Molecular Medicine (Multidisciplinal Medicine) School of Ph.D. Studies AND CLINICAL STUDIES ON DIABETIC RETINOPATHY. Ph.D. theses. Dr.

Átírás

1 Molecular Medicine (Multidisciplinal Medicine) School of Ph.D. Studies FUNDAMENTAL AND CLINICAL INVESTIGATIONS IN DIABETOLOGY: EXPERIMENTS IN ISOLATED ISLETS AND CLINICAL STUDIES ON DIABETIC RETINOPATHY Ph.D. theses Dr. Dura Eszter Tutor: Prof. Dr. Romics László Semmelweis University Budapest 2002

2 1. SUMMARY (1) At a concentration of D-glucose comparable to that found in the rat plasma postprandially (8.3 mm), a mixture of 20 amino acids at their physiological concentrations supplemented together with citrulline, ornithine and taurine augments by about 50% the output of insulin in islets prepared from fed rats. Our metabolic, cationic and secretory findings extrapolated to the situation found in vivo document an impressive role of circulating amino acids in the normal control of insulin release. Simulating physiological conditions, our results were considered as compatible with both the role of certain amino acids as nutrients (e.g. L-glutamine) and the accumulation of other amino acids (e.g. L-arginine, L-lysine) as positively charged molecules in the islet cells. (2) Cytochalasin B (21 µm) enhanced insulin release evoked by D-glucose and nonglucidic secretagogues (2-ketoisocaproate, L-leucine and L-glutamine), despite inhibiting D-glucose uptake and D-glucose metabolism in pancreatic islets. Cytochalasin D (20 µm), which failed to affect D-glucose uptake and metabolism by isolated islets, also augmented glucose-stimulated insulin release, but unexpectedly to a lesser extent than cytochalasin B. However, in islets stimulated by non-glucidic nutrients cytochalasin D was as potent as cytochalasin B in potentiating the secretory response. This situation coincided with the fact that cytochalasin B inhibited more severely D-glucose metabolism in non-b, as distinct from B islet cells and, in the former case, caused a relatively greater inhibition of hexose catabolism at 2.8 mm than at 16.7 mm D-glucose. These findings suggest a so-far-unidentified interference of cytochalasin B with the B- cell glucose-sensing device. (3) The copper-containing semicarbazide-sensitive amine oxidase enzyme (SSAO) catalyses the conversion of certain endogenous monoamines, like methylamine into cytotoxic aldehydes, hydrogen peroxide and ammonia. We demonstrated that the physiological activity of serum SSAO enzyme is significantly higher in Type 2 diabetic patients with high-risk proliferative diabetic retinopathy compared to those without retinopathy. Our clinical results support the hypothesis that elevated SSAO activity may be involved in the pathogenesis of microvascular diabetic late complications, such as retinopathy. The pharmacological manipulation of SSAO activity might be an interesting new concept for prevention and treatment of diabetic retinopathy. 1

3 2. INTRODUCTION AND BACKGROUND The current theses presents diabetes mellitus, as a multidisciplinal theme from the aspects of fundamental investigations and from the aspect of the clinician who treats the complications of the disease. We conducted in vitro experiments in incubated islets and islet cells isolated from rat pancreas. In the clinical part of the theses, the possible role of serum semicarbazide aminoxidase enyme was investigated in the pathogenesis of diabetic retinopathy, in patients with type 2 diabetes. 2.1 PHYSIOLOGY OF INSULIN SECRETION A continuous and continously adjusted supply of pancreatic insulin is essential to ensure fuel homeostasis in human subjects and mammalian animals. Under physiological conditions, the release of insulin is ruled in an immediate and direct manner by nutrients, hormones and neurotransmitters and, in a delayed fashion, by a series of ontogenic, alimentary and endocrine factors. Among circulating nutrients, D-glucose plays a key role in the regulation of insulin release. D-glucose represents the sole substrate able, at even when tested in vitro in the absence of any other exogenous nutrients. The immediate stimulation of insulin release by D-glucose represents the outcome of a sequence of metabolic, ionic and mechanical events in pancreatic islet B-cells. Beside D-glucose, other non-glucose nutrient secretagogues have insulinotropic activity, like other monosacharides, amino acids. 2.2 PATHOPHYSIOLOGY OF INSULIN SECRETION In type 2 diabetes, a defect in insulin release may be caused by a number of site-specific anomalies at virtually all steps of the stimulus-secretion coupling process. In most type 2 diabetic subjects, the insulin secretory response to D-glucose appears preferentially affected, when compared to the insulinotropic action of other nutrient or non-nutrient secretagogues. 2.3 DIABETIC MICROVASCULAR COMPLICATIONS Retinopathy is the most frequent microvascular complication associated with diabetes mellitus (DM). Nevertheless, the exact pathogenetic mechanisms of vascular endothelial damage in diabetes have not been identified. The biochemical disturbances (e.g. nonenzymatic glycation, increased aldose reductase activity, production of vasoactive substances, oxidative stress, altered fibrinolytic and antithrombin activity) may result in 2

4 anatomical and functional changes of the vessel wall (e.g. mural-cell loss, endothelial proliferation, increased capillary permeability, alteration of the blood-retinal barrier). The duration of diabetes is associated with an increased prevalence of diabetic retinopathy (DR) in Type 2 diabetic individuals. After 15 years duration of diabetes, nearly 78% of patients with Type 2 DM develop some degree of retinopathy. Furthermore, among patients with newly diagnosed Type 2 DM, due to its gradual and often asymptomatic onset, DR can be present at diagnosis in 18-39%. Apart from poor glycaemic control, several other potentially modifiable risk factors may be important for the development and progression of DR, including increased systolic and diastolic blood pressure, plasma triglyceride, fibrinogen and urinary microalbumin excretion. In addition, DR may have a genetic component as well. However, these factors explain only a part of the variation of retinopathy among diabetic subjects. 2.4 THE MULTIFUNCTIONAL MOLECULE: THE SEMICARBAZIDE-SENSITIVE AMINE OXIDASE Semicarbazide-sensitive amine oxidase (SSAO; EC ) [amine:oxygen oxidoreductase (deaminating)(copper-containing)] is a group of heterogeneous coppercontaining amine oxidase enzymes which are present predominantly in the plasma membrane of vascular smooth muscle cells and in other cell types (e.g. adipocytes, retina ganglion cells); it can also be found in the serum. SSAO enzymes are sensitive to inhibition by semicarbazide and related hydrazines, but resistant to inhibitors of monoamine oxidases (MAO-A and MAO-B) such as clorgyline and pargyline. The exact physiological and pathophysiological role of SSAO is still presumed. Possibly it scavenges circulating biogenic amines and protects against various exogenous monoamines. Short chain aliphatic amines, such as methylamine that can be found in tissues, blood and urine, have been considered to be physiological substrates for SSAO enzymes. Recent data suggest that SSAO may play a role in vascular endothelial damage through conversion of certain endogenous monoamines, like methylamine, into cytotoxic aldehydes, hydrogen peroxide and ammonia. SSAO CH 3 NH 2 + O 2 + H 2 O HCHO + H 2 O 2 + NH 3 methylamine formaldehide hidrogen peroxide ammónia 3

5 It has been demonstrated that serum SSAO activity is elevated in Streptozotocin (STZ)- induced diabetic rats, and in alloxan-induced diabetic sheep. Serum SSAO has been reported to be increased in patients with diabetes mellitus and in congestive heart failure. Recent studies have suggested that elevated SSAO activity may be responsible for diabetic microvascular complications, such as nephropathy and retinopathy. However, it is unclear whether SSAO activity is different in diabetic individuals with any stages of retinopathy. The aim of the present study was to examine the association between SSAO activity and the severity of retinopathy in Type 2 diabetic subjects. We have measured serum SSAO activities in a well-characterized group of patients with Type 2 DM with or without DR, compared to nondiabetic control subjects. 3. AIMS 3.1 IN VITRO EXPERIMENTS Az aminosavak szerepét az insulin szekréciós válaszban és a szekréció szabályozásában vizsgáló korábbi kísérletekben az aminosavakat a fiziológiás koncentrációt sokszorosan meghaladó dózisban (mm) alkalmazták, ill. csak néhány aminosav kombinációjának insulinotróp hatását vizsgálták. Célul tztük ki ezért, hogy az aminosavak insulin szekrécióban betöltött tápanyag- és direkt hatásának ketts szerepét fiziológiás körülmények között is igazoljuk. Kísérleteinkben patkányból izolált pancreas szigetek mködését vizsgáltuk, a táplálékfelvételt követ állapotok modellezése során. A pancreas szigeteket a plazma éhhomi, normál posztprandiális ill. hiperglikémiát jellemz vércukorszintjének megfelel D-glukóz oldatban, valamint 20 aminosavat, citrullint, ornitint és taurint fiziológiás koncentrációban (µm) tartalmazó aminosav keverékben inkubáltunk. A szigetek insulin szekréciójában, 45 Ca felvételében, valamint D-glukóz metabolizmusában bekövetkez mködésbeli változásokat regisztráltuk. A cytochalasin B-rl (mely a Helminthosporium dematioideum gomba által termelt sejtpermeabilis toxin, a sejtosztódást és a kontraktilis mikrofilamentumok kialakulását gátolja) ismert, hogy izolált pancreas szigetekben és izolált perfundált pancreasban egyaránt fokozza a tápanyag (pl. D-glukóz) és nem-tápanyag szekréciót serkent szerek által kiváltott insulin elválasztást, annak ellenére, hogy a D-glukóz felvételét és metabolizmusát gátolja a pancreas szigetekben. A cytochalasin B-re adott szekréciós válasz idbeli lefutását, valamint az insulin termel B-sejtek ultrastrukturális szerkezetére és motilis aktivitására gyakorolt hatását több tanulmány is vizsgálta, mely 4

6 során bizonyossá vált, hogy az insulin kibocsátást növel hatás nagyrészt a B-sejt mikrofilamentáris sejtvázával való kölcsönhatásnak köszönhet. Korábban az insulin szekréció fokozása és a plazmamembránon keresztüli D-glukóz transzport gátlása között nem feltételeztek direkt okozati összefüggést és hatásbeli kapcsolatot. Vizsgálataink alapjául az a tény szolgált, hogy több sejt-típusban a cytochalasin D (Zygosporium mansonii gomba termeli, sejtpermeabilis gomba toxin), a cytochalasin B- hez hasonló hatást fejt ki a mikrofilamentáris rendszerre (aktin filamentumok gátlása, gátolja a sejtosztódást a kontraktilis mikrofilamentumok dezorganizálásával), ugyanakkor nem befolyásolja a D-glukóz transzportját. Patkány pancreasból izolált szigetekben, a D-glukóz ill. nem-glukóz tápanyagok által indukált insulin szekréció folyamatát, cytochalasin B és cytochalasin D jelenlétében tanulmányoztuk. Ezt követen a cytochalasin B anyagcsere hatásának további vizsgálatát végeztük alacsonyabb (2.8 mm) és magasabb (16.7 mm) koncentrációjú D-glukóz jelenlétében inkubált, tisztított pancreas B-szigetsejtekben ill. tisztított non-bszigetsejtekben. Questions in in vitro experiments: 1. Milyen szerepet töltenek be a fiziológiás koncentrációjú aminosavak az insulin szekréció normál szabályozásában? 2. A fiziológiás koncentrációjú 20 aminosav és citrullin, ornitin, valamint taurin keveréke együttesen hogyan befolyásolják a táplálkozás után preparált pancreas szigetekben az insulin szekréciót, a patkány plazmában poszprandiálisan kialakuló értéknek megfelel koncentrációjú D-glukóz (8.3 mm) jelenlétében? 3. A fiziológiás koncentrációjú aminosav keverék összetételének változtatásával igazolható-e az aminosavak ketts hatásmódja az insulin szekréció fiziológiás szabályozásában? 4. Az aminosavakra adott szekréciós válaszban mely intracelluláris metabolikus, iontranszport ill. mechanikai folyamatok vesznek részt? 5. Patkány pancreasból izolált szigetekben, a D-glukóz ill. nem-glukóz tápanyagok által indukált insulin szekréció fokozásában kimutatható-e eltérés a két penész gomba anyagcsere termék, a cytochalasin B és a cytochalasin D hatása között? 5

7 6. Patkány pancreasból izolált szigetekben, a D-glukóz metabolizmus befolyásolásában van-e különbség a cytochalasin B és a cytochalasin D között? 7. Mutat-e különbséget a D-glukóz metabolizmusa cytochalasin B jelenlétében, hipoglikémiát (2.8 mm) ill. hiperglikémiát (16.7 mm) modellez állapotokban patkány pancreasból izolált tisztított B-szigetsejtekben ill. tisztított non-bszigetsejtekben? 3.2 STUDY ON DIABETIC RETINOPATHY Kutatómunkánk kiindulópontja az a feltételezés volt, mely szerint a szérum szemikarbazid-szenzitív aminoxidáz enzim emelkedett aktivitása közvetlen szerepet játszhat a diabeteses retinopathia kialakulásában. Vizsgálatunk célja a szérum SSAO enzim aktivitás meghatározása volt különböz súlyossági fokú diabeteses retinopathiában szenved 2-es típusú cukorbetegekben, valamint egészséges kontroll személyekben, hogy az emelkedett SSAO aktivitás és a diabeteses retinopathia kialakulása közötti feltételezett összefüggést humán klinikai adatok nyerésével támasszuk alá. Questions: 1. Kimutatható-e különbség a szérum SSAO aktivitás értékek között a különböz diabeteses retinopathia stádiumokban, 2-es típusú cukorbetegekben? 2. Tapasztalható-e összefüggés a retinopathia súlyossága és az SSAO enzim szérum szintje között? 3. Befolyásolja-e az enzim aktivitást a cukorbetegség fennállásának ideje, a hipertónia vagy az obesitas (BMI)? 4. Összefügg-e az enzim aktivitás a diabetesben rendszeresen mért laboratóriumi paraméterekkel (HbA 1c, éhgyomri glukóz, ALT, GGT, húgysav, kreatinin koncentrációk, mikroalbuminuria)? 5. Szerepet játszhat-e a szérum SSAO aktivitás emelkedése a diabeteses retinopathia kialakulásában? 6

8 4. MATERIALS AND METHODS 4.1 EXPERIMENTS IN INCUBATED ISLETS Kísérleteinkhez kb. 200 g testsúlyú, nstény, Wistar patkányokat (Proefdierencentrum, Haverlee, Belgium) használtunk. A patkány plazmában posztprandiálisan mérhet aminosav koncentrációkat modellez aminosav keveréket irodalmi adatok alapján állítottuk össze. A pancreas Langerhans-szigeteket kollagenáz módszerrel izoláltuk. A diszperz szigetsejteket neutrális proteinázzal szeparáltuk, majd Percoll gradiensen centrifugáltuk, mely után a non-b és B-sejtek tisztítását MACS (Magnetic Cell Separator) és R2D6 B- sejt elleni ellenanyag alkalmazásával végeztük. Az insulin szekréciót 125 I jelzett radioimmunassay-el, a D-glukóz metabolizmust, a 3-O-metil-D-[U- 14 C]glukóz transzportot, a D-[5-3 H]glukózból képzdött 3 HOH és a D-[U- 14 C]glukózból keletkezett 14 CO 2 mennyiségét liquid szcintillációs méréssel határoztuk meg. A D-[U- 14 C]glukóz 14 C-savas metabolitjaiat Dowex 1x8, a 14 C-jelzett aminosavakat Dowex 50 ioncserél kromatográfiával szeparáltuk. Az eluált radioaktivitást felszálló papírkromatográfiával, bután-1-ol:metanol:h 2 O (2:2:1 térfogatarányú) elegyében vizsgáltuk, és analitikai ioncserél radiokromatográfiával (Beckman Multichrom B aminosav analizátor) határoztuk meg. 4.2 CLINICAL STUDY A prospective study was performed on a defined group of Type 2 diabetic patients (n=93) compared to non-diabetic control subjects (n=42). Age at diagnosis, gender, duration of diabetes, presence of systemic hypertension and BMI were recorded. All participants underwent a detailed ophthalmic evaluation, colour retinal photography and laboratory investigations. According to the ophthalmic findings Type 2 diabetic subjects were arranged in four severity levels of retinopathy: (0) no retinopathy, (1) nonproliferative retinopathy (mild-to-moderate, moderate-to-severe, severe, very-severe), (2) early proliferative retinopathy and (3) high-risk proliferative retinopathy. Each patient was assigned to the level determined by the worse eye. Besides routine metabolic parameters and renal function characteristics, serum SSAO activity was determined by a radio-enzymatic procedure using [ 14 C]-benzylamine as substrate. 7

9 5. RESULTS 5.1 IN VITRO EXPERIMENTS Insulin secretion in isolated pancreatic islets Insulinotropic action of amino acids at their physiological concentrations The present data document that, at a concentration of D-glucose comparable to that found in the plasma of fed rats (8.3 mm), a mixture of 20 amino acids, citrulline, ornithine and taurine, all tested at their physiological concentrations, augments by about 50% the output of insulin in islets prepared from fed rats. To the extent that this finding could be extrapolated to the situation found in vivo, it would document quite an impressive role of circulating amino acids in the normal control of insulin release. The amino acid mixture failed to affect adversely the final insulin content of the islets, despite a sizeable increase in insulin output during the prior 90 min incubation. This suggests that the amino acid mixture increased, like D-glucose the rate of proinsulin biosynthesis, a phenomenon typical of the B-cell functional response to nutrient secretagogues. Likewise, the fact that the amino acid mixture augmented significantly insulin release at a high concentration of D-glucose (16.7 mm) argues in favour of their roles as nutrients since cationic amino acids exert little effect upon insulin release at such a high concentration of the hexose. Az L-glutaminnal és az elágazó szénláncú aminosavakkal (L-izoleucin, L-leucin, L-valin) végzett kísérleti eredmények is összhangban vannak az aminosavak tápanyag szerepét bizonyító korábbi megfigyelésekkel. Kísérleteinkben az L-glutamint és az elágazó szénláncú aminosavakat az aminosav keverékbeli (vagyis fiziológiásan a plazmában mérhet) koncentrációjukban alkalmazva azt kaptuk, hogy az L-glutamin kissé mérsékli, míg az elágazó szénláncú aminosavak hatásosan fokozzák a D-glukózra adott insulin szekréciós választ. Az L-alanin váratlan és látszólagosan negatív insulinotróp hatása a szigetek teljes aminosav keverékre adott insulin szekréciós válaszában kapcsolatban állhat az aminosav keverékben elfoglalt magas koncentrációjával (560 µm). Az L-alanin ugyanis piruváttá transzaminálódhat, elvonva így más aminosavak transzaminálásából az α- ketoglutársavat. Ezen kívül az L-alanin az ATP-vel együtt allosztérikusan gátolja a piruvát kináz enzimet, vagyis a foszfoenolpiroszlsav piroszlsav átalakulást. Saját 8

10 kísérleteinkhez hasonló módon a taurin más, korábbi vizsgálatban sem bizonyult insulinotróp anyagnak. Vizsgálati eredményeink szerint, az aminosav keverék tápanyagszer insulin szekréciós hatása nem tulajdonítható az izolált szigetekben, sem fokozott D- glukóz felhasználásnak, sem jelentsebb D-glukóz oxidációnak. A bázikus aminosavak részvételét igazolja az aminosav keverékre adott szekréciós válaszban az, hogy az aminosav keverék annak ellenére fokozta az insulin kibocsátást 8.3 mm D-glukóz expozíció során, hogy nem növelte a 45 Ca felvételét ugyanezen D-glukóz koncentráció mellett. Ezek az eredmények azt vetik fel, hogy a bázikus aminosavak jelenléte az aminosav keverékben valamely ismeretlen módon elfedte a tápanyag szerepet betölt aminosavak 45 Ca nettó felvételt növel hatását. Korábbi megfigyelések szerint a bázikus aminosavak az izolált szigetek D-glukóz metabolizmusára inkább negatív módon hatnak. A kísérletekben alkalmazott koncentrációban a bázikus aminosavak (L-arginin, L-citrullin, L-lizin és L-ornitin) fokozták a 8.3 mm D-glukóz által kiváltott insulin kibocsátást, ez pedig alátámasztja részvételüket a teljes fiziológiás koncentrációjú aminosav keverékre adott szekréciós válasz létrejöttében. The results obtained here in the presence of glibenclamide, forskolin, theophylline and cytochalasin B document the participation of Ca 2+, a cyclic AMP, and the effector microfilamentous system in the secretory response to the amino acid mixture. A szulfonilurea-származék glibenclamid, valamint a forskolin jelenlétében kapott adataink alapján, az aminosavak egyaránt elsegíthetik a Ca 2+ bejutását a szigetsejtekbe és az adenilátcikláz enzim aktiválását is (pl. a kalcium-kalmodulin rendszeren keresztül), mivel mind a forskolin, mind a glibenclamid szekréció fokozó hatása viszonylag kevésbé volt jelents az aminosav keverékkel együtt, mint anélkül. A teofillin és a cytochalasin B azonban mind az önmagában, mind az aminosav keverékkel együtt alkalmazott D-glukóz esetében, hasonló mérték insulin kibocsátást idézett el. Kapott eredményeink összhangban állnak eddigi ismereteinkkel, mely szerint a foszfodieszteráz gátló teofillin és a penészgomba anyagcseretermék cytochalasin B, egyaránt a szekréciós válasz távolabbi helyén, a Ca 2+ szigetsejtbe való belépése, valamint a camp generálása utáni fázisban fejtik ki hatásukat. Our metabolic, cationic and secretory findings were considered as compatible with both the role of certain amino acids (e.g. L-leucine, L-glutamine, L-asparagine) as nutrients and the accumulation of other amino acids (pl. L-arginine) as positively charged 9

11 molecules in the islet cells. In conclusion, this work provided novel information on the regulation of insulin release by amino acids and their mode of action in the B-cell under close-to-physiological conditions Effects of cytochalasin B and D upon insulin release The concentrations of cytochalasin B and cytochalasin D, (21 and 20 µm) used in the experiments were virtually identical to one another and occupied identical positions in the concentration-response relationships for the respective effects of these two cytochalasins upon glucose-stimulated insulin release. Nevertheless, at such concentrations, cytochalasin B was more efficient than cytochalasin D in augmenting glucose-induced insulin secretion. In the present study, cytochalasin D, which failed to affect D-glucose uptake and metabolism by isolated islets, also augmented glucosestimulated insulin release, but unexpectedly to a lesser extent than cytochalasin B. The difference does not appear attributable to a greater intrinsic efficiency of cytochalasin B to interfere with the mechanical events leading to exocytosis of secretory granules from the islet B cells. Indeed, when non-glucidic nutrients, either 2- ketoisocaproate or the association of L-leucine and L-glutamine were used to stimulate insulin release, cytochalasin D was as potent as or more potent than cytochalasin B in potentiating the secretory response D-glucose metabolism in isolated pancreatic islets and in purified pancreatic islet cells Cytochalasin B inhibited more severely D-glucose metabolism in non-b, as distinct from B, islet cells and, in the former case, caused a relatively greater inhibition of hexose catabolism at 2.8 mm than at 16.7 mm D-glucose. Az eredmények alapján levonható következtetések: 1. Alacsonyabb koncentrációjú (2.8 mm) D-glukóz jelenlétében, a nem oxidatív glikolízissel történ glukóz bontás jelentsebb a non-b-sejtekben, mint a B- sejtekben. 2. A glukóz koncentráció emelése 2.8 mm és 16.7 mm D-glukóz szint között, relatíve hatásosabban fokozta a glikolízist a B-sejtekben, mint a non-b-sejtekben. 3. A cytochalasin B D-glukóz katabolizmust gátló hatására érzékenyebbek a non-bsejtek, mint a B-sejtek. 10

12 Fiziológiás körülmények között, normál vércukor szint mellett, a D-glukóz transzport a glukóz metabolizmusát szabályozó szerepet tölt be a pancreas non-b-sejtjeiben, az insulin termel B-sejtekben azonban nem. A cytochalasin B non-b-sejtek D-glukóz metabolizmusát gátló hatása magyarázatul szolgál arra, hogy a cytochalasin B miért gátolja relatíve nagyobb mértékben az izolált szigetek D-glukóz katabolizmusát alacsonyabb, mint magasabb D-glukóz koncentráció esetében. A jelen adatok megersítették, hogy a pancreas egészét tekintve, a non-b-sejtek részvétele a D-glukóz katabolizmusában intenzívebb 2.8 mm glukóz koncentrációnál, mint 16.7 mm D-glukóz jelenlétében. Kimutattuk, hogy a cytochalasin B a pancreas non- B-sejtjeiben relatíve nagyobb mértékben gátolja a D-glukóz lebontását alacsonyabb D- glukóz koncentráció esetében, mint magasabb D-glukóz koncentráció alkalmazásánál. Összefoglalva tehát megállapíthatjuk, hogy a cytochalasin B egy jelenleg még nem ismert mechanizmus útján képes a cytochalasin D-hez viszonyítva, hatékonyabban fokozni a D-glukóz stimulált insulin szekréciót. Hence, the present findings suggest a sofar-unidentified interference of cytochalasin B with the B-cell glucose-sensing device. 11

13 5.2 SSAO ACTIVITY IN DIABETIC RETIONPATHY Our results confirm the previous finding, that serum SSAO activity is elevated in patients with diabetes mellitus. In the total group of Type 2 diabetic patients (n=93), serum SSAO activity was, on average, 47% higher than in nondiabetic control subjects (n=42) (p<0.0001). We demonstrated that serum SSAO is elevated in Type 2 diabetic patients with high-risk PDR (n=16) compared to Type 2 diabetic subjects without any retinopathy (n=42) (p<0.02). Analyzing the groups of diabetic patients with retinopathy of all stages, we could not find any direct connection between the severity of retinopathy and serum SSAO activity. Duration of diabetes was not statistically different in the subgroups. SSAO activity correlated with duration of disease (p<0.04) only in high-risk PDR patients. Age at diagnosis of diabetes mellitus was similar in the four subgroups. There was no significant difference regarding systolic and diastolic blood pressure between the groups. HbA 1c concentrations showed no statistical difference in relation to retinopathy stages. SSAO did not correlate with age, serum creatinine, ALT, GGT, uric acid concentrations or BMI. These results suggest that elevated SSAO activity may be responsible for endothelial damage and fundus changes in diabetic retinopathy. This finding might be due to conversion of endogenous monoamines, like methylamine, into toxic aldehydes and hydrogen peroxide. The importance of the correlation between SSAO activity and highrisk PDR in Type 2 diabetic patients needs to be furthermore prospectively investigated in larger samples of diabetic patients. There needs to be confirmation regarding whether SSAO has a causative role in the development of microvascular complications, or the elevation of SSAO activity is the result of endothelial damage in diabetes mellitus. Supposing that the elevated SSAO activity has pathological importance, the pharmacological manipulation of SSAO activity might be an interesting new concept for prevention, delay or treatment of microvascular complications in diabetes. Further studies are required to the design and selection of SSAO inhibitors that could protect tissues and cells against injury. 12

14 6. PUBLICATIONS 6.1 PUBLICATIONS IN CONNECTION WITH THE THESISES I. Dura E., Mészáros Zs., Salacz Gy., Magyar K., Romics L., Karádi I.: Serum Semicarbazide-Sensitive Amine Oxidase Activity in Patients with Retinopathy in Type 2 Diabetes Mellitus. Diabetes Research 2001;35: II. III. IV. Jijakli H., Zhang H-X., Dura E., Ramirez R., Sener A., Malaisse W.J.: Effects of cytochalasin B and D upon insulin release and pancreatic islet cell metabolism. Int J Mol Med 2002;9: (IF: 1.899) Dura E., Jijakli H., Zhang H-X., Oguzhan B., Sener A., Malaisse W.J.: Insulinotropic action of amino acids at their physiological concentrations: I. Experiments in incubated islets. Int J Mol Med 2002;9: (IF: 1.899) Dura E., Mészáros Zs., Salacz Gy., Magyar K., Romics L. és Karádi I.: A szérum szemikarbazid-szenzitív aminoxidáz enzim aktivitás vizsgálata diabeteses retinopathiában szenved 2-es típusú cukorbetegekben. Orv Hetil (accepted for publication: OH / 2002) 6.2 OTHER PUBLICATIONS V. Dura E., Récsán Zs., Szamosi A., Salacz Gy.: Tompa szemsérülés és következményei a szem elüls szegmentumában. Szemészet 1998;135: VI. VII. Dura E., Récsán Zs., Salacz Gy.: Tompa szemsérülés és következményei a szem hátsó szegmentumában. Szemészet 1998;135: Bögi J., Dura E., Fiedler O., Hargitai J., Papp M., Récsán Zs.: Gyakori problémák a pseudoexfoliatiós szemek kezelésében: a szürkehályog-mtétek komplikációi, az argon lézer trabeculoplastica hatásossága. Szemészet 1999;136: VIII. Salacz Gy., Dura E.: Az üvegtest pótlás új lehetségei. Orvosképzés 2002;1:

15 7. ACKNOWLEDGMENTS I wish to express my deepest grade of gratitude to all who have helped me during these studies at Semmelweis University Budapest, Hungary especially to: Prof. Dr. László Romics Prof. Dr. István Karádi Prof. Dr. József Mandl Dr. András Hrabák Prof. Dr. György Salacz Dr. Júlia Bögi Prof. Dr. Kálmán Magyar Dr. Zsuzsa Mészáros Edit Oszvald Judit Kertész Ferenc Lévai furthermore at Brussels Free University, Belgium: Prof. Willy J. Malaisse Prof. Dr. Bernard Vray Prof. Dr. Abdullah Sener Dr. Hassan Jijakli Hai-Xia Zhang Dr. Berrin Oguzhan Laurence Ladriére Jeanine Schoonheydt Maryse Urbain Catherine Demesmaeker My family is entitled to my warmest gratitude for stimulating atmosphere, patience and encouragement during this work. 14