10. A MÁJMŰKÖDÉS VIZSGÁLATA I.

Átírás

1 10. A MÁJMŰKÖDÉS VIZSGÁLATA I. Az epefesték-forgalom zavarainak vizsgálata Az epefesték-forgalom kóros eltéréseire a vérplazma (vérszérum), a vizelet és a bélsár epefestéktartalmából és származékainak vizsgálatából következtethetünk. Az epefesték (bilirubin, Br) narancssárga, zsírban oldható vegyület. A szervezetben a hemoglobin, azon belül is a hem lebontási termékeként fordul elő. Az MPS-ben képződik. A phagocyta sejtekből kijutva az albuminhoz kötve szállítódik (bilirubin I., Br I., indirekt blirubin) a májba. Ott a májsejtek glükuronsavval konjugálják (Br II., direkt bilirubin, bilirubin-glükuronid), és az epével ürül a bélbe. A Br II. élettani körülmények között csak minimális mennyiségben kerül a vérbe. A Br II. a belekben a glükuronsavról leválik, a baktériumok hatására redukálódik, urobilinogénné (UBG) és szterkobilinogénné (SBG) alakul át. Ezek a bélsár jellegzetes sárgásbarna színét adják. Az UBG egy része az ileumban szívódik fel az epesavakkal együtt. A felszívódást követően a vérbe, majd a májba kerül, és ott ismételt átalakuláson megy keresztül, majd kiválasztódik. Ez az ún. enterohepaticus körforgalom. Végül, további bakteriális redukcióját követően urobilin, és szterkobilin formájában a bélsárral ürül. Kóros körülmények során, a Br-koncentráció megnő a vérben. A plazma színe ilyenkor sárgás. A molekula apoláros jellege miatt a zsírban dús szövetekbe, zsírszövetbe, bőralatti kötőszövetbe stb. nagyobb mennyiségben rakódik le, így azokat sárgás színűvé festi. Ez a sárgaság (icterus). A sárgaság okai lehetnek, ha az epefestékből több képződik intravasalis haemolysis miatt (praehepaticus icterus); vagy ha a májfunkció zavarában kevesebb Br alakul át, ill. a májszövet károsodása miatt több jut ki a májból a keringésbe (hepaticus icterus); esetleg az epevezető, vagy az epekapilllárisok elzáródása miatt a Br nem ürül az epével, visszamarad a májban, így onnan több jut a keringésbe (posthepaticus icterus). A vérszérum bilirubin (Br)-tartalma A vérszérum bilirubinszintjének változása a májműködés károsodását jelző egyik legjelentősebb paraméter volt, ma már a többi specifikusabb meghatározás lassan háttérbe szorítja. Vérbeli, vizeletbeli koncentrációjának emelkedése jelzi a máj kiválasztó működésének károsodását. A vér- és a vizeletminták gyűjtésénél figyelembe kell vennünk, hogy a bilirubin magasabb hőmérsékletre és UV-sugárzás hatására (napfényre) érzékeny. Kezdetben biliverdinné oxidálódik, ami zöldes színű, majd tovább bomlik. Ezért a mintákat 4 o C-on kell tárolnunk, és fénytől óvnunk

2 kell, hogy a laboratóriumi vizsgálatokat az anyag bomlása ne befolyásolja. A vesén át kiválasztott Br vizeletpangás miatt esetenként a húgyhólyagon belül is oxidálódhat, ilyenkor azt tapasztaljuk, hogy a vizelet zöldes árnyalatú lesz. A bilirubin meghatározása az ún. Hijmanns ven den Bergh reakcióval, a diazo-módszerrel történik. A diazo-reagens szulfanilsavat és NaNO2-t tartalmaz. A savas karakterű reagens a vérplazmában lévő nagy móltömegű fehérjéket (fibrinogént) kicsapja, ilyenkor a minta opaleszkálóvá válik. Ez a fotométeres direktbilirubin (dirbr) kimutatást zavarja. Ezért szérumot használunk plazma helyett. Az összbilirubin (totbr) kimutatását a reagens nem befolyásolja, mert a kimutatásához használt alkohol vagy koffein a fibrinogént feloldja. A vizsgálatot a Jendrassik és Gróf által leírt fotometriás eljárással végezzük. A diazotált Br 540 nm-es hullámhosszúságú fényben ad elnyelési maximumot. A vizsgálatkor először a totbr mérésével végezzük, majd a dirbr mérése következik. A totbr és a dirbr különbsége adja az eredetileg albuminhoz kötött Br I, vagyis az indirekt Br (ibr) koncentrációját. A totbr élettani értéke az állatokban általában 7-8 µmol/l, a dirbr: 1,5 µmol/l. Kutyákban és macskákban kissé nagyobb értékeket is mérhetünk (tot Br: 2-17 µmol/l, dirbr: 9 µmol/l), lovakban, azonban kifejezetten nagy totbr-koncentrációk mérhetők (totbr: µmol/l, dirbr: 1,5 µmol/l) a magas indirekt Br-érték miatt. A vizelet és a bélsár bilirubin- és urobilinogén-tartalma Az egészséges állatok vizeletében - a húsevők kivételével általában csak az UBG mutatható ki. (A szarvasmarha vizeletében nem jelenik meg.) BrII. (bilirubin-glükuronid) kizárólag kóros körülmények között fordulhat elő. A nagy molekulájú albuminhoz kötött bilirubin (BrI.) megjelenésével pedig, szinte egyáltalán nem számolhatunk. A húsevők veséjében megtalálható az UDP-glükuronil-transzferáz enzim, így bennük élettani bilirubinuria is tapasztalható. Húsevőkben és lovakban már néhány napos éhezést követően is észlelhető kisfokú, ún. éhezési bilirubinuria (a Br II-képződés fokozódása miatt). Az egészséges állatok bélsarát az ürülő epefesték-származékok állatfajonként jellemző módon barnára vagy zöldesbarnára színezik. Ha az epevezetőn keresztül a bélcsatornába jutó epe mennyisége nő vagy csökken, a bélsár színe változik. A Br-derivátumokban szegény bélsár acholiás, hypocholiás vagy hypochrom, a Br-derivátumokban gazdag bélsár pedig hyperchrom, hypercholiás, vagy pleichrom.

3 Gmelin-próba Az eredeti Gmelin-reagens tömény és füstölgő salétromsavat is tartalmazott. A próba elvégzéséhez, azonban elegendő a tömény (65%-os) salétromsav-oldat is. A nagy sűrűségű reagenst óvatosan kisebb sűrűségű a vizelet alá kell rétegezni, ekkor a salétromsavval történő reakció nyomán a folyadékhatáron különböző színű rétegek jelennek meg. Felülről lefelé a következő rétegek láthatók: a legfelső rétegben, esetleg a kémcső falán kristályos szemcsés réteg, vagy csak néhány kristály: az ún. salétromsavas karbamid (macskákban élettani) szalmasárga réteg: vizelet szürkésfehér réteg: fehérje (Heller-próba) lila réteg: indikán, vagyis indolszulfát (a bélből felszívódott indolból a májban képződik, megjelenése lóban élettani, a többi fajban kóros bélbeli fehérje bomlás, dyspepsia /fokozott indolképződés/ során keletkezik). zöldes réteg: biliverdin (a Br-nak salétromsav által képzett oxidált terméke), barnás réteg: urobilinogén legalsó réteg: Gmelin-reagens A bilirubin- és az UBG-koncentráció változását: -, +, ++ és +++ jelekkel jelöljük.

4 A különböző sárgaságtípusokban megfigyelhető változások Prehepaticus (haemolysis) Hepaticus (májelfajulás) Posthepaticus (epehólyag-elzáródás) Vér (szérum, plazma) ibr ( ) dbr UBG (nem mérjük) - Szabad Hb a plazmában (nem mérjük) Haptoglobin (nem mérjük) Ht Reticulocyta szám ( ) Véralvadási mutatók (, DIC-ben) (PT, APTI, TI) (K-vitamin adása (K-vitamin adása után után nem változik) normalizálódik) Jellemző enzimaktivitási ALT ALT (kisállat) ALKP (kutya) eltérések LDH AST (nagyállat) GGT (ló, macska, GLDH (nagyállat) kutya) Jellemző karbamid karbamid epesavak szubsztrátváltozások NH3 epesavak Vizelet UBG Br Hb - - Bélsár Br-derivátumok hypercholiás, hypocholiás acholiás hyperchrom

5 A máj kiválasztó tevékenységének vizsgálata A máj kiválasztó tevékenysége alapvetően fontos abból a szempontból, hogy a különböző endogén (pl. epefesték, szteroid hormonok stb.) és exogén anyagok (pl. gyógyszerek, toxinok stb.) ne halmozódjanak fel a szervezetben. A májsejtek által átalakított molekulák részben az epével, részben a vesén keresztül választódnak ki. Ha a máj kiválasztó tevékenysége nem megfelelő, akkor bizonyos vegyületek felhalmozódnak a vérben, illetve a szervezetben és számos kóros jelenséget okoznak (pl. másodlagos hyperaldosterinosmus /l. 6. old./, sárgaság, idegrendszeri tünetek az ammónia felhalmozódása miatt stb.). A biotranszformáció első lépését, a molekulák átalakítását (hidroxiláció, oxidáció, redukció, hidrolízis) követő második lépésben a konjugáció zajlik. A legfontosabb ebből a szempontból a glükuronsavas konjugáció, ezért a máj kiválasztó tevékenységét jól reprezentálja ennek a vizsgálata. A glükuronsavas konjugáció romlása, vagy a konjugátum csökkent kiválasztása tapasztalható több veleszületett humán betegségben is, pl. Crigler-Najjar kór, Dubin-Johnson szindróma, de élettani körülmények során is, amikor az újszülöttek májában az UDP-glükuronil-transzferáz aktivitása még nem megfelelő, így az újszülött csecsemők 1/3-ában sárgaság alakul ki. Ugyanakkor, mind az emberek, mind az állatok esetében a máj súlyos megbetegedéseiben többek között romlik a glükuronsavas konjugáció is. Így ennek a vizsgálata májfunkciós próbaként is alkalmazható. Brómszulfalein- (BSP)-próba A BSP alapállapotban fehér színű, semleges és savanyú közegben színtelen, lúgos közegben lilás színnel oldódó festék. A BSP-t a hepatocyták brómra és tioéterre bintják, majd a brómot glükuronsavval konjugálják. A bróm-glükuronid az epével ürül. A BSP-t megfelelő mennyiségben iv. beadva kutyákban, nagyállatokban szinte kizárólag a máj választja ki. Macskában azonban a vese is részt vesz az exkrécióban. A próba a máj UDP-glükuronil-transzferáz enzimének működéséről ad felvilágosítást. A 0,063 mólos (5 %-os) oldatból 0,1 ml/kg (=5 mg/kg) adagban történt befecskendezést követően a vérből a BSP-t a máj 95%-ban eliminálja (állatfajtól függően) perc alatt. Egészséges húsevők és juh mája 30 perc, szarvasmarháé és lóé 40 perc alatt választja ki a BSP-t az epe segítségével. A BSP-próba használatát korlátozza, hogy anaphylaxiás reakció léphet fel egyes esetekben az iv beadást követően. Macskánál a próba nem specifikus, mert a BSP vesén keresztül is kiválasztódhat.

6 Egyszerű BSP-próba A kutyák testtömegére számított mennyiségű festék beadása előtt heparinos csőbe vért veszünk a jobb oldali v. cephalica antebrachii-ből (0. perces minta) és ugyanazon a tűn át a számított mennyiségű BSP-t befecskendezzük. A kutyából újabb vérvétel következik 2-3 perc után a bal oldali v. cephalica antebrachii-ből (3. perces minta). További 30 perc elteltével ugyancsak a baloldali vénából gyűjtjük a harmadik vérmintát (30. perces minta). A vérmintákat lecentrifugáljuk. Vérvételenként 1 ml plazmára, 4 ml fiziológiás konyhasóoldatra és egy csepp 2,78 mólos (10 %-os) NaOH oldatra van szükség. Amennyiben a minták tartalmaznak BSP-t, a NaOH-oldat becseppentésére lilás elszíneződés következik be, és ez 565 nm hullámhosszúságú fényben spektrofotometriásan mérhető. Spektrofotométer segítségével a BSP-retenció mértéke is meghatározható: a 3. perces és a 30. perces minta abszorbanciáját a 0. perces minta (vak) ellenében fotométeren mérjük. A 3. perces minta abszorbanciáját 100 %-nak vesszük, és a 30. perces mintáét ennek százalékban fejezzük ki. Tíz %-feletti BSP-retenció enyhe, %-os retenció a májparenchyma súlyos működési zavarát jelzi. A BSP retenciójának leggyakoribb okai: Primer májelégtelenség (pl. cirrhosis, daganat, zsíros májelfajulás, hepatitis), a máj rossz perfúziója (pl. szívelégtelenség, portoszisztémás sönt, elzáródott portalis erek), egyéb okok (a máj UDP-glükuronil-transzferáz termelődésének primer zavara, pl. veleszületett hiánya). A BSP biológiai felezési idejének meghatározása Ezt a módszert elsősorban nagyállatokon alkalmazzuk, mert nem szükséges hozzá a testtömeg pontos ismerete és kisebb mennyiségű (1 g) BSP felhasználása is elegendő. A 0. perces mintavétel és a BSP ezt követő beadása után percen belül 3-5 percenkénti időpontokban 3-5 vérmintát gyűjtünk. A vérvételek időpontját másodperc pontossággal kell végezni. A BSP kimutatása a vérplazmából az egyszerű BSP-próbánál leírtakkal azonos módon történik, azaz a különböző időpontokhoz tartozó abszorbanciaértékeket a 0. perces minta, mint vak ellen fotométeren mérjük. A felezési idő meghatározására az ad lehetőséget, hogy a BSP koncentrációja a beadást követő percig az eltelt idővel négyzetarányosan csökken. Az egyes időpontokban kapott abszorbanciaértékeket féllogarítmusos papír ordinátáján (y tengelyén) tüntetjük fel. A BSP kiürülésének mértéke egy egyenes megszerkesztésével ábrázolható. A felezési idő a (decimális beosztású) vízszintes tengelyre vetítve leolvasható. A görbét egészséges állatokon végzett vizsgálatok alapján kell megszerkeszteni, majd a beteg állatokon is el lehet végezni a méréseket,

7 és meg lehet szerkeszteni a görbét. A májbeteg állatok esetében a görbe meredeksége jelentősen csökken BSP abszorbancia Idő (perc) Egészséges Zsírmáj szindrómás A BSP-felezési idő egészséges és májelfajulásos (zsírmáj szindrómában) beteg szarvasmarhában Az indocián-zöld (ICG) kiválasztás Az ICG használata az anaphylaxiás hatások szempontjából a BSP-nél kevésbé veszélyes és főképp macska esetében kifejezetten májspecifikusnak tekinthető. Az ICG-meghatározás is a máj glükuronsavas konjugációjának mértékéről tájékoztat. Hasonlóan a BSP-hez, alap vérmintát veszünk, majd kutya esetében 1 mg/ttkg (macska: 1,5 mg/ttkg) adagban iv beadjuk az ICG-t (0,5 %-os oldatban), ezután 3 és 30 perc elteltével vérmintákat veszünk. Az ICG kimutatása a plazmából spektrofotometriásan történik. Kutya esetében kórosnak mondható a %-nál nagyobb, macskánál a 15 %-ot meghaladó retenció. Az ICG meghatározás korlátja a reagens drágasága. Epesavak Az epesavak a máj kiválasztó működését jelző paraméterek. Ugyanakkor, számos májbetegségben változik értékük. Az epesavakat a májsejtek koleszterinből szintetizálják. Először az ún. primer epesavak képződnek (kolsav, kenodeoxikolsav). Ezután kutyában és macskában főként taurinnal és kis részben glicinnel konjugálódnak (taurokolsav, -kenodoxikolsav, glikokolsav, glikokenodeoxikolsav). Ezek Na-sói választódnak ki az epébe, majd a vékonybélbe. Elsődleges

8 feladatuk a lipidek emulgeálása. A vastagbél baktériumainak hatására részben dekonjugálódnak, részben az ún. másodlagos epesavakká alakulnak (litokolsav, deoxikolsav). Nagy részük az ileumban felszívódik, és a májba visszakerül (enterohepaticus körforgalom). Csak 2-5%-uk kerül a bélsárba főként a rosszul oldható litokolsav fomájában. A primer és a szekunder epesavak sóinak egy kis része a májból a vérkeringésbe kerül. Ezeket az epesavakat mérjük. Meghatározásuk vérplazmából történik. A RIA-, és a magasnyomású folyadékkromatográfiás (high pressure liquid chromatography, HPLC) módszerrel elkülönítettem mérhetjük a különböző epesavakat, míg az enzimatikus spektrofotometriás eljárással az összepesav-szintet lehet mérni. A vérvételt 12 órás éhezésnek kell megelőznie, ebből a mintából megmérjük az ún. éhezési epesavkoncetrációt. Az állatot megetetjük, majd 2 óra elteltével ismét vérmintát veszünk, és megmérjük az ún. postprandialis epesavszintet. Etetés után (a postprandiális mintában) 5-6-szoros élettani mértékű emelkedés is bekövetkezhet. Az epesavak vizsgálatára EDTÁ-val, vagy Na-citráttal lehet a vért alvadásában gátolni, a heparin zavarja a mérést. Az összepesav-koncentráció meghatározásának lényege, hogy az epesavakat előbb NAD jelenlétében a 3-α-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzimmel oxidáljuk, majd a képződő NADH-t diaforáz enzimmel nitroblue tetrazolium (NBT) festékképző jelenlétében NAD-dá és színes formazánná alakítjuk. A spektrofotometriás mérés során a kéződött szín 540 nm-en képez elnyelési maximumot. Élettani érték: húsevőkben praeprandialisan < 6 µmol/l, egyéb állatfajokban változóan µmol/l. Az élettani értékhez képest az éhezési epesav-koncentrációnak macskában 5-6-szoros, kutyában 10-szeres emelkedése súlyos májbetegség gyanúját veti fel és nincs szükség postprandialis minta vételére. Amennyiben az éhezési érték nem ilyen magas, akkor a postprandialis értéket kell figyelembe vennünk. Az epesavak koncentrációjának emelkedése részben amiatt jelentkezik, hogy májkárosodás esetén az ileumból visszaszívódott epesavakat a máj nem tudja feldolgozni. Másik ok lehet az epevezeték, vagy az epekapillárisok elzáródása, így az epesavak is retineálódnak a májban és a vérbekeringésbe kerülnek. Az ún. portoszisztémás sönt esetén pedig, az ileumból felszívódott epesavak a máj érintése nélkül kerülnek a vérkeringésbe. Ez utóbbi, perfúziózavarok miatt kialakuló májbetegség esetében az epesavak postprandialis értékei a meghatározóak. Az ileum betegségei is befolyásolják az epesavak koncentrációját, mert ez a felszívódásuk fő helye, így, ha romlik a felszívódás, akkor az epesavkoncentráció csökkenhet.

9

10 Az epesavforgalom vázlata (Az élettani folyamatok magyarázata fehér alapon, a kórósaké szürke alapon látható.)

11 Gyakorlati feladatok: 1. A vérszérum bilirubin-derivátumainak vizsgálata Bekészítés: vérszérum-minták (egészséges kutya, ló, és icterusos icterus kutya), Diazo I.-, II.- reagens, spektrofotométer, küvetták, koffein-reagens, pipetták (5-40 µl-es, µl-es, µl-es). Bemérés: Bemérendő anyagok Összbilirubin (totbr) Direkt bilirubin (dirbr) minta (szérum) (ml) 0,2 0,2 0,2 alkohol v. koffein oldat 0, % NaCl - 0,7 0,8 diazo reagens 0,1 0,1 - Tapasztalatok leírása: Vak 2. A vizelet bilirubin-derivátumainak vizsgálata Bekészítés: vizeletminták (egészséges kutya, ló, és icterusos icterus kutya), tömény salétromsavoldat, kémcsövek, cseppentős pipetták. Bemérés: a kémcsőben lévő, mintegy 2 ml vizelet alá cseppentős pipettával 1 ml tömény salétromsavat rétegzünk. Tapasztalatok leírása: 3. Egyszerű BSP-próba Bekészítés: a BSP-próba elvégzése kutyán (l. előbb), majd vérminták lecentrifugálása (3000/p fordulatszámon) a plazmák elkülönítése; pipetták (1, 5 ml-es); cseppentős pipetta; 10%-os NaOHoldat; fotométer Bemérés: 1 ml plazmába 4 ml 0,9%-os NaCl-oldatot pipettázunk, majd 1-1 csepp NoOH-oldatot cseppentünk; az így elkészített oldatokat 565 nm-en fotometráljuk. Tapasztalatok leírása: