén} L-ß-hidroxiacil-CoA-dehidrogenáz >>>>>>NADH R-CH 2 -CH 2 -CO-CH 2 -CO-S-CoA <<<<<<<<CoA-SH {A gén} 3-ketoacil-CoA-tioláz R-CH 2 -CH 2 -CO-S-CoA CH 3 -CO-S-CoA Zsírsavlebontás

46 A szteroid váz lebomlása átmeneti termék Mycobacterium tenyészetben

47 A szteroid váz Mycobacterium tenyészetben észlelhető lebontása megakadályozható a vas iont tartalmazó 9α hidroxiláz szelektív gátlásával, például a fertőtlenítő szerként ismert oxint (C 9 H 7 ON) használva 8-hidroxikinolin

48 A vad törzsből klasszikus genetikai módszerek alkalmazásával előállított, az NRRL-ban elhelyezett Mycobacterium mutáns törzsek aktivitása. A törzsek az oldallánc szelektív lebontására alkalmazhatók. [Az SCM mutáns 1 -dehidrogenáz hiányos. 1 hiány A 8153, 11045, törzsek 9α-oxigenáza sérült]

49 androst-4-en-3,17-dion nyerése szitoszterinből 9α-oxigenáz hiányos mutáns alkalmazásával

50 Bioterméktechnológia SZÜLETÉS- SZABÁLYOZÁS HORMONÁLIS ÚTON Biomérnök mesterszak záróvizsgatétel 3 GESZTODEN előállítása 19-norszteroidból ösztrogén váz előállítása prokirális kiindulási anyagból

51 19-norszteroidok előállítása. 19-oximetil származékból 1 dehidrogénező aktivitás kihasználásával

52 Smith- Torgov eljárás 19-norszteroid szintézis prokirális köztestermékből

53 Kémiai redukcióval nyerhető termékek (Az acilezett termék enzimes hidrolízise srm éri el az 50%-os kihozatalt! )

54 Két oxidoreduktáz tevékenysége ismert (3α illetve 3β és 17β tevékenység!) androsztándiol

55 A prokirális intermedier (szekodion) redukciója élesztővel aerob körülmények között metabolizálható szénforrás (glülóz vagy etanol) jelenlétében

56 3β,17β oxidoreduktáz 3α oxidoreduktáz

57 α-enzim 3α-hidroxi származék β-enzim, 3β,17βdihidroxi származék

58 A nikotinsav alkotórész szerepe a folyamatban: NAD + NADH és H + Dehidrogenáz (oxidoreduktáz) NAD + NADH H +

59 szubsztrátum szekodion etilszekodion androszténdion ösztron propilszekodion etanolos oldatként adagolva

60

61 A Smith-Torgov norszteroidszintézis prokirális köztesternékének (szekodion) szelektív redukciója

62 A d-ösztradiol szintézis kulcs-intermedierjének az előállítása, [3-metoxi-8,14-szeko-1,3,5(10),9(11)-ösztratetraén-14-keto-17β-hidroxi származék] mikrobiológiai eljárással Malátakivonatot tartalmazó ferdeagaron kinőtt Saccharomyces uvarum tenyészettel oltott kukoricalekvárt és malátakivonatot tartalmazó levegőztetett tenyészettel 2x10 8 sejtszám elérésekor hasonló összetételű 10% répacukrot is tartalmazó táptalaj oltandó. A növekedő élesztőtenyészethez 8-10 órás korban adott β-naftol visszaszorítja az α-enzim aktivitást. A habzás gátlása céljából dodecilbenzolszulfonsav és polipropilénglikol elegy adagolása után, 24 órás korban (2-3x10 8 sejtszám elérésekor) a szekodion szubsztrátum mikrokristályos formában kerül a tenyészethez (etilszekodion esetében detergens adagolása is szükséges) A széndioxid képzés csökkenésekor Kb 30 óra múlva 10%-nyi szacharóz adagolás szükséges. A ph csökkenése előnyös, mert a baktériumos fertőzés lehetőségét hátráltatja A redukált termék nagyméretű, az élesztősejt méretét többszörösen meghaladó kristályként jelenik meg. A 70-80% tisztaságú kristályos nyers termék az élesztősejtektől szűréssel elkülöníthető. A nyers termék acetonból átkristályosítva, majd éterrel mosva 96%-os tisztaságú termékként kiindulási anyagként használható a 19-norszteroid szintézishez

63 19-norszteroid szintézis királis kulcstermékéhez vezető eljárás vázlata Szekodion 3-metoxi-8,14-szeko-1,3,5(10),9(11)-ösztratetraén-14,17-dion szekoolon 3-metoxi-8,14-szeko-1,3,5(10),9(11)-ösztratetraén-17-hidroxi-14-on

64 Kiindulási köztestermék az enantiomer ösztron előállításához AZ ACETIL SZÁRMAZÉK ELŐNYÖSEN BEFOLYÁSOLJA A BOROHIDRID ELHELYEZKEDÉSÉT A LEENDŐ D -GYŰRÜN

65 A 14β-hidroxi-17keto-szekoszármazék enantiomer ösztron előállításához használható

66 Smith- Torgov eljárás 19-norszteroid szintézis prokirális köztestermékből

67 Biomérnök mesterszak-záróvizsgatétel 4 A β-laktám szerkezet biológiai hatása: Gram pozitív korokozók által kiváltott szeptikus folyamatok akadályozása toxikus mellékhatás nélkül Rezisztens korokozók megjelenése?? Allergén tulajdonság??? Penicillin félszintézis kiindulási anyagaként használható 6-aminopenicillansav (6-APS) előállításának jelentősége előállításának jelentősége rezisztencia fejlesztés; spektrum szélesítés; savállóság biztosítása;

68 A sejtfalszintézis történései a citoplazmában, a membránban és a periplazmában Ez utóbbi helyen működő transzpeptidáz reakciót akadályozza a β-laktám szerkezetű antibiotikum-csoport Miért β-laktám? Mert a cisztein β-szénatomjához kapcsolódó aminocsoport vízkilépéssel regál a karboxilcsoporttal

69 A peptidoglükán szerkezetű baktériumsejtfal építőelemének láncvégi D-ala-D-ala szerkezete és a penicillin térszerkezeti modelje összehasomlítható

70

71 A penicillin előállítás története A Penicillium chrysogenum tömlős gomba kukoricalekvár-glükóz jelenlétébe kinőtt tenyészet termelő fázisban, semleges ph-nál, laktóz szénforráson (szénhidrátban szegény tápközegben!) azetidinon szerkezetű antibiotikumot termel (savanyú ph-nál a hatásos anyag elbomlik, glükóz represszálja a penicillin bioszintézisért felelős enzimek képződését és működését!) A gomba növekedése ezzel szemben szénhidrátban gazdag táptalajon, savanyú ph tartományban optimális (ahol viszont a baktérium nem szaporodik) Penicillium chrysogenum NRRL 1951 törzs Alexander Fleming 1929-ben észlelte: szeptikus folyamatot okozó baktériumok húskivonaton észlelhető szaporodását egy fonalas gombatenyészet (P. notatum) akadályozta A gomba által termelt hatóanyag (antibiotikum) a megbetegedett számára nem volt toxikus Sporája laktóz szénforráson nem csírázott. A tejcukrot extracellulárisan nem hidrolízálta, Laktóz permeázt sem termelt. A glükózon kinőtt tenyészet a tejcukrot feltűnüen lassan metabolizálva fenilecetsav jelenlétében G- penicillin termelésére alkalmas. Mutagén kezeléssel az antibiotikum képződést nagyságrenddel sikerült megjavítani A laktózbontó aktivitás extracelluláris megjelenése után megszünve a tejcukor kiváltságos helyzete a metabolizálható szénforrás program szerinti adagolásával lehet ideális szintre csökkenteni a glükóz represszív hatását.

72

73 Az antibiotikum képződése a Penicillum chrysogenum fiziológiailag aktív csúcssejtjében folyik

74

75 A transzpeptidáz reakció végbemenetele közben a szubsztrátum átmenetileg acilezi az enzimet és az acilezett enzimről kerül az acilező ágens a muropeptid sejtfal N terminális amino csoportjára.

76

77 L-α-aminoadipinsav L-cisztein L-valin ATP ATP O H H SH CH 3 HOOC--CH-CH 2 -CH 2 -CH 2 --C--N C CH 2 H H-C-CH 3 NH 2 O=C N C-H δ-(l-α-aminoadipil) - L-ciszteinil - D-valin COOH ACV tripeptid szintetáz (ACVs) Fe ++ O 2 Mg ++ ATP ditiotreitol H H H H O H H H CH 3 : : HOOC C C C C C N----C---C S C CH 3 H 2 N H H H O=C----N C H : izopenicillin-n COOH Izopenicillin -N-szintetáz

78 Prökaróta és eukarióta Izopenicillin-N szintetáz kémia szerkezetének (aminosav-szekvencia) összehasonlítása Az aminosavak bekeretezése hívja fel az olvasó figyelmét a kis mértékben eltérő szerkezetre!

79 A benzil-penicillin képződést katalizáló három enzim, [ACVs, IPNs, IAT] működése: A három enzim képződését represszálja a glükóz! működését a glutation gátolja! L-a-aminoadipinsav L-cisztein L-valin ATP ATP O H H SH CH 3 HOOC--CH-CH 2 -CH 2 -CH 2 --C--N C CH 2 H H-C-CH 3 NH 2 O=C N C-H d-(l-a-aminoadipil) - L-ciszteinil - D-valin COOH ACV tripeptid szintetáz (ACVs) Fe++ O2 Mg++ ATP ditiotreitol H H H H O H H H CH 3 : : HOOC C C C C C N----C---C S C CH 3 H 2 N H H H O=C---N C H : izopenicillin-n COOH Izopenicillin -N-szintetáz (IPNs) Izopenicillin aciltranszferáz (IAT) 6-oxopiperidin-2-karbonsav (piro-adipinsav) NAD+ >>>> NADH H H CH 3 H H CH 3 : : : : HOOC-CH-CH 2 -CH 2 -CH 2 -CO-NH-C---C S C- CH 3 (BENZIL)--CO-NH-C---C S C-CH 3 NH 2 O=C---N C-H penicillin aciláz O=C---N C-H : : COOH (BENZIL)-CO-S CoA COOH izopenicillin-n G-penicillin (benzil-penicillin) képződés

80 A növekedési szakaszban a NADPH igényes reduktáz aktivitás biztosítja az élő sejt beltartalmának redukált állapotát (az SH csoportok működőképességét a glutation aktiv állapotát)

81 Az idiofázisban képződő adipilciszteinil-valin tripeptid a penám váz kialakulásának az előfeltétele A gombák exponenciális növekedési fázisában képződő tripeptid, a (glutamilciszteinil-glicin) Glutation fontos szerepet tölt be, az aminosavfelvételben

82 Azetidinon származékok képződésének a vázlata penám és kefém termékek képződése penicillin és cephalosporin bioszintézise

83 Izopenicillin aciltranszferáz (IAT) 6-oxopiperidin-2-karbonsav (piroaminoadipinsav) NAD + >>>> NADH L H H CH 3 H H CH 3 : : : : HOOC-CH-CH 2 -CH 2 -CH 2 -CO-NH-C---C S C-CH 3 (BENZIL)--CO-NH-C---C S C-CH 3 NH 2 O=C--- N C-H penicillinaciláz O=C--- N C-H : : COOH (BENZIL)-CO-S CoA COOH izopenicillin-n G-penicillin (benzil-penicillin) képződés NH 2 H H H O H H H H : : HOOC C C C C C N C C S C H O H H H H O=C N C== C CH 2 O C CH 3 D * * Cephalosporin-C szerkezeti képlete O=C OH (δ)-d-α-aminoadipilsavval acilezett 7-amino-kefémsav.acetát ami Penicillin-N-ből gyürűtágítással, hidroxilezéssel és acetilezéssel képzódik

84

85 A kutató munka igazolta a fonalas gombafajok genetikai állományában a penámváz szintézisére szolgáló enzimek génjeinek jelenlétét ASCOMYCETES (perfekt) DEUTEROMYCETES (imperfekt) Emericella nidulans Aspergillus nidulans Eurotium Penicillium notatum(chrysogenum) Sartorya Epidermophyton Eupenicillium Trichophyton Talaromyces Microsporum Carpenteles Malbranchea Thermoascus Polypaecilum Gymnoascu Arthroderma Nanizza

86 A fonalas gombák DNS állományában a Cephalosporin váz képzéséhez szükséges enzimek jelenlétét igazolták Az N penicillin képződéséhez szűkséges; ACV tripeptid szintetáz (ACVs), és izopenicillin N szintetáz (IPNs) enzimeken kívül; az izopenicillin epimeráz továbbá a gyűrűtágító rendszer, az expandáz, dezacetoxicephalosporin C szintetáz valamint a befejező lépéseket katalizáló hidroxiláz, aciláz, karbamoil transzferáz, és a metiltranszferáz jelenléte is bizonyított. ASCOMYCETES DEUTEROMYCETES Emericellopsis Cephalosporium acremonium (Acremonium chrysogenum) Byssochlamys Paecilomyces persicinus Arachnomyces Scopulariopsis Anixiopsis Diheterospora Spiroidium

87 Penicillin rezisztencia penicillináz Limitált proteolízis Proteáz hatás apoláros szakasz ***extracelluláris penicillináz**** H 2 N Met (Xxx)15 Ser (Xxx)22 Glu Ser Lys Thr Glu (Xxx)258 Lys COOH O foszfatídsavval acilezett szerin-oh HO P=O HO CH CH CH 2 H O O O=C C=O R R R = páratlan szénatomszámú alkil láncok (foszfolipid zsírsav) A membránhoz kötődő penicillináz extracelluláris enzimmé válása

88

89 A penicillináz rezisztens methicillin szerkezete

90 Az azetidinon származékok első kifejlesztői a létért való küzdelemben a pokarióták voltak Streptomyces clavuligerus, Nocardia lactamdurans, Lysobacter lochenigenus, Flavobacterium A fonalas gombák a prokariótáktól vették át a génállományt A Streptomyces clavuligerus Cephamycin-C termelésére és clavulánsav termelésére is képes

91 CH 3 NH 2 H H H O H O H : : HOOC----C----C----C----C----C----N-----C------C-----S-----CH 2 O H H H H O= C------N-----C===C---CH 2 --O--C---NH 2 Cephamycin szerkezete O=C-OH Streptomyces clavuligerus által termelt biológiailag hatásos (aktív) vegyületek: a transzpeptidáz-t inaktíváló cephamycin és a penicillináz-t inaktíváló clavulánsav

92 Prekurzor nélkül folytatott penicillin fermentáció helyett célravezetőbb Penicillin G, vagy Penicillin V nyers termékből enzimes hasítással előállítani a 6 APS-t Miért? Mert prekurzor jelenlétében az IPN képződése fokozódik a penám váz acileződése miatt!

93 6-aminopecillansav enzimes előállítása Kukoricalekvárt tartalmazó szénhidrát szegény tápközegben növekedő prokarióta sejt (pl. Escherichia coli) aciláz aktivitása semleges ph tartományban képes hidrolizálni az N-acil származékot. (Az aciláz szint a vad törzsnél katabolikusan represszált) Ugyanez az enzim savanyú körülmények között acilezi az aminocsoportot hordozó vegyületet. Az enzimet hordozó prokarióta sejt fiziológiás sóoldatban szuszpendálva a penicillin dezacilezésére használható a 8 ph folytonos biztosítása mellett. A mellékreakciók (CO 2 ) zavaró hatása csökkentendő!

94 A 6-APS kihozatalt zavaró mellékreakciók

95 Ampicillin D-fenilglicin származék előállítása

96 Sheehan: V-penicillin és 6-aminopenicillin sav kémiai szintézise

97 6 APS előállítása kémiai úton

98 Desacetoxi 7- aminocefalosporin sav előállítása kémiai gyürűtágítással A fenoxi ecetsav eltávolítása Streptomyces törzsekkel történhet

99 Biomérnök mesterszak-záróvizsgatétel 5 Biotermék technológia Ízfokozó L-glutaminsav és tápszerkiegészítőként használható esszenciális aminosavak előállítása

100 Esszenciális aminosavak szabályozott bioszintézise L-lizin L-leucin L-valin L-izoleucin L-treonin L-metionin

101 PIRUVÁT >Acetil-S-CoA CO 2 ATP piruvát dehidrogenáz (-ATP) piruvát karboxiláz (+acetil-coa) BIOTIN ADP citrát szintetáz (-ATP) OXÁLACETÁT NADH CITRÁT almasav dehidogenáz - akonitát hidratáz NAD + ALMASAV Acetil-CoA IZOCITRÁT malát szintetáz NADP + izocitrát- H 2 O gyenge IC liáz dehidrogenáz fumaráz NADPH GLIOXILÁT CO 2 FUMARÁT SZUKCINÁT FADH 2 FAD α-ketoglutarát (+ADP) NADPH szukcinát dehidrogenáz glutamát dehidrogenáz NH 3 (-ATP) NADP + Net: 3 NADH + ATP (zárojelben) a szabályozó metabolitok L-GLUTAMINSAV Glutaminsav képződés Corynebacterium glutamicum tenyészetében, amely a gabonacsirából előállított izanyagot kiszorította a piacról MELASZ és ammónia tartalmú tápközegben {8pH) limitált levegőztetéssel

102 A BIOTIN a fehérjében levő lizin ε-amino csoportjához kötődve végzi feladatát. vegyes savanhidrid képződés ATP segítségével O OH ATP +H 2 CO 3 >>>> ADP + HO C O P OH + P i O A szénsav-foszforsav vegyesanhidrid karboxilezi a biotint (Pi felszabadulás!) és ez a csoport az acetil-s-coa aktívált metil csoportjára kerülve hozza létre a zsírsav szintézishez szükséges malonil-coa-t Illetve piruvátból az oxálacetátot *(A malonil-coa képződést a hosszabb szénláncú zsírsavak alloszterikusan gátolják) A zsírsavak CoA-S-acilát alakban vannak jelen a citoplazmában MELASZ és ammónia szint (limitált levegőztetés) Glutamát

103 A citrát ciklus az intermedier metabolizmus, a bioszintézis valamint a lebontási utak központi szereplője; Az aerob anyagcsere működésénak a feltétele a szénváz teljes elégetésével

104 AROMÁS TERMÉKEK Phe, Tir, Trp, nikotinsav, PABA, szabályozott bioszintézise (Az eritróz-foszfát a pentóz-foszfát ciklus köztesterméke)

105 6 G-6-P + 12 NADP + >>>>>>>>>>>>>>> 5 G-6-P + 12 NADPH + 6 CO 2 Aromás szintézis kiindulási anyaga

106 alloszterikusan szabályozott enzimaktivitások az aromás aminosavak bioszintézisének útján E. coli-ban

107 Phe Tir Fenilalanin és tirozin bioszintézis szabályozása korizmáttól a ketosavképződésig ugyancsak izoenzimek működését igényli a ketosavakat glutaminsavval működő transzamináz alakítja fenilalaninná illetve tirozinná

108 TRIPTOFÁN SZINTÉZIS korizminsavtól foszforibozil-antranilátig (triptofán a komplex szétesét okozva szabályoz) A két alegységből álló antranilát szintetáz és a két alegységből álló foszforibozil transzferáz asszociátumként működik triptofán jelenlétében szétesik ezzel szabályoz! (NIKOTINSAV SZINTÉZIS NAD )

109 TRIPTOFÁN BIOSZINTÉZIS befejező lépései Escherichia coli-ban ez az enzim móltömegű piridoxálfoszfát kofaktorral működő tetramer. Két α alegységből és egy β 2 dimerből épül fel. Az érintetlen tetramer komplex in vivo az indol-3-glicerol-foszfátból és az L-szerinből L-triptofánt és glicerinaldehid-3-foszfátot alakít.

110 Piridoxál-foszfát a triptofán-szintetáz működése közben.. L-szerin képződés GAP glicerinaldehid-3-foszfát felszabadításával indol-3-glicerol-foszfát + szerin GAP + TRIPTOFÁN.. Triptofán-szintetáz alkalmazásakor indol + szerin TRIPTOFÁN + víz

111 glioxilát L-alanin L-SZERIN L-cisztein Glicin(glikokoll) L-glutaminsav L-aszparaginsav

112 Bioszintézis novekedő Corynebacterium tenyésztben A három aminosav (Trp, Phe,Tir) egyidejű jelenléte akadályozza a dezoxiheptonát-aldoláz működését 1 {az enzim allosztérikus gátolhatóságának felfüggesztésével triptofántermelő mutánshoz jutunk!}

113 A trns aciláz szubsztrát tévesztésének köszönhetően alkalmas hiánymutánsok felhasználásával megoldható a direktszintézis; 5-metil-triptofánnal, 5 fluor-triptofánnal, 4-metil-triptofánnal és triptofán-hidroxamáttal szemben rezisztens mutánsokat izoláltak, majd p-fluor-fenilalaninra, továbbá p-amino-fenilalaninra rezisztens mutánsokat állítottak elő belőlük. A technológia kialakításakor ez itóbbi két aminosav aktuális koncentrációját a táptalajban analitikai mérésekkel limitáló szintre kell beállítani! ### Triptofanáz felhasználásával is megoldható a szintézis LUGOSÍTVA az elegyet indol + piruvát + ammónia > triptofán + víz

114 A triptofán szintézist katalizáló gének szabályozása Az enzimképződés szabályozása a prokariotáknál** Alaphelyzet: represszált állapot I promoter I operátor I attenuátor I trpe gén I trpd gén I trpc gén I trpb gén I trpa gén I represszor---** triptofán jelenlétében a represszor erősen kötődik a promoter szakaszhoz az polimeráz kapcsolódását akadályozza A második vázlat a derepresszió jelenségét ábrázolja. Triptofán hiányában a korepresszor (esetünkben triptofán) nélküli represszor-fehérje lemozdul az operátorról. Ennek következtében elindulhat a transzkripció, az átírási folyamat.ennek megfelelően a σ-faktor jelenlétében az RNSpolimeráz elindul a struktúrgének felé. I promoter I operátor I attenuátor I trpe gén I trpd gén I trpc gén I trpb gén I trpa gén I ** RNS polimeráz ----> represszor Struktúrgének: E = antranilát-szintetáz D = antranilát-transzferáz C = IGP-transzferáz B = triptofán-szintetáz B A = triptofán-szintetáz A ** Az attenuátor régió szerepéről bővebbet a ábrák tartalmaznak

115

116 A gén bekapcsolása előtti állapot

117 A struktúrgén A struktúrgén átírásától a működőképes fehérje megjelenéséig

118 A strukturgének átírásának beszüntetése A termináló szakasz szerkezete,

119 A σ-faktor nélküli RNS-polimeráz lemozdul a DNS-ről a termináló hurok hatására

120 Yanofski

121 A termináló hurok hatására az RNS polimeráz kilép a DNS láncon létező átíró-buborékból. Az elkészült RNS pedig felveszi (a bázispárok adta lehetőséget kihasználva) a stabilitását növelő szerkezetet

122 L-ASCORBINSAV előállításához kapcsolódó tevékenység

123 Dávid Perlman eljárása szorbózból az eljárás 80%-os kihozatallal dolgozott

124 Az Acetobacter suboxidans glükózból kálcium-glükonátot képez, amit az 5- ketoreduktáz alakít 5-ketoglükonsavvá. A glükóz oldatból 90%-os hozammal nyert 5-ketoglükonát-kálciumból katalitikus hidrogénezéssel nyert racemátból az L-gulonát mikrobiológiai úton alakítható 2-keto-L-gulonsavvá. A D gulonát kálcium sója visszavezethető a folyamatban (US.Pat: ).

125 Pseudomonas albosesamae ATCC 21998; Acetobacter melanogenus ATCC %-os glükóz oldatból 95%-os kihozatallal nyerhető a 2,5-diketoglükonsav. Az 5-ketocsoport Corynebacterium és Brevibacterium törzsekkel redukálható. Sonoyama és munkatársai szerint Acetobacter melanogenus ATCC 9937 és Brevibacteriun ketosoreductum ATCC törzsek kevert tenyészetével glükózból egy lépésben 2-keto-gulonsav nyerhető (US Pat: ).

126 Biomérnök mesterszakzáróvizsgatétel 6 Biotermék technológia Nádcukrot (répacukrot) kiváltó IZOCUKOR nyerése keményitőből BIOETANOL program

127 Invertáz működése

128 GLÜKÓZ-FRUKTÓZ CUKORSZÖRP (invertcukor) IPARI ELŐÁLLÍTÁSA OH H OH H OH H Szorbit H - C - C - C - C - C - C - H H OH H OH H OH

129 FRUKTÓZ-SZÖRP ELŐÁLLÍTÁSÁRA ALKALMAS TÖRZS NYERÉSE Természetes forrásból származó mikróba szuszpenzió Egyedüli szénforrásként xilánt tartalmazó minimál táptalajra szélesztés Egy hét inkubálás 30 C-on Szélesztés xilánt tartalmazó minimál táptalajra Tiszta tenyészet izolálása ferde agar táptalajra A törzs tisztaságának ellenőrzése komplett táptalajra szélesztéssel Ismételt vissza-oltogatással xilánt tartalmazó táptalajra Ellenőrzött tiszta tenyészettel xilózt tartalmazó folyékony táptalaj oltása 48 órán keresztül levegőztetve kerve A kinőtt tenyészetek sejtjeinek elkülönítése centrifugálással A sejtek inkubálása 30 %-os glükóz oldatban 60 C-on A glükóz-fruktóz arány változásának vizsgálata A legaktívabb tenyészetekkel xilózos cső oltása Különböző hőfokon inkubálva napos korban A legaktívabb tenyészetek sejtjeit ismételten 30%-os glükóz oldatba szuszpendálni A legaktívabb törzsekkel optimális hőmérsékleten ideális korú tenyészetet készítünk A tenyészetet elkülönítve glükóz oldatban inkubálni különböző hőfokon 72 óra inkubálás után a sejteket ismételten szuszpendáljuk, legalább hat alkalommal és 72 órában mérjük az G/F arányt a felezési idő vizsgálata A mérés ismétlése a legelőnyösebbnek talált 3 törzs-zsel Kiegészítve a fehérjetartalom változás vizsgálatával. Törzsfenntartás szénforrásként xilánt tartalmazó táptalajon

130 Glükóz-früktóz izomeráz előállítása ipari fermentációs eljárással

131 A GLÜKÓZ-FRUKTÓZ IZOMERÁZ az az enzim, amelynek az előállítására folytonos fermentációs technológiát dolgoztak ki. Az eljárást évtizedek óta ipari méretben használja a Novo Industry A/S. Az intracelluláris enzimet egy atipikus termofil Bacillus coagulans konstitutív módon termeli. A tenyésztés hőmérséklete 50 C, ami a közel semleges optimális ph mellett a tápanyagban gazdag táptalajon a tenyészet homogenitását elősegíti, a környezetből származó idegen mikrobák elszaporodását nehezíti. A táptalaj előkészítésére, sterilezésére, az egész apparátus bakteriológiai tisztaságát szolgáló módszerek kidolgozására különös gondot fordítottak. A termelő törzs genetikai stabilitása akár 1000 órás folytonos tenyésztést is elbír a biológiai teljesítőképesség észrevehető változása nélkül. A törzs eredetileg endospóra képző volt, ezért a folytonos fermentációs technológia kidolgozása céljából klasszikus genetikai módszerek alkalmazásával stabil nemspórázó mutánsát állították elő, amelyben a litikus hatású enzimek képződésének a szabályozása nem sérült meg A folytonos eljárás termelékenysége 3-4-szerese a szokásos eljárásnál kapott értéknek, ami a viszonylag nagy higítási rátával magyarázható. (m = óra 1). A nagyobb termelékenység kompenzálja a drágább táptalaj és a költségesebb technológia alkalmazásának hátrányait. Az évtizedek óta használatban levő eljárás a lehető legalacsonyabb glükózkoncentráció mellett, oxigénlimitált körülmények között, a higítási sebesség változtatásával biztosítja a maximális specifikus aktivitású sejtek nagy mennyiségének a képződését.

132 Fakultatív anaerob alkoholosan erjesztők

133 Az alkoholos erjedés szubsztrátuma A hidrolitikus folyamat eredményeként az oligomerekből illetve poloimerekből felszabaduló anomerek átalakulása spontán folyamat az egyensúlyi állapot eléréséig [a] 20 D= , α-d-glükopiranóz β-d-glükopiranóz [a] 20 D= A vízben oldott monomer forgatóképessége folyamatosan változik amíg el nem éri az egyensúlyi állapot ( 1 / 3 α-d-glükóz <> 2 / 3 β-d-glükóz) adta értéket, a ot a dextróz (jobbra) forgató képességét α-amiláz (α-1,4-glukan-4-glukano hidroláz) random bontja a keményítő α-1,4 kötéseit. A mikroorganizmusokban előforduló 60 kd méretű enzim nem bontja az a-1,6 kötést, de az α-1,6 kötés szomszédságában levő α-1,4 kötést sem. Ezért a reakció termékben jelentős mennyiségben fordulnak elő oligomerek. Az Aspergillus oryzae által termelt enzim például keményítőből 4 % glükózt, 56 % maltózt, 28 % maltotriózt és egyéb oligoszacharidot tartalmazó maltóz szirupot készít: β-amiláz (α-1,4-glukán maltohidroláz) a Bacillus genusban előforduló enzim a keményítő redukáló végén kezdve maltóz egységeket hasít le. Nem bontja az 1,6 kötéseket. GLUKOAMILÁZ. Széles spektrumú, a poliszacharid nem redukáló végétől indulva az 1,3, 1,4, és 1,6 kötéseket bontja. Főleg gombákban Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Rhizopus fajokban fordul elő. Keményítőből 97 % glükózt, 1,5 % maltozt és valamennyi egyéb oligoszacharidot tartalmazó elegyet készít. Az α-amiláz jelenléte gyorsítja a reakciót, fokozza az eljárás teljesítményét. A hidrolízist követő anomerizáció határozza meg a reakcióképességet

134 A hidrolízist követő anomerizáció határozza meg a reakcióképességet

135 1 tonna alapanyagból előállítható etanol A cukornádból nyert etanol 20%-kal a kukoricából nyert 50%-kal drágább, mint a cukoripari melléktermékből, a melaszból nyerhető etanol. Az etanol energia tartalma (26,6 MJ.kg-1) A kiindulási anyag energia költsége meghatározó jellegű! Cukornád 70 liter Nyárfa 160 liter Répagyökér 95 liter Burgonya 100 liter Melasz 280 liter Kukorica 370 liter Cukornád Brazilia 16 GJ/ha 4,0 MJ/kg etanol Cukorrépa Új-Zéland 16 GJ/ha 5,3 MJ/kg etanol Kukorica USA 21,8 GJ/ha 12,3 MJ/kg etanol

136 Etanol előállítása xilózból (xilites út) Aerob eljárás

137 Xilóz alkoholos erjesztése (xilóz izomeráz jelenlétében) Anaerob eljárás

138 Répacukorgyár szennyvíztisztitó telepének folyamatábrája 7 köztes ülepítő 5 metanogén anaerob reaktor D denitrifikációt igénylő szennyezés 13 utóülepítő

139 Biomérnök mesterszak-záróvizsgatétel 7 Biotermék technológia A környezetszennyezés felszámolása mikroszervezetek biológiai aktivitásának felhasználásával

140

141

142 Ammóniában dús szennyvíz tisztítása erre a célra kialakított nirtrifikációt és denitrifikációt végző sorba kapcsolt egységek működtetését igényli. A nitrifikáció során aerob körülmények között a Nitrosomonas törzsek az ammóniát nitritig, a Nitrobacter nemzetség pedig tovább nitrátig oxidálja. NH ,5 O 2 2 H + +H 2 O + NO 2 H = 301-től 352 kj NO 2 + 0,5 O 2 NO 3 H= 65 től 88 kj Anaerob körülmények között a két faj asszociátuma egymást segítve a nitrátlégzés terhére végzi az ammónia oxidációját 5 NH NO 3 4 N 2 +9 H 2 O + 2 H + G = 1483 kj

143 Az ammóniában gazdag szennyvíz denirifikálását végzõ eljárás folyamatábrája NO 3 +6H + +5e 0,5N 2 +3H 2 O NO 3 +0,33CH 3 OH NO 2 +0,67H 2 O NO 2 +0,5CH 3 OH 0,5 N 2 +0,5 CO 2 +0,5 H 2 O+OH (némi lugosodással jár!) (A folyamatábrán metanol szerepel oxidálható szubsztrátumként)

144 nitrifikáló egységek vázlatrajzai

145 metán termelő anaerob reaktorok Szennyvíztisztító telep Debrecenben

146 Szennyvíztisztítómű Debrecenben

147 a mikroszervezetek konzorciuma porózus üvegágyra telepedve fejtik ki metanogén aktivitásukat.

148 Schardinger (CIKLO)-DEXTRIN /7 glükózt tartalmaz a ciklus/ A külső felület poláris jellege a hatos szénatomon elhelyezkedő hidroxil-csoporttól származtatható A hidrogénhidak stabilizálta belső felület apoláros jelleget kölcsönöz

149 ciklodextrin

150 A keményítő vizes kolloid oldatban hidrogénhidakkal stabilizált helikális szerkezetű formában létezik A Bacillus macerans membránhoz kötött amilolitikus enzime a spóraképzést követő sejtliziskor a membránból szabadulva nem veszti el a membránba kötődését segítő hidrofob szakaszát. Ezért képes a keményítő hélikális szerkezetének apoláros régiójában elhelyezkedve létrehozni a gyürűs dextrineket

151 Üres ciklodextrinek kölcsönhatása Zsírsavakkal FBCx (1 g α-ciklodextrin/tabletta)

152 Üres ciklodextrinek kölcsönhatása Zsirsavakkal Az αcd funkcionális jellemzői: αcd a legjobb zsirsav komplexáló szer a zsirsav/αcd komplex kötési állandója magas (a bezárt zsirsav nem disszociál) a komplex szinte vizoldhatatlan egy αcd üreg 5-6 db CH 2 -csoportot fed a zsirav/ αcd komplexek moláris sztöhiometriája 1:2 1:3, 2:3, zsirsav-tipustól függően

153 Az üres alfa-cd folyamatos fogyasztása csökkenti a zsírfelszívódást Weight (Ibs) Day of study körülmények: 3 tabletta, 3 x1 gram alfacd/nap, magas zsirtartalmú, normál táplálékfelvétel 180 nap múlva: szérum triglicerid 46%-kal, testtömeg 10%-kal csökken (Jen and Artiss, 2005)

154

155 Üres CD az Anthrax ellen: avagy LYUK A LYUKBAN 1. A lépfene baci egy letális faktort (LF) és edema faktort (EF) választ ki, mely egy heptamer poruson át jut a sejtbe. 2. Csak gigadózisú antibiotikumok hatnak 3. Finoman hangolt betaciklodextrin (14b) hatásos aktivitást mutat. (Karginov et al PNAS , 15075, 2005.) Heptakis per-6-(3-aminopropylthio)-beta-cd 0.2 nm! koncentrációban Antrax pore lumenben gátolja LF transzportot

156 Az Anthrax bacillus támadási mechanizmusa A lépfene kórokozója Kulcs komponens: a protektiv antigén (PA), ennek heptamerje ül a sejtmemebránba pórusként

157 Ciklodextrin és Ciprofloxacin kombináció hatása in vivo Antrax fertőzéssel szemben (Karginov, PNAS, 2007)

158 A giráz működését gátló Ciprofloxacin

159 Streptomyces törzsek által termelt girázgátló antibiotikum

160 HPBCD USP és EU Pharm gyártók: Roquette Molecusol Janssen J&J Encapsin Wacker / ISP Cavasol HP Cargill (USA) Cavitron Cyclolab(HU) xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx USP Pharm szulfobutiléter-béta-ciklodextrin (SBEBCD)

161 BESZÁMOLÓ ) Milyen követelményeket kell kielégíteni az iparban használható biokonverziós eljárásnak? A biokonverziós eljárásban használható mikrobiális reakció legyen - egy termékhez vezető.- teljessé tett - viszonylag kis térfogatban végezhető - olcsó segédanyagokat igénylő - egyszerü berendezésekben lefolytatható - rövid idő alatt végbemenő folyamat. Végül a teremék kinyerésére viszonylag egyszerű, hatásos módszer szolgáljon. 2) Milyen biokonverziós eljárásban előnyös androszténdion alkalmazása induktorként? A D1-dehidrogenáz,továbbá a 11-oxigénfunkció kialakítását segítő aktivitás szelektív fokozása érdekében. pl: prednizolon, illetve hidrokortizon bioszintézis esetében ) Milyen természetes alapanyagról hallott, amelyből gazdaságosan androsztendion nyerhető? Szterinekből: koleszterin, szitoszterin, ergoszterin 4) Mely enzim inaktíválása akadályozza a szterin váz lebomlását? D1-dehidrogenáz, illetve a 9a-oxigenáz 5) Milyen terméket nyerünk koleszterinből, ha D1-dehidrogenáz hiányos mutánst használunk a szterinoldallánc lebontást célzó biokonverziós eljárásban? 9a-hidroxi-3-keto származékot 6) Milyen terméket nyerünk koleszterinből, ha 9a-oxigenáz hiányos mutánst használunk a szterinoldallánc- lebontást célzó biokonverziós eljárásban? 3-keto-D4 származékot (androszt-4-en-3,17-dion) 7) Mit tud a sztatinok szterinszint csökkentő (gombamembrán képződést gátló) szerepéről? Ezek a vegyületek (antimetabolitok) természetes körülmények között, a létért folytatott ádáz küzdelemben, a gombamembrán felépítéséhez nélkülözhetetlen szterin képződését akadályozva a rivális gomba növekedését gátolják. Nevezetesen az acetil-coa-ból képződő köztestermékből (bhidroxi --b-metilglutaril-coa) a mevalonsav dehidrogenáz, másnéven glutaril-coa reduktáz által végzett reakció szolgáltatja a szteroid bioszintézis-út teljesítményét meghatározó (3-R-mevalonát) építőelemet.

162 8) Milyen hidroxilezési lépésekről hallott a mikrobiális élettani tanulmányai során? FAD katalizálta dehidrogénezést követő vizfelvétel eredményeként megjelenő hidroxi származék, illetve a szubsztrátum molekula elektrongazdag pontján történő hidroperoxid kialakulását követő NADPH-t igénylő vízképzéssel (nem vízleadás!) nyerhető hidroxi származék. 9) Milyen mikroszervezetek katalizálta biokonverziós lépések kidolgozása javította a gyulladásgátló kortikoidok (pl. prednizolon) gyógyszerpiaci helyzetét? A D1- dehidrogénezés és a 11b-hidroxilezés optimális technológiájának kombinált eljárás keretében való alkalmazása a köztes termék kinyerése nélkül ipari méretben. 10) Miért előnyös a D1- dehidrogenáz és a 11b-oxigenáz képződését serkentő induktorként androszténdiont (AD) használni? Mert az AD nemcsak nagy mennyiségben rendelkezésre álló alapanyagból viszonylag gazdaságosan nyerhető, de mint induktor célzottan csupán a kívánt enzim képződését serkenti. Egyéb enzimek képződését befolyásoló csoportot ugyanis nem tartalmaz. 11) A racém norszteroidok előállítására kidolgozott Smith-Torgov eljárás milyen beavatkozással válik alkalmassá enantiomer norszteroidok szintézisére? A leendő szteroid D gyürüjén, az alkil csoport szomszédságában levő két karbonil azonos valószínűséggel reagálva, egyaránt alkalmas a C gyürű kialakítására. Ezért képződik racém norszteroid. Az egyik karbonil reakcióképességét szelektív módon felfüggesztve gyürűzáráskor csak az egyik, (D, vagy L) norszteroid képződik. 12) Minek köszönhető a Penicillium fonalas gomba által termelt anyag sikere a bakteriális fertőzés elleni küzdelemben? A hatásos anyag biokémiailag a prokarióta olyan szerkezeti elemének, a peptidoglükán sejtfalnak a képződését zavarja, amely a gazdaszervezetben nem fordul elő, ezért nem észlelhető toxikus mellékhatás.

163 13) Mit tud a b-laktám (azetidinon) szerkezetü antibiotikumok hatásmódjáról? A hatóanyag (azetidinon) az eubaktériumok peptidoglükán sejtfalának képződését katalizáló D-Ala-D- Ala dipeptidre specifikus transzpeptidáz aktiv centrumába kerülve acilezi, inaktíválja az enzimet. A periplazmikus térben folyó sejtfalszintézis gátlása a növekedő sejt pusztulását okozza. 14) Miért nem hatásos a G és V penicillin a Gram negatív baktériumok okozta fertőzés ellen? A Gram negatív baktériumok külső membránján való áthaladást akadályozza a hatóanyag gyengén savanyxú karaktere 15) Miért tekinthető mérföldkőnek a 6-aminopenicillansav gazdaságos előállítása? Mert a Penicilliun chrysogenum által termelt b-laktám antibiotikum köztestermékéből az eubaktériumokra ható, széles spektrumu, saválló, penicillináz rezisztens, nem toxikus hatóanyagot lehetett előállítani. 16) Milyen elektronszerkezeti tulajdonság segíti a cephém váz penicillináz tűrését? A kvázi delokalizált elektron eloszlás O=C N C== C C.,... COOH NH2 H H H O H H H H : : HOOC C C C C C N C C S C H O H H H H O=C N C== C CH2 O C CH3 Cephalosporin-C képlete O=C OH H-C == C-H H O H H H CH3 : : H-C C C C N C C S C CH3 H-C C-H H O=C N C H G-Penicillin szerkezeti képlete O=C OH (Benzil-penicillin)

164 17) Milyen félszintetikus penicillin származékról hallott? Oxacillin.(5-metil-3-fenil-4-izoxazolil-penicillin. nátrium monohidrát) A 3 fenil és az 5 metilcsoport térbeli gátlása akadályozza a molekula kapcsolódását a penicillináz aktív központjához. A molekula elektronszerkezete savtűrést biztosít. Ezért per os adagolva is alkalmas a penicillin rezisztens fertőzések leküzdésére. Ampicillin előállítása Escherichia coli tenyészetévelaz ampicillin aminocsoportja a hatóanyag savanyú karakterét csökkenti. Így a Gram-negatív baktériumok külső membránján való áthaladás nem jelent problémát a hatóanyag számára. A citoplazmamembrán és a külső membrán között folyó sejtfalszintézis így akadályozható. Amoxicillin 6-D-a-amino-p-hidroxi-fenilacetamido-penicillansav, az ampicillin p-hidroxi analógja. Baktérium spektruma és kémiai stabilitása hasonló, de jobban szívódik fel a bélcsatornából, ezért magasabb vérszintet ad. Klavulánsavval kiegészítve penicillináz rezisztens hatóanyag. Karbenicillin (Geopen) Dinátrium-a-karboxi-benzilpenicillin. Savérzékeny, a penicillináz is bontja. Oldatában lassan dekarboxileződik. Széles spektrumu, különösen hatásos a Pseudomona, Proteus, Providencia fertőzések esetében. Idült hugyúti és epeúti fertőzések leküzdésére használják. Maripen. A benzil penicillin acetoxi-metilésztere. A vízben alig oldódó anyag nagyobb hányada átvészeli a gyomorban töltött időt. A bélbe kerülve az ott működő észterázok felszabadítják belőle az oximetil-penicillint, amely spontán hidrolizál G-penicillinné, amely rövid idő alatt hatásos vérszintet eredményez. Methicillin, (2,6-dimetoxi-fenil-penicillin nátrium só) 2,6-dimetoxibenzoil-kloriddal acilezett 6-APS. Vízben igen jól oldódó fehér kristály. Életmentő gyógyszerként a penicillin rezisztens törzsekre is hat annak ellenére, hogy a penicillináz képződését indukálja. A penicillináz rezisztenciáját a b-laktám gyűrűt árnyékoló két metoxi csoportnak köszönheti.