4. SZERVES SAVAK SZERVES SAVAK. Felhasználása. Citromsav. Termelés. Történet. Pécs Miklós: Biotermék technológia

Átírás

1 SZERVES SAVAK Mind prokarióták, mind eukarióták termelnek savakat, nincs különbség. 4. SZERVES SAVAK Anyagcserében: Az aeroboknál: a szénforrások szerves savakon keresztül oxidálódnak. Ha nem megy végig (hiányos anyagcsereutak) savtermelés Anaeroboknál: sok NADH keletkezik reduktív közeg akkor van savtermelés, ha nem redukálódik tovább alkohollá 1 2 Citromsav Képlete: Összegképlete: C 6 H 8 O 7 Molekulatömeg: 192 g/mól Tulajdonságai: Fehér, kristályos, kellemesen savanyú ízű anyag Háromértékű gyenge sav, így savasításra illetve pufferek készítésére fel lehet használni Előfordulása: A TCA (vagy Szent-Györgyi-Krebs) ciklus része, ezért szinte a legtöbb szervezetben előfordul Bizonyos citrusféléknek a termésében (lime, citrom) a szárazanyagnak akár a 8%-át is elérheti a citromsav, ennek a kinyerésére is vannak eljárások Felhasználása Körülbelül 60%-ban az ital- és élelmiszer ipar használja fel pl: gyümölcslevek és gyümölcslé sűrítmények, lekvárok ízesítése, konzerválása a száma: E330 A gyógyszeriparban is felhasználják pl: vas-citrátot a vas bevitelére, a nátrium sóját véralvadás gátlásra, kalcium bevitelre az angolkór megelőzésére, és kozmetikumok tartósítására Pufferolásra használják a háztartási tisztítószerekben Felhasználják a fémiparban felületek tisztítására, passziválásra (salétromsav helyett ahol ez nem alkalmazható) Mosószerekben is felhasználják a víz lágyítására a foszfátok helyett mert nem okoz eutrofizációt, ami miatt a foszfát alapú lágyítok bizonyos országokban be vannak tiltva. 3 4 Termelés Történet t/év t/év t/év t/év t/év Több mint egy milliárd dolláros piac A többi szerves savval ellentétben kizárólag fermentációs úton termelik (régebben: citrusfélék terméséből) SCHELE izomból izolálja 1923-ig citrus termésekből termelik ZAHORSKY citromsav termelő törzset szabadalmaztat CURRIE: felületi eljárás, cukor, ph=2, Hozam: ~60 % Első CS üzemek Belgium, Pfizer (USA), Sturge (Anglia) Felületi üzem Kaznejov, melasz. LEOPOLD: K-ferrocianid +20 % Perquin, Kluyver Lab., Szűcs (P-limitáció) SZUBMERZ! +80 % n-paraffin: Candida (Szardínia) 6 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 1

2 Bioszintézis Citromsav ciklus Szentgyörgyi-Krebs ciklus Acetil-CoA A glikolízíssel kezdődik (vázlatosan): glükóz fruktóz-6-p fruktóz-1-6-p PEP piruvát acetil-coa citrátkör Az A. niger-nél a citoszolban működik egy anaplerotikus reakció is: piruvát oxál-acetát malát Melléktermék képződés: oxál-acetát oxálsav + ecetsav 7 Pyr + CoA+NAD + Piruvát - dehirogenáz komplex Acetil-CoA+ CO 2 + NADH * Pyr+ CO 2 + ATP 6 Piruvát - karboxiláz FADH FAD + NADH NAD + MALÁT FUMARÁT SZUKCINÁT CoA GTP OXÁLACETÁT+ADP +Pi GDP * Anaplerotikus reakciók OXÁLACETÁT * Acetil-CoA GLIOXILÁT SZUKCINIL-CoA CITRÁT cis-akonitát IZO-CITRÁT α-ketoglutarát NADH CO 2 NAD + NAD + CO 2 NADH 8 Citromsav bioszintézis Citromsav bioszintézis TCT Anyagcsere mérnöki beavatkozás: a továbbalakulás megakadályozása: olyan mutánsok kellenek aminek az akonitáz és izocitrát dehidrogenáz aktivitása kicsi. a citrát szintetáz aktivitása legyen nagy a citromsav felhalmozódása miatt nincs oxálacetát képződés, ez az anaplerotikus utakon át történik (mint a lizinnél): Piruvát + CO 2 + ATP malát + P i + ADP (Mg, Fe és K ionok kellenek a piruvát karboxiláznak) PEP + CO 2 + ADP oxál-acetát + ATP (Mg, K, Mn és ammónium ionok kellenek a PEP karboxiláznak) 9 10 Szubsztrátok, törzsek Melaszt, keményítő hidrolízátumot és hulladék szénhidrátot használnak mint szénforrást (szacharóz, glükóz) A melasszal a probléma, hogy ha szennyezett, például a Fe, Mn vagy Zn ionok mennyisége túl magas, akkor negatívan hat a termelésre ilyenkor ioncserélő oszlopokon kivonják a kationokat. Általában Aspergillus niger vagy A. wentii törzseket használnak (magas hozam, elnyomható az izo-citromsav, és glükonsav termelés) Szénhidrogéneken is lehet fermentálni magas konverzióval Candida lipolytica törzzsel, de a probléma az alkánok rossz vízoldhatósága és nagyobb arányban keletkezik izocitromsav. Másrészt meg kell szabadulni a szénhidrogén nyomoktól, mert egyesek karcinogének. (+ a kőolaj ára) 11 Tápoldat C-forrás: lásd fent N-forrás: NH 4+ (vagy NO - 3 ). NH 4+ jobb: lásd bioszintézis. Az ammónia elfogyasztásával savanyodik a közeg: jó hatású P felesleg: kedvez a citromsav és oxálsav képződésnek Nyomelemek: Fe, Mn és Zn limit szükséges. Ha kevés a Fe: lassú növekedés és cukorfelhasználás A vas az akonitáz kofaktora! A szaporodáshoz 2000 µg Fe/liter az optimális, a savtermelő szakaszban µg/l, Befolyásolja a pelletképződést is. A vastartalom csökkentésére a melaszt ioncserélni kell, vagy K-ferrocianidot adnak. Csak rozsdamentes készülékekben! A vas hatását ellensúlyozza: - MeOH - Cu adagolása - alacsonyabb hőmérséklet Mn > 20 µg/l felett a citromsavképződés csökken 12 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 2

3 Tápoldat A citromsav ki- és belépése a sejtbe eltérő mechanizmussal történik: Kifelé aktív transzporttal megy, a sejt meg akar szabadulni a fölös citromsavtól. Befelé viszont Mn-kelát formájában tud belépni, ezért is fontos a Mn-szintet 20 µg/l alatt tartani. A melaszt pl. Mnmentesíteni kell (ioncsere, a Fe eltávolítással együtt). Fermentációs paraméterek Oldott oxigén koncentráció: ha alacsony, csökken a citromsav termelés intenzív levegőztetés, néha O 2 dúsítás! Ha kimarad a levegőztetés: a savtermelés leáll (a sejtszaporodás újraindul) Kulcskérdés a morfológia pelletképződés Fermentációs paraméterek ph: a melléktermékek képződését fertőzési kockázatot befolyásolja Optimális ph= ph < 3 csak citromsav-képződés (az extracelluláris glükóz-oxidáz inaktiválódik) ph = 6 felett oxálsav képződés ph = 3-6 oxál- és glükonsav képződés is ha nincs pufferolva a közeg, a ph gyorsan 3 alá megy de a melasz erősen pufferol savanyítás kénsavval ilyen savas közegben kicsi a befertőződés veszélye. Hőmérséklet: Optimális = C Ha <28 C a citromsav képződési sebesség csökken Ha >33 C oxálsav képződés Felületi tenyésztés Zárt kamrák: mosható, dezinficiálható (HCHO, gőz ) Állványokon tálcák (alumínium, rozsdamentes), (~4 x 2,5 x 0,25 m) kb: l tápoldat. Tápoldat: híg melasz (cukor: 15-20%) + tápanyagok ph=6-6,5 K-ferrocianid - melasz minőség szerint: próbafermentáció Funkciója: Fe, Mn, Zn eltávolítás, Feleslegük a növekedést limitálja és a citromsav képződést növeli. C= mg/l Inokulum: konídium szuszpenzióval ( mg/m 2 ) Fermentáció: steril levegőbefúvás: nedvesség, hőmérséklettartás, O 2 bevitel, CO 2 eltávolítás Jelentős a bepárlódás: % Fermentációs idő: nap Hozam: % Produktivitás: 7-8 kg citromsav/m 3 /nap. De olcsó Anyag el. Répamelasz Melasz tart. Felületi tenyésztés Spóra Levegő micélium elválasztás fermentlé sterilizálás fermentáció Micélium (állattakarmány) 17 Szubmerz tenyésztés Fermentor: m 3 keverős reaktor m 3 air-lift, merülő-sugaras (pelletképzés)! Tápoldat: melasz tisztítás (ioncsere K-ferrocianid) kukorica (elfolyósítás - elcukrosítás) Inokulálás: konídium vagy vegetatív (pellet) inokulum: 12 órával rövidebb! Fermentáció: levegőztetés: 0,2-1 vvm (O 2 dúsítás)! hőmérséklet: o C ph szabályozás: 2-2,6 2-3 nap pelletképződés, 5-8 nap citromsav képződés (függ a cukor koncentrációtól, és a használt törzstől) Általában fed batch: 5% cukorral indul. Majd cukor és K-ferrocianid rátáplálás 18 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 3

4 Szubmerz tenyésztés Fermentáció: Állandó mikroszkópos megfigyelés (pellet) Szubmerz tenyésztés citromsav konc.: 130 g/l melaszon; g/l cukorból Nádmelasz Spóra Levegő Konverzió: %; Produktivitás: 0,67-0,75 kg citromsav/m 3 *h; ~16-18 kg citromsav/m 3 *nap Melasz tart. sterilizálás oltóanyag előállítás fermentáció micélium elválasztás Fruktóz: a szacharózból képződik invertálódással. Kezdetben polimerizálódhat. Anyag el. Micélium (hulladék) A feldolgozás lépései A feldolgozás lépései 1. MICÉLIUM ELVÁLASZTÁS 2. OXALÁT FERROCIANID ELTÁVOLÍTÁS 3. KALCIUM-CITRÁT KICSAPÁS ÉS ELVÁLASZTÁS 4. CITROMSAV FELSZABADÍTÁS ÉS GIPSZ ELVÁLASZTÁS micélium szűrő segédanyag mésztej + FeCl 3 hulladék mésztej fermentlé H 2 SO 4 gipsz 1. Micélium elválasztás vákuum dobszűrő 0,2 1,0 mm átmérőjű pellet a jó Newtoni szuszpenzió, nyálkaképzés nehezíti a szűrést, szűrősegédanyag pl. szalmatörek 2. Oxalát mentesítés kevés Ca(OH) 2 adagolása Ca-citrát ne csapódjon ki csak Ca(H 2 citrát) 2 ig titrálják Klarifikálás pl. nyomó szűrő, Funda szűrő, 3. Ca-citrát kicsapás fontos paraméterei: citromsav koncentráció, hőmérséklet o C, ph ~7, Ca(OH) 2 adagolás üteme, mono-, di-, tricalcium citrát egyensúly oldhatóság forrón kisebb! nagy kristályok képződése előnyös szennyezések ph=7, 18-25%-os CaO, nagy mennyiségű hő szabadul fel hasznosítás, szűrés vákuum dobszűrőn 4. citromsav felszabadítása %-os H 2 SO 4 val, (1-2 g/l feleslegben), a képződő gipszet vákuum dobszűrőn szűrik Feldolgozás, izolálás A feldolgozás lépései-ii fermentáció 1. SZÍNTELENÍTÉS ÉS IONMENTESÍTÉS 2. KONCENTRÁLÁS aktív szén, gyanta, regeneráló sav jelentős sótartalmú oldat cefre bepárlás Citragil (takarmány) citromsav nyersoldat 3. KRISTÁLYOSÍTÁS KRISTÁLY SZEPARÁLÁS kicsapás citrát elválasztás citromsav felszabadítás gipsz elválasztás gipsz (hulladék) 4. SZÁRÍTÁS 5. APRÍTÁS, OSZTÁLYOZÁS 6. CSOMAGOLÁS BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 4

5 A feldolgozás lépései - 2 Tisztítás 5. Színanyagok eltávolítása aktív szenes oszlopon Ionok eltávolítása kationcserélő, anioncserélő, regenerálás erős savval ill. bázissal 6. Tiszta citromsav oldat koncentrációja: g/l további koncentrálás - Többfokozatú vákuum bepárló, kb. 40 o C 7. Kristályosítás vákuumkristályosítóban 36,5 o C alatt képződő termék citromsav-monohidrát 40 o C felett vízmentes termék szűrőcentrifuga az anyalúg visszavezetése a folyamatba 8. Szárítás 36,5 o C alatti hőmérsékleten (kristályvízvesztés veszélye) ioncserés sótalanítás bepárlás kristályosítás centrifugálás szárítás citromsav nyersoldat aprítás osztályozás CSOMAGOLÁS tonna citromsavra számítva: Micélium: ~135 kg (25 30% fehérje, 15 20% szénhidrát) Takarmány trágya papíripar Gipsz: 1,4 t építőipar Szennyvíz: 8 m 3, 5 6 % szárazanyag; KOI mg/l Feldolgozása: Melléktermékek, szennyvíz Bepárlás (szárazanyag: %) takarmány-kiegészítő (Citragil) (Az ár nem fedezi a költségeket) Élesztősítés: Torula 14 kg/m 3 Biogáz: ANAMAT eljárás. Kilép: CH 4, CO 2, víz aerob és anaerob eljárás kombinációja ECETSAV ELŐÁLLÍTÁSA A legősibb technológia: a bor megecetesedik, borecet Cukrok etanol ecetsav Saccharomyces cerevisiae Acetobacter aceti Felületi kultúra: töltött oszlopban csorog lefelé a kb. 10 %- os alkohol, felfelé áramlik a levegő. Biofilm alakul ki. Konverzió > 90 %. Nem steril, a befertőződéstől védi az alkoholtartalom és a savas ph. (de: ecetangolna ) Szubmerz tenyésztés: Acetobacter fajok, cél, hogy ne oxidáljon CO 2 + vízzé, hanem megálljon az ecetsavnál. Más források: földgázból parciális oxidációval, fa száraz lepárlásával ÚJ LEHETŐSÉG: HOMOACETOGÉNEK ÚJ LEHETŐSÉG: HOMOACETOGÉNEK Egyes Clostridium törzsek képesek CO 2 fixálásra: 1 C 6 H 12 O H 2 O 2 CH 3 -COOH + 2 CO H + + 8e 2 CO H + + 8e CH 3 -COOH + 2 H 2 O C 6 H 12 O 6 3 CH 3 -COOH! Fermentáció típusa Szakaszos Folyamatos sejtvisszatáplálás Folyamatos sejtvisszatáplálás nélkül Forgódobos fermentor Produktivitás (g*l -1 *h -1 ) 0,9 4 2,5 10 Ecetsav konc. (g*l -1 ) A 2 CO 2 ból autotróf CO 2 -fixálással egy új acetil-coa képződik. Miért? Sok Clostridium kemoautotróf, képes H 2 +CO 2 vagy CO gáz-keveréken növekedni, mint egyedüli szénforráson. Előny: +50% hozam, Hátrány: lassú folyamat Szakaszos: glükóz rátáplálás, semlegesítés dolomittal Félfolytonos: lefejtés 50%-ig Forgótányéros: egyfajta immobilizálás, a tányér felületére biofilm tapad Elméleti konverzió: 1 g/g, a gyakorlatban 90-95% BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 5

6 ECETSAV GLÜKONSAV ELŐÁLLÍTÁSA Felhasználása: Ipar: erős sav, reakciók, alapanyag, Vízkőoldás Élelmiszeripar: tartósítás Új: jégmentesítés: só helyett Ca- vagy Mg-acetát 1928 felületi tenyésztés cukron, Penicillium notatum 80-87% -os konverzió Ma: főleg Aspergillus niger, mellette baktériumok: Gluconobacter suboxydans, metanolhasznosítók, pl. Ps. ovalis Bioszintézis: baktériumoknál: egy lépés, membránhoz kötött dehidrogenáz gombáknál: két lépésben, a második a sejten kívül megy GLÜKONSAV ELŐÁLLÍTÁSA FERMENTÁCIÓS TECHNOLÓGIA A két szubsztrátot glükóz és O 2 bőségesen kell bevinni. Glükóz: rátáplálás, mert az egyszeri adagolás lelassítja a folyamatot. Kihozatal: 0,90-0,95 (glükózra) A glükóz-oxidáz enzim molekuláris oxigént használ fel és H 2 O 2 -ot termel. Ezt a kataláz elbontja. (Kioltási gyűrűt eredményezhet, régen azt hitték, hogy antibiotikumot termel a törzs - blamázs). Oxigén: igen erőteljes levegőztetés, intenzív keverés, nagy fejnyomás. DO-t magas értéken tartani FERMENTÁCIÓS TECHNOLÓGIA FERMENTÁCIÓS TECHNOLÓGIA ph: 5,5 alá nem szabad engedni, mert az enzimrendszer inaktiválódik. Szabályozása: CaCO 3 -tal automatikus, ill. +NaOH-dal, mert a Na só jobban oldódik. N és P: a termelési szakaszban limitáló koncentrációban, inkább nyugvósejtes tenyészet. Feldolgozás: - a micélium szűrése, - bepárlás, - kicsapás CaCO 3 -tal, - elválasztás Micélium hasznosítása: - újrafelhasználás fermentációhoz, - enzim-kinyerés (glükóz oxidáz, kataláz) Törzsfejlesztés: az enzimet a goxb gén kódolja. Génmanipulációval: derepresszált mutáns, 36 óra alatt lefut a ferm BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 6

7 GLÜKONSAV Üzemeltetési költség Közvetlen költségek Kapacitás: t/a Beruházási költség: KÖLTSÉGELEMZÉS Egység Egység/t Egység/a Ár,$/egység Költség $/t $/a Nyersanyagok Dextróz t 1, ,98 60 % Kalcium-karbonát t 0, ,83 Gabonaáztató lé t 0, ,12 (szilárd tartalom) Kénsav t 0,002 75,5 0,15 Magnézium-szulfát t 0, ,83 3,33 (heptahidrát) Diammónium-foszfát t 0, ,28 Monokálium-foszfát t 0, ,34 Munkabérek 709, Üzemeltetők fő/év Művezető fő/év Üzemvezető fő/év ,26 6 % Karbantartás /a beruházás 4%-a/ Szolgáltatás Villamos energia kwh , Technológiai víz 3 m 0,17 0, ,017 1,02 Hűtővíz m vízforgatás Gőz t 3, ,5 81, % Eddig összesen 919, Közvetett költségek Rezsi költség /a munkabérek 75%-a/ Adók és biztosítás /a beruházás 2%-a/ Értékcsökkenési leírás /a beruházás 1O%-a/ % Eddig összesen 227, Összesen 1147, GLÜKONSAV Felhasználási területek: nem korrozív sav Fémipar (tisztítás, rozsdátlanítás) Üvegipar Detergensekben (komplexképző) Gyógyszeripar (vízoldhatóságot javítja, Ca, Fe) Cementadalék Termelés: ~ t/év Cégek: AKZO (NL), Carlo Erba (I), Merck (D), Mallinkrodt (USA) Egylépéses konverzióval fumársavból. A termék kicsapásával az egyensúlyinál jobb konverzió érhető el: Törzs: Corynebacterium glutamicum, nyugvósejtes tenyészet Enzim: fumaráz, sztereoszelektív, csak L-malátot termel. Körülmények: ph = 8, t = 25 C Egyensúly: 15 : 85 aránynál (oldatban) Kristályfermentáció Feldolgozás: a Ca-malátot kénsavval bontják, a gipszet leszűrik, ioncserével tisztítják, bepárolják, kristályosítják. Amino GmbH eljárása: Corynebacterium glutamicum, szakaszos üzem, nem steril, p-oh-benzoésav észterek Imidazol és idegen fehérje adagolás javítja az enzim aktivitást 2000 t/év, kihozatal: 85 %, 150 g/l Tisztaság: > 99 % Tanabe eljárás: (eltérések) Brevibacterium flavum, immobilizált sejtek (carragenan gél) 1000 literes csőreaktor, ph = 6,5-8, t = 37 C Konverzió: 80% (egyensúlyi), kihozatal: 70 % BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 7

8 Éves igény: ~ t Felhasználás: Élelmiszeripar (sav cukor arány) gyümölcs és zöldség készítmények, üdítők, lekvárok, édességek Kozmetikai ipar Gyógyszeripar Az (L)-tejsav tipikusan az anaerob anyagcsere terméke, a piroszőlősav hidrogénezésével keletkezik. A természetben előfordul: - savanyú káposzta - aludttej, kefír - kovász - kovászos uborka Alternatív előállítások: Szintetikusan: acetaldehid + HCN Bioszintézis (anaerob): Heterofermentatív: 1 tejsav/molekula glükóz Homofermentatív: 2 tejsav/molekula glükóz (nincs CO 2!) Törzsek: - coccusok, - bacillusok, -néhány fonalas gomba Iparban: Lactobacillusok Tápanyagigény: komplex, szerves nitrogént igényelnek, fehérje-hidrolizátumokat. Szénforrás: glükóz, galaktóz, a poliszacharidokat bontani A fermentáció körülményei: Anaerob, levegőztetés nem kell, N 2 öblítés viszont igen. Pufferolás: a keletkező tejsavat közömbösíteni kell, mivel károsítja a sejteket. Lehet: CaCO 3 -tal (automatikus, de szilárd fázis), Alkáli lúgokkal (jelentősen hígítja a fermentlevet) NH 3 gáz befúvatásával (drágább, de nem hígít) Kidolgoztak szakaszos és folytonos technológiákat, a leghatékonyabb a sejtvisszatáplálásos Feldolgozás: klasszikus, kalcium-laktátos lé: - a hőmérsékletet C-ra emelik, - az oldat ph-ját kalcium-hidroxiddal közé állítják. a kalcium laktát teljes egészében oldatba megy. - a levet melegen szűrik - kénsavval felszabadítják a tejsavat, a kalcium gipsz formájában kicsapódik. - a csapadékos oldatot leszűrik, - a kapott tejsav oldat tetszőlegesen töményíthető, akár %-ig, atmoszférikus vagy csökkentett nyomáson. Feldolgozás: Alkáli, vagy ammónium-laktátos lé: - a sejtek elválasztása után mindenképpen savval szabadítják fel a tejsavat, rengeteg só képződik Koncentrálás, tisztítás Bepárlás. Membránműveletek: egyre inkább terjednek A sejtek elválasztására mikroszűrés, Az oldott molekulák szétválasztására nanoszűrés, A laktát só koncentrálására elektrodialízis A sav felszabadítására bipoláris elektrodialízis BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 8

9 A TEJSAV FELHASZNÁLÁSA Élelmiszeripar (tartósítás, ízesítés, sütőipari adalékok, malolaktikus erjesztés) Textil festés, kikészítés, bőrcserzés Műgyanták, celofán Ragasztók, detergensek Kozmetikai ipar (AHA) Gyógyszeripar Legújabban: zöld kémia Lebontható műanyagok (polilakton) gyártása Észterei a zöld = környezetkímélő oldószerek 49 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 9