Molekuláris Orvostudományok (Multidiszciplináris Orvostudományok) Doktori Iskola RETINOPATHIA PATHOGENEZISÉNEK TANULMÁNYOZÁSA

Átírás

1 Molekuláris Orvostudományok (Multidiszciplináris Orvostudományok) Doktori Iskola DIABETOLÓGIAI ALAP- ÉS KLINIKAI KUTATÁSOK: A SZIGETSEJT MŰKÖDÉS, VALAMINT A DIABETESES RETINOPATHIA PATHOGENEZISÉNEK TANULMÁNYOZÁSA Doktori (Ph.D.) értekezés Dr. Dura Eszter Témavezető: Dr. Romics László, akadémikus, egyetemi tanár Szigorlati bizottság: Dr. Somogyi János, egyetemi tanár Dr. Gerő László, egyetemi tanár Dr. Halmos Tamás, osztályvezető főorvos Hivatalos bírálók: Dr. Gerő László, egyetemi tanár Dr. Wittmann István, egyetemi docens Semmelweis Egyetem Budapest 2002

2 TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS IRODALMI HÁTTÉR AZ INSULIN SZEKRÉCIÓ FIZIOLÓGIÁJA A pancreas Langerhans-szigetek szöveti felépítése Az insulin szekréciót befolyásoló tényezők Glukózzal indukált insulin szekréció A D-glukóz metabolizmus szerepe az insulin szekrécióban. A glukóz-szenzor funkció Iontranszport folyamatok Mechanikai folyamatok Sejtek közötti kölcsönhatások, a sejtek heterogenitásának szerepe Nem-glukóz insulinotróp hatások Az aminosavak insulinotróp hatása Az aminosavak tápanyag szerepe az insulin szekrécióban Bázikus aminosavak hatása a pancreas B-sejtek insulin szekréciójára Dikarbonsavak metil-észterei Hormonok és neurotranszmitterek szabályozó szerepe Az insulin szekréció hosszú távú szabályozása AZ INSULIN SZEKRÉCIÓ ZAVARA A "G-kvintett"...Hiba! A könyvjelző nem létezik Glukotoxicitás Glukóz-deszenzitizáció és glukotoxicitás a B-sejtekben A glukotoxicitás és következményei az extrapancreatikus szövetekben A DIABETES MIKROVASZKULÁRIS SZÖVŐDMÉNYEI A diabeteses retinopathia epidemiológiája A diabeteses retinopathia rizikótényezői A diabeteses retinopathia pathogenezise A MULTIFUNKCIONÁLIS MOLEKULA: A SZEMIKARBAZID-SZENZITÍV AMINOXIDÁZ ENZIM CÉLKITŰZÉSEK IN VITRO KÍSÉRLETEK VIZSGÁLATOK DIABETESES RETINOPATHIÁBAN ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK IN VITRO KÍSÉRLETEKBEN HASZNÁLT ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Kísérleti állatok Anyagok Az aminosav keverék összetétele és elkészítése Módszerek Pancreas szigetek izolálása Pancreas szigetek inkubálása Pancreas szigetek insulin szekréciójának meghatározása A szigetek insulin tartalmának mérése

3 Izolált pancreas szigetek 45 Ca felvételének mérése Diszperz pancreas szigetsejt szuszpenzió izolálása Tisztított pancreas B-szigetsejtek és tisztított pancreas non-b-szigetsejtek nyerése D-glukóz metabolizmus vizsgálata Az extracelluláris és intracelluláris megoszlási terek meghatározása pancreas szigetekben. A 3-O-metil-D-[U- 14 C]glukóz transzportja D-[5-3 H]glukóz felhasználás vizsgálata. D-[5-3 H]glukóz átalakítása 3 HOH-vá A D-[U- 14 C]glukóz oxidáció vizsgálata. D-[U- 14 C]glukóz átalakítása 14 CO 2 -vé D-[U- 14 C]glukóz átalakítása 14 C-jelzett savas metabolitokká D-[U- 14 C]glukóz átalakítása 14 C-jelzett aminosavakká Statisztikai feldolgozás KLINIKAI VIZSGÁLATOKBAN ALKALMAZOTT MÓDSZEREK Beteg kiválasztás Anamnézis, belgyógyászati vizsgálat Szemészeti vizsgálat Laboratóriumi vizsgálatok SSAO meghatározás Statisztikai elemzés EREDMÉNYEK INSULIN SZEKRÉCIÓS VIZSGÁLATOK IZOLÁLT PANCREAS SZIGETEKBEN Fiziológiás koncentrációjú aminosav keverék hatása az izolált szigetek insulin szekréciójára Izolált patkány pancreas szigetek insulin szekréciójának meghatározása D-glukóz jelenlétében Fiziológiás koncentrációjú aminosav keverék hatása a különböző D-glukóz koncentrációk által kiváltott insulin szekréciós válaszra A szigetek insulin tartalma Az insulin szekréció arányának időfüggése Az aminosav keverék összetétel változtatásának hatása a pancreas szigetek insulin szekréciójára Taurin szerepe aminosav keverékben Bázikus aminosavak szerepe az aminosav keverékben Az L-glutamin szerepe az aminosav keverékben Az elágazó szénláncú aminosavak szerepe az aminosav keverékben Az L-alanin szerepe az aminosav keverékben Insulinotróp anyagok hatása a 8.3 mm D-glukózzal kiváltott inzulin szekrécióra az aminosav keverék jelenlétében A glibenclamid és a forskolin hatása A forskolin és a teofillin hatása A teofillin és a cytochalasin B hatása Az aminosav keverék hatása pancreas szigetek 45 Ca nettó felvételre A cytochalasin B és D hatása az izolált pancreas szigetek insulin szekréciójára Izolált patkány pancreas szigetek insulin szekréciójának meghatározása D-glukóz jelenlétében Cytochalasin B és cytochalasin D koncentrációk kiválasztása az izolált pancreas szigetek insulin szekréciójának vizsgálatához

4 A cytochalasin B és D hatása a D-glukózzal előidézett insulin szekrécióra A cytochalasin B és D hatása a nem-glukóz tápanyagokkal kiváltott insulin szekrécióra A GLUKÓZ METABOLIZMUS VIZSGÁLATA IZOLÁLT PANCREAS SZIGETEKBEN ÉS TISZTÍTOTT PANCREAS SZIGETSEJTEKBEN Izolált pancreas szigetek D-glukóz metabolizmusának vizsgálata A glukóz transzport és megoszlási terek vizsgálata. Cytochalasin B és D hatása az izolált pancreas szigetek 3-O-metil-D-[U- 14 C]glukóz felvételére A cytochalasin B és D hatása az izolált pancreas szigetek D-glukóz metabolizmusára Az aminosav keverék hatása pancreas szigetekben a D-glukóz anyagcserére Tisztított pancreas szigetsejtek D-glukóz metabolizmusának vizsgálata Cytochalasin B hatása a pancreas diszperz szigetsejt szuszpenzió D-glukóz metabolizmusára A D-[5-3 H]glukóz metabolizmusa tisztított pancreas B-sejtekben és tisztított non-b-sejtekben Tisztított pancreas B-szigetsejtek és tisztított non-b-szigetsejtek D-[U- 14 C]glukóz oxidációja D-[U- 14 C]glukóz átalakulás 14 C-jelzett aminosavvá és 14 C-jelzett savas metabolitokká, tisztított B- szigetsejtekben és tisztított non-b-szigetsejtekben VIZSGÁLATOK DIABETES RETINOPATHIÁBAN SSAO aktivitás értékek a retinopathia különböző stádiumaiban Vizelet albumin ürítés A diabetes időtartama A diabetes mellitust jellemző paraméterek MEGBESZÉLÉS IN VITRO KÍSÉRLETEK EREDMÉNYEINEK ÉRTÉKELÉSE Insulin szekréciós vizsgálatok izolált pancreas szigetekben A cytochalasin B és D hatása az insulin szekrécióra A glukóz metabolizmus vizsgálata izolált pancreas szigetekben és tisztított pancreas szigetsejtekben KLINIKAI VIZSGÁLAT EREDMÉNYEINEK MEGBESZÉLÉSE KÖVETKEZTETÉSEK AZ INSULIN SZEKRÉCIÓ ZAVARAINAK FARMAKOLÓGIAI ÉS TERÁPIÁS VONATKOZÁSAI A DIABETES MIKROVASZKULÁRIS SZÖVŐDMÉNYEINEK TERÁPIÁS LEHETŐSÉGEI KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS IRODALOMJEGYZÉK SAJÁT KÖZLEMÉNYEK AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT SAJÁT KÖZLEMÉNYEK AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁN KÍVÜL MEGJELENT SAJÁT KÖZLEMÉNYEK TUDOMÁNYOS ELŐADÁSOK, POSZTEREK, TOVÁBBKÉPZŐ ELŐADÁSOK Az értekezés témájában Az értekezés témáján kívül ÖSSZEFOGLALÓ SUMMARY

5 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE AGE ALT ATP BB BMI BSA camp DCCT DM DMSO DNS DR EGTA ETDRS FAD FLAG FSK GGT GLP-1 GLUT HbA 1c HEPES HGF ICAM-1 IFN IGT IL LDL MAO NK NOD NPDR PDR RAO SSAO TGF TNF UKPDS VAP-1 VCAM-1 VEGF vw késői glikációs végtermékek (advanced glycation end products) szérum alanin-aminotranszferáz adenozin trifoszfát biotenyésztés (bio breeding) testtömeg index (body mass index) bovin szérum albumin ciklikus adenozin monofoszfát Diabetes Control and Complication Trial diabetes mellitus dimetilszulfoxid dezoxiribonukleinsav diabeteses retinopathia etilénglikol-bi-(2-amino etiléter)n,n-tetra ecetsav Early Treatment Diabetic Retinopathy Study Research Group flavin adenin dinukleotid fluoreszcein angiográfia forskolin szérum gamma-glutamil-transzpeptidáz glukagon-szerű peptid-1 glukóztranszporter glikált hemoglobin 4(hidroxietil)-1-piperazin etán szulfonsav hepatocita növekedési faktor intercelluláris sejtadhéziós molekula-1 interferon gamma csökkent glukóztolerancia (impaired glucose tolerance) interleukin low density lipoprotein monoaminoxidáz természetes ölősejtek (natural killer cells) non-obez diabeteses (non-obese diabetic) non-proliferatív diabeteses retinopathia proliferatív diabeteses retinopathia retina specifikus aminoxidáz szérum szemikarbazid-szenzitív aminoxidáz transzformáló növekedési faktor (transforming growth factor ) tumor nekrózis faktor United Kingdom Prospective Diabetes Study vaszkuláris adhéziós protein-1 vaszkuláris sejtadhéziós molekula-1 vaszkuláris endotheliális növekedési faktor (vascular endothelial growth factor) von Willebrand faktor 5

6 1. BEVEZETÉS A diabetes mellitus (DM) komplex anyagcsere zavar, amelyet krónikus hiperglikémia, valamint a szénhidrát-, zsír-, és fehérje-anyagcsere egyéb rendellenességei jellemeznek, s amelyet gyakran kísérnek specifikus mikrovaszkuláris (retinopathia, nephropathia, neuropathia) és makrovaszkuláris szövődmények (atherosclerosis, stroke, coronariabetegség, perifériás artériák betegsége). Az egyre rohamosabban növekvő számú beteg miatt, az új terápiás lehetőségek kutatása rendkívül időszerű. Az elkövetkezendő évtizedekben a diabetes betegek számának további jelentős növekedése várható. A WHO előrejelzése szerint 2025-re, a Föld 20 év feletti lakosságában a cukorbetegek száma a jelenlegi 140 millióról várhatóan 300 millióra nő [48]. Hazánkban ma kb személy tud diabeteséről, ugyanennyien nincsenek tudatában betegségüknek, így magyarországi előfordulása feltehetően eléri a 10%-ot. Ezért különleges fontosságú, hogy a DM kialakulását és a lehetséges szövődmények arányát minél inkább visszaszorítsuk. A diabetes mellitus pathogenezisében jelenleg a B-sejt glukóz-szenzor funkciójának, valamint insulin szekréciójának elsődleges hibáját és/vagy a perifériás szövetek insulin rezisztenciáját tartjuk a betegség megjelenéséért felelős állapotnak. A kialakult kóros anyagcsere viszonyokat jellemzően visszafordíthatatlan morfológiai eltérések kísérik, melyek az érintett személyek életminőségét és életkilátásait rontják. A kutatások ezért a betegség kialakulásának és lefolyásának minél alaposabb megismerését célozzák. Ezen ismeretek birtokában nyílhat mód a folyamat minél korábbi fázisában történő megállítására, a szövődmények kialakulásának megelőzésére, illetve súlyosságának mérséklésére, az életminőség javítására, a mortalitás csökkentésére. Jelen értekezésben a multidiszciplinális téma megközelítése a betegség okait felderítő alapkutatások felől, valamint a diabetes szövődményeivel találkozó klinikus szemszögéből történik. In vitro kísérleteinkben insulin szekréciós és metabolikus vizsgálatokat végeztünk patkány pancreasból izolált szigetekben, valamint szigetsejtekben. Az értekezés klinikai részében, a szemikarbazid-szenzitív aminoxidáz (SSAO) enzim szerepét vizsgáltuk a diabeteses retinopathia pathogenezisében, 2-es típusú cukorbetegségben. 6

7 2. IRODALMI HÁTTÉR 2.1 AZ INSULIN SZEKRÉCIÓ FIZIOLÓGIÁJA A pancreas Langerhans-szigetek szöveti felépítése A pancreas exokrin állományától jól elkülönülő sejtcsoportok létezését 1869-ben írta le Paul Langerhans. Az ovális alakú, pancreas-szerte előforduló, 76x175 µm nagyságú sejtcsoportok sűrűbben találhatók meg a farokrészben, mint a fejben és a testben. A szigetek az átlagosan g tömegű pancreasnak mindössze 1-3 %-át alkotják. Felnőtt emberben a számuk kb. 1-2 millió. Bőséges a vérellátásuk, vénás vérük a V. portae rendszerébe kerül. A Langerhans-szigetek sejtjeit festődésük és morfológiájuk alapján csoportosíthatjuk. Emberben legalább négy különböző alapvető sejttípus fordul elő: A-(α), B-(β), D-(δ), és F-(PP) sejtek melyek legalább négy, hormonális aktivitással rendelkező peptidet termelnek: glukagont, insulint, szomatosztatint és pancreas-polipeptidet. Az insulint termelő B-sejtek, amelyek a leggyakoribbak, rendszerint az egyes szigetek centrumában helyezkednek el, non-b-sejtekkel (A-, D- és F-sejtekkel) koszorúszerűen körülvéve Az insulin szekréciót befolyásoló tényezők A pancreas B-sejtek insulin szekréciója nélkülözhetetlen a szervezet energia homeosztázisának fenntartásában. Az insulin szekréció fiziológiás körülmények között állandó, folyamatos ellenőrzés alatt áll [88]. Az insulin szekrécióját azonnali hatással, direkt módon befolyásolhatják tápanyagok, hormonok, neurotranszmitterek, valamint hosszú távú szabályozással számos ontogén, táplálkozási és endokrin faktor [88]. Az insulin a B-sejtek endoplazmatikus retikulumában szintetizálódik. Innen a Golgiapparátusba kerül, ahol membránhoz kötött granulumokba épül be. Megfelelő szekréciós inger hatására, ezek a granulumok a mikrotubuláris rendszer részvételével jutnak a sejthártyához, amivel aztán membránjuk fuzionál, és az insulin exocitózissal a külső térbe kerül. Átjut a B-sejtek és a szomszédos kapillárisok bazálmembránján, majd a kapillárisok fenesztrált endotheliumán keresztül a véráramba kerül. 7

8 2.1.3 Glukózzal indukált insulin szekréció A keringésben lévő D-glukóz kulcsszerepet tölt be az insulin szekréció szabályozásában. A D-glukóz az egyetlen tápanyag, amely fiziológiás koncentrációban, más exogén tápanyag nélkül is képes in vitro az insulin szekréció stimulálására. A D-glukóz szinte azonnali insulin szekréciót kiváltó hatása a pancreas B-sejtek számos metabolikus, iontranszport és mechanikai folyamatának eredménye (ld. I. táblázat és 1. ábra). I. táblázat. A D-glukózzal indukált insulin szekréció lépései a pancreas B-sejtekben [88]. 1. Metabolikus események GLUT2 transzporter részvétele a D-glukóz koncentráció gyors kiegyenlítődésében, a B-sejt membránon át Glukokináz enzim foszforilálja a D-glukózt A glikolízis felgyorsul Az oxidatív foszforiláció preferenciális fokozódása a mitokondriumban: ATP képződés 2. Iontranszport folyamatok Az ATP stimulálja a K + csatornák záródását Ennek megfelelően a plazmamembrán depolarizálódik Ennek eredményeképpen kinyílnak a feszültség-függő Ca 2+ csatornák A Ca 2+ beáramlik a sejtbe és a citoplazma Ca 2+ koncentrációja emelkedik 3. Mechanikai folyamatok A mikrotubuláris rendszer részvétele a szekréciós granulumok oda-vissza mozgásában A mikrofilamentáris rendszer közreműködésével a szekréciós granulumok elérik az exocitózis helyét Membrán fúzió és leválás az exocitózis helyén Exocitózis és endocitózis (membrán recirkuláció) 8

9 D-glukóz Insulin GLUT-2 Glukokináz Glukóz-6-P Glikolízis Ca 2+ Citrát kör ATP K + -ATP csatorna Ca 2+ szulfonilurea K + 1. ábra. A pancreas B-sejtek insulin szekréciója. (A szaggatott vonal gátló hatást jelez. : membrán depolarizáció.) A D-glukóz tápanyag szerepét az insulin szekréció D-glukóz koncentráció és időfüggése is bizonyítja. Egyensúlyi állapotban az insulin szekréció arány szigmoid jellegű módon kapcsolt az extracelluláris glukóz koncentrációhoz. A küszöbérték 5.0 mm-hoz közel, a maximális válasz fele 10.0 mm-nál, a maximális insulin szekréció pedig 20.0 mm D-glukóz koncentráció körül alakul ki. Váratlan D-glukóz koncentráció emelkedésnél az insulin szekréció fokozódás bifázisos jellegű. Az első gyors szekréciós fázis után, mely 1-2 percen belül eléri csúcsértékét, kb. 5 perc elteltével jelenik meg a lassabban emelkedő, elhúzódó jellegű insulin szekréció fokozódás második fázisa. Ugyanis a D-glukóz és más tápanyag-jellegű szekréció fokozó anyagok, nemcsak a preformált insulin szekrécióját fokozzák, amelyet a belső raktárakból felszabaduló Ca 2+ vált ki, hanem a proinsulin bioszintézisét is. Ez a B-sejtben az insulin prekurzor peptidek preferált szintézisével kapcsolatos [88]. 9

10 A D-glukóz metabolizmus szerepe az insulin szekrécióban. A glukóz-szenzor funkció A D-glukóz transzportja, foszforilációja és katabolizmusa a pancreas B-sejtekben az extracelluláris D-glukóz szintnek megfelelően vezet az intracelluláris ATP-szint emelkedéséhez. A D-glukóz metabolizmusában részt vevő és azt szabályozó B-sejt specifikus folyamatok összessége a B-sejt optimális működését eredményezik. A B-sejt glukóz-szenzor funkciója ezeken a különleges folyamatokon keresztül valósul meg, és látja el feladatát [85]: 1. A B-sejtekben a GLUT2 transzporter részvételével válik lehetővé a D-glukóz transzport, vagyis a D-glukóz koncentráció azonnali kiegyenlítődése az extracelluláris és intracelluláris tér között. 2. Az insulin termelő B-sejtekben a D-glukóz foszforilálását az alacsony K m -mel ( mm) rendelkező hexokináz enzim mellett, a magas K m -ű (10 mm) glukokináz enzim is katalizálja, így vezetve a D-glukóz foszforiláció arányának emeléséhez fiziológiás mértékű vércukor szint növekedés esetén. 3. A pancreas B-sejtekben mind a hexokináz, mind a glukokináz mitokondriális porin fehérjékhez kötött. Ez a kötődés teszi lehetővé a mitokondriális ATPfelhasználódását a D-glukóz foszforilációhoz, valamint összeköti a hexózok foszforilációját és a mitokondriális légzési folyamatokat [87]. 4. A pancreas B-sejtekben jelen levő glukokináz regulátor fehérje, - mely a glukokinázhoz kapcsolódik, ha fruktóz-6-p kötődik hozzá - a glukokináz enzim aktivitását csökkenti. Fruktóz-1-P kötődése a regulátor fehérjéhez azonban disszociálja a regulátor fehérjét a glukokináz enzimről, és az aktív marad [73]. 5. A D-glukóz fiziológiás koncentráció tartományában fokozódnak a foszforilált D- glukóz szint arányában a mitokondriális oxidatív lebontó folyamatok. A főbb mitokondriális dehidrogenázok Ca 2+ függő módon aktiválódnak. (Mint pl. a dihidroxiacetonfoszfát-glicerofoszfát shunt FAD-koenzimmel működő kulcsenzime, a glicerofoszfát dehidrogenáz enzim). Így tehát magasabb D-glukóz koncentráció esetében, a piruvát termelés jobban fokozódik, mint a laktát termelés, vagyis az ATP javarésze a piruvát mitokondriális oxidációjából, illetve a D-glukózból ered [85]. Preferáltan stimulált mitokondriális ATP termelés következik be: a citoplazmában levő ATP mennyiségének folyamatos szabályozása az extracelluláris D-glukóz szint emelkedésével egy időben, szimultán történik [87]. 10

11 6. D-glukóz anomér specificitás. Az -D-glukóz (glikolízisbeli) metabolizmusa hatékonyabb, és insulinotróp hatása is kifejezettebb, mint a -D-glukózé [78] Iontranszport folyamatok A glukóz metabolizmus a glikolízis következtében ill. a preferáltan stimulált mitokondriális ATP termeléssel, nemcsak energetikai jelentőségű folyamat, hanem az ion koncentrációt is befolyásolja, a plazmamembránon át történő K + vagy Ca 2+ transzporton keresztül [91]. A magas citoplazmatikus ATP szint összekötő kapocs a D- glukóz metabolizmus helyétől "távolabb" folytatódó iontranszport folyamatokkal [91]. Az insulin szekrécióban központi szerepet játszik a plazmamembrán K + csatorna zárása ATP által (ld. 1 ábra). Ennek következtében az intracelluláris kálium szint nő, vagyis a sejten belüli pozitív töltés mennyisége növekszik, a plazmamembrán depolarizálódik és a Ca 2+ feszültség-függő csatornák megnyílnak. A Ca 2+ beáramlása emeli a citoplazma szabad Ca 2+ koncentrációját és aktiválja a mikrotubuláris-mikrofilamentáris rendszert, amely elősegíti a szekréciós granulumok megfelelő irányú transzlokációját és exocitózissal történő szekrécióját. A kationok és sejtmozgások részvételét az insulin szekréció folyamatában radioizotópos, elektrofiziológiai, ultrastrukturális és sejtkinetikai vizsgálatok is bizonyították [94] Mechanikai folyamatok A sejtváz-citoszkeleton (mikrotubuláris-mikrofilamentáris) rendszer aktívan képes módosítani az insulin szekréciót [86]. A sejt felszínével párhuzamosan rendeződő sejtváz, a nem stimulált pancreas B-sejtekben, a plazmamembrántól távol tartja az insulin granulumokat. Megfelelő inger hatására azonban, a granulumok lefűződnek és a mikrotubuláris-mikrofilamentáris rendszer mentén a sejtmembránhoz jutnak, majd exocitózisra kerülnek. Ismert, hogy a mikrofilamentáris hálózat gátlószereivel (pl. cytochalasin B) insulin szekréció idézhető elő [68, 102, 139]. A mechanikai folyamatokat biokémiai események kísérik. A mikrofilamentáris rendszer mozgását a kalcium citoplazmatikus koncentrációjának növekedése váltja ki, a kalciumkalmodulin függő protein kináz és protein kináz A, valamint miozin könnyű lánc kináz (MLCK) együttes foszforiláló hatásán keresztül [51]. 11

12 Sejtek közötti kölcsönhatások, a sejtek heterogenitásának szerepe A Langerhans-szigetekben a B-sejtek és a non-b-sejtek parakrin módon befolyásolják a szomszédos sejtek szekretoros működését [107]. A szigeten belüli mikrocirkuláció, valamint a sejtek közötti rés-kapcsolat (gap junction) és a bioelektromos intercelluláris kölcsönhatások is potenciális szabályozó szerepet tölthetnek be [103]. Kimutatható, hogy még egy szigeten belül is, a B-sejtek különféle metabolikus, szintetikus és szekréciós aktivitás-szintűek lehetnek. A D-glukóz koncentráció emelkedése szinkronizálhatja a sejteket, ami magyarázhatja az insulin szekréció oszcilláló működését [75] Nem-glukóz insulinotróp hatások A D-glukózon kívül, számos más vegyület is képes a B-sejtek insulin szekrécióját előidézni. Ezek egy része lényegében utánozza a tápanyag D-glukóz insulin szekrécióra gyakorolt hatását így pl. egyéb monoszacharidok, bizonyos aminosavak. A tápanyagként hasznosuló nem-glukóz insulinotróp anyagok hatására akkor is létrejön insulin szekréció, ha a GLUT2 transzporter, ill. a glukóz-szenzor funkció bármely komponense nem működik, vagyis amikor a hiperglikémia már nem vált ki insulin elválasztást. Az insulinotróp anyagok más része a glukóz hatását potenciálva, csak glukóz jelenlétében fejti ki hatását. Ilyenek pl. a β-adrenerg receptor agonisták, a peptidhormonok (gasztrointestinális hormonok, glukagon, kortikotropin), vagy a foszfodieszteráz gátlók (pl. a teofillin). Közös ezekben a vegyületekben, hogy a B-sejtek camp tartalmát növelik. camp hatására a sejtszervekből, a camp-kalmodulin [136] rendszeren keresztül stimuláló hatású Ca 2+ szabadul fel, így az intracelluláris Ca 2+ koncentráció emelésével serkentik az insulin szekréciót Az aminosavak insulinotróp hatása Az aminosavak pancreas szigetek insulin szekréciójára gyakorolt hatása kettős [83]. Egyes aminosavak (pl. az L-glutamin, L-leucin) oly módon stimulálják a szigetek insulin szekrécióját, hogy tápanyagként hasznosulnak a sejtekben [69, 76]. Más aminosavak, pl. az L-arginin pozitív töltésük következtében akkumulálódnak az insulint termelő sejtek belsejében és ez eredményezi az insulin szekréciós választ [12]. 12

13 Az aminosavak tápanyag szerepe az insulin szekrécióban Elsőként az L-leucinról vált ismertté, hogy (10 mm koncentrációban) D-glukóz nélkül is insulinotróp hatású. Régebben úgy gondolták, hogy hatását sztereospecifikus receptorhoz kötődve fejti ki [79, 143]. Később kiderült, hogy a transzportálódó, nem metabolizálódó leucin-analóg, a 2-aminobiciklo[2,2,1]heptán-2-karbonsav (BCH) ugyancsak stimulálja az insulin szekréciót azáltal, hogy aktiválja a glutamát dehidrogenázt és stimulálja a szigetekben az endogén aminosavak katabolizmusát. Ezzel párhuzamosan fokozódott a szigetek O 2 felvétele és csökkent a K + konduktancia, vagyis záródtak a K + csatornák, fokozódott a proinsulin szintézis és az insulin szekréció [121]. Az L-leucin dezaminált analógja a 2-ketoizokapronsav L-aszparaginnal vagy L- glutaminnal együtt alkalmazva, a citoplazmatikus NADPH+H szint emelésével [74], ill. transzaminálódva fokozzák az insulin szekréciót [79, 143]. Hasonló a kevéssé metabolizálódó ketosav, a 3-fenilpiruvát insulinotróp hatása is. Az aminosavak transzaminálódásában való részvételével fokozza a szigetekben az endogén aminosavak lebontását [80] Bázikus aminosavak hatása a pancreas B-sejtek insulin szekréciójára Az L-arginin insulinotróp hatását elsősorban a B-sejtben való akkumulációja okozza, mely arginin-transzporter függő folyamat. A pozitív töltésű aminosavak, az L-arginin, L- ornitin és a nem metabolizálódó L-homoarginin depolarizálják a plazmamembránt, megnyitva a Ca 2+ feszültség-függő ioncsatornákat [12]. A D-glukóz insulinotróp hatásával összehasonlítva, nincsen foszfát csapda, és nem az ATP képzéstől függ az insulin szekréció. Ismert, hogy az L-ornitin a poliamin szintézisben, és azon felül az L- arginin az NO képzésben, az urea ciklusban és a kreatin szintézisben vesz részt Dikarbonsavak metil-észterei A glutamát, a szukcinát és a piruvát metil-észtereik formájában könnyebben penetrálnak a pancreas B-sejtekbe, és kiváló insulinotróppá válnak [70]. Alkalmazásuk a diabetes terápiájában a jövő ígéretes lehetőségnek tűnik (ld. 7.1 fejezet). 13

14 Hormonok és neurotranszmitterek szabályozó szerepe A katekolaminok kettős hatást fejtenek ki az insulin szekrécióra, α-adrenerg receptorokon keresztül gátolják, β-adrenerg receptorokon keresztül serkentik. Az adrenalin és noradrenalin nettó hatása általában a gátlás. Az adrenalin 2 -receptoron keresztül hatva gátolja a tápanyag-kiváltott insulin szekréciót pl. stressz, vagy izommunka során [88]. Ugyanakkor pl. izommunka során az insulin szekretálódik vércukor szint emelkedés nélkül is, amely arra utal, hogy a (tápanyag) D-glukózon kívül számos más faktor is szabályozhatja az insulin szekréciót [88]. Ezzel ellentétben a gasztrointesztinális hormonok, mint a glukagon-szerű peptid-1 (glucagon-like peptide-1; GLP-1), a gasztrin, vagy a szekretin potenciálják a tápanyagkiváltott insulin szekréciót, az adenilátcikláz enzim aktiválásán keresztül. Ez a magyarázata annak a tapasztalatnak, hogy a D-glukóz szájon át adva fokozottabb arányú insulin szekréciót idéz elő, mint ugyanakkora mértékű hiperglikémiát okozó intravénás D-glukóz injekció [88]. Az insulin szekréció kolinerg szabályozása a foszfolipáz C diacilglicerol inozitol- 1,4,5-triszfoszfát protein kináz C intracelluláris Ca 2+ mobilizáción keresztül valósul meg. A N. vagus ezen az úton közvetíti az insulin szekréció kefalikus fázisát [88] Az insulin szekréció hosszú távú szabályozása Az insulin szekréció hosszú távú szabályozásában ontogén faktorok is résztvesznek. Ez magyarázza a pancreas eltérő szekréciós működését a különböző életszakaszokban (fötális, neonatális, felnőtt kor). A táplálkozási faktorok szerepét bizonyítja, hogy éhezésben a D-glukózra adott insulin szekréciós válasz zavart szenved, mely a glukokináz enzim csökkent expressziójával hozható összefüggésbe [36]. Ezzel ellentétben elhízás esetében, a D-glukózra adott insulin szekréciós válasz jelentős fokozódását tapasztaljuk. Számos hormon képes a pancreas B-sejtek működését befolyásolni. Megváltozott endokrin állapotokban (pl. pajzsmirigy betegségek, akromegália, terhesség, laktáció) számítani lehet az insulin szekrécióban bekövetkező változásokra is [88]. 14

15 2.2 AZ INSULIN SZEKRÉCIÓ ZAVARA A diabetes mellitus multifaktoriális etiológiájú betegség, melyet elsősorban krónikus hiperglikémia jellemez. 1-es típusú cukorbetegségben a B-sejtek pusztulása következtében abszolút insulin hiány alakul ki. 2-es típusú cukorbetegségben a pancreas B-sejtek öröklött vagy szerzett insulin szekréció zavara és/vagy extrapancreatikus insulin rezisztencia alakul ki [91]. A B-sejt diszfunkció az insulin szekréció valamennyi speciális fázisát érintheti (ld. II. táblázat). II. táblázat. A B-sejt diszfunkció lehetséges okai 2-es típusú diabetes mellitusban [88]. 1. A proinsulin-insulin átalakulás öröklött zavara 2. A D-glukóz metabolizmus elsődleges zavara A glukokináz gén mutációja (csökkent működés) A glukóz-6-foszfatáz enzim túlműködése A mitokondriális, FAD-dal működő glicerofoszfát dehidrogenáz enzim csökkent aktivitása (energetikai zavar) 3. D-glukóz metabolizmus másodlagos zavara GLUT2 gén expresszió csökkenése (underexpression) Glikogén akkumulálódás (glukotoxicitás) 4. Mitokondriális ATP generálás zavara trns Leu(UUR) pontmutáció 5. A mikrotubuláris-mikrofilamentáris rendszer zavart működése az insulin szekrécióban A II. táblázatban összefoglalt B-sejt diszfunkciók közül, a proinsulin átalakulás és a C- peptid kihasadás zavarát 2-es típusú DM néhány esetében, familiáris betegségként írták le. Különböző mitokondriális génmutációk (DNS ill. RNS pontmutációk, pl. trns Leu(UUR) pontmutáció) is szerepet játszhatnak a 2-es típusú DM pathogenezisében, zavart okozva a mitokondriális ATP generálásában [34]. A szekréciós folyamat utolsó fázisát érintő, speciálisan a B-sejtek mikrotubuláris rendszerének zavarát is leírták már, kísérletes 2-es típusú diabeteses állat-modell esetében, hiperglikémiás egerekben (Acomys cahirinus) [95]. 15

16 2.2.1 A "G-kvintett" A legtöbb 2-es típusú diabetes esetében, elsősorban a D-glukózra adott szekréciós válasz szenved zavart, más tápanyag illetve nem-glukóz insulinotróp anyag hatásával összehasonlítva [91]. Feltételezhetően tehát, a pancreas B-sejtek D-glukóz szenzor funkciójának zavara alakul ki először, mely meghatározó jelentőségű a 2-es típusú DM pathogenezisében [91]. A D-glukóz metabolizmusában kialakuló lehetséges működészavarokat, - találó módon - a "G-kvintett"-ként foglalhatjuk össze [84] (ld. III. táblázat). III. táblázat. A pancreas B-sejt D-glukóz metabolizmusának lehetséges működészavarai 2-es típusú diabetes mellitusban: a "G-kvintett" [84]. 1. GLUT2 gén expresszió zavara 2. Glukokináz gén mutáció 3. Glukóz-6-foszfatáz túlműködése 4. Glicerofoszfát dehidrogenáz hiánya 5. Glikogén akkumuláció 1. A GLUT2 csökkent expressziója. Hosszantartó hiperglikémia esetében a GLUT2 pozitív sejtek száma, az insulin pozitív sejtek számának arányához képest csökken [101]. Ez a funkcionális defektus a glukóz metabolizmus zavarához vezet és új értelmezést nyer a B-sejtek heterogenitásának ismeretében (ld fejezet). 2. A glukokináz gén non-sense mutáció számos MODY (maturity-onset diabetes of the young) beteg esetében kimutatható (ez a 2-es típusú cukorbetegek kb. 1%-át jelenti) [141]. A legtöbb 2-es típusú diabetesben szenvedő betegben azonban ilyen eltérés nem található. 3. A glukóz-6-foszfatáz túlműködése jelentős funkció zavart eredményezhet 2-es típusú diabetesben, ugyanis a (glukóz-6-p glukóz+p i ) futil ciklus (foszfát csapda) kialakításával ATP deplécióhoz vezet [91]. 4. A FAD-dal aktivált mitokondriális glicerofoszfát dehidrogenáznak, a dihidroxiacetonfoszfát-glicerofoszfát út (shunt) kulcsenzimének felnőttkori csökkent működése kapcsolatba hozható az élet korai szakaszában történt fehérjehiányos táplálkozással [110]. Hasonló zavart találtak öröklődő, 2-es típusú DM-ban szenvedő rágcsálókban (Goto-Kakizaki patkányok, db/db egerek és fa/fa patkányok) is. 16

17 Ilyen károsodás azonban, nem volt ki mutatható az 1-es típusú diabeteses állatmodellekben (spontán diabeteses BB patkányokban ill. NOD egerekben) [88]. 5. Glikogén akkumuláció. A normoglikémiás szigetek nem tartalmaznak kimutatható mennyiségű glikogént, viszont akár csak egy napig tartó, extrém magas glukóz expozíció után, a glikogén akkumulálódik a szigetsejtekben, mind in vivo, mind in vitro [88] Glukotoxicitás A relatív vagy abszolút insulin hiány következménye a krónikus hiperglikémia, amely önmagát felgyorsító folyamatban a cukorbetegség kialakulásához és annak számos szövődményéhez vezet a szervezetben Glukóz-deszenzitizáció és glukotoxicitás a B-sejtekben A krónikus hiperglikémia másodlagos B-sejt funkció-zavart eredményezhet, melynek reverzibilis fázisában glukóz-deszenzitizáció következik be. Ekkor a pancreas B-sejtek kevéssé érzékenyek a D-glukóz insulinotróp hatására. Ez a fázis időleges és visszafordítható [52]. A glukotoxicitás azonban már a B-sejt irreverzibilis károsodását jelenti [91]. Vagyis lényegében először maga a B-sejt válik diabetesessé. A glukotoxicitás okai és/következményei a B-sejtekben [91]: 1. Szorbitol akkumuláció a B-sejtekben. 2. A B-sejt proteinek nem-enzimatikus glikációja (beleértve a citoszolban található fehérjéket is). 3. A szekréciós túlműködés miatt bekövetkező B-sejt kimerülés. 4. Glikogén akkumuláció a B-sejtekben. 5. Hiperglikémiás pszeudohipoxia: a hiperglikémia során a megnövekedett glukózoxidáció a NADPH felszaporodásához vezet, mely fokozott szabadgyök termeléssel jár. A glukotoxicitás speciális jelei: 1. Paradox módon, D-glukóz koncentráció emelkedése után, átmeneti insulin szekréció gátlás, majd csökkentő D-glukóz koncentrációnál, insulin szekréció fokozódás következik be. 2. Intravénás D-glukóz adására 2-es típusú DM betegek az anomer specificitás zavarát mutatják. Az -D-glukóz anomerre adott insulin szekréciós válasz preferenciája gátlódik, sőt megfordul [90]. 17

18 A glukotoxicitás és következményei az extrapancreatikus szövetekben A hiperglikémia a biokémiai folyamatok egyensúlyzavarait váltja ki (nem-enzimatikus glikáció, protein kináz C aktiváció, hexózamin anyagcsere út, aldóz reduktáz enzim aktivitás növekedés), melyek sejt-szintű működési zavart eredményeznek (vazoaktív anyagok termelődése, kóros fibrinolitikus és antithrombin aktivitás, oxidatív stressz) [18, 131]. Ezen tényezők következtében jellegzetes anatómiai és funkcionális elváltozások keletkeznek a szervezet számos szövetében, mely állapotok részletes ismertetése meghaladja az értekezés kereteit. Ezért a továbbiakban a diabetes specifikus krónikus érszövődmények közül, az értekezés klinikai vizsgálataihoz kapcsolódó diabeteses retinopathiával foglalkozunk. 2.3 A DIABETES MIKROVASZKULÁRIS SZÖVŐDMÉNYEI A diabeteses retinopathia epidemiológiája A diabeteses retinopathia (DR) a cukorbetegségben kialakuló krónikus, specifikus kisérkárosodások közül az egyik leggyakoribb, az életminőséget jelentősen befolyásoló szövődmény. Megfelelő kezelés nélkül, a magára hagyott betegség - az esetek nagy részében a non-proliferatív, majd proliferatív stádiumon át - teljes vaksághoz vezet. Jelenleg a diabeteses retinopathia, az iparilag fejlett ill. közepesen fejlett társadalmakban a év közötti, munkaképes korú korosztályban a megelőzhető vakság fő oka. A nemzetközi ajánlásoknak megfelelően (Saint Vincent Deklaráció, Diabetes 2000 SM ) hazánkban is hangsúlyt kell fektetni a cukorbetegség következtében látáskárosodott betegek számának csökkentésére [5, 53] A diabeteses retinopathia rizikótényezői Nagyszámú beteganyagon végzett prospektív tanulmányok (DCCT, UKPDS) tapasztalatai szerint a DM időtartama és a hiperglikémia mind 1-es, mind 2-es típusú diabetesben a mikroangiopathiás szövődmények, így a retinopathia legfontosabb rizikótényezői [134, 135]. 2-es típusú cukorbetegekben 15 év betegségtartam után, közel 78%-ban alakul ki valamilyen fokú diabeteses retinopathia [49]. Ugyanakkor a fokozatos és gyakran tünetmentes kezdet miatt, az újonnan felfedezett 2-es típusú cukorbetegekben (az általában non-proliferatív stádiumú) DR az esetek 18-39%-ában is jelen lehet [51]. Előfordulhat, hogy látásromlás, vagy más okból végzett vizsgálat kapcsán, a szemfenéki kép alapján a szemorvos diagnosztizálja a cukorbetegséget [105]. 18

19 A nem-megfelelő szénhidrát anyagcsere viszonyok mellett számos egyéb, potenciálisan befolyásolható rizikófaktor is szerepet játszhat a DR kialakulásában és progressziójában: többek között a magasabb szisztolés és diasztolés vérnyomás, valamint az emelkedett plazma triglicerid szint [25, 49, 51]. A diabeteses angiopathiára, így a retinopathiára való fogékonyság kialakulásában genetikai faktorok is szerepet játszhatnak [9]. A felsorolt tényezők azonban a DR számos és sokszínű klinikai megjelenési formájának csak egy részét magyarázzák A diabeteses retinopathia pathogenezise Bár a szemfenéki elváltozások jól ismertek, a vaszkuláris endothel károsodás pathomechanizmusa nem tisztázott még teljes mértékben. A tartósan magasabb vércukorszint biokémiai folyamatok egyensúlyzavarait váltja ki, mely a retina érhálózatában is jellegzetes anatómiai és funkcionális elváltozásokhoz vezet (ld. IV. táblázat). IV. táblázat. A diabeteses retinopathia kórlefolyása során kialakuló anatómiai és funkcionális elváltozások [50]. Anatómiai elváltozások bazálmembrán károsodás (vastagodás) pericita veszteség az érfalban (apoptózis) endothel proliferáció mikroaneurizmák képződése kapillárisok elzáródása neovaszkularizáció Funkcionális elváltozások károsodott véráramlás, viszkozitás hipoxia, ischaemia kapilláris permeabilitás vér-retina gát károsodás elektrofiziológiai eltérések (ERG) Az érdeklődés középpontjában jelenleg a krónikus hiperglikémiára visszavezethető számos pathomechanizmus mellett, a retinopathia kialakulásának molekuláris alapjai, a növekedési faktorok pl. hepatocita növekedési faktor (HGF), transzformáló növekedési faktor (TGF vaszkuláris endotheliális növekedési faktor (VEGF), ill. jelátviteli rendszereik állnak [1, 20, 104, 145]. 19

20 2.4 A MULTIFUNKCIONÁLIS MOLEKULA: A SZEMIKARBAZID-SZENZITÍV AMINOXIDÁZ ENZIM A szemikarbazid-szenzitív aminoxidáz enzim elnevezés - (SSAO; EC ) [amine:oxygen oxidoreductase (deaminating)(copper-containing)] - több homológ enzimet jelöl az aminoxidáz enzimek családján belül. Az enzimcsoport közös vonása, hogy kofaktorként FAD helyett rezet tartalmaznak, érzékenyek a szemikarbaziddal és egyéb ún. karbonil reagensekkel való gátlásra, de rezisztensek a monoaminoxidáz enzimek (MAO-A és MAO-B) inhibitoraival szemben, mint pl. a clorgilin és a pargilin [10, 16, 149]. Az értekezésben az enzimcsaládot összefoglalóan, SSAO néven említjük. Az enzim az emlős állatok és az emberi szervezet számos szövetében megtalálható, elsősorban az érfal simaizomsejtjei és több más sejt-típus (pl. zsírsejt, retina ganglionsejt) plazmamembránja tartalmazza [44, 63, 153]. Szolubilis SSAO aktivitás a szérumban is kimutatható [147]. A szérum SSAO enzim génszekvenciáját (a 17. kromoszóma q21-es régióján) és glikoprotein struktúráját (két azonos alegység, melyben egy kezdeti rövid N terminális citoplazmatikus domén után egy transzmembrán szakasz következik, majd egy nagyobb extracelluláris domén, mely tartalmazza a katalitikus helyet, valamint egy réz iont) egymástól függetlenül végzett kutatások azonosnak találták a vaszkuláris adhéziós protein-1 (VAP-1) szerkezetével [124, 152]. A VAP-1 szelektint nem igénylő multifunkcionális adhéziós molekula, mely a leukociták (elsősorban CD8+ limfociták és NK sejtek) endothelhez való kitapadását és a szervezeten belüli közlekedését segíti. Az SSAO fiziológiai és pathofiziológiai szerepe még nem ismert minden részletében. Az SSAO enzim által katalizált oxidatív deamináció során monoamin vegyületekből (pl. metilaminból, aminoacetonból) aldehidek, valamint hidrogén-peroxid és ammónia keletkeznek (ld. 2. ábra) [63, 150]. Endothel sejttenyészetben, egyidejű metilamin és SSAO expozíció után jellegzetes morfológiai változások észlelhetők: a pszeudopódiumok eltűnése, vakuolizáció és sejt zsugorodás [150]. 20

21 SSAO a.) CH 3 NH 2 + O 2 + H 2 O HCHO + H 2 O 2 + NH 3 metilamin formaldehid hidrogén-peroxid ammónia SSAO b.) CH 3 OCH 2 NH 2 + O 2 + H 2 O CH 3 COCHO + H 2 O 2 + NH 3 aminoaceton metilglioxál hidrogén-peroxid ammónia 2. ábra. Az SSAO enzim által katalizált oxidatív deamináció a.) metilamin, ill. b.) aminoaceton szubsztrát jelenlétében. A reakció során toxikus hatású aldehid, hidrogén-peroxid és ammónia keletkezik. Emelkedett szérum SSAO aktivitást mutattak ki diabeteses kísérleti állatokban [28, 42], 1-es és 2-es típusú cukorbetegekben [13, 14, 98], valamint krónikus pangásos szívelégtelenségben [15] és krónikus májbetegségben [54]. Feltételezések szerint a fokozott SSAO enzim aktivitás során keletkező toxikus reakciótermékek endothelkárosító hatása szerepet játszhat a krónikus érszövődmények kialakulásában [148]. Diabeteses retinopathiában szenvedő 1-es és 2-es típusú cukorbetegekben is magasabb SSAO szintek mérhetők [13, 35, 39]. Az azonban nem tisztázott egyértelműen, hogy vajon a szérum SSAO aktivitás különböző-e a DR különböző súlyossági stádiumaiban, van-e direkt összefüggés a retinopathia súlyossága és az enzim aktivitás között. 21

22 3. CÉLKITŰZÉSEK 3.1 IN VITRO KÍSÉRLETEK Az aminosavak szerepét az insulin szekréciós válaszban és a szekréció szabályozásában számos tanulmány vizsgálta már [11, 12, 64, 69, 76, 115, 116, 119]. Ezekben a kísérletekben azonban az aminosavakat a fiziológiás koncentrációt sokszorosan meghaladó dózisban (mm) alkalmazták, ill. csak néhány aminosav kombinációjának insulinotróp hatását vizsgálták. Célul tűztük ki ezért, hogy az aminosavak insulin szekrécióban betöltött kettős hatásmódját fiziológiás körülmények között is igazoljuk. Kísérleteinkben patkányból izolált pancreas szigetek működését vizsgáltuk, a táplálékfelvételt követő állapotok modellezése során. A pancreas szigeteket a plazma éhhomi, normál posztprandiális ill. hiperglikémiát jellemző vércukorszintjének megfelelő D-glukóz oldatban, valamint 20 aminosavat és citrullint, ornitint, taurint fiziológiás koncentrációban tartalmazó aminosav keverékben inkubáltunk. A szigetek insulin szekréciójában, 45 Ca felvételében, valamint D-glukóz metabolizmusában bekövetkező működésbeli változásokat regisztráltuk. A cytochalasin B-ről (mely a Helminthosporium dematioideum gomba által termelt sejtpermeabilis toxin, a sejtosztódást és a kontraktilis mikrofilamentumok kialakulását gátolja) ismert, hogy izolált pancreas szigetekben és izolált perfundált pancreasban egyaránt fokozza a tápanyag és nem-tápanyag-jellegű szekréciót serkentő szerek által kiváltott insulin elválasztást [68, 102, 139]. A cytochalasin B-re adott szekréciós válasz időbeli lefutását, valamint az insulin termelő B-sejtek ultrastrukturális szerkezetére és motilis aktivitására gyakorolt hatását több tanulmány is vizsgálta. A kutatások során bizonyossá vált, hogy az insulin kibocsátást növelő hatás nagyrészt a B-sejt mikrofilamentáris sejtvázával való kölcsönhatásnak köszönhető [62, 68, 102, 125, 138, 139]. A cytochalasin B, a D-glukózra adott insulin szekréciós válasz fokozása mellett azonban, gátolja a D-glukóz felvételét és további katabolizmusát izolált pancreas szigetekben és egyéb sejt-típusban is [62]. Korábban az insulin szekréció fokozása és a plazmamembránon keresztüli D-glukóz transzport gátlása között nem feltételeztek direkt okozati összefüggést és hatásbeli kapcsolatot [62]. 22

23 Vizsgálataink alapjául az a tény szolgált, hogy több sejt-típusban a cytochalasin D (Zygosporium mansonii gomba termeli, sejtpermeabilis gomba toxin), a cytochalasin B- hez hasonló hatást fejt ki a mikrofilamentáris rendszerre (aktin filamentumok gátlása, gátolja a sejtosztódást a kontraktilis mikrofilamentumok dezorganizálásával), ugyanakkor nem befolyásolja a D-glukóz transzportját. Patkány pancreasból izolált szigetekben, a D-glukóz ill. nem-glukóz tápanyagok által indukált insulin szekréció folyamatát, cytochalasin B és cytochalasin D jelenlétében tanulmányoztuk. Ezt követően a cytochalasin B anyagcsere hatásának további vizsgálatát végeztük alacsonyabb (2.8 mm) és magasabb (16.7 mm) koncentrációjú D- glukóz jelenlétében inkubált, tisztított pancreas B-szigetsejtekben ill. tisztított non-bszigetsejtekben. In vitro kísérleteinkben a következő kérdésekre kerestük a választ: 1. Milyen szerepet töltenek be a fiziológiás koncentrációjú aminosavak az insulin szekréció normál szabályozásában? 2. A fiziológiás koncentrációjú 20 aminosav és citrullin, ornitin, valamint taurin keveréke együttesen hogyan befolyásolják a táplálkozás után preparált pancreas szigetekben az insulin szekréciót, a patkány plazmában poszprandiálisan kialakuló értéknek megfelelő koncentrációjú D-glukóz (8.3 mm) jelenlétében? 3. A fiziológiás koncentrációjú aminosav keverék összetételének változtatásával igazolható-e az aminosavak tápanyag- és direkt hatásának kettős szerepe az insulin szekréció fiziológiás szabályozásában? 4. Az aminosavakra adott szekréciós válaszban mely intracelluláris metabolikus, iontranszport ill. mechanikai folyamatok vesznek részt? 5. Patkány pancreasból izolált szigetekben, a D-glukóz ill. nem-glukóz tápanyagok által indukált insulin szekréció fokozásában kimutatható-e eltérés a két penész gomba anyagcsere termék, a cytochalasin B és a cytochalasin D hatása között? 6. Patkány pancreasból izolált szigetekben, a D-glukóz metabolizmus befolyásolásában van-e különbség a cytochalasin B és a cytochalasin D között? 7. Mutat-e különbséget a D-glukóz metabolizmusa cytochalasin B jelenlétében, hipoglikémiát (2.8 mm) ill. hiperglikémiát (16.7 mm) modellező állapotokban patkány pancreasból izolált tisztított B-szigetsejtekben ill. tisztított non-bszigetsejtekben? 23

24 3.2 VIZSGÁLATOK DIABETESES RETINOPATHIÁBAN Kutatómunkánk kiindulópontja az a feltételezés volt, mely szerint a szérum szemikarbazid-szenzitív aminoxidáz enzim emelkedett aktivitása közvetlen szerepet játszhat a diabeteses retinopathia kialakulásában. Vizsgálatunk célja a szérum SSAO enzim aktivitás meghatározása volt különböző súlyossági fokú diabeteses retinopathiában szenvedő 2-es típusú cukorbetegekben, valamint egészséges kontroll személyekben, hogy az emelkedett SSAO aktivitás és a diabeteses retinopathia kialakulása közötti feltételezett összefüggést humán klinikai adatok nyerésével támasszuk alá. Az értékezés klinikai vizsgálatának kérdés felvetései: 1. Kimutatható-e különbség a szérum SSAO aktivitás értékek között a különböző diabeteses retinopathia stádiumokban, 2-es típusú cukorbetegekben? 2. Tapasztalható-e összefüggés a retinopathia súlyossága és az SSAO enzim szérum szintje között? 3. Befolyásolja-e az enzim aktivitást a DM fennállásának ideje, a hipertónia vagy az obesitas (BMI)? 4. Összefügg-e az enzim aktivitás a diabetesben rendszeresen mért laboratóriumi paraméterekkel (HbA 1c, éhgyomri glukóz, ALT, GGT, húgysav, kreatinin koncentrációk, mikroalbuminuria)? 5. Szerepet játszhat-e a szérum SSAO aktivitás emelkedése a DR kialakulásában? 24

25 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1 IN VITRO KÍSÉRLETEKBEN HASZNÁLT ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Kísérleti állatok Kísérleteinkhez kb. 200 g testsúlyú, nőstény, Wistar patkányokat (Proefdierencentrum, Haverlee, Belgium) használtunk. A kísérleti állatok táplálékhoz és ivóvízhez korlátlanul juthattak. Tartási körülményeik az Európai Unió idevonatkozó előírásainak megfeleltek Anyagok A cytochalasin B és D, valamint a forskolin és a teofillin a Sigma (St. Louis, MO, USA) terméke. A cytochalasinok oldására alkalmazott DMSO-t (dimetilszulfoxid) a Merck-től (Darmstadt, Németország) szereztük be. A 3-O-metil-D-[U- 14 C]glukóz (specifikus aktivitás: 0.30 Ci/mmol), a 3 HOH, a [U- 14 C]szacharóz (specifikus aktivitás: 0.55 Ci/mmol), a D-[5-3 H]glukóz (specifikus aktivitás: 15.7 Ci/mmol) és a D-[U- 14 C]glukóz (specifikus aktivitás: 0.34 Ci/mmol) a New England Nuclear-tól (Boston, MA, USA) származott Az aminosav keverék összetétele és elkészítése A patkány plazmában posztprandiálisan mérhető aminosav koncentrációkat modellező aminosav keveréket irodalmi adatok alapján állítottuk össze. Az inkubációs médium végső aminosav koncentrációit az V. táblázatban tüntettük fel. A 4-szeres vagy 8-szoros koncentrációjú aminosav keveréket tartalmazó oldatot (ph=7.4) valamennyi kísérlethez egyszerre készítettük el, majd 15 ml-es adagokban, -80 C-on tároltuk. Közvetlenül felhasználás előtt, szobahőmérsékleten olvasztottuk ki az aminosav keveréket tartalmazó oldatot. Az inkubációs médiumba a kívánt mennyiségre, négyszeresére ill. nyolcszorosára hígítottuk. A maradék oldatot nem használtuk fel újra. Az aminosavak közül az L-alanin, L-arginin, L-aszparagin, L-aszpartát, L-cisztein, L- glicin, L-glutamát, L-glutamin, L-izoleucin, L-leucin, L-lizin, L-metionin, L-prolin, L- szerin, L-tirozin, L-treonin, L-triptofán és az L-valin a Merck (Darmstadt, Németország) terméke. Az L-citrullin, L-fenilalanin, L-hisztidin és a taurin a Sigma cégtől (St. Louis, MO, USA) származott. Az L-ornitint az Aldrich-tól (Steinheim, Németország) szereztük be. 25

26 V. táblázat. A kísérletekben alkalmazott aminosav keverék összetétele. A patkány plazmában posztprandiálisan mérhető aminosav koncentrációk, irodalmi adatok alapján kerültek kiszámításra. A kísérletekben alkalmazott aminosav keverék koncentrációi a patkányban található átlagos plazma koncentrációknak feleltek meg. Az értékeket átlag±sd tüntettük fel, zárójelben az átlag megállapításához felhasznált irodalmak számát tüntettük fel. Aminosav Plazma koncentráció Sprague-Dawley patkány törzsben ( M/l) [19, 96, 99, 112, 144] Plazma koncentráció Wistar patkány törzsben ( M/l) [6, 7, 22, 23, 61, 106] A kísérletekben alkalmazott aminosav keverék összetétele a ( M/l) L-alanin 529±190 (6) 591±130 (6) 560 L-arginin 218±63 (6) 204±121 (6) 210 L-aszparagin 81±21 (5) 16±6 (2) 60 L-aszpartát 31±16 (6) 36±42 (4) 35 L-cisztein 23±7 (3) 47±5 (2) 30 L-citrullin 90±30 (5) 89±18 (2) 90 L-fenilalanin 85±26 (6) 74±15 (6) 80 L-glicin 341±70 (6) 193±103 (6) 270 L-glutamát 142±61 (6) 103±84 (3) 130 L-glutamin 636±160 (5) 599±223 (3) 620 L-hisztidin 85±16 (6) 82±33 (6) 85 L-izoleucin 105±30 (6) 70±29 (3) 90 L-leucin 185±60 (6) 136±31 (3) 170 L-lizin 455±102 (6) 382±52 (6) 420 L-metionin 58±15 (6) 48±25 (4) 55 L-ornitin 70±17 (4) 52±27 (4) 60 L-prolin 286±56 (2) 257±163 (6) 265 L-szerin 285±133 (6) 250±106 (6) 270 L-tirozin 90±21 (6) 97±47 (6) 95 L-treonin 250±84 (6) 329±91 (6) 290 L-triptofán 95±24 (5) 167±42 (6) 135 L-valin 233±68 (6) 190±36 (6) 210 Taurin 300±152 (5) 286±183 (6) 290 a Megegyezik a Sprague-Dawley és Wistar patkány törzsek plazmájában mért átlagos aminosav koncentrációk átlag értékeivel Módszerek Pancreas szigetek izolálása A sziget izolálás célja funkcióképességét megtartott Langerhans-szigetek és szigetsejtek nyerése. Kísérleteinkben a kollagenáz módszert alkalmaztuk [55, 93], mely rágcsáló, malac és humán pancreas sziget izolálására is adaptálható. A továbbiakban patkány pancreas szigetek izolálását írjuk le. 26