Doktori (Ph.D.) értekezés Keresztury László

Átírás

1 Az MHC rendszer molekuláris genetikai vizsgálata, eredményeinek felhasználása a származás-megállapításban, a populációgenetikában és a csontvelő transzplantációban Doktori (Ph.D.) értekezés Keresztury László SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA A humán molekuláris genetika és géndiagnosztika alapjai Program Témavezető: Dr. FALUS ANDRÁS egyetemi tanár Semmelweis Egyetem Genetikai, Sejt - és Immunbiológiai Intézet és Országos Haematológiai és Immunológiai Intézet Immungenetikai Osztály Budapest, 2001

2 2 Mónikának, Rebekának és Marcellnak

3 Tartalomjegyzék TARTALOMJEGYZÉK...3 ÖSSZEFOGLALÁS...5 SUMMARY BEVEZETÉS CÉLKITŰZÉSEK IRODALMI HÁTTÉR A HUMÁN GENOM A humán genom szerveződése A humán genom polimorfizmusai A FŐ HISZTOKOMPATIBILITÁSI GÉNKOMPLEX (MHC) Az MHC nevezéktana Az MHC vizsgálatában alkalmazott módszerek VIZSGÁLATI MINTÁK ÉS MÓDSZEREK VIZSGÁLATI MINTÁK Populációs minták Speciális csoportok vizsgálati mintái NAGY MOLEKULASÚLYÚ, GENOMIÁLIS DNS IZOLÁLÁSA ÉS KONCENTRÁCIÓ-MÉRÉSE Izolálás kisózással Lahiri-Nurnberger -módszer A DNS-oldat koncentrációjának és tisztaságának meghatározása optikai denzitásméréssel ALKALMAZOTT MÓDSZEREK VNTR-alapú restrikciós fragmenshossz polimorfizmus vizsgálata hibridizációs "assay" módszerrel HLA-A2 szubtipizálás PCR-ARMS módszerrel A HLA-C-lókusz polimorfizmus-vizsgálata PCR-SSO technikával Származás-megállapítási ügyekben alkalmazott PCR-vizsgálatok TAP1 és TAP2 polimorfizmusok kimutatása STATISZTIKAI SZÁMÍTÁSOK A VNTR-alapú RFLP vizsgálatok eredményeinek statisztikai értékelése A populációgenetikai számításokkal kapcsolatos fogalmak Az Arlequin populációgenetikai szoftver (Ver ) Származás-megállapítás, Essen-Möller értékek EREDMÉNYEK A VNTR LÓKUSZOK VIZSGÁLATÁNAK EREDMÉNYEI Populációgenetikai tesztek A két VNTR lókusz öröklődése, családvizsgálatokkal bemutatva A HLA-A2 ALLÉL TIPIZÁLÁSÁNAK EREDMÉNYEI A HLA-C TIPIZÁLÁS EREDMÉNYEI Az IHW és CTP sejtvonalak tipizálásának eredményei Populációk statisztikai vizsgálatai A csontvelőátültetés előtti donor-recipiens párok vizsgálati eredményei A SZÁRMAZÁS-MEGÁLLAPÍTÁSI VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEI Kizárások Nem kizárásos apasági ügyek AZ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA MEGBESZÉLÉS...67

4 7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE...75 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁHOZ KAPCSOLÓDÓ ELŐADÁSOK, POSZTEREK... Hiba! A könyvjelző nem létezik. 9. IRODALOMJEGYZÉK

5 Összefoglalás Az MHC rendszer molekuláris genetikai vizsgálata, eredményeinek felhasználása a származásmegállapításban, a populációgenetikában és a csontvelő transzplantációban Keresztury László Témavezető: Dr. FALUS ANDRÁS egyetemi tanár, igazgató Semmelweis Egyetem,Genetikai, Sejt - és Immunbiológiai Intézet, Országos Haematológiai és Immunológiai Intézet, Immungenetikai Osztály A származás-megállapítási vizsgálatokban alkalmazott HLA-tipizálást az 1990-es évek elejétől az MHC génkomplex, az örökítő anyag szintjén megnyilvánuló polimorfizmus vizsgálatai egészítik ki. Ezek az eljárások betegellátáshoz kapcsolódó molekuláris biológiai vizsgálatok szerves részét képezik, nélkülözhetetlen adatokat szolgáltatva a csontvelőbetegek és donoraik vizsgálatában. Az MHC I osztályba tartozó HLA-A lókusz HLA-A2 alléljének a szubtípus vizsgálatait végeztük el random normál populációs mintával. Elkezdtük a HLA-C lókusz polimorfizmusainak molekuláris biológiai módszerekkel végrehajtott vizsgálatait. A vizsgálatokat két földrajzi régióból származó és a hazai népességet reprezentáló mintákkal, továbbá szerológiai módszerrel HLA-ABDR egyezőnek bizonyult csontvelő donor-recipiens párokkal végeztük el. Megkezdtük a TAP fehérjék kódoló szekvenciáiban detektálható polimorfizmusok vizsgálatát. A vérminták és buffy coat minták DNS-tartalmát ún. kisózásos módszerrel izoláltuk. A HLA-A2 allél szubtípusai közül a HLA-A*0201 (96.4%) és a HLA-A*0205 (3,6%) szubtípust mutattuk ki. Az allél funkcionális jelentősége, továbbá az egyes országok és népcsoportjaik közötti szubtípusgyakorisági eltérések további, populációgenetikai felmérések szükségességét igazolják. A HLA- C lókusz molekuláris biológiai vizsgálatokkal kapott eredményeinek értékelése alapján a mintacsoportok -HLA-C allélgyakorisági értékeik alapján - belesimulnak az európai átlagba, noha a három csoport allélgyakorisági értékei között eltérések mutatkoztak. A csontvelőbetegek és donoraik szerológiai és molekuláris biológiai módszerekkel kapott eredményeiben 87%-os eltéréseket találtunk. Minden allélt kimutattunk; a heterozigótaság mértéke 90% feletti lett. Két VNTR-lókusz RFLP-módszerrel végzett vizsgálatát végeztük el random normál hazai populációs mintával. E vizsgálatok helyett az igazságügyi gyakorlatban már STR-vizsgálatokat alkalmaznak. A TAP polimorfizmusok megkezdett vizsgálatai a jövőben módosított kondíciók mellett folynak tovább. 5

6 Summary Molecular genetic examination of the MHC and application of its results in parentage, population genetic surveys and bone marrow transplantation László Keresztury Supervisor: Dr. András FALUS Professor and Chairman Department of Genetics, Cell- and Immunobiology, Semmelweis University National Institute of Haematology and Immunology HLA-typing in paternity cases has been applied and completed with examination of DNA polymorphisms of MHC at the level of DNA from the beginning of the 1990s. These methods are in close connection with molecular biology examinations related to medical attendance providing indispensable data in the examination of donor-recipient pairs in bone marrow transplantation. The examination of HLA-A2 alleles of HLA-A locus from Class I HLA was carried out with healthy unrelated Hungarians, at random. We launched the examination of the HLA-C loci polymorphisms with the molecular biology method. The identification of polymorphisms of HLA-C locus was set up with two geographically isolated Hungarian populations, and a control group. In addition to this, serologically HLA-ABDR matched bone marrow donor-recipient pairs were examined at HLA-C locus, previously. The identification of DNS sequence-polymorphisms of TAP proteins was set up. The DNA content from nucleated cells of anticoagulant blood samples and buffy coat samples was extracted with salting-out method. The HLA-A*0201 (96.4%) and HLA-A*0205 (3,6%) subtypes were identified from the extremely polymorph allele A2 of our sample group. Additional population genetic surveys should be considered the functionally important allele HLA-A2 and detectable polymorphisms in different ethnic groups are considered. On the basis of our results: the allele frequencies of above mentioned populations merge with the average European results, in spite of the fact that there were some minor alterations between the groups. The serologically HLA-ABDR matched donor-recipient pairs indicated 87% difference from with PCR-based method in HLA-C locus. There were no null (blank) alleles; the heterozigousity was above 90%. Two VNTR loci examinations were carried out and the data evaluation was accomplished. These methods have been replaced by STR-methods in the field of jurisdiction. The examintions of TAP polymorphisms which we have been started will be continued under modified conditions. 6

7 Az értekezésben előforduló rövidítések jegyzéke ARMS dntp Et-Br GvHD HLA HSP IHW MHC MKK MKP v K NBT NIH PCR P v RE RFLP SSC SSO SSP STR VNTR "amplification refractory mutation system" deoxinukleotid keverék ethidium-bromid "graft versus host" betegség humán leukocita lókusz A hősokk fehérje "International-Histocompatibility Workshop" "Major histocompatibility complex", fő hisztokompatibilitási génkomplex "Mutter-Kind-Konstellation", Anya-gyermek haplotípus-konstelláció "Mutter-Kind-Präsumptivvater-Konstellationen", Anya-gyermek-vélelmezett apa haplotípus-konstelláció "Nitroblue-tetrazolium" - só " National Institute of Health (US)" Polimerizációs láncreakciós technika (in vitro) "Präsumptivvater", vélelmezett apa Restrikciós enzim "restriction fragment length polymorphism", restrikciós fragmens hosszpolimorfizmus Standard saline citrate "sequence-specific oligonucleotide", szekvencia-specifikus oligonukleotid "sequence-specific primer", szekvencia-specifikus primer "short tandem repeats", rövid, tandem ismétlődő egységek "variable number of tandem repeats", változó számú, tandem ismétlődő egységek 7

8 1. Bevezetés A származás-megállapítási vizsgálatokban nélkülözhetetlen a megbízható, természettudományos eszközökkel kapott reprodukálható eredmények felhasználása [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7]. E vizsgálatok a hasonló tulajdonságaik alapján karakterizálható, öröklődő jellegekre irányulnak, valamint azokra, amelyek az adott populációban rendkívül változatos formában jelennek meg, azaz nagyfokú polimorfizmus jellemzi őket. A polimorfizmus-vizsgálatok az 1970-es évek közepéig a géntermékek szintjén kimutatható "genetikai sokféleséget" vizsgálták: az 1960-as években az egyes vércsoport-rendszerek [8] kb.20-, az 1970-es évek közepéig a szérum-proteinek elektroforetikus vizsgálatai mintegy 30 marker detektálását tették lehetővé. A laboratóriumi vizsgálati módszerek fejlődése révén, az 1970-es évek közepétől már az örökítő anyag, a DNS vizsgálatát is lehetővé tette: a restrikciós fragmenshosszpolimorfizmus vizsgálatokkal (RFLP) közel , az ismétlődő fragmensek kópiaszámának kimutatásával (mini- vagy mikroszatelliták) számú egyedi különbséget adó allél detektálható. Az RFLP módszert követő, majd azt egyre inkább felváltó, polimeráz láncreakción (PCR) alapuló módszerek bevezetése forradalmasította a molekuláris biológiai vizsgálatokat és azok alkalmazását. A humán genom szerkezetének feltérképezésével [8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18] párhuzamosan, közvetlenül a genetikai örökítő anyag polimorfizmusának vizsgálatával, rendkívüli mértékben gyarapszik az ismert, funkcionális jelentőségü gének és allélek száma. Az emberi genom egy ezredét kitevő, rendkívül polimorf, fő hisztokompatibilitási génkomplex (MHC) szerológiai módszerekkel végzett vizsgálata [19] hazánkban 1979 óta tartozik a származás-megállapítási vizsgálatok bizonyítási eljárásai közé [20]. Ezeknek az eljárásoknak azonban határt szab a vizsgált antigének meghatározására szolgáló ellenanyagok korlátozott specificitása, az egyes típusok epitópjainak hasonlósága, valamint - pl. egyes HLA antigének esetében - korlátozott mértékű sejtfelszíni megjelenése. A meglevő eljárások molekuláris biológiai módszerekkel történő bővülésével lehetővé vált egyrészt az egységesnek tűnő szerológiai HLA típusok valós sokféleségének megismerése, a - gyenge sejtfelszíni kifejeződése miatt kevésbé feltárt - HLA-C lókusz polimorfizmusának felmérése, az újabb és újabb, a hisztokompatibilitásban szerepet játszó 8

9 terméket kódoló gének kimutatása és -vizsgálata. Másrészt - a különböző orvosi beavatkozások következményeiként - bizonyossá vált, hogy a polimorfizmusok jelentős része funkcionális jelentőséggel bír. Az MHC génkomplex polimorfizmusainak az ismerete nélkülözhetetlen az orvosi gyakorlatban: a szerv- és szövetátültetés során a recipiens számára a tőle - az adott genetikai rendszerben - legkevésbé eltérő donor kiválasztásában, az immunreaktivitás folyamatának - és bizonyos, főként autoimmun betegségek patomechanizmusának megértésében. Az egészségügyi laboratóriumi gyakorlatban alkalmazott módszerek felhasználhatók továbbá a származás-megállapítási eljárásokban, hiszen segítségükkel - a populációs adatok tükrében - megadható az apaság valószínűsége, illetve igazolható a biológiai apa személye. 9

10 2. Célkitűzések Jelen értekezésben az MHC polimorfizmusok vizsgálatában alkalmazható molekuláris genetikai módszerek bővítéséről, az I. osztályú HLA lókuszok vizsgálatára szolgáló módszerek beállításáról, valamint az eredmények populációgenetikai értékeléséről számolunk be. Ezek a vizsgálatok illeszthetők a meglevő laboratóriumi infrastruktúrához, szervesen kapcsolódnak az egészségügyi ellátás gyakorlatába, továbbá alkalmazhatók a származás-megállapítási eljárások során A leggyakoribb HLA-A allél, a HLA-A2 szubtípusainak kimutatására szolgáló módszer(ek) alkalmazásával vizsgálni kívántuk a magyarországi népesség allélmegoszlását A HLA-C lókusz alléljeinek kimutatására szolgáló molekuláris genetikai módszerek beállításával a hazai népességben detektálható HLA-Cw* allélek kimutatása volt a célunk, melynek funkcionális jelentősége a következő vizsgálandó terület lesz a hazai laboratóriumi gyakorlat számára Egyéb, az MHC régióban kódolt funkcionális molekulák (pl. LMP, TAP) polimorfizmus-vizsgálatának keretében - jelen munkában - a TAP fehérjéket kódoló DNS régió polimorfizmusainak vizsgálatát kezdtük meg További, az MHC-régión kívül eső polimorf lókuszokat vizsgáltunk, amelyek különbözőek lehetnek azonos HLA típusú személyeknél. Ennek keretében random választott, normál populációs mintán kettő, a magyarországi gyakorlatban még nem használt VNTR-lókuszt vizsgáltunk RFLP módszerrel Az újonnan beállított módszerekkel random választott, normál populációs mintán és kiemelt, homogén csoporton vizsgáltuk a detektált HLA-lókuszok és a két VNTRlókusz allélgyakoriságait. 10

11 2.6. Az említett módszerekkel bővített molekuláris biológiai vizsgálatokat beépítettük a Magyarországon alkalmazott, szerológiai módszerrel végrehajtott HLA-tipizálás származás-megállapítási gyakorlatába A beállított módszereket alkalmaztuk az optimális donor-recipiens megfeleltetéshez a csontvelő-átültetést megelőzően A populációgenetikai eredmények kiértékeléséhez megfelelő statisztikai programot állítottunk be. 11

12 3. Irodalmi háttér 3.1. A humán genom A humán genom szerveződése A genom a (haploid vagy diploid) sejtek teljes örökítőanyag-mennyisége (DNStartalom) a sejtmag és a mitokondriumok DNS-állományából áll. A gének a genom alig 10%-át alkotják. A maradék, ún. nem kódoló szekvenciák pszeudogéneket, génfragmenteket, intronokat, egyedi, kis kópiaszámú szakaszokat, valamint transzkripcionálisan inaktív, változó erősséggel ismétlődő, szakaszokat foglal magába [21, 22]. A tandem-ismétlődő elemek [23] közé sorolhatók a kromoszómák centromerikus és telomerikus régióinak megaszatellitái, szatellitái, továbbá a mini- és mikroszatellitái A humán genom polimorfizmusai Amennyiben egy genetikai jelleg vagy lókusz alléljeinek megjelenési gyakorisága valamely populációban alacsonyabb, mint 0.99, az adott jelleg vagy lókusz polimorfizmusáról beszélünk. (a) A mutáció történhet a gének exonjában, a lókusz azonos hosszúságú, de eltérő nukleotid sorrendű alléljeit létrehozva. A polimorf gének tipikusan 2-6 allélváltozattal rendelkeznek. A (neutrális) mutáció a géntermék térszerkezetében nem okoz funkcióváltozáshoz vezető módosulást (pl. izoenzimek): az allélok elektroforetikus vizsgálatokkal, izoelektromos fókuszálással különíthetők el. Különös jelentőségűek azonban azok a DNS-polimorfizmusok, amelyek az általuk kódolt géntermékek a szervezet számára kulcsfontosságú funkcionális eltéréseit határozzák meg. (b) A genomiális DNS valamely restrikciós enzimmel történő hasítása során eltérő hosszúságú fragmensekre esik szét. A polimorfizmusok ezen típusát restrikciós fragmenshossz polimorfizmusnak (restriction fragment length polymorphism; a továbbiakban: RFLP) nevezzük. Az egyedi különbségeket restrikciós enzimek (a továbbiakban: RE) felismerési hasítóhelyeiben (recognition site) kialakuló, egy-egy bázist érintő mutációk (deléció, inszerció, szubsztitúció) okozzák. Amennyiben ezek a humán genonom teljes hosszában, sorban ismétlődő (tandem repetitív) DNS szekvenciák egy-egy szegmentjében, vagy azok határoló régióiban történnek, az 12

13 adott ún. változó számú, tandem-ismétlődő lókusz (variable number of tandem repeats; a továbbiakban: VNTR) [24] eltérő hosszúságú allélváltozatait kapjuk. Ezeket a miniszatellitáknak is nevezett, a kromoszómák telomerikus régióinak nemkódoló szakaszaiba csoportosuló lókuszokat 9-64 bázispár (tovább: bp) méretű magszekvencia (ún. core-unit ) változó számú tandem ismétlődései jellemzik. A miniszatelliták mellett ismertek rövid tandem-ismétlődések (short tandem repeats; a továbbiakban: STR), vagy mikroszatelliták. A tri-, tetranukleotidok tandem ismétlődéseinek a száma néhánytól több tucatig terjedhet. Az STR-ek populációban jelentkező allélszáma (lókusztól függően) 5-20-ig terjedhet. E - fenotípusos eltérést többnyire nem okozó - hipervariábilis genetikai jellegek a polimorfizmus vizsgálatok szempontjából azonos értékűek a fehérje-polimorfizmusokkal A Fő Hisztokompatibilitási génkomplex (MHC) A 6. kromoszóma rövid karján (6p21.3) található az emberi genom (egyik) legnagyobb genetikai polimorfizmussal jellemezhető, mintegy négymillió bázis hosszúságú, erősen konzervatív nukleotid sorrendű komplexe. Az immunrendszer működésének egyéni variációi mögött három nagy gén-csoportban (MHC I, -II, -III) kódolt, eltérő funkciójú fehérjék nélkülözhetetlen, funkcionális eltérései húzódnak [25]. Az MHC I- és MHC II osztály ún. klasszikus MHC-génjei által kódolt, fő szövetösszeférhetőségi antigéneket nevezik HLA (human leukocyte locus A; továbbiakban: HLA) antigéneknek. Az MHC-fehérjék - az immunrendszer működése szempontjából - nélkülözhetetlen intracelluláris- és sejtfelszíni peptidreceptorok. Nem képesek a szervezet számára tolerálható illetve nem tolerálható (antigénnek tekintendő) peptidek közötti különbségtételre, csak azok kötésére. Alapvető szerepük az "immunológiai saját" determinálása, a T-sejt repertoár kialakítása az MHC-peptid-komplexek révén és a nem-sajátként azonosított sejtek, fehérjék T- sejtek általi felismerése. 13

14 Szerkezet és funkció: Az MHC I osztályú molekulák A szervezet magvas sejtjein és a trombocitákon megjelenő heterodimer MHC I glikoproteinek 5 doménből felépülő α- (nehéz-)láncának felszínén, az α1-és α2- domének által kialakított, zárt peptidkötő zsebek találhatók. Ide kötődnek az endogén eredetű fehérjék degradációjából származó, rövid peptidek (e folyamat fontos elemei az MHC II osztály régiójába tartozó gének által kódolt, a TAP1 és TAP2 szállítófehérjék). Az allélvariánsok a peptidkötő helyek aminósav-sorrendjének eltérő változatait hordozzák. HLA I I osztály régiója Szerkezet és funkció: Az MHC II osztályú molekulák Az MHC II molekulát két, egymással nemkovalens módon kapcsolódó, heterodimer szerkezetű polipeptidlánc alkotja. A α-láncot kódoló DA és a polimorfabb β-láncot kódoló DB gének a kromoszóma centromerje és az MHC I lókuszok között, a HLA-D régióban helyezkednek el, DPA/DPB-, DQA/DQB- és DRA/DRB-láncokat kódoló szub-régiókat alkotva. A 4-4 doménnal rendelkező, MHC II glikoproteinek exogén eredetű peptideket kötő régióit az α1-β1 doménpár alakítja ki. 1. sz. ábra : Az MHC génkomplex géntérképe HLA III osztály régiója HLA I osztály régiója HLA GÉNKOMPLEX 14

15 Az MHC nevezéktana [26] A szerológiailag meghatározható HLA I. osztály transzplantációs HLA-A, -B, -C lókuszok által kódolt antigénjeit, valamint a limfociták által felismert HLA-D régió lókuszai által determinált antigéneket nagy betűvel, alléljait arab számokkal jelöljük (pl. HLA-A19). Ha ezek némelyike a későbbiekben egyedi specificitásokra, alegységre (split) bomlik (pl. A29, A30, A31, A32 stb.), az eredeti, szélesen" reagáló (broad) antigén száma, annak utóbb meghatározott split -je utáni zárójelben szerepel: pl. "HLA-A29 /19/". A molekuláris biológiai módszerekkel meghatározott HLA I osztályú lókuszok nehézláncát kódoló gén egyik allélja: pl. HLA-A*01. Ennek szubtípusa további két számmal bővül: pl. HLA-A*0101. Az MHC II-régió alléljainak és szubtípusainak nevezéktana hasonló, pl. a DR lókusz β- könnyűláncának a génje: HLA-DRB1, míg egyik allélját kétjegyű számmal jelöljük: HLA-DRB1*13; szubtípusa további két számmal bővül: HLA-DRB1*1301. A DR géncsoport egyetlen DRA génje (egyféle típusú α- láncot kódol) és a négy átíródó DRB gén - DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 - a következő struktúrában alkotja a heterodimereket: a DRA és DRB1 gének kódolta fehérjék a HLA-DR1 és HLA-DRw18 közötti antigéneket hordozzák. A DRA és DRB3 géntermékei a DR52 antigént, a DRA és DRB4 a DR53 antigént, a DRA és DRB5 a DR51 antigént fejezik ki. A HLA-DQA és HLA-DQB antigéneket a DQA1 és DQB1 gének határozzák meg. A HLA-DP régió szerkezete hasonló. Az azonos kromoszómán elhelyezkedő, mendeli öröklésmenet szerint, kodomináns módon, kapcsoltan öröklődő jellegeket nevezzük haplotípusnak: az utódok fenotípusa a négy szülői haplotípus kombinációja Az MHC vizsgálatában alkalmazott módszerek A HLA-antigének szerológiai módszerrel történő meghatározásának 1964-től [27] alkalmazott gyakorlata a limfocita-citotoxicitási teszt [28]. A molekuláris biológiai vizsgálatokban alkalmazott hibridizációs analízis az azonosítandó (target) DNS szakasz és az alkalmazott (jelzett) DNS próba között létrejövő 15

16 heteroduplex detektálásán alapul. Ehhez vagy darabokra hasítjuk az izolált, genomiális DNS mintát restrikciós enzimmel (RE) [29], vagy egy kitüntetett rövid szakaszának mennyiségét in vitro, polimeráz láncreakcióval (PCR) (Mullis, Cetus Corp. 1985) felszaporítva tesszük alkalmassá a vizsgálatokra [30, 31]. Az RFLP vizsgálati módszerek alkalmazásakor az izolált, genomiális DNS minta [32] RE-mel történő hasítása (ún. emésztés) után a kapott fragmensek agaróz-gélben [33, 34] történő, méretszerinti frakcionálása [33, 34] következik. A fragmensek relatív helyzetét transzferálással szilárd hordozóra (nylon membrán) rögzítjük (Southern 1975.). A keresett (target) DNS-szekvencia helye és mérete a membránra juttatott, jelzett próbával becsülhető [35, 36, 37]. A genom VNTR lókuszainak vizsgálatában még igen, de az egyes MHC gének polimorf intronjainak (pl. HLA-DRB, -DQA,-DQB) vizsgálatában már nem alkalmazzák. A PCR módszerek alkalmazásakor a denaturált DNS-mintához oligonukleotid primerpárt adva, a DNS-target eredeti mennyisége több cikluson keresztül jelentősen növelhető [38, 39, 40, 41, 42, 43]. PCR-SSO (szekvencia-specifikus oligonukleotid) - hibridizáció A PCR amplifikáció termékének SSO-technikával végzett hibridizálásával allélek és allélcsoportok különíthetők el [45]. A PCR termék egy kiemelt lokusz minden allélját (generikus amplifikáció) tartalmazza, vagy csak egy alcsoportját (csoport-specifikus amplifikáció). A HLA I. osztály esetében a hipervariábilis régiókat hordozó első és második domént kódoló 2. és 3. exont kell amplifikálni. A HLA-A, -B, -C gének analízise során a PCR termékeket jelentős számú (a HLA-A gén esetében 50, a HLA-C gén esetében 39) szekvencia-specifikus oligonukleotiddal kell hibridizálni. Lókusz-specifikus primerek alkalmazása teret nyitott -többek között- a HLA-A2 és a HLA-B27 allélek szubtípusainak gyors meghatározásához. A HLA II. osztály analízisében a polimorf első domént kódoló 2. exon amplifikálása történik. Az első (generikus) PCR-termékekkel a HLA-DR, -DP, -DQ gének alacsony 16

17 felbontású, a második csoport-specifikus amplifikálással a HLA-DRB1, -DPB1,-DQB1 gének termékeinek nagy felbontású tipizálása lehetséges. A próbák hibridizációja történhet membránra kötött PCR-termékekkel (dot-blot) és fordítottan, membránra kötött próbákhoz hibridizálva a PCR-termékeket (fordított dotblot). Az első esetben egyszerre több egyén (PCR-termékek) párhuzamos tesztelését végezhetjük el; a fordított dot-blot viszont egy személy komplett multiallél-teszt eredményét kapjuk egyetlen hibridizációval. PCR -SSP (szekvencia-specifikus primer) amplifikáció A reakció az enzimatikus primer-hosszabbodás specificitásán alapul: csak akkor következik be, ha DNS-minta tartalmazza a vizsgálandó szekvenciamotívum-párhoz tervezett primerek 3'-végével komplementer DNS-szekvenciát. Pozitív reakció esetén a PCRtermék meghatározott méretű sávként azonosítható az agaróz gélben [46, 47, 48, 48, 49]. A HLA-A, -B, -C és a HLA- DR, -DQ, -DP gének tipizálása és szubtípusainak a meghatározása lehetséges. PCR-ARMS ("amplification refractory mutation system")-módszer A HLA-A2 allél szekvencia-specifikus vizsgálatában a PCR-SSP módszer speciális változatát alkalmaztuk: az első PCR reakcióval amplifikált lókusz vagy csoportspecifikus amplifikáció terméke szolgál a következő, allélspecifikus, differenciáló PCRreakció templátjául. Az amplifikáció csak abban az esetben következik be, ha a templátként használt vizsgálandó DNS tartalmazza a primernek megfelelő célnukleotid sorrendet [49, 50]. A normál primer a mutáns templáthoz nem kötődik, PCR-termék nem képződik. A vizsgált DNS-szakaszban bekövetkezett egy bázispár változás, illetve kisebb deléciók kimutatása lehetséges. A TAP1-, TAP2 -gének polimorfizmusainak vizgálatában két, 3 végződésében eltérő, komplementer szekvenciájú, allél-specifikus primert alkalmaztunk. A normál primer 3 -terminális végének nukleotid szekvenciája a normál DNS-el komplementer, a mutáns primer 3 -terminális végének nukleotid szekvenciája a mutáns DNS-el komplementer (Newton 1989) [51, 52, 53, 54]. 17

18 A kimutatható allélek száma MHC I. osztály MHC II. osztály tipizálási módszerek A B C DRB1 DQA1 DQB1 DPA1 DPB1 szerológiai molekuláris biológiai táblázat: A HLA lókuszok szerotipizálással és molekuláris biológiai módszerekkel kimutatható alléljeinek áttekintő táblázata (forrás: Detektálás Közvetlen (ethidium-bromid) festés A DNS tartalmú fragmensek gélbeni lokalizációja közvetlenül meghatározható ethidiumbromid (Et-Br) festék alacsony koncentrációban történő használatával. A DNS-festék komplex hatékony UV-fényelnyelése miatt már rendkívül kis DNS mennyiség (kb. 2 ng) is látható. Kemilumineszcens jelzés [55] A közvetlen jelölés (Lifecodes) esetén az RFLP vizsgálatokban alkalmazott próbák NICE ) tartalmazzák az alkalikus foszfatázt. A szubsztrátot (a Lumi-Phos 480 vagy CDP-Star ) hibridizálás után kell a rendszerhez adni. A PCR vizsgálatokban a membránra kötött PCR-termékhez (dot-blot) már alkalikus foszfatázzal jelölt próbákat hibridizálunk. Ehhez kell a szubsztrátot (a Lumi-Phos 480 vagy CDP-Star ) adni. Az alkalikus foszfatáz dioxetán szubsztrátjának kémiai reakciója röntgenfilmen láthatóvá tehető fényemissziót (477 nm) okoz (Bronstein és mtsai 1990,1991). 18

19 4. Vizsgálati minták és módszerek 4.1. Vizsgálati minták A minták kiválasztása egyrészt a beállítandó vizsgálati módszereknek megfelelően történt, másrészt egyes célkitűzések alapján speciális csoportokat állítottunk Populációs minták A HLA-A2 allélgyakoriság meghatározására a 12. IHWS antropológiai szekciójában [56] magyar populációként jellemzett és vizsgált 126 random kiválasztott, egymással rokonsági kapcsolatban nem álló egészséges személy DNS mintájából olyan 55 személy mintáját használtuk, akik HLA-A2 pozitívnak bizonyultak. A HLA-C lókusz vizsgálataihoz használt minták kiválasztása és a mintagyűjtés a "The Biological History of European Populations" program keretében, dr. Tauszik Tamás vezetésével történt. A Káli-medencében 5 apró település lakosságának közel 20%-ától (70 személy) és a Duna-Tisza közében elhelyezkedő Ópusztaszer és Pusztaszer, valamint a környező kisebb települések lakosságának mintegy 15%-ától (45 személy) gyűjtöttek (10 ml heparinos, 10 ml citrátos) vérmintát. Az összes minta vércsoportszerológiai, valamint szerológiai módszerrel végzett HLAvizsgálatai után csak azokat a személyeket vizsgáltuk tovább, akiknek a családja több évszázada él az adott régióban. Az egyenesági leszármazottak esetében kizártuk a gyermeket. Testvérek, unokatestvérek esetében random választottuk az egyik személyt. Ilyen előzmények után a molekuláris biológiai vizsgálatokhoz 46 Káli-medencében élő és 32 Ópusztaszerről és környékéről származó személy vérmintáinak DNS tartalmát izoláltuk. Kontrollként 44 random kiválasztott, normál magyarországi népességhez tartozó személy vérmintáját dolgoztuk fel. A PCR-SSO technika kontrolljaként 15 jól karakterizált nemzetközi sejtpanel-mintát használtunk: az IHWC (International Histocompatibility Workshop Cell) panelből 6 típust [57], a Cell Ter Panel-ből 9 típust. 19

20 A populációgenetikai értékelés során az általunk feldolgozott minták eredményeit a Magyar Csontvelődonor Regiszter (Hungarian Bone Marrow Donor Register, HBMDR) adatbankjához (n =2090, december) hasonlítottuk. Az RFLP vizsgálatok beállításához az Országos Vérellátó Szolgálat pécsi és debreceni regionális központjaiból kapott 132 random kiválasztott mintát használtunk: 71 db vérmintát és 61 db "buffy coat" mintát Speciális csoportok vizsgálati mintái Teljesen HLA-egyező rokon donorral nem rendelkező, csontvelő transzplantációra szoruló betegek és szerológiai módszerrel vizsgálva HLA-A, -B, DR egyezőnek bizonyult donoraik kivizsgálása során a II. osztályú allélek szubtípusbeli (DRB1, DQB1, DPB1) összehasonlítása rutinszerüen megtörténik (az átültetés sikeressége és a DNS szintű egyezés mértéke közötti összefüggések elemzése). Ezt a vizsgálatkört kiegészítendő meghatároztuk minden elérhető donor-recipiens pár HLA-Cw és A2 szubtípusát. Első csoportban 61, a későbbiekben 76 donor-beteg összehasonlítást végeztünk. Az apasági ügyek molekuláris biológiai vizsgálataihoz néhány ml (Na-citrát antikoaguláns-tartalmú) vérminta szükséges. Kétséges esetekben, amennyiben a szerológiai vizsgálatok eredménye nem kielégítő, a további vizsgálatokhoz a szerológiai meghatározáshoz használt vérminták maradék limfocitáiból preparált DNS használható. Az értekezésben 12 apasági ügyet dolgoztunk fel. A TAP polimorfizmusokat 50 DNS-mintával vizsgáltunk Nagy molekulasúlyú, genomiális DNS izolálása és koncentrációmérése Izolálás kisózással [58] Az alvadásgátolt (10 ml) vérmintát 1 x ELB (vörösvérsejt-lízis) puffer hozzáadásával (30-40 ml) óvatosan keverve inkubáltuk (10 perc), centrifugáltuk (5 perc, 2000 rpm). A felülúszó eltávolítása után az eljárást megismételtük. Az üledéket 1 x PBS-ben (20-25 ml) reszuszpendáltuk, centrifugáltuk (10 perc, 2000 rpm). A felülúszó óvatos leöntése után az üledéket 1 x PBS-ben (6 ml) reszuszpendáltuk; 3 x fehérvérsejt-lízis puffert (3.3 20

21 ml), proteináz-k enzimet (35 μl) adtunk hozzá és óvatosan keverve inkubáltuk (56 C, 180 perc). A szobahőmérsékletűre hűtött mintát NaCl (3.0 ml, 4 C-os, 6N) hozzáadásával erősen összeráztuk, a kicsapódott fehérjét centrifugáltuk (10 C, 30 perc, 2000 rpm). Az üledékről óvatosan leválasztottuk a felülúszót, melynek DNS-tartalmát (10-15 ml) propanollal kicsaptuk. Eppendorf csőben a csapadékot etanollal (650 μl, 70 %) óvatosan öblítettük, centrifugáltuk (2-5 perc, rpm). Az alkoholt leöntöttük, a DNS mintát hagytuk szobahőmérsékleten megszáradni vagy Speed-Vac-ban szárítottuk, majd megfelelő mennyiségű ultratiszta vízben oldottuk. A DNS koncentrációt az optikai denzitás (OD 260nm ) értékének mérésével 1-2 μg/μl koncentrációjúra állítottuk. Szükséges oldatok: 10x ELB (vörösvérsejt-lízis) puffer(ph 7.4): 1.55 M NH 4 Cl, 0.10 M KHCO 3, 0.01 M EDTA. 3x fehérvérsejt-lízis puffer: 1,8% DTT /dithiotreitol); 6,0 % SDS; 30,0 mm Tris-HCl; 30,0 mm EDTA; 300,0 mm NaCl (tárolás: -20ºC-on) 10x PBS: 2,70 mm KCl; 137,0 mm NaCl; 1,50 mm KH 2 PO 4 ; 7,75 mm Na 2 HPO 4 Proteináz-K enzim oldat: - Proteinase K 10 mg/ml (tárolás -20 C -on) Lahiri-Nurnberger -módszer [59] Az alvadásgátolt (400 μl, 0,5 M Na 4 -EDTA 6-8ml mintához) vérmintát "TKM-1 puffer" (5 ml), Nonidet P40 (125 μl) hozzáadása és rövid keverés után centrifugáltuk (10 perc, 2000 rpm). Az enyhén opálossá váló oldatot "TKM-1"-ben (5 ml) átmostuk, centrifugáltuk (10 perc 2000 rpm). Az üledéket "TKM-2 puffer" ben (800 μl) reszuszpendáltuk, 10 %-os SDS-ben (50 μl) keveréssel inkubáltuk (10 perc 55 o C). NaCl (300 μl, 6 N, 4 C) hozzáadásával erősen összeráztuk, centrifugáltuk (10 perc, rpm). A felülúszó DNS tartalmát azonos mennyiségű propanollal kicsaptuk. Centrifugálás (4 C, 10 perc, rpm) után a csapadékot etanolban (1.0 ml, 70%-os, -20 C) mostuk, centrifugáltuk (2 perc, rpm). Az alkohol leöntése után a DNS mintát Speed-Vac-ban szárítottuk, majd megfelelő mennyiségű (kb μl) ultratiszta vízben oldottuk. Szükséges oldatok: 21

22 TKM 1 (ph 7,6): 10mM Tris HCl (ph 7,6); 10mM KCl; 10mM MgCl 2 ; 2mM Na 4 EDTA. TKM 2 (ph 7,6): 10mM Tris HCl (ph 7,6); 10mM KCl; 10mM MgCl 2,; 2mM Na 4 EDTA; 400 mm NaCl. A Laihri-Nurnberger -módszert 50 buffy coat minta DNS tartalmának izolálásában használtuk; a maradék 11-et kisózásos módszerrel dolgoztuk fel. A citráttal alvadásgátolt vérminták feldolgozása kizárólag kisózásos módszerrel történt. Az izolált DNS mintákat 4 C -on (néhány hétig) illetve -20 C -on (néhány hónapig) tároltuk. Az izolált DNS minőségének ellenőrzése Az izolált DNS oldatának kb. 5%-át hozam (yield-) gélen (0.7%-os agaróz gél) vizsgáltuk. A jó minőségű, nagy molekulasúlyú DNS a felvitel helyéhez közel marad, kissé elhúzódva a pozitív sarok felé. Homogén szerkezetében sávok nem láthatók A DNS-oldat koncentrációjának és tisztaságának meghatározása optikai denzitásméréssel A spektrofotometriás koncentrációmérés előtt a DNS-mintákat 37 C-os vízfürdőben homogenizáltuk (60 perc), és 1:20 hígításokat készítettünk (15 μl oldat 285 μl desztillált vízzel). Az OD 260 értéket a hígítási faktorral (20), valamint a 260 nm egy egységének 1 ml ében az 50 μg DNS-t jelző, mennyiségi értékével (50) szorozva (= OD 260 x 1000) az oldat koncentrációját (μg/ml) kapjuk. Megfelelő minőségű preparátum esetében a két hullámhossz (A 260 / A 280 ) mérési értékhányadosa: Ha a DNS és fehérje aránya 50-50%, a hányados értéke:1, Alkalmazott módszerek VNTR-alapú restrikciós fragmenshossz polimorfizmus vizsgálata hibridizációs "assay" módszerrel A "Lifecodes OUICK-LIGHT Paternity Identity Kit" protokoll általunk kidolgozott módosításaival. Emésztés restrikciós enzimmel 22

23 A DNS-minták emésztéséhez Providencia stuartii baktériumból izolált Pst I restrikciós enzimet alkalmaztunk, mely enzim a rá specifikus hasítóhelyen a genomiális DNS-t 4096 bp (4 6 ) méretű, ragadós végű fragmensekre vágja. Az enzim hasítóhelyének palindrom mintázata: CTGCAG. Az emésztés végrehajtására szolgáló oldatok összetételét az izolált DNS minták koncentrációját és mennyiségét figyelembevéve állítottuk össze. Emésztendő DNS-minta mennyisége Pst I enzim 10x H puffer BSA (10U/μl) 5 μg DNS emésztése 30μl térfogatban 3 μl 3 μl 0.3 μl 10 μg DNS emésztése 50μl térfogatban 5 μl 5 μl 0.5 μl 20 μg DNS emésztése 100μl térfogatban 10 μl 10 μl 1 μl 2. táblázat: A restrikciós enzimmel végrehajtott emésztés kondíciói A 37 C-os vízfűrdőben egy éjszakán át folytatott emésztést kelátképző (12.5 mm) EDTA hozzáadásával, vagy fagyasztóba (-20 C) helyezéssel állítottuk le. Az emésztettséget 1x TAE-val készült 0.7%-os agarózon ellenőriztük, amelybe dermedés (60 C) előtt μl ethidium-bromidot (Sigma, 5 mg/ml) pipettáztunk. A minták (12 μl térfogatban: 5 μl emésztett DNS, 4 μl 2x loading -puffer, 3 μl ultratiszta vízzel kiegészítve), az emésztettségi-kontroll és a PstI teszt gél standard (10-10 μl) futtatása V/cm feszültséggel, 45 percig történt. Értékelés Az enzimaktivitásra az emésztési kontroll (DNS-t tartalom: 500 ng) utalt; az emésztettség megítélését a Pst teszt-gél standard mutatta (fluoreszcens intenzitása 500 ng - 1 μg mennyiségű, emésztett DNS mennyiségének felel meg). A fragmensek méret szerinti szétválasztása: Gélkészítés: Üveglapot (16x20 cm) szalaggal (1.8 cm, 3M autoclave-type) ragasztottunk körbe, amelybe 1x TAE-val készült 0.8% agarózt (Sigma A 9539, RRO ; 36 C, vagy Sigma A-6877, type II medium EEO) öntöttünk. Dermedés (60 o C) előtt a gélbe (300 μl) 23

24 ethidium-bromidot kevertünk. [Fésűk (20 minta felviteléhez) 13x6x3 mm/fog, 12 mintához: 11x7x1mm/fog]. A minták (45μl térfogatban: 35 μl emésztett DNS, 7 μl 6x-loading -puffer, ultratiszta vízzel kiegészítve) mellé (10-10 μl) Combination -, Visual -, továbbá (20 μl) Sizing -standardot is felvittünk a gélre futtatáshoz. Az elektroforézis 1,6 V/cm feszültséggel 16 órán át történt. Oldatok: 6x loading puffer: 15 % Ficoll (Type 400), 0.25 % bromofenolkék, 0.25 % xylenecyanol FF 10 x TAE ph 8.0 (2000ml): 96.8 g Tris, 8.2g bórsav, 7.44g EDTA A DNS fragmensek szilárd hordozón rögzítése: Az emésztés során képződött és az agaróz gélelektroforézissel szétválasztott fragmenseket alkalmassá kell tenni szilárd hordozóra történő replika-készítéshez. Az első lépésben depurinálás (10 perc, 1.5 N, HCl) történt, utána a gélt desztillált vízben leöblítettük. Következett a denaturálás (30 perc 1.5 M NaCl és 0.5 M NaOH oldatban), majd ismét desztillált vízben öblítettük. Az eljárást neutralizálással (30 perc, 1.5M NaCl, 0.5 M Tris és M EDTA tartalmú oldatban, ph 7.5) fejeztük be. A kapilláris transzferálás (Southern 1975): A 20 x SSC-t (500 ml) tartalmazó tálcára üveglapot (21x29 cm) helyeztünk. Erre 2db - végeivel a tálcába lógó-, előzőleg 20 x SSC-ben megnedvesített szűrőpapír-"híd" (18 x 32cm) került. A felső oldalával lefelé fordított, 20 x SSC-vel locsolt gélre 3 x SSC-be áztatott nylon-membránt (Hybond -N+ nylon, Amersham Life Science) és 3 db szűrőpapírt (15x18 cm) simítottunk. Az egészet folpack fóliával borítottuk, amely gél feletti négy oldalán hármat bemetszve ablakocskát nyitottunk a negyedik oldalra visszahajtva. Erre kerültek a pontosan illesztett, méretre hajtogatott papírtörölköző lapok, majd egy üveglap, amelyre nehezékeket tettünk. (Végeztünk transzferálást vákuum-rendszerrel is: a nylon membránt a tálca porózus lemezére simított, 20 x SSC-ben nedvesített, Whatman szűrőpapírra borítottuk. Vékony gumimaszkkal fedtük, amelybe előzőleg az agaróz-gél méreténél kisebb ablakot vágtunk; peremfedéllel leszorítottuk. A gélre-gumimaszkra folyamatosan csorgatott 20 x 24

25 SSC a tálca alján levő szívó-csonkon jelentkező vákuumhatásra szívódik a tálcába, és magával viszi a DNS fragmenseket a membránra). A DNS fragmensek membránra kötése: a membrán hőkezelésével (szűrőpapírok között, vákuum kemencében 60 perc, 80 C kp/cm 2 ) majd UV fénnyel (kb. 10 perc, 254 nm, 15 cm-ről kb W/cm 2 ). A membránokat zárt műanyag-tasakban, 4 C -on tároltuk. Oldatok, szükséges anyagok: 20x SSC (standard saline citrate): 3 M NaCl, 0.3 M Na-citrát (ph 7.0) Szűrőpapírok : (transzferáláshoz) Whatman 3 MM (cat. No ), (szárításhoz) Macherey-Nagel (MN) 813 A hibridizálás Alkalmazott próbák: A restrikciós enzimmel emésztett genomban az SLI 1335 próbával (NICE Paternity Probe) a D1 S339 polimorf VNTR-t, az SLI 1090 próbával (NICE Paternity Probe) a D6 S132 polimorf VNTR-t lehet kimutatni (NICE -Cellmark Diagn., Abingdon, UK- Chemiluminescent Probes, Lifecodes Corp.Stamford, USA). ( D1 S339(CEB3): az 1. kromoszóma rövid karján (1p36) található, központi szekvenciája 33 bázis hosszúságú (dr. Ivan Balázs személyes közlése). D6 S132 (CEB8): a 6. kromoszóma hosszú karján (6q27) található, központi szekvenciája 33 bázis hosszúságú (dr. Ivan Balázs és dr. Gilles Vergnaud [60] személyes közlése) A K 562 sejtvonal sávtartománya, Pst I restrikciós enzimmel emésztve a D6 S132 lókuszban: kb; Hae III enzimmel a D1 S132 lókuszban: kb (mindkettőnél ± 1.8%). Detektálás A kötődött, alkalikus foszfatázzal jelzett próbák detektálása Lumi-Phos 480 (Lumigen Inc., Southfield, Michigan U.S.A.) vagy CDP Star (Tropix Inc, Bedford, USA) kemiluminescens szubsztrátokkal történt. ([email protected], [email protected]). A módszer végrehajtásának megkezdése előtt a hibridizáló-, mosó I- és II-oldatokat 55 C-on 65 percig (rázó vízfürdőben) előmelegítettük. 25

26 A hibridizáló hengerbe hajtogatott membrán mosó II oldattal való inkubálása (10 perc 20 C-on) után a gyártó által javasolt mennyiségű próba-oldatot (1 μl/ml hibridizáló oldat) pipettáztunk az előmelegített hibridizáló oldatba, és a hibridizálást 55 C-on, 20 percig végeztük hibridizáló szekrényben. Az eredeti leírást módosítva a membránt mosó I és - II oldatokkal (2x10 perc ill. 2x20 perc 55 C), majd 1 x Quick-Light pufferrel öblítettük le (6x 20 C-on). Kemilumineszcens detektálás Lumi-Phos 480 szubsztráttal, valamint CDP Star szubsztráttal végrehajtott folyamat megegyezik a HLA-C lókusz vizsgálatában leírtakkal. A membránokat (néhány hétig) zárt műanyag fóliában 4 C-on tároltuk. Rehibridizálás Hosszabb tárolás előtt a membránról eltávolítottuk az előző hibridizálás reagenseit, s vagy megszárítva 4 C -on tároltuk, vagy újabb hibridizálásnak (rehibridizálás) vetettük alá. Amennyiben az alkalmazott szubsztrát a Lumi-Phos 480 volt, az előző hibridizálás reagensei forró mosó II oldattal távolíthatók el (65 C, 30 perc), majd a már említett hibridizálással folytatható. A CDP Star szubsztrát esetén a membránt 0.1 %-os SDSben kell öblíteni (15 perc, 80 C), majd az ezt követő hibridizálásig 1 x SSC-ben kell áztatni HLA-A2 szubtipizálás PCR-ARMS módszerrel [vö. Irodalmi áttekintés] A normál primer a mutáns templáthoz nem kötődik, PCR-termék nem képződik. A HLA-A2 allél szekvencia-specifikus felszaporítása két egymást követő PCR reakciólépéssel történik. Az elsőben alkalmazott 4 primerkeverék lehetővé teszi az identifikálás első lépését: a felszaporított 813 bp méretű DNS szakasz tartalmazza az összes HLA-A2 allél 2. és 3. exonját. Tekintettel azonban arra, hogy kevés HLA-A2 allél tartalmaz különleges szekvencia-motívumokat, a következő PCR reakció során az előző reakció terméke szolgál templátként. Az egymáshoz nagyon hasonló szubtípusok azonosítása a második, ún. 26

27 "nested" PCR-reakció során alkalmazott 19 szekvencia specifikus primerkeverékkel (SSP) lehetséges. [61, 62, 63, 64, 65, 66, 67]. Kizárható a többi HLA-I osztályú allél szekvencia-motívumainak zavaró jelenléte és lehetőség nyílik az egymáshoz nagyon hasonló szubtípusok azonosítására 1) PCR reakció Az első PCR reakciókhoz 8-8 μl 33A, 34A, 35A, 36A primerkeveréket mértünk be vizsgálati mintánként a PCR csövekbe. A minták párolgását 20 μl paraffinolajjal akadályoztuk meg. Az alábbi keverékből minden csőbe 13 μl-t tettünk: 19.5 μl (dd) H 2 O, 0.75 μl (=150ng) DNS-minta, 7.5 U (1.5 μl) Taq-polimeráz enzim 39 μl TDMH (A2-PCR-mixkeverék). (Az I. reakcióhoz szükséges reakcióelegy összetétele: 494 μl 10x PCR puffer (670mM Tris, 166 mm ammóniumszulfát, 1% Tween 20), 35 μl dntp keverék (25 mm), 395 μl MgCl 2 (25 mm),, 976 μl dd H 2 O (össztérfogat: 1900 μl).) Az első négy PCR-reakció ciklusainak a paramétereit a 3. sz. táblázatban közöljük. A PCR reakciók termékeit agarózgél-elektroforézissel (1.5-2 %-os, 1x TBE pufferrel) mutattuk ki, párhuzamosan futtatva a bázispár felbontású molekulasúlymarkerral. (10μl termékhez 3μl Orange G-festék vagy "2x-loading" puffert adagoltunk). A 256 bp méretű belső kontroll (az emberi növekedési hormont kódoló génszakaszból) a PCR ciklusok hatékonyságát jelzi. Paraméterek Ciklus szám o C Perc perc mp mp Szükséges reagensek: mp Orange G festék: 0.5 % Orange G, 20 % mp Ficoll, 100 mm EDTA (futási sebessége mp eltér a PCR-termékekétől) mp 2 x loading puffer: 250 μl glicerin, 50 μl perc krezolvörös, 700 μl (dd) víz 3. táblázat: Az 1. PCR-ciklusok paraméterei 27

28 "Nested" (2.) PCR-SSP reakciók PCR-ciklusok: Paraméterek Ciklus szám o C Perc perc mp mp mp mp mp mp mp perc 72 1 perc perc Az előző sorozat 33A jelű PCR-termékeiből 10 μl-t 100-szorosra higítottunk, majd ebből a higított termékből, mint templátból a következő - második PCR reakció reakcióelegyéhez 7,5 μl-t mértünk. A további 19 reakcióhoz μl specifikus primerkeverékeket mértünk be mintánként a PCR csövekbe. A zavaró párolgás gátlása érdekében 20 μl paraffinolajjal fedtük a reakcióelegyet. Az alábbi keverékből 8 μl-t mérünk minden csőbe (49 μl (dd) H 2 O, 7.5 μl (100x) DNSminta) 2.7 μl Taq-polimeráz, 93 μl TDMH=A2-keverék). 4. táblázat: A 2. ("nested") PCR -ciklusok paraméterei A PCR termék ellenőrzése: agarózgélen (ld. az 1. PCR reakció után). A PCR-ciklusokat Perkin-Elmer 9600 thermocyclerben végeztük. A reakcióelegyekhez vékony falú 0.2 ml PCR csöveket használtunk. Értékelés: A PCR reakciók termékeit 2% agarózgélen futtattuk. Az adott specifikus pozitív reakciók mintázata alapján adható meg a vizsgált minta HLA-A2* szubtípusa. 28

29 A HLA-A*0201 szubtípus I. PCR reakciók M 11 34A 35A 36A M 01A 02A 03A 04A 05A 06A 07A 08A09A10A11A12A13A 14A 15A 16A 17A 18A 19A M II. PCR reakciók 2. sz. ábra: Az 1.és 2. PCR-reakciók termékei az A*0201 szubtípus esetében (M.: molekulasúly-marker; a további adatok az alkalmazott primereket jelölik) A HLA-C-lókusz polimorfizmus-vizsgálata PCR-SSO technikával A vizsgálatot az eredeti Quick-Type (Lifecodes Corp.) használati utasításainak általunk kidolgozott módosításaival hajtottuk végre. Amplifikáció Végrehajtása 50μl végtérfogatban történt, amely 2,5-2.5 µl C 1 és C 2 primert, ng μg/μl koncentrációjú DNS-t, valamint 2.5 unit Dupl-A-Taq Taq DNS- 29

30 polimeráz enzimet (5U/μl) és PCR-keveréket (5 μl 10xPCR puffer, 5 μl, 2,5mM a négy dntp-ből) tartalmazott. A PCR ciklusok: kezdő denaturáció 60mp, 96 o C, majd 32 ciklusban 30mp 95 o C, 60mp 65 o C anneláció, 180mp 72 C extenzió, végül 10 perces extenzió 72 o C-on. A PCR-termék ellenőrzése 2% agarózgél-elektroforézissel történt. A sikeres reakciót a 904 bp (ún. "house-keeping" génszakaszból) méretű termék jelenléte igazolja. Szilárd hordozóra rögzítés (replika-készítés) Nylon membránra (Hybond -N+) az amplifikált mintákat - 12x8 mintázatban, több sorozatban - az alábbi módon rögzítettük: A 10 x SSC-ben nedvesített, majd szobahőmérsékleten szárított membránokra (120-80mm) 96db, 2-4 μl amplifikált mintát szárítottunk. A membránokat denaturáló, membrán-öblítő oldatban, majd 2 x SSC-ben öblítettük és szárítottuk (RT). A DNS fragmentek membránra kötése vakuum kemencében történt: 60 perc, 80 C, kp/cm 2. Utána felső megvilágítású UV fénnyel (254 nm) kezeltük (10 perc, W/cm 2 ). Tárolás: nylon-tasakba zártan, 4 C-on. Hibridizálás A membránokat - a gyártó utasításainak módosításaival - 39 db, alkalikus foszfatázzal konjugált SSO-próbával (a gyártó által mellékelt oldatokkal) hibridizáltuk. Az eljárást kétféle módon végeztük: A 12x8 db mintát tartalmazó membránokat 12 db, egyenként 8 db mintát tartalmazó csíkra vágtuk, majd 2 ml 2 x SSC-ben áztattuk (RT, 5 perc). Ezt leöntve a membráncsíkokat 2 ml, 2 μl - a 39 db próba valamelyikét tartalmazó - előmelegített (45 C) hibridizáló-oldatban hibridizáltuk (30 perc, 45 C). Utána a csíkokat (2 ml) 2 x SSC-ben leöblítettük (5 perc, RT), majd (2-3 ml) előmelegített TMAC-ban (60 C, 30 perc) mostuk. Végül a csíkocskák (2 ml) 2 x SSC-ben (5perc, RT), majd 1 x QIUCK-LIGHT pufferban (4-6 x 20 ml, 1-1 perc) történő áztatása következett. A fenti eljárást a membránok csíkokra vágása nélkül, megfelelő mennyiségű oldatokban végeztük el. Kemilumineszcens detektálás (Lumi-Phos 480, illetve CDP-Star szubsztrátokkal). Az előhívó fóliára helyezett membránt applikátorral Lumi-Phos 480-al permeteztük. 30

31 A membránokat először CDP-Star -assay pufferben (RT, 10 perc), majd CDP-Star - koncentrátum 1:100 higítását tartalmazó CDP-Star -assay pufferben inkubáltuk (RT, 5perc). A membránokat ún. előhívó fóliába zártuk, majd filmkazettába helyezett röntgenfilmre (DuPont Cronex 4 (medical X-ray film) helyeztük. Az expozíció a Lumi-Phos 480 esetén perc, a CDP-Star esetén perc volt. Az értékelést táblázat segítségével végeztük. Rehibridizálás (újra-hibridizálás) Lumi-Phos 480 szubsztrát esetén: A membránokat előmelegített mosó I oldatban 45 percig 65 C -on kell öblíteni, majd az eljárás hibridizálással folytatódhat. CDP-Star szubsztrát esetén: hibridizálás előtt a membránokat 0,1 % SDS-ben mozgatva (15 perc 80 C) -, majd 1 x SSC-ben kell öblíteni. Az eljárás hibridizálással folytatódhat. Szükséges oldatok, reagensek: 1 x TBE (Tris-borát puffer) ph 8.0: 89 mm Tris- HCl, 89 mm bórsav, 2 mm EDTA (ph 8 ) Denaturáló oldat: 0.5 M NaCl, 0.5 M NaOH Membrán-mosó oldat: 0.5 M NaCl, 0.5 M Tris (ph 7,4) CDP-Star assay puffer ( ph 9,5): 10 ml / l MgCl 2 (0.1M), 10.5 ml / l Dietanolamin (98%) TMAC mosó-oldat: 3 M TMAC, 0.1 % SDS Származás-megállapítási ügyekben alkalmazott PCR-vizsgálatok A vizsgálatokhoz a beteg kivizsgáláshoz beállított és használt teljes módszerrepertoárból a legalkalmasabbat választottuk ki, az adott esetben leginformatívabb allél vizsgálatára. A HLA-Cw* allélek kimutatása PCR - SSO módszerrel, a HLA-II osztályú antigének meghatározása PCR - SSP illetve, PCR - reverz dot blot módszerrel történt [68]. Egyéb, nem MHC-polimorfizmus vizsgálat keretében három STR-lókusz detektálása történt: SE 33 (ACTBP2), FGA és vwa. 31

32 TAP1 és TAP2 polimorfizmusok kimutatása (A TAP1 és TAP2 fehérjéket kódoló régió polimorfizmusát elsőként Powis és mtsai (1992) és Colonna és mtsai (1992) vizsgálták. A bevezetésre szánt, kísérleti stádiumban levő módszer - PCR-ARMS - a 12 IHSW [69] keretében került kipróbálásra. Tipizálási módszer Az ARMS technika bármely ismert mutáció/polimorfizmus gyors genotipizálását lehetővé teszi. Alapja, hogy adott paraméterek mellett csak a 3 -vég nukleotidjaiban eltérő primerek nem eredményeznek PCR amplifikációt. Minden PCR reakcióelegyben 4 oligonukleotid - primer - van, melyek közül kettőnek ("sense" és "anti-sense") 3'-vég nukleotidja komplementer a tipizálandó allélekben található dimorf nukleotid egyikével. További 1-1 nukleotidos eltéréseket terveztek mindkét oligonukleotidba a 3'-végtől a specifitás növelésére. A két másik oligonukleotid (egy "sense" és egy "anti-sense") komplementer a dimorf nukleotid két oldalától asszimetrikus távolságra elhelyezkedő szomszédos szekvenciákkal. A PCR reakció egy konstans kontroll terméket eredményez az egy vagy két specifikus termék mellett attól függően, hogy a vizsgált személy homo- vagy heterozigóta (3.sz. ábra). A DNS mintákat (0.4-1,0 μg) 100μl térfogatban amplifikáltuk (0,25-1,0 μg mindegyik oligonukleotid primerből, 200mM dntps, 1x Taq DNS polimeráz puffer és 2U Taq DNS polimeráz enzim). A párolgás megakadályozására, a reakcióelegy felszínére paraffinolajat rétegeztünk. PCR-ciklusok: Ciklus szám Paraméterek o C Perc / / táblázat: A TAP polimorfizmusok vizsgálatai során alkalmazott PCR-ciklusok paraméterei 32

33 PCR-termék azonosítása agarózgél-elektroforézissel (1.5-2,0 %-os, 1x TBE pufferrel), párhuzamosan, bázispár felbontású (5μl) molekulasúly-markerral (φx-174 RF DNA, Hae III digest) futtatva (10μl termékhez 3μl Orange G-festéket vagy "2xloading" puffert alkalmaztunk). A TAP I/1 és I/2 valamint a TAP II/1,-2,-3 allélekkel 50 DNS-mintát vizsgáltunk. A TAP I/1 allél 533 bp méretű kontrollja és a két 351 bp és 241 bp méretű fragmensei 10 esetben, a TAP II/1 allél 427 bp méretű kontrollja és a két 328 bp és 158 bp méretű fragmensei 49 esetben detektálhatók voltak, a minták homozigóta vagy heterozigóta voltától függően. A "workshop- reagens" használatával a vizsgálat-sorozatban résztvevő laboratóriumok túlnyomó többsége nem kapott eredményeket, ezért a vizsgálati rendszer felülvizsgálata vált szükségessé. Ennek a polimorfizmusnak a vizsgálatára ismételt primerszintézis, és/vagy a szekvencia ellenőrzés szükséges. Polimorf helyek Kontroll (bp) 1. reakció 2. reakció TAP1/I (Pozíció: 333) 533 Ile (333) 241 Val (333) C TAP1/II (Pozíció: 637) 429 Asp (637) 307 Gly (637) C TAP2/I (Pozíció: 379) 58 0 C 427 Val (379) 328 Ile (379) 158 TAP2/II (Pozíció: 565) 400 Thr (565) 161 Ala (565) C TAP2/III(Pozíció:665) 58 0 C 408 Thr (665) 141 Ala (665) táblázat: A DNS-alapú vizsglatok reakciói és a vizsgálható polimorfizmusok 158 bp 328 bp 427 bp Kontrol sz. ábra: A TAP 2/1 polimorfizmusok agaróz-elektroforézis felvétele 33

34 4.4. Statisztikai számítások A VNTR-alapú RFLP vizsgálatok eredményeinek statisztikai értékelése Az általunk alkalmazott - egylókuszos - VNTR-analízis során az egyének két kópiában lévő, eltérő magszekvencia számú fragmens-sávokkal (a továbbiakban: sáv) különböztethetők meg. A sávmintázat - molekulasúly marker segítségével - méretbecsléssel kapott eredményei közvetlenül használhatók a statisztikai számításokhoz [70, 71]. A fragmensek folytonos eloszlású adatait - 31 db mérettartományba (ún. bin) sorolva - diszkrét eloszlású adatokká alakíthatjuk. A fragmens-mérettartományok a "bin"-ek, az eljárás a "binelés"; az általunk alkalmazott módszer az ún. "fixed bin" eljárás [72] (A binelés a statisztikai analízis pontosabbá tételére szolgáló módszer: a becsült fragmensméret egy állandó -"fixed"-, vagy egy rugalmasan képzett -"floating"- biztonsági ablakocskába, "bin"-kategegóriába kerül) [73, 74]. Az egyén két sávját befogadó binek a továbbiakban az egyén adott VNTR-lókuszra vonatkozó "genotípusát" ("binotípusát", Weir 1992.) jelenti [75]. Az adott VNTR-profil gyakorisági értékei akkor elfogadhatóak, ha megfelelő bin értékekkel kerülnek összehasonlításra: ehhez nélkülözhetetlenek a populációgenetikai felmérések. A binelés során nem végeztük el a korrekciós ún. re-binelést. (Ezen eljárással az egyes fragmensek binkategóriája pontosan meghatározható akkor is, ha a fragmens mérete két bin határ-régiójára esik). A D1 S339 és a D6 S132 lókuszok folytonos eloszlású (nem binelt) és diszkrét eloszlású (binelt) adataival értékeltük a vizsgált populációban tapasztalt allélgyakoriságokat, a populációban tapasztalható heterozigótaság mértékét, Hardy-Weinberg egyensúlyát, valamint kapcsoltságukat más lókuszokkal [76]. A hazai és a kettő, az U.S.A.-ból származó adatbázis homogenitásának statisztikai öszszehasonlítása chi-négyzet (χ 2 ) próbával történt, "RxC" programmal számolt, számítógépre kidolgozott ún. "2-utas RxC kontingencia-táblázat" teszttel A populációgenetikai számításokkal kapcsolatos fogalmak (a) Polimorfizmus és heterozigótaság [77, 78] 34

35 Amennyiben a lókusz összes ismert alléljának gyakorisága kisebb 99%-nál, vagyis bármelyiket elhagyva, az összes többi allélgyakoriság 1%, a lókuszt polimorfnak mondjuk (vö ). A heterozigótaság az egyes lókuszok (pl. A, B, C stb.) heterozigócia értékeinek átlaga. összege és a vizsgált lókuszok száma segítségével számolhatunk. H= (1/n) x (H A + H B + H C +.H n ). (b) Hardy-Weinberg egyensúly [79, 80] A minta allélgyakorisági értékei alapján következtethetünk a populációs genotípusgyakoriságokra. A vizsgálat nullhipotézisében feltételezzük, hogy a vizsgált populáció lókuszai Hardy-Weinberg egyensúlyban vannak. (c) Linkage disequilibrium [81, 82, 83] Két különböző lókusz alléljait linkage equilibriumban levőnek mondjuk, ha statisztikailag függetlenek egymástól. Előfordulhat, hogy a populációban megfigyelt haplotípusgyakoriságok szignifikánsan eltérnek az elméletileg várt haplotípus-gyakoriságoktól, amely a kapcsoltsági egyensúly felbomlásának (linkage disequilibrium) a következménye. Hipotézis-vizsgálatokban nullhipotézisként a lókuszok egyensúlyát - vagyis a linkage disequilibrium hiányát -feltételezzük. (d) Khi-négyzet próba (χ 2 -próba) Eloszlások összehasonlítására szolgáló szignifikancia vizsgálati módszer. A függetlenségi vizsgálatokban arra keressük a választ, hogy a két vizsgált populációban a lókuszok (abszolút) allélgyakoriságai eltérnek-e egymástól, az illeszkedés vizsgálatban pedig arra, hogy a tapasztalt genotípus-gyakoriságok megfelelnek-e előre ismert (elméleti) genotípus-gyakoriságoknak. χ 2 = Σ [(T-E) 2 / E], ahol a T = a mért, tapasztalt adatok, az E = elméletileg várt érték (e) Hipotézisvizsgálatok A statisztikai következtetéseket nullhipotézis alkalmazásával vontuk le: feltételeztük, hogy az egyes, vizsgált csoportok között nincs összefüggés. A nullhipotézist 5% -os valószínűségi szintnél vetettük el, ekkor az eredmény szignifikáns Az Arlequin populációgenetikai szoftver (Ver ) Az MHC-rendszer és a VNTR-alapú RFLP vizsgálata során kapott eredményeket az Internetről szabadon letölthető Arlequin [84] populációgenetikai szoftver, március 35

36 31-én megjelent verziójával ( dolgoztuk fel Származás-megállapítás, Essen-Möller értékek Az apaság valószínűségének meghatározása során értékelni kell: A gyermeknek - biológiai apjától kapott genetikai információi alapján - milyen szoros a genetikai kapcsolata a vélelmezett férfivel? Mi a valószínűsége annak, hogy a vélelmezett apa a biológiai apa, amennyiben a gyermek alléljei megtalálhatók az anyában és a férfiban is? Ha az apasági vizsgálatban szereplő férfi nem zárható ki, az apaság valószínűségét kell számolni, vagyis azt, hogy a kérdéses populációból (rasszból) véletlenszerűen választott férfi genotípusa milyen eséllyel különbözik az adott személyétől. A valószínűségi értéknek el kell érnie, vagy ahol lehetséges - meg kell haladnia a 95 %-ot. Ennek a valószínűségi értéknek a megállapítását a HLA rendszerre kidolgozott formula (W. Mayr és V. Pausch 1972) [85] alapján végeztük el, amely eredménye az ún. Essen- Möller érték és a valószínûségi százalék. A számítás az adott populációra jellemző haplotípus-gyakoriságokra épül. A számítás során a vélt apa fenotípusából kombinálható valamennyi genotípust figyelembe kell venni és összehasonlítani a kérdéses anya-gyermek konstellációnak megfelelő, hasonló szerológiai reakciómintázattal rendelkezõ "valódi apákkal", továbbá a populációban előforduló nem apákkal. Végül a HLA rendszer alapján számolt Essen- Möller értékek összesítése történik a vércsoport és szérumfehérje stb. rendszer Essen-Möller értékeinek figyelembevételével. A tévesen vádolt férfiak kizárási esélye 96%-ról 99,9%-ra emelhető: ezzel 1000 tévesen vádolt férfiból 999 biztosan kizárható. Az Essen- Möller értékekből kalkulált különböző valószínűségi kategóriák: <95% : valószínűségi vélemény nem adható ; %: valószínű ; %: igen nagy fokban valószínű ; %: gyakorlatilag bizonyított. Essen-Möller számítások: A lg Y/X+10 adatai: 36

37 Az "Y érték": a vélelmezett apák nem-apák -közötti gyakorisága. Mindazon haplotípus-variációk, amelyek felírhatók a lehetséges apáknál és a nem-lehetséges apáknál (értéke azonos a genotípus-frekvenciával). Az "X érték": az anya-gyermek-vélelmezett apa haplotípus-konstelláció (MKP v K), valamint az anya-gyermek haplotípus-konstelláció (MKK) adott populációban meglevő haplotípus-frekvencia adatainak a hányadosa. Az MKK összes lehetséges genotípus-variációinak felírása után, a vélelmezett apa (P v ) gyakoriságát kell számolni az igazi apák között. A genotípusosan lehetséges MKP v K-t határozzuk meg, értéke tehát a "vélelmezett apa", "lehetséges apák" közötti gyakoriságát adja meg. A rekombinációt nem vettük figyelembe. A hiányzó (blank) allélt x -el jelöltük. 37

38 5. Eredmények 5.1. A VNTR lókuszok vizsgálatának eredményei A két VNTR lókusz vizsgálata során kapott fragmensek és azok allél gyakorisági értékeit a 7. sz. táblázat tartalmazza. (A további számításokhoz, a saját eredményeink mellett, felhasználtuk a minták - az Országos Vérellátó Szolgálat a debreceni és a pécsi Regionális Központjainak a laboratóriumaiban készült - szerológiai módszerekkel kapott HLA-adatait is.). Allél gyakoriság Fragmens (bp) D6 S132 lókusz D1 S339 lókusz táblázat: A két, D6S132 és D1S339 VNTR-lókusz, elektroforézis során kapott sávjai (allélok), valamint azok allélgyakorisági értékei. 38

39 A 8. táblázatban a nagyobb gyakorisággal jelentkező sávok láthatók. A D6S132 esetében a 10% feletti értékek a 3034 bp és a 4821 bp közötti régió: itt található a sávok közel 70%-a. A további három-három binkategória, 2352 bp és a 6368 bp közötti szakaszok a fragmensek több, mint 90 %-át magukba foglalják. Bin D6 S132 (n:188) D1 S339 (n: 186) Sorszám kategória (bp) sáv(db) % sáv (db) % táblázat: Binkategóriák és a két lókusz sávjainak eloszlása az egyes binkategóriákban 39

40 A D1S132 lókusz esetében hat kategória (2089 és 3329 bp között) tartalmazza a fragmensek közel 53%-t. Összesen tizennégy binkategóriában találtuk a sávok 80%-át. A D6 S132 lókuszban a leggyakoribb sávok nagyobb fragmens-méretűek és szűkebb mérettartományban, mint a D1S339 lókuszban Populációgenetikai tesztek Hardy-Weinberg egyensúlyi teszt A nullhipotézisben feltételezzük, hogy a vizsgált lókuszok Hardy-Weinberg egyensúlyban vannak. (Amennyiben a populáció Hardy-Weinberg egyensúlyban van, a megfigyelt allélgyakoriságok ismeretében megadható a genotípus várható gyakorisága). Ha a P-érték kisebb 0.05-nél (5% szignifikancia-szint), kijelenthetjük, hogy az eltérést nem okozhatta véletlen (elvethető a nullhipotézis). A HLA-DR és a D6S132 lókuszok -számításaink szerint- nincsenek Hardy-Weinberg egyensúlyban. A heterozigóták mért (observed) és az elméletileg várt (expected) értékeiből homozigóta túlsúlyra következtethetünk. E jelenséget okozhatja mintavételi hiba, s eltérések forrása lehet az alkalmazott módszer is. Azok a minták, amelyekben csak egyetlen allélt sikerült meghatározni - SBP (single-band pattern) -, lehetnek valódi homozigóták, vagy heterozigóták, egyetlen meghatározott alléllal. heterozigóták HLA genotípus megfigyelt (observed) várt (expected.) P-érték gén/lókusz binelt nem binelt HLA-A HLA-B HLA-DR binelt nem binelt binelt nem binelt binelt nem binelt binelt nem binelt D6 S D1 S

41 9. táblázat: A HLA lókuszok és a VNTR lókuszok P- értékei (Magyarázat: bin = bineléssel számolt adatok, nem-binelt = binelés nélkül számolt adatok ) Kapcsoltsági (linkage disequilibrium) teszt A vizsgált mintaszám (n): D6 S132 lókusz n = 94, D1 S339 lókusz n = 93. A vizsgált lókuszok száma: 5 (HLA-A, -B, -DR; D6 S132, D1 S339) Nullhipotézis: az egyes lókuszok között nincs kapcsoltság, a lókuszok egyensúlyban (linkage equilibrium) vannak. bineléssel binelés nélkül lókuszok HLA-A HLA-B HLA-DR D6 S132 D1 S339 HLA-A HLA-B HLA-DR D6 S132 D1 S339 HLA-A HLA-B HLA-DR D6 S D1 S táblázat: Az egyes lókuszok közötti kapcsoltságok áttekintő táblázata (Az egyes lókuszok közötti kapcsoltságokat "+"-szal jelöltük). A (11. táblázat) HLA -A és -B, a HLA-A és- DR, valamint a HLA-B és -DR lókuszok alléljai közötti kapcsoltságot statisztikailag igazoltuk: egzakt P-érték < 0.05-nél. A két VNTR lókusz populációban jelentkező kapcsoltságait azok binelt és nem-binelt adataival számoltuk. Jóllehet a binelt adatok esetében a HLA-A és D6 S132 lókuszok között kapcsoltsági viszony jelentkezik, figyelembe kell venni, hogy a teszt a két lókusz Hardy-Weinberg egyensúlyát feltételezi, amely feltétel viszont a D6S132 lókusz esetében nem teljesült. A többi lókusznál nem vethető el a nullhipotézis: a linkage disequilibrium nem igazolt. 41

42 sorsz. egzakt P érték lókuszpárok bineléssel binelés nélkül 1. HLA-A és -B < HLA-A és -DR < HLA-B és -DR < < HLA-A és D6 S HLA-B és D6 S HLA-DR és D6 S HLA-A és a D1 S HLA-B és a D1 S HLA-DR és a D1 S D6 S132 és a D1 S táblázat: A lókuszpárok egzakt P - értékei A populációs adatbázisok öszehasonlításai A D6S132 lókusz vizsgálatának hazai adatbázisát az U.S.A.-ból származó adatbázisokkal hasonlítottuk össze.(az adatbázisokat dr. Ivan Balázs - Lifecodes - bocsátotta a rendelkezésünkre) A saját mintánkban és az U.S.A.-beli kaukázusiban a 19. és a 21. kategória volt a legnagyobb gyakoriságú. A nagyobb populációs minta azonban érzékelteti az RFLP lókusz rendkívüli polimorfizmusát. Az afro-amerikaiak esetében nincs ilyen kimagasló érték, de a két adatbázis közötti különbségek azonban szembeötlők. A három populációs adatbázis statisztikai összehasonlításakor (12. táblázat) feltételeztük, a hazai normál populációs adatbázis, valamint az összehasonlítandó két populáció adatbázis-párjai megfelelnek egymásnak, nincs közöttük eltérés. (Valójában azonban azt várjuk, hogy a magyarországi minták és az észak -amerikai kaukazoid minták felelnek meg egymásnak). Az eredmények azonban nem haladták meg az 5%-os szignifikancia szintet (a nullhipotézis nem fogadható el). A három adatbázis egymással történt statisztikai összehasonlítása alapján mindegyik populáció eltér a másik kettőtől. 42

43 bin bin Hazai minták kaukázusiak* afro-amerikaiak* sorsz. mérettartomány (n= 94) (n= 614) (n= 182) táblázat: A három populáció összehasonlítása a D6S 312 VNTR-lókusz bin - kategóriáinak tükrében (* U.S.A. adatbázisok) Chi-négyzet (χ 2 ) értékek arra vonatkozóan, hogy az egyes adatbázisok mennyire felelnek meg egymásnak: "Hazai" adatok és kaukázusiak (U.S.A.): P <

44 "Hazai" adatok és afro-amerikaiak: P < kaukázusiak (U.S.A.) és afro-amerikaiak P < Összegezve: A 7. sz. táblázatban bemutattuk a rendkívül polimorf lókuszok általunk detektált alléljeit. Az allélokat osztályokba (bin) sorolva a D6S132 esetében az alléloknak a 70%-a 5 binkategóriában ( bp) található. Ez az intervallum a másik lókusz esetében szélesebb (8. táblázat). A két lókusz közül a D6S132 nem volt Hardy-Weinberg egyensúlyban. Az általunk detektált homozigóta túlsúlyt több tényező okozhatja (9. táblázat). A kapcsoltsági számítások igazolták az irodalmi adatokat a HLA lókuszok esetében, de kapcsoltság mutatkozott a D6S132 (binelt adatok) és a HLA-A lókusz között (10., 11. táblázatok). A hazai adatbázis statisztikailag eltérőnek bizonyult mind a (U.S.A.) kaukázusiaktól, mind az afro-amerikaiaktól (12. táblázat) A két VNTR lókusz öröklődése, családvizsgálatokkal bemutatva Az alábbi sz. táblázatokban követhetők a HLA-haplotípusok és a két VNTR lókusz alléljainak, az egyes családokban követhető öröklődési mintázatai (nem binelt adatok). HLA D6S132 D1S339 családtagok A1 A2 B1 B2 DR1 DR anya (3525) gyermek (3526) apa (3524) táblázat 44

45 HLA D6S132 D1S339 családtagok A1 A2 B1 B2 DR1 DR anya (3588) gyermek (3589) apa ( 3587) táblázat HLA D6S132 D1S339 családtagok A1 A2 B1 B2 DR1 DR anya (3590) gyermek (3591) táblázat HLA D6S132 D1S339 családtagok A1 A2 B1 B2 DR1 DR anya (3672) gyermek (3673) testvér (3674) apa (3671) táblázat HLA D6S132 D1S339 családtagok A1 A2 B1 B2 DR1 DR anya (3708) gyermek (3709) apa (3707) táblázat Jelölés: anyai allélok, apai allélok 45

46 5. 2. A HLA-A2 allél tipizálásának eredményei A tipizáló kit a vizsgálat idején ismert 17 féle HLA-A2 altípus kimutatására volt alkalmas: a lehetséges 145 heterozigóta A*02 kombináció közül 136-ot képes elkülöníteni. (2000-ben már 37 A*02 szekvencia volt ismeretes) [86]. Azon allélok esetében, ahol nem volt kizárható, hogy egy újabban felfedezett allél van jelen, nagyfelbontású PCR- SSP módszerrel validáltuk az eredményt. Az értékelés a 18. táblázat használatával történt: az alléleket az agarózgél-elektroforézis során kapott sáv jelenléte és mérete alapján lehet azonosítani. A választott magyarországi népesség random, egymással rokonságban nem álló 55 tagjának génszintű HLA-A*02 tipizálása során, három allélt mutatunk ki: HLA-A*0201, *0205 és *A0207. A három A*0207 típusúnak mutatkozó mintával végzett ismételt tipizálás (PCR-SSP tipizáló kit) mindhárom esetben A*0201 típust igazoltak. A tipikusan kaukázusi allél, az A*0201 jelentős, 96.7%-os gyakorisága mellett az A*0205 split 3.6 %-ban fordult elő. A 19. táblázatban a HLA-A2 szubtípusok megoszlása látható 6 népcsoportban. Saját eredményeink tükrében a finneknél jelentősen kisebb gyakoriságú az A*0201, magasabb az A*0207. A Szardínia szigetén élőknél meglepően gyakori az A*0205, ami a hazai népességben kevesebb, mint egy nagyságrenddel kisebb értékű [64]. Fragmens (bp) Specificitás 715 A*0201/0204/0207/0209/0211/0215N/0216/ A* A* A*0204/0209/ A*0202/0205/ A*0205/ A*0207/0215N 408 A* A*0206/0210/ A* A* A*0212/ A*0203/ A* minden A*02 kivéve A* A*0205/0206/0208/ A*0201/0202/0204/0207/0209/0211/0212/0215N/0216/ A* A*0205/0206/ táblázat: A HLA-A2tipizálás értékelő táblázata: PCR-termék és a megfelelő szubtípus 46

47 N (%) HLA-A2 Szubtípusok német 1 (n=116) török 1 (n=46) finn 2 (n=25) magyar 2 (n=55) osztrák 2 (n=34) szardíniai 3 (n=44) A* (97) 37 (80,4) 9(36) 51 (93) 32(94,1) 26 (59,1) A* (2.9) 0 A* A* A* (1,7) 5 (10,8) 0 2 (3,6) 0 18 (40,9) A* (2,2) A* (44) 2 (3,6) 0 0 A* A* A* A*0211 1(0,8) 1 (2,2) (2,9) 0 A* A* A* A*0215N A* (8) A* (2,2) sz. táblázat: A HLA-A2 allélek megoszlása a kaukázusi népességben (forrás: 1 IHWS, AHS 2, Society Report 1996., 2 IHWS, AHS 2, Anthropology Regional Report 1996., 3 Carcassi és mtsai, Tissue Antigens 1995.) Az 1995 után vizsgált csontvelő donor-recipiens párok mintáiból minden HLA-A2 alléllal rendelkezőt kivizsgáltunk (a mintákból HLA-Cw* meghatározást is végeztünk). Ennek eredményeként az eddig vizsgált 10 HLA-A2 pozitív donor-recipienspár (a donorok francia és német állampolgárok voltak) vizsgálatai során csak A*0201 allélt mutattunk ki. 47

48 HLA személyek A1 B1 Cw Cw* beteg (S. K.) /04-06/ /08/10-14 donor (francia) /04-06/ /08/ táblázat: A donor-recipiens párok egyező allélokkal HLA Személyek A* Cw beteg (B. P.) donor (német) táblázat: A donor-recipiens párok eltérő HLA-Cw allélokkal (az eltérő allélok vastagon szedve) HLA személyek A* Cw* beteg (F. K.) /11/ donor (német) /11/ táblázat: A donor-recipiens párok egyező HLA-Cw* allélokkal (az eltérő allélok vastagon szedve) Az eredmények összegzéseként elmondható, hogy az általunk vizsgált, a hazai népességet reprezentáló mintában a HLA-A*0201 és a HLA-A*0205 szubtípusokat detektáltuk, összhangban az európai adatokkal. A csontvelő donor-recipiens párokat folyamatosan vizsgáltuk (néhány példa: táblázatok), eddig HLA-A*0201 szubtípust azonosítottunk A HLA-C tipizálás eredményei Az IHW és CTP sejtvonalak tipizálásának eredményei A sejtvonalakból olyan mintákat választottunk, amelyek europid személyektől származnak, s a meghatározható allélok lehető legszélesebb skáláját reprezentálják. Ahol lehetséges volt, az adott allélre heterozigóta mintát dolgoztunk fel. 48

49 A vizsgálatok célja az volt, hogy igazoljuk a PCR-SSO rendszer pontos működését az általunk végzett tipizálások során, azokat mintegy belső kontrollként tipizáltuk. A kapott eredményeink azonosak voltak a panel-mintákéval Populációk statisztikai vizsgálatai Ópusztaszer (és környéke, a továbbiakban: Ópusztaszer, n = 32), a Káli-medence (n =46), valamint a magyar kontroll (n = 44). Hardy-Weinberg egyensúly A nullhipotézisben feltételeztük, hogy a vizsgált lókuszok Hardy-Weinberg egyensúlyban vannak. Az eredményekből kitűnik, hogy a magyar népességet reprezentáló csoport a HLA-A lókuszban nincs Hardy-Weinberg egyensúlyban (A lókusz P-értéke a szignifikancia szint alatt van: olyan mértékű az eltérés, amelyet nem okozhatott véletlen). E jelenséget okozhatja mintavételi hiba, s az alkalmazott módszer is eltérések forrása lehet. A populációk a többi lókuszban Hardy-Weinberg egyensúlyban vannak. Lókusz genotípus szám Ópusztaszer (n =32) genotípus szám Káli-medence (n= 46) genotípus szám magyarok (n = 44) HLA-A HLA-B HLA-C HLA-DR HLA-DQ táblázat: A három populáció Hardy-Weinberg egyensúlyi (P) értékei A lókuszpárok kapcsoltsági analízise (A számításokat a számítógépes program alapbeállításaival végeztük). A vizsgálat nullhipotézise: feltételezzük, hogy az egyes lókuszok között nincs kapcsoltság, a lókuszok (P: 0.05-ös szignifikancia-szintnél) egyensúlyban vannak. 49

50 A 24. táblázatban láthatók az egyes lókuszok melyik lókusszal kapcsoltak ("+"-szal jelölten). A 25. táblázat tartalmazza ezeknek a kapcsolatoknak számolt "egzakt P-értékeit": - mindhárom populációban igazoltuk a HLA-B és -C, valamint a HLA-DR és -DQ lókuszok alléljai közötti kapcsoltságot, - a két hasonló (káli-medencei és a magyarországi népességet reprezentáló) populációban további kapcsoltság jelentkezett: a HLA-A és -B, továbbá a HLA-C és -DQ lókuszok között, - ettől eltérően az ópusztaszeri populáció a HLA-B és -DR, a HLA-B és -DQ, a HLA-C és -DR lókuszok között mutatott kapcsoltságot. A többi lókuszpár esetében a kapcsoltságot statisztikailag nem igazoltuk. HLA Ópusztaszer (n = 32) Káli-medence (n=46) és a magyar kontrol (n=44) Lókusz -A -B -C -DR -DQ -A -B -C -DR -DQ -A B C DR DQ táblázat: A három populáció HLA-lókuszainak kapcsoltsági áttekintő táblázata HLA Egzakt P-értékek Lókuszok Ópusztaszer Káli-medence Magyarok A és -B A és -C B és -C < < < A és DR B és DR < C és DR A és DQ B és DQ < C és DQ DR és DQ < < < táblázat: A három vizsgált populáció HLAlókusz párjai között fennálló kapcsoltság 50

51 A HLA-C lókusz allélgyakorisági értékei A 26. táblázatban a szerológiai és a molekuláris biológiai módszerekkel kapott eredmények láthatók. A szerológiai módszerrel kimutatott allélok száma alig tér el egymástól: a két földrajzi régióból származó mintákban öt-öt, a magyar kontrollban hat allél. Ezzel szemben a DNS vizsgálatokkal mindhárom csoportban 13 allélt mutattunk ki. Figyelemre méltó a leggyakoribb allélok gyakorisági értékei közti különbség. Szerológiai módszerrel az ópusztaszeri mintákban kaptuk a legtöbb blank allélt, azonban a magyar kontroll értékei is tetemesen meghaladják a DNS vizsgálatokkal kapott értékeket: az ópusztaszeri mintákban 6,2%, a magyar kontrollban 2.3%, a kálimedenceiben mindössze 1.1 %. A gyakori HLA-Cw7 szerológiai kimutatása - szerotipizáló reagens hiányában - csak a magyar kontroll mintái esetében történt. DNS vizsgálatokkal - mindhárom adatbázisban - jelentős, % közeli értékeket kaptunk. Ópusztaszer (n = 32) Káli-medence (n = 46) Magyar kontrol (n = 44) Szerológia PCR-SSO Szerológia PCR-SSO Szerológia PCR-SSO % Cw % Cw* % Cw % Cw* % Cw % Cw* 9,4 1 3,1 1 5,4 1 5,4 1 4,5 1 7,9 1 3,1 2 4,7 2 10,9 2 10,9 2 10,2 2 9,1 2 7,8 3 4,7 3 9, ,4 3 11,4 3 10,9 4 10, ,2 4 10,2 4 9,1 4 1,6 6 7,8 5 2,2 5 2,2 5 6,8 5 6,8 5 67,2 0 7,8 6 58,7 0 3,3 6 7,9 7 1,1 6 37,5 7 27,2 7 48,9 0 28,4 7 1,6 8 5,4 8 2,3 8 7,8 12 9, ,6 14 2,2 14 1,1 14 3,1 15 2,2 15 1,1 15 1,6 16 1,1 16 1,1 16 1,6 17 2,2 17 1,1 17 6,2 0 1,1 0 2, táblázat: A szerológiai és DNS vizsgálatokkal (PCR-SSO és -SSP) kimutatott Cwallélok és gyakorisági értékeik. (Megjegyzés: "O" = ki nem mutatott- vagy blank allél) 51

52 Összehasonlítottuk a HLA-B és -Cw (27. táblázat), a HLA-A és -Cw (28. táblázat), valamint a HLA-Cw és -DR (29. táblázat) haplotípusok allélpárjainak eltéréseit a vizsgált populációkban. A HLA-B és -C lókuszpár gyakoribb alléljeit a 27. táblázatban mutatjuk be. A két lókusz leggyakoribb alléljei közé tartozó B8 és Cw7 allélek a lókuszpár leggyakoribb kombinációi közé tartoznak: a 10% körüli értékeknél azonban az ópusztaszeri minták jóval magasabb, 16% gyakorisággal fordultak elő. A káli-medencei minták leggyakoribb B35-Cw 4 haplotípusa (10%) a két másik csoportban a második helyen szerepel 8%-kal. Mindhárom csoportban találtunk HLA-B7, - Cw7 haplotípust egymáshoz közeli gyakorisági értékekkel (4-6%), a HLA-B27, -Cw2 haplotípus azonban, a magyar kontrollhoz képest, gyakoribb volt a káli-medencei mintákban, de hiányzott az ópusztaszeri csoportból, amely további, betegség asszociációval (HLA-B27 és reumatológiai betegségek -így a Bechterew-kór-, illetve fogékonyság Shigella, Yersinia baktériumok által okozott enterális fertőzésekre, s a Cw2 -antigénnel együtt a Reiter betegségre [87]) kapcsolatos kérdéseket vet fel. A HLA-B18, -Cw5 csak az ópusztaszeri-, a HLA -B14, -Cw8 csak a káli-medencei-, a HLA-B61, -Cw12, valamint a HLA-B62, -Cw12 csak a magyar kontroll mintáiban volt kimutatható. HLA- Káli-medence Ópusztaszer Magyar kontroll B C gyakoriság Sd Gyakoriság Sd gyakoriság sd táblázat: HLA-B és -Cw haplotípusok 52

53 Összehasonlításként nagyobb számú (n=604), európai vizsgálat (Nagy-Britannia, kaukázusiak) eredményeit [57] mutatjuk be. Feltűnő a HLA-B27 - HLA-Cw2 haplotípus egyes hazai mintákban detektált magasabb és a HLA-B7 - HLA-Cw7 haplotípus alacsonyabb mértékű előfordulása. HLA-B HLA-Cw* Haplotípus gyakoriság * , táblázat: 604 kaukázusi minta feldolgozásának eredményei (Nagy-Britannia) A HLA-A és -C lókuszpár alléljeinek gyakori kombinációit a 29. táblázatban mutatjuk be. A két gyakori allélből álló HLA-A2, -Cw7 haplotípus a káli- medencei mintákban és a magyar kontrollban 10%-, ill. 11%-os az Ópusztaszeriekben 4.7% gyakoriságú volt. Érdekes azonban, hogy a HLA-A1, - Cw7 kombinációnak a magyar kontrollban és az ópusztaszeri mintákban hasonló (10% és 11%) gyakorisági értékeit tapasztaltuk, szemben a káli-medencei minták 2.5%-os gyakoriságával. A káli-medencei minták ezen eltérései az ópusztaszeri minták vonatkozásában jelentős (P= ), a magyar kontroll mintáinak vonatkozásában szignifikáns mértékűek (P= ). A HLA-A24, -Cw7 allélpár káli-medencei és ópusztaszeri gyakoriságaival (5.6% illetve 7.8%) szemben ez a kombináció mindössze 2.3%-os gyakorisággal jelent meg a magyar kontroll mintákban. HLA- Káli-medence Ópusztaszer Magyar kontroll A Cw Gyakoriság Sd Gyakoriság sd Gyakoriság sd , , , , , , táblázat: HLA-A és Cw hapotípusok 53

54 A detektált HLA-Cw, -DR haplotípusok közül (30. táblázat) a HLA-Cw7, -DR3 volt a leggyakoribb mindhárom populációban; Cw 7 és DR11 haplotípust a magyar kontrollban nem találtunk. A HLA-Cw12, -DR15 haplotípus káli-medencei mintákban talált gyakorisági érték eltérése a kontroll csoporthoz szignifikáns volt (P=0,0134), az ópusztaszeri mintákban nem mutattuk ki. HLA- Káli-medence Ópusztaszer magyar kontroll Cw DR gyakoriság sd gyakoriság sd gyakoriság sd táblázat: HLA-Cw és DR haplotípusok Összehasonlítottuk a három hazai minta-csoportban detektált HLA-Cw alléleket. (A 27. táblázatban európai felmérési adatokat is közlünk.) A három populáció HLA-Cw alléljeinek gyakoriságát az alábbi táblázatban tüntettük fel, összehasonlítva három jelentős számú, (európai) kaukázusi mintával készült tanulmány eredményeivel. A három hazai populáció Cw alélgyakorisági értékei nagyon hasonlóak egymáshoz, csak kevés helyen találtunk szignifikáns eltérést. Hasonlóan más kaukázusi populációkhoz, a Cw7 a leggyakoribb allél: az idézett irodalmi adatok 28-34% közötti értékei közel állnak a magyar és a káli-medencei adatokhoz, de az ópusztaszeri minták 37,5%-os értéke messze a legmagasabb. A Cw 4 allél gyakorisági értékeit (10-16%) jól közelítik a saját adataink. A szerológiai módszerekkel rutinszerűen körülményesen detektálható Cw 12 allél gyakorisági értékeihez (4-7%) képest a káli-medencei- (10%) és főleg a magyar kontroll 17%-os értékei magasabbak. A Cw 3 allélgyakorisági értékekhez (10-54

55 13%) hasonló értékeket kaptunk, kivéve az ópusztaszeri populációt (5%). A Cw 2 allélgyakoriságokhoz (3-4%) hasonló értéket kaptunk az ópusztaszeri mintákban, de a másik kettőben magasabbat (közel 10%). A Cw 6 allél gyakorisági értékei az ópusztaszeri mintákban 8%, a magyar kontrollban 1%, a káli-medencei mintákban 3%; az eltérés az ópusztaszeri és a magyar kontroll között közel áll a szignifikancia szinthez (P= 0,055819). A Cw 12 allél gyakorisága a kálimedencei és az ópusztaszeri mintákban magasabb, mint a magyar kontrollban, de a szignifikanciaszintet nem éri el. Az allél gyakorisága a referencia populációkban jóval alacsonyabb. HLA- Cw* Ópusztaszer n=32 magyarországi minták Magyar kontr. n=44 Káli- med. n=46 Irodalmi adatok n=105 /A/ n=280 /B/ n=604 /C/ , , ,126 0, ,112 0, ,073 0, ,105 0, ,295 0, ,037 0, ,078 0, ,0048 0,012 0, ,0524 0,028 0, ,0406 0,034 0, ,0048 0,012 0, nincs adat nincs adat 0, táblázat: Az általunk feldolgozott, hazai minták és irodalmi adatok HLA-Cw gyakorisági eredményei (Irodalmi hivatkozások: A- [88]; B-[89]; C [57]) A csontvelőátültetés előtti donor-recipiens párok vizsgálati eredményei A 61, szerológiai módszerrel HLA-A, -B, -DR egyezőnek bizonyult donor-recipiens pár további HLA lókuszainak molekuláris biológiai vizsgálatait végeztük el. A vizsgálatok célja annak kiderítése volt, hogy detektálható-e a további lókuszok alléljai között eltérés. Az alábbi táblázat az adott lókusz alléljeiben eltérő minták számát és az eltérés mértékét mutatja: a legnagyobb százalékban a HLA-Cw és a HLA-DPB1 lókuszokban fordult elő. 55

56 A donor-recipiens párok eltérései az adott lókuszban HLA-Cw HLA-DRB1 HLA-DQB1 HLA-DPB1 eltérés az adott lókuszban / összes vizsgált minta (eltérés mértéke %-ban) Eltérések 53 / 61 (87%) 11 / 61 (18%) 15 / 61 (25%) 53 / 61 (87%) 32. táblázat: A szerológiai módszerekkel HLA-ABDR egyező minták molekuláris biológiai vizsgálatainak az eredményei A későbbiekben folyamatosan nőtt a betegek és donoraik száma, ezért a továbbiakban 76 donor-recipiens párral további, a HLA-C lókuszra vonatkozó vizsgálatot végeztünk el, amelyben összehasonlítottuk a HLA-C allélek szerológiai módszerrel és PCR-SSOval történt kimutatásának az eredményeit. Az eredmények önmagukért beszélnek: gyakorlatilag minden allél kimutatható, bizonyítva a lókusz heterogenitását. Kimutatható HLA-Cw allélek (%) Személyek Szerológiai módszerekkel PCR-SSO -val donorok (n=76) Betegek (n=33) táblázat: A HLA-C lókusz szerológiai- és DNS-alapú vizsgálatainak összehasonlítása Megjegyzés: 0 = nem kimutatott allélek száma, 1 = 1 kimutatott allél, 2 = 2 kimutatott allél (%- ban adott értékek) Az említett donor-recipiens párok HLA lókuszainak allél- egyezéseit és -eltéréseit mutatjuk be egy eklatáns példán. Az eltérések a HLA-C és -DP lókuszok alléljai között tapasztalhatók. Mindezek -többek között - különösen alátámasztják a HLA-C lókusz molekuláris biológiai módszerekkel végzett további vizsgálatait. HLA- Cw A B C DR DQ DP Beteg / Donor / Donor ? / Donor / Donor / táblázat Egy beteg és potenciális donorainak vizsgálati eredményei 56

57 A HLA-C lókusz vizsgálatai eredményeinek összegzése: A három vizsgálati csoport általunk vizsgált HLA-lókuszai Hardy-Weinberg egyensúlyban voltak. Kivételt képezett a magyar kontroll-csoport a HLA-A lókuszban (23. táblázat). A lókuszpárok kapcsoltsági analízise alapján a magyar kontroll-csoport és a kálimedencei régió mintái hasonlóak, a harmadik eltér e kettőtől (24., 25. táblázatok). Összehasonlítottuk a három csoport HLA-C lókuszainak szerológiai és molekuláris biológiai eredményeit (26. táblázat), továbbá a HLA-B és -C, a HLA-A- és -C, valamint a HLA-C és -DR haplotípusok allélpár-eltéréseit (27, 29, 30. táblázatok); végül összehasonlítottuk a detektált HLA-Cw alléleket (31.táblázat). A szerológiai módszerekkel HLA-ABDR egyezőnek bizonyult, csontvelőátültetés előtti donor-recipiens párok vizsgálati eredményei eltéréseket mutattak a molekuláris biológiai módszerek eredményeinek összehasonlításában A származás-megállapítási vizsgálatok eredményei A DNS-szintű vizsgálatok esetenként segítséget adtak a vélelmezett apa kizárásában, illetve - ahol arra volt szükség - a valószínűség megerősítéséhez. A vizsgálatok eredményeként vagy sikerült kizárni (1) a perben szereplő férfit az apaságból vagy nem (2). Az "egy-férfis" ügyekben egy-, a "két-férfis" ügyekben két férfi vizsgálatát végeztük el; az utóbbi esetekben a HLA-DRB1, HLA-DQB1, és STR lókuszok vizsgálatának bevonásával. Amennyiben elhunyt férfi apasági vizsgálataira volt szükség, a vizsgálatokat indirekt módon, a családtagok vizsgálataival végeztük el. (Az alábbi táblázatokban a vastagon szedett számok azokat az allélokat reprezentálják, amelyek mind a gyermekben, mind a vélelmezett apában megtalálhatók. Az aláhúzott, dőlt betűs számok azokat, amelyekkel a férfi kizárható volt. A csillag (*) a nukleotidszekvencia alapján megadott allél jelölése, pl. A*0101) Kizárások Ún. egy férfis esetek: Két esetben a DNS-alapú allél-meghatározás segítette a kizárást (30. táblázat és 31. táblázat). 57

58 A HLA-A lókuszban a fenotípusosan egy meghatározható allélt mutató a feltételezett homozigóta vélelmezett apa kizárását DNS alapú tipizálással sikerült megerősíteni. Az eredményt az STR-tipizálás alátámasztotta. személyek HLA-A - B - A* FGA VWA SE33 anya gyermek ,2 vélelmezett apa táblázat A gyermek és a vélelmezett apa, gyakran előforduló HLA-A, -B allélekkel rendelkezett. A HLA-C lókuszban sikeres kizárást e lókusz DNS-alapú tipizálásával és a HLA-DRB1 nagy felbontású vizsgálatával megerősítettük: a gyermek által hordozott apai allélok a vizsgálatban szereplő férfi egyik alléljével sem egyezik meg. személyek HLA-A - B -C - C* - DRB1* anya gyermek vélelmezett apa táblázat Ún. két férfis ügyek A szerológiai módszerrel végzett HLA-tipizálást a DRB1 és a DQB1 allélek DNStipizálásával tettük teljessé Kizárás HLA-DRB1 lókuszban Mindkét férfi, továbbá a gyermek is hordozottt HLA-A2, -B51 alléleket. A DRB1 allélek vizsgálatával az első férfi az apaságból kizárható volt. személyek HLA-A - B - DRB1* anya gyermek férfi férfi táblázat 58

59 Kizárás HLA-DQB1 lókuszban Mindkét férfi és a gyermek rendelkezett HLA-A2, -B13, -Cw6 és -DRB1*0701 allélekkel. A DQB1 allélek vizsgálatával azonban a második férfi kizárható volt az apaságból. személyek HLA-A - B - C - DRB1* - DQB1* anya gyermek férfi férfi táblázat Kizárás STR-lókuszokban Mindkét férfi és a gyermek rendelkezett a gyakori HLA-A1, -B8, -Cw7, -DR3, -DQ2 antigénekkel valamint egy-egy DPB1 alléllel. A két férfi közül a második kizárásában a nem-kapcsolt STR polimorfizmusok vizsgálata segített. személyek HLA-A - B - C - DRB1* - DPB1* FGA VWA SE 33 anya ,2 gyermek ,2 30,2 1. férfi ,2 30,2 2. férfi táblázat Elhunyt férfi apasági vélelmének megdöntése Ebben az ügyben az elhunyt férfi felesége, két gyermeke, továbbá három testvére (két nő és egy férfi) került vizsgálatra: a néhai alperes genotípusának valószínűsítésével (indirekt meghatározással) lehetővé vált apaságának kizárása. is. A szerológiai módszerrel, továbbá DNS alapú vizsgálatokkal kiterjesztett családvizsgálat készült, amely során kiderült, hogy a (vizsgálatban szereplő) gyermek HLA-A24, - B63 haplotípusa nem található meg az elhunyt férfi családjában. Figyelembe véve, hogy az elhunyt férfi két vérrokon, biológiai gyermekeinek egyike a HLA-A és -B lókuszokban homozigóta volt, szükségessé vált a DRB1, DQB1 allélek vizsgálata is. A 59

60 családvizsgálattal igazolt, néhai férfi DRB1* 0101, genotípusa eltért a gyermek, biológiai apjától örökölt DRB1*1302 szubtípustól. (4. ábra) A1 A2 Cw7 B8 B50 rokon 1 HLA-A1,2;B8,50;Cw7 A1 Cw7 B8 A2 B50 rokon 2 HLA-A1,2;B8,50;Cw7 A1 Cw7 B8 A2 B50 rokon 3 HLA-A1,2;B8,50;Cw7 A1 Cw7 B8 DRB1*0301 A30 Cw6 B13 DRB1*0301 feleség HLA-1,30;B8,13;Cw6,7;DR3 A2 B50 DRB1*0701 A1 Cw7 B8 DRB1*0101 elhunyt férfi HLA-A1,2;B8,50;Cw7;DR1,7 A2 B39 DRB1*0101 A29 B7 DRB1*1001 anya HLA-A2,29;B7,39;DR1,10 A2 B50 DRB1*0701 A30 Cw6 B13 DRB1*0301 gyerm 1 HLA-A2,30;B50,13;Cw6;DR3,7 A1 A1 Cw7 Cw7 B8 B8 DRB1*0301 DRB1*0101 gyerm. 2 HLA-A1;B8;Cw7;DR1,3 A2 B39 DRB1*0101 A24 B63 DRB1*1302 kiskorú. HLA-A2,24;B39,63;DR1,13 4. ábra : Elhunyt férfi és családjának haplotípus vizsgálata Nem kizárásos apasági ügyek Feltételezett homozigótaság volt a HLA-A és/vagy B lókuszban a gyermeknél vagy a feltételezett apánál. Ennek megerősítését segítették a további, DNS szintü vizsgálatok (A és B). A.) A gyermek HLA-B lókuszban homozigóta volt. A DRB1allél meghatározásával megerősítettük az apaság valószínűségét. személyek HLA-A - B - C - DRB1* anya gyermek vélelmezett apa táblázat 60

61 Az apaság valószínűsége 52.5% DRB1* allél nélkül és 98,7% DRB1* alléllal. A vércsoport- és a HLA-tipizálás összesített valószínűségi értéke: %. B.) A gyermek az összes, szerológiai módszerrel vizsgált lókuszban (HLA-A, -B, - C) homozigóta volt. DNS alapú vizsgálatokkal sikerült HLA-A* 1101 genotípust meghatározni, amellyel a vélelmezett, az anya és az apa is rendelkezett, bizonyítva a gyermek homozigótaságát. Az STR-lókuszok vizsgálataival kapott eredmények megerősítették az apaság valószínűségét. személyek HLA-A - B - C - A* FGA VWA SE33 anya ,2 gyermek ,2 vélelmezett apa ,2 41. táblázat Az apaság valószínűsége %. A vércsoport- és a HLA tipizálás összesített valószínűségi értéke: % Blank allélt határozunk meg a gyermek és a vélelmezett apa HLA- A és/vagy B lókuszaiban. HLA-DRB1* tipizálással történt az apaság megerősítése. személyek HLA-A - B - C - DRB1* anya gyermek x vélelmezett apa x táblázat Az apaság valószínűsége %. A vércsoport- és a HLA tipizálás összesített valószínűségi értéke: % Tekintettel arra, hogy bizonyos allélek szerológiai módszerekkel nem detektálhatók, a HLA-tipizálást DNS alapú vizsgálatokkal tettük teljessé (C-1 és C-2). 61

62 A.) A blank HLA-A allélt HLA-A*3202 allélként igazoltuk a gyermekben és a vélelmezett apában. Az apaság valószínűségét STR tipizálással megerősítettük. személyek HLA-A - B - C - A* FGA VWA SE33 anya ,2 gyermek 26 x ,2 31,2 vélelmezett apa x x ,2 28,2 43. táblázat Az apaság valószínűsége %. A vércsoport- és a HLA tipizálás összesített valószínűségi értéke: %. B.) A DNS-alapú allélmeghatározással ritka, szerológiailag nem detektálható HLA- A*6603 allélt azonosítottunk a gyermekben és a vélelmezett apában. személyek HLA-A - B - C - A* anya gyermek 33 x vélelmezett apa x x táblázat Az apaság valószínűsége %. A vércsoport- és a HLA tipizálás összesített valószínűségi értéke: % Elhunyt férfi apaságának megerősítése Az elhunyt férfi szüleinek HLA-vizsgálata volt lehetséges. Noha a gyermekben kimutatható volt az elhunyt alperes édesanyjának HLA-A, -B, -C haplotípusa (5.ábra), ahhoz, hogy egyértelműen megállapítható legyen az átörökített haplotípus alperesi eredete, a HLA-DRB1*, -DRB3*, -DRB4* és -DQB1* allélekre is kiterjesztettük a tipizálást. 62

63 A HLA-A, -B, -C haplotípushoz mind az apai nagyanya, mind a perben szereplő gyermek esetében HLA-DRB1*0401, DRB4*0101, DQB1*0302 haplotípus kapcsolódott. Az elhunyt férfi apasága igen nagy fokban valószínűsíthető volt. A1 Cw 7 B8 DRB1*0301 DRB3*0101 DQB1*0201 nagyanya DRB4* HLA-1,24;B8,60;Cw3,7;DR3,4;DRw 52,53; DQ2,3 A2 B27 DR1101 DRB3*0101 DQB1* vagy X DRB4* nagyapa HLA-2;B27,50;DR11,7;DRw 52,53;DQ2,3 A25 Cw 5 B12 DRB1* X A24 Cw 3 B60 DRB1*0401 DRB4*0101 DQB1*0302 DQB1*05 03 anya HLA-3,25;B12,35;Cw4,5;DR1,4;DRw 53;DQ1,3 2 vagy DRB3* A1 Cw 7 2 vagy B B3* B3* A24 Cw 3 B B4*0101 2v.X vagy B4* elhunyt férfi HLA-2,24;B27,60;Cw3;DR4,11;DRw 52,53;DQ3 A1 Cw 7 B B3* v.X B4* A25 Cw 5 B12 DRB1*0101 DQB1* gyermek DRB4*0101 HLA-25,24;B12,60;Cw3,5;DR1,4;DRw 53;DQ1,3 5. ábra: Elhunyt férfi apaságának megerősítése 5.5. Az eredmények összefoglalása A genomiális DNS izolálása A citráttal alvadásgátolt vérminták feldolgozása kizárólag kisózásos módszerrel történt. A Laihri-Nurnberger -módszert buffy coat minták feldolgozásakor alkalmaztuk. Az izolált DNS mintákat 4 C -on (néhány hétig) illetve -20 C -on (néhány hónapig) tároltuk. A VNTR-lókuszok RFLP-, valamint a HLA-C lókusz PCR-SSO vizsgálatait a "Lifecodes OUICK-LIGHT Paternity Identity Kit" protokoll, valamint a Quick-Type használati utasításainak általunk kidolgozott módosításaival hajtottuk végre. 63

64 A VNTR-lókuszok vizsgálati eredményei: A 7. sz. táblázatban bemutattuk a rendkívül polimorf lókuszok általunk detektált alléljeit. Az allélokat osztályokba (bin) sorolva a D6S132 esetében az alléloknak a 70%-a 5 binkategóriában ( bp) található. Ez az intervallum a másik lókusz esetében szélesebb (8. táblázat). A két lókusz közül a D6S132 nem volt Hardy-Weinberg egyensúlyban. Az általunk detektált homozigóta túlsúlyt több tényező okozhatja (9. táblázat). A kapcsoltsági számítások igazolták az irodalmi adatokat a HLA lókuszok esetében, de kapcsoltság mutatkozott a D6S132 (binelt adatok) és a HLA-A lókusz között (10., 11. táblázatok). A hazai adatbázis statisztikailag eltérőnek bizonyult mind az (U.S.A.) kaukázusiaktól, mind az afro-amerikaiatól (12. táblázat). A HLA-A2 szubtípus-meghatározás eredményei: A vizsgált, a hazai népességet reprezentáló mintában a HLA-A*0201 és a HLA-A*0205 szubtípusokat detektáltuk, összhangban az európai adatokkal. A csontvelő donor-recipiens párokat folyamatosan vizsgáltuk (néhány példa: táblázatok), eddig a HLA-A*0201 szubtípust azonosítottuk. A HLA-C lókusz vizsgálati eredményeinek összegzése: A vizsgálati csoport általunk vizsgált HLA-lókuszai Hardy-Weinberg egyensúlyban voltak, kivéve a magyar kontroll-csoportot a HLA-A lókuszban (23. táblázat). A lókuszpárok kapcsoltsági analízise alapján a magyar kontroll-csoport és a káli-medencei régió mintái hasonlóak, a harmadik eltér e kettőtől (24., 25. táblázatok). Összehasonlítottuk a három csoport HLA-C lókuszainak szerológiai és molekuláris biológiai eredményeit (26. táblázat), továbbá a HLA-B és -C, a HLA-A- és -C, valamint a HLA-C és -DR haplotípusok allélpáreltéréseit (27, 29, 30. táblázatok); végül összehasonlítottuk a detektált HLA-Cw alléleket (31.táblázat). A szerológiai módszerekkel HLA-ABDR egyezőnek bizonyult, csontvelőátültetés előtti donor-recipiens párok vizsgálati eredményei eltéréseket mutattak a molekuláris biológiai módszerek eredményeinek összehasonlításában. A PCR-alapú vizsgálatok hatékonysága szembetűnő a kimutatott allélszintű eltérések feltárásában is. 64

65 A származás-megállapítási vizsgálatok eredményeinek összefoglalása: Az ún. kizárásos apasági vizsgálatokban a vizsgálatban szereplő férfi/ak/ apasági vélelme az eredmények alapján megdőlt. A vizsgálatokban egy férfi szerepelt: ún. "egy férfis" esetek - A 35. táblázatban a szerológiai vizsgálatok alapján feltételezhető HLA-A lókuszbeli homozigótaságot DNS-alapú vizsgálatokkal sikerült megerősíteni. - A 36. táblázatban gyakori HLA-A,-B allélek esetén a sikeres kizárást HLA- C lókusz és DRB1 DNS-alapú tipizálása segítette. Két férfi szerepelt a vizsgálatokban, ún. "két férfis" esetek - A 37. táblázat: a DRB1 allélek vizsgálatával az első férfi kizárható volt az apaságból - A 38. táblázat: a DQB1 allélek vizsgálatával a második férfi kizárható volt az apaságból - A 39. táblázat: példa az STR markerek használatának jelentőségére. Az öt HLA-lókusz vizsgálata mellett alkalmazva, segítségükkel a második férfi kizárható volt az apaságból ábra: elhunyt férfi apaságból való kizárása feleségének, vérrokon, biológiai gyermekeinek és testvéreinek együttes vizsgálataival történt. Az ún. nem kizárásos apasági vizsgálatokban a vizsgálatban szereplő férfi/ak/ apasági vélelme az eredmények alapján nem dőlt meg. A gyermeknél vagy a vélelmezett apánál feltételezett homozigótaság a HLA-A és/vagy -B lókusz/ok/ban - A 40. táblázatban az apaság megerősítése DRB1 allélek meghatározásával történt - A 41. táblázat: homozigóta HLA-lókuszok esetén végzett HLA-A* tipizálás történt A HLA-B lókuszban hiányzó (blank) allél esetén végzett DRB1* tipizálás bemutatása (42. táblázat) Szerológiailag nem detektálható allélek esetén végzett vizsgálatok (43, 44. táblázatok) - DNS-alapú tipizálással meghatározott blank allél a HLA-A lókuszban 65

66 - DNS-alapú tipizálással ritka HLA-A*allél meghatározása. Elhunyt férfi apaságának megerősítése nagyszülői haplotípus detektálásával - A részletek az 5. sz. ábrán láthatók 66

67 6. Megbeszélés Az MHC génkomplex polimorfizmus-vizsgálatainak a célja a szerológiai módszerrel végzett HLA-tipizálás, valamint a HLA II osztályba tartozó lókuszok molekuláris biológiai vizsgálatainak kiegészítéseként [91], a HLA I osztályba tartozó (transzplantációs) HLA-A, -B, -C lókuszok (molekuláris biológiai módszerekkel történő) tipizálásának bővítése volt. Egyrészt a HLA-A2 allél és a HLA-C lókusz polimorfizmusai által meghatározott szerkezeti sokfélség kiemelt jelentőségű immunológiai funkcionális jelentőséggel rendelkezik, ezért vizsgálatai nélkülözhetetlenek a csontvelő-transzplantációkat megelőzően a donorkiválasztásban. Másrészt -mivel az örökítő anyag szintjén történő polimorfizmus vizsgálatokat alkalmazzák származás-megállapításban (apasági vizsgálatokban) [90], népcsoportok, etnikumok eredetének kutatásában [130, 131, 132] is -, beépítettük és alkalmaztuk azokat az Országos Haematológiai és Immunológiai Intézet Immungenetikai Osztályán évtizedek óta végzett apaságvizsgálatokba. Esetenként azonban szükség van az MHC régión kívül eső DNS régió/k/ vizsgálatára. Ennek keretében két, az 1. és a 6. kromoszómákon található, polimorf VNTR lókuszokat vizsgáltunk Vizsgálatainkhoz használt DNS mintákat hatékony, megbízható és költségtakarékos ún. kisózásos módszerrel izoláltuk. Az eredményeink kiértékeléséhez az ARLEQIUN populációgenetikai szoftvert alkalmaztuk. Természetesen tisztában voltunk azzal, hogy a kis mintaszám veszélyeket rejt a statisztikai számítások kapcsán. Tekintettel arra, hogy a földrajzi régiók lakóinak száma adott volt, igen gondosan válogattuk ki mintáinkat. Úgy ítéltük meg, hogy ezekből az eredményekből is kaphatunk olyan információkat, amelyek körültekintően értékelve alapot adnak a további kutatási irányokra. 67

68 A HLA-A2 a HLA-A lókusz egyik leggyakrabban előforduló allélje. Szubtipusvizsgálatainak alapvető indoka az volt, hogy e nagy diverzitású allél azonosítása, háromdimenziós, molekuláris szerkezetének megismerése [92, 93, 94] óta ma már 51 szubtípusa ismert [86]. Rendkívüli polimorfizmusa [66, 95, 96] funkcionális jelentőségére utal [67]. A különböző populációkban megjelenő polimorfizmusok a szelekciós előnyt adó mutációkra [61], a letális patogénekkel szembeni immunfolyamatokra, valamint az antigén-bemutatás mechanizmusára, a T-sejtes immunválaszra [97] irányítja a figyelmet: fontos korlátozó elemei a citotoxikus T-limfociták felé történő antigén bemutatásnak (pl. HLA-A*0201) [98], továbbá a fehérje-antigének megkötésének [99]. A szubtípus-specifikus eltéréseknek funkcionális jelentősége lehet továbbá egyes daganatos betegségekben (pl. melanoma), az anya-magzat magzati-anyai kapcsolatában [100], bizonyos HLA-asszociált betegségekben (pl.alzheimer-betegség, arthritis psoriatica stb.) [101, 102]. Az egyes A2 variánsok eltérő immunológiai reakciókkal (pl. válaszadási képesség, surveillance stb) állnak kapcsolatban, így alkalmazhatók molekuláris epitóp-specifikus vakcina tervezésben [103, 104]. A random, normál populációs mintából (n=126) azon személyek vérmintáit vizsgáltuk DNS-alapú módszerrel, akik rendelkeztek a szerológiai módszerrel meghatározott HLA- A2 alléllal. Az 55 mintában két típus, az A*0201 (96.7%) és az A*0205 (3.6%) volt jelen, hasonlóan más európai országok kaukázusi populációihoz. Mindazonáltal jelentős különbségek lehetnek nem csak egyes országok népessége, de országokon belül is a különböző eredetü népcsoportok között is [53]. Előzetes vizsgálatok az átlag magyar népességben, sőt a világ nagy részén nem kimutatható szubtípus, az A*0211 jelenlétét igazolták a magyarországi cigányok között, amely másutt, csak az észak-indiai népességben fordul elő számottevő százalékban [105]. A csontvelő donor-recipiens párok közül minden HLA-A2 alléllel rendelkezőt megvizsgálva eddig mindegyik HLA-A*0201 szubtípussal rendelkezett. Fontos a megkezdett munka folytatásával feltérképezni az A2 szubtípusok hazai eloszlását, hiszen az eredmények jelentős klinikai előnyt nyújthatnak az irányított donorkere- 68

69 sésben, a szerv- és csontvelő-transzplantációban, a várható szövődmények előrejelzésével illetve megelőzésével [106, 107]. A HLA-A2 allél egyrészt nagy gyakorisággal szerepel a hazai népességben, másrészt különlegesen polimorf, ezért a különféle polimorfizmus vizsgálatokban való alkalmazása feltétlenül indokolt. Élénk szakmai érdeklődés irányul a HLA-C lókusz antigénjeinek funkciói [109, 110, 111, 112, 113] és alléljainak detektálása [108] felé. A HLA-C antigének biológiai szerepéről eddig kevés információ állt rendelkezésre, de az újabb kutatások rendkívül érdekes folyamatokra világítanak rá: jelentős klinikai és immunregulációs folyamatokban szerepelnek [57], kapcsolatba hozhatók egyes betegségekel (pl. psoriasis vulgaris [57]). Nagyon fontos az a kutatási eredmény, miszerint az NK-sejtek (természetes ölősejtek) "szelektálnak" a HLA-C molekulák közt: a 77. és 80. pozícióiban levő aminósavaik szerint két fő csoportba sorolhatók [111, 112, 132]. A szerológiailag kimutatható 10 alléllal (Bodmer és mtsai 1999) [112] szemben a DNS-alapú módszerekkel 18 allél (csak fő csoport) mutatható ki. A szerológia módszerrel végzett vizsgálatok során számolni kell a nem detektált (blank) allélek magas gyakorisági értékeivel: ez elérheti a 30%-ot is, szemben a molekuláris biológiai módszerekkel tapasztalható 4%-kal. [114]. Különösen körülményes (vagy jelenleg nem lehetséges) a HLA-Cw*12-Cw*18 allélek detektálása [57, 88, 89]. A szerológiai vizsgálatokkal HLA-A, -B,-DR egyezőnek talált donor-recipiens párok HLA-Cw* allél-eltérései elérhetik a 30-40%-ot is, további HLA- A, és -B eltérésekre utalva. S valóban, a HLA-A és -B szubtipus-meghatározás 30%-os eltéréseket igazolt.[115, 116, 117, 118, 119]. Mivel mindezek nem a szerológiai analízis hibás végrahajtásából, vagy a téves értékelésből, hanem a szerológiai reagensek használatának és beszerzésének nehézségeiből fakadtak, indokoltnak tűnt, a szerológiai meghatározás kiegészítéseként a DNS-alapú HLA-C tipizálás hazai elindítása. Két földrajzi régióból származó mintákat [120] dolgoztunk fel, a magyar népességet reprezentáló, normál populációs mintával (n=44). 69

70 A magyar kontroll-csoport HLA-A lókusza (P=0.01) kivételével a minták a vizsgált HLA-lókuszokban Hardy-Weinberg egyensúlyban voltak (23. táblázat). A lókuszpárok kapcsoltsági analízise alapján (egzakt P-értékek) szerint: mindhárom populációban kapcsoltság jelentkezett a HLA-B és -C, valamint a DR és DQ lókuszok allélpárjai között. A magyar kontroll-csoport és a káli-medencei régió mintái hasonlóak, az Ópusztaszer környéki mintákban több lókuszpár között mutatkozott kapcsoltság (24., 25. táblázatok). Összehasonlítottuk a három csoport HLA-C lókuszainak szerológiai és molekuláris biológiai eredményeit, amelyek a fent említett, nemzetközi eredményekkel teljesen egybehangzóak: a molekuláris biológiai vizsgálatokkal 7% alá esett a blank allélok gyakorisága a populációs mintákban (26. táblázat). A csontvelő betegek és donoraik vizsgálatában az eredmény még ennél is jobb volt (33. táblázat)! A korábban említett irodalmi adatoknak megfelelőek a szerológiai vizsgálatok alapján egyezőnek bizonyult csontvelőbetegek és donoraik PCR-alapú vizsgálatokkal jelentkező eltérései: a HLA-C lókusz esetében rendkívül magas eltérést detektáltunk (32. táblázat). [115, 116, 117, 118] Megvizsgáltuk a HLA-B és -C, a HLA-A- és -C, valamint a HLA-C és -DR haplotípusok allélpár-eltéréseit (27, 29, 30. táblázatok), végül összehasonlítottuk a detektált HLA-Cw alléleket (31.táblázat). Noha az eredmények alapos vizsgálata alapján mutatkozik különbség a három reprezentatív csoport között, általánosságban elmondható, hogy az eredményeink az európai átlagba símulva hasonlók azokhoz [46, 57, 88, 89]. A csontvelő donorok- és recipensek MHC eltérései az esetlegesen kialakuló GvHD legjelentősebb rizikófaktorai. A szerológiai módszerekkel egyezőnek bizonyult csontvelő donor-recipiens pároknál - az irodalmi adatokkal egybehangzóan - jelentős HLA-C lókuszbeli eltéréseket detektáltunk. A polimorfizmus-vizsgálatokat a származás-megállapítási vizsgálatokba is bevezettük. 70

71 Két VNTR-lókusz vizsgálatát végeztük el normál magyar populációs mintán [121]. Az alléleket közvetlen méretbecsléssel [73,74], valamint kategóriákba sorolva, bineléssel határoztuk meg [71-77]. A D6S132 lókusz nem volt Hardy-Weinberg egyensúlyban, mint ahogy a HLA-DR lókusz sem. Ennek az okát csak további mérésekkel lehet meghatározni: okozhatja metodikai hiba, de eltérések forrása a mintavétel módja is. A Hardy-Weinberg értékekhez képest homozigóta túlsúlyt detektáltunk: ezt okozhatják azon minták, amelyekben csak egyetlen allélt határoztunk meg (SBP) [75]. Az egyensúlytól való eltérés okozója lehet továbbá a Wahlund-effektus [72, 75]. A lókuszok közötti kapcsoltság számításaiban a HLA-lókuszokon túl (meglepő módon) kapcsoltsági viszony jelentkezett a HLA-A és a D6S132 lókusz között. Mivel ezek távol helyezkednek el a 6. kromoszómán, az eredményt további vizsgálatokkal igazolni kell. Két U.S.A.-ból származó populációs adatbázissal összehasonlítva a hazai eredményeinket azt tapasztaltuk, hogy mindhárom populáció eltér egymástól. Ezekkel a vizsgálatokkal demonstrálni kívántuk az RFLP-módszerrel kapott adatok feldolgozását: családok vizsgálataival néhány példán bemutattuk az allélok öröklődését. Látható azonban, hogy a D6S132 lókusz eredményei nincsenek Hardy-Weinberg egyensúlyban, így populációs referencia-adatbázisként jelen állapotában nem használható. Hazánkban a HLA tipizálás az apasági vizsgálatokban 1979 óta tartozik a bizonyítási eljárások közé. Ezeknek a módszereknek különös előnye az igazságszolgáltatás területén rutinszerűen alkalmazottakkal szemben, hogy az azonos mintából történő további, DNS szintű vizsgálatok [122] a korábbi eredményeket egészítik ki. Az Országos Haematológiai és Immunológiai Intézet Immungenetikai Osztályán 1979 és 1999 között 2384 apasági ügy feldolgozása történt és 1999 között 950 ügyből 28 esetében készültek DNS-alapú vizsgálatok: 1994-től a HLA-II-, 1998-tól a HLA-I osztályú lókuszok vizsgálataival. Az értekezésben 12 apasági ügyet részleteztünk, amelyek felében kizártuk a vélelmezett férfit, hat esetben az apaság valószínűségét számítottuk [123] 71

72 A DNS-alapú HLA-A és HLA-C lókusz vizsgálataival sikerrel zártuk ki a vélelmezett apát, illetve a HLA-II osztályú lokuszok PCR-technikával végzett vizsgálatokkal az ügyekben szereplő férfiak közül az egyiket. Molekuláris biológiai vizsgálatokat végeztünk a HLA-A és/vagy-b lókuszban jelentkező feltételezett homozigótaság, blank allél, szerológiai módszerekkel nem detektálható allélek meghatározása során. Ezekben az esetekben az apaság valószínűségének statisztikai valószínűségét határoztuk meg. A 35., 41., 43., 44. sz. táblázatokban szereplő vizsgálatok során szükséges volt a HLA- A lókusz molekuláris biológiai vizsgálata. A 36. sz. táblázat a HLA-Cw* allélek PCRalapú vizsgálatának szép példája. Egy esetben csak az MHC régión kívül eső STRlókuszok vizsgálatával sikerült a perben szereplő két férfi egyikét kizárni az apaságból (39. táblázat). Mindkét vizsgálati csoportban bemutattunk olyan esetet, ahol elhunyt férfi apasági valószínűségét vizsgáltuk. A VNTR-lókuszok analízise [5, 6, 124, 125,126, 127] szolgálhatna segítségül hasonló esetekre, azonban az RFLP-módszereket mind jobban kiszorították/kiszorítják a PCRtechnikával végezhető, olcsóbb, gyorsabb, kevésbé munkaigényes és könnyebben értékelhető STR-lókusz vizsgálatok [128]. A HLA régió mikroszatellita [129] vizsgálataival eddig azonosított 155 marker a polimorfizmus-vizsgálatok új távlatait jelentik ( ). Egy kutatási program keretében vizsgáltuk a TAP fehérjéket kódoló DNS szekvenciák polimorfizmusait. A TAP I/1,2 és TAP II/1,2,3 allélek polimorfizmusainak vizsgálatai során az 50 mintával végzett analízis csupán a TAPII/1 allél esetében volt sikeres. A kutatási program során változtatni kellett a vizsgálat kondícióin. A kutatás a Nemzetközi Hisztokompatibilitási Workshop keretein belül a jövőben folytatódik. 72

73 7. Köszönetnyilvánítás Tisztelettel köszönöm Dr. Falus András professzor segítségét tanulmányaim elkezdéséhez, majd folytatásához. Szigorú következetessége mellett teret engedett önálló gondolataimnak, gondjaimban nyújtott segítsége mindig gyors és hatékony volt. Köszönöm az alprogram vezetőjének, dr. Sótonyi Péter professzor tanácsait. Különösen a kezdeti szakaszban nem nélkülözhettem őket. A kezdéshez erőt adott dr. Abrudbányiné dr. Cserhalmi Mária, dr. Gacs Mária és dr. Ottó Szabolcs professzor. Volt munkahelyi vezetőim - látva az igazságügyi eljárásokban jelentkező követelményeket - hivatalos hátteret, szabad időt biztosítottak tanulmányaimnak. Köszönöm megértő segítségét, megtisztelő bizalmát dr Pintér Sándor r. altábornagynak, dr. Kacziba Antal r. vezérőrnagynak, dr. Katona Gézáné r. ezredesnek, dr. Bartalus Antal R. dandártábornoknak, Kiss Mihály r. ezredesnek, dr. Horeczky László r. ezredesnek, Kaizer Józsefnek és dr. Szabó Jánosnak. A laboratóriumban Nagy Gergelyné sok terhet vett le a vállamról. Tisztelettel köszönöm Petrányi G. Győző akadémikus, az Országos Haematológiai és Immunológiai Intézet volt Főigazgatójának, dr. Földi Jánosnak és dr. Gyódi Évának hogy lehetőséget adtak ahhoz, hogy kísérleteimet az intézetben végezzem. Bármikor fordulhattam segítségért az Imungenetikai Osztály vezetőjéhez, Dr. Gyódi Évához. A laboratóriumi munkában óriási segítséget kaptam Újhelly Annától; sok kisebb és nagyobb praktikára megtanított. Sok tanácsot kaptam Garaczi Krisztinától, Pénzes Máriától és Dr Hegyesi Hargitától. Angol nyelvtani tanácsokat Forintos Évától, informatikai segítséget Szabó Tihamértól kaptam. Dr. Stenszky Valéria professzor asszonytól és Uherkovichné Paál Mária főorvostól kaptam a szerológiailag HLA-tipizált vizsgálati mintákat az RFLP vizsgálatokhoz. Köszöntettel tartozom Stenszky professzor asszonynak és Dr. Tóth Sárának, hogy megtiszteltek kritikai megjegyzéseikkel. Tisztelettel és hálával köszönöm Dr. Rajczy Katalin segítségét, aki szinte az első percektől mellettem állt. A laboratóriumi és az elméleti munka legapróbb részleteiben is türelmesen segített, ami pótolhatatlan volt számomra. 73

74 Köszönöm Vargha Péter matematikus nélkülözhetetlen segítségét a statisztikai számításokban. Dr. Kemény Sándor professzor segítsége nagyon fontos volt számomra a statisztikai fogalmak értelmezésében. Dr.Lászik András segítsége nélkülözhetelen volt számomra a tanulmányaim teljes ideje alatt. Szavak után kutakodva sem tudom kifejezni azt a hálát, amellyel feleségemnek, gyermekeimnek tartozom, a köszönetet szüleimnek és a családomnak. Nyugodt biztos hátteret biztosítottak e hosszú munkához, ami sok-sok lemondással és megalkuvással járt. Támogató, figyelmes megértésük nélkül nem juthattam volna e sorokig. 74

75 8. Az értekezés alapjául szolgáló közlemények jegyzéke Első szerzős publikációk 1. Keresztury L., Lászik A., Pénzes M., Hegyesi H., Falus A.: Application of a chemiluminescent labeled single locus probe in the detection of repetitive nucleotide sequences on the human 6-th chromosome, Med. Sci. Monit. 4(4): , L. Keresztury, A. Lászik, H. Hegyesi, A Falus.: DNA profiling by detection of repetitive nucleotide sequences on human chromosome 6, Acta Biologica Hungarica 53 (4),pp Keresztury L., Rajczy K., Lászik A., Falus A., Gyódi É., Petrányi G.Gy.: Combination of DNA-based and conventional methods detecting HLA polymorphism and its utilization for paternity testing, The American Journal of Forensic Medicine and Pathology, 2002 Mar;23(1): Keresztury L, Rajczy K, Tauszik T, Gyodi E, Petranyi GG, Falus A.: DNA Typing Revealing High HLA-Cw Polymorphism Completes Availability of Major Histocompatibility Complex Loci in Forensic Medicine, The American Journal of Forensic Medicine and Pathology, 2003 Mar;24(1):70-75 Társszerzős közlemények 1. Lászik A., Weisser H.-J., Keresztury L., Pollak S.: Allele frequencies for the VNTR locus D17S5 (YNZ22) in Hungary, Int. J. Legal. Med. 112: 336, Lászik A., Falus A., Keresztury L., Sótonyi P.: DNA technology and its application in forensic medicine. A rewiew, Acta Biologica Hungarica 49 (1): 89-95, Lászik A., Weisser H.-J., Keresztury L., Pollak S., Papp G., Pozsgai I.: PCR typing of human semen stains after SEM-EDX examination, Int. J. Legal. Med. 112: , Rajczy K., Jaini R., Keresztury L., Pozsonyi E., Garaczi K., Kaur G., Gyodi E., Mehra N.K., Petrányi G.Gy.: Population expression of HLA*02 subtypes indicates a common origin for North Indians and Hungarian Gypsies (163), Eur. J. Immunogenetics, 28; 279, 2001 Közlésre benyújtva: Pénzes M., Rajczy K., Tauszik T., Gyódi É., Padányi Á., Keresztury L., Petrányi G. Gy: HLA-G polymorphism and linkage disequilibrium with HLA-A in three Hungarian population 75

76 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁHOZ KAPCSOLÓDÓ ELŐADÁSOK, POSZTEREK 1. Lászik A., Weisser H.-J., Keresztury L., Pollak S., Papp Gy.: Stabilitatät der human Spermium DNA nach Elektronenstrahl - Bestrahlung, Partnerschaftstreffen der Universitäten, Semmelweis Medizinische Universität, Universität Freiburg, Universität Heildelberg V. Symposium Budapest, május 26-27, Rajczy K., Keresztury L., Gyódi É., Pénzes M., Tauszik T., Padányi Á., Petrányi G.Gy.: HLA-C polymorphism in two, geographically isolated Hungarian population settled around XII-XIII. century, 13 th European Histocompatibility Conference, Kréta április 13-17, Rajczy K., Pénzes M., Keresztury L., Gyódi É., Petrányi G.Gy.: Molecular characterization of HLA-Cw incompatibilities in HLA-A,B,DR matched unrelated donor-recipient pairs, Central European Transplant 4 th CET Meeting november 3-6, Rajczy K., Pénzes M., Keresztury L., Bartha A., Masszi T., Gyódi É.,. Petrányi G.Gy.: Molecular characterization of HLA-Cw incompatibilities in HLA-A,B,DR matched unrelated donor-recipient pairs, 14 th European Histocompatibility Conference Montpellier április Rajczy K., Pénzes M., Keresztury L., Gyódi É., Petrányi G.Gy.: Molecular characterization of HLA-Cw incompatibilities in HLA-A,B,DR matched unrelated donor-recipient pairs, Magyar Immunológiai Társaság XXIX. Kongresszusa, Bük, október 27-29, Rajczy K., Jaini R., Keresztury L., Pozsonyi E., Garaczi K., Kaur G., Gyodi E., Mehra N.K., Petrányi G.Gy.: Population expression of HLA*02 subtypes indicates a common origin for North Indians and Hungarian Gypsies; 15 th European Histocompatibility Conference Granada, Spanyolország, március 28, Pozsonyi É., Rajczy K., Garaczy K., Pénzes M., Keresztury L., Barta A., Kriván G., Masszi T., Nagy K., Gyódi É., Pálóczi K., Petrányi G.Gy: A DNS szintű HLAmeghatározások szerepe a nem teljesen egyező csontvelődonorok kiválasztásában. Az eltérések összefüggése a transzplantációs szövődményekkel. MHTT XVIII. Kongresszusa Pécs május

77 9. Irodalomjegyzék 1. Kahn R.: An introduction to DNA structure and genome organization In: Farley M.A., Harrington J.J.: Forensic DNA technology, Lewis Publishers Inc., Harcourt Brace Jovanovich Publ., San Diego pp 51-62, Kirby L.T.: DNA fingerprinting, Stockton Press New York, London, Tokyo, Melbourne, Hong Kong pp , Simons M.J.: HLA DNA identityping In: Robertson J., Ross A.M., Burgoyne L.A.: DNA in forensic science, theory, techniques, application, Ellis Horwood, New York pp , Lászik A., Weisser H.-J., Keresztury L., Pollak S., Papp Gy.: Stabilitatät der human Spermium DNA nach Elektronenstrahl - Bestrahlung, Partnerschaftstreffen der Universitäten, Semmelweis Medizinische Universität, Universität Freiburg, Universität Heildelberg V. Symposium Budapest, május 26-27, Lászik A., Falus A., Keresztury L., Sótonyi P.: DNA technology and its application in forensic medicine. A rewiew, Acta Biologica Hungarica 49 (1): 89-95, Lászik A., Weisser H.-J., Keresztury L., Pollak S.: Allele frequencies for the VNTR locus D17S5 (YNZ22) in Hungary, Int. J. Legal. Med. 112: 336, Lászik A., Weisser H..-J., Keresztury L., Pollak S., Papp G., Pozsgai I.: PCR typing of human semen stains after SEM-EDX examination, Int. J. Legal. Med. 112: , Hansen HE: Forensic aspects of HLA serology, Alma. pp 1-10, Little P.: The book of genes, Nature Vol ,

78 10. Cho M.K., Magnus D., Caplan A.L., McGee D., EGG: Ethical forum consideration in synthetising a minimal genome, Science Vol , Strachan T., Read A.P.: Human molecular genetics 1 st ed. Bios Scientific Publishers Ltd., Oxford ; 2 nd ed. Bios Scientific Publishers Ltd, Oxford pp , Collins F.S.: Sequencing the human genome Hospital Practice, 15 Jan Collins F.S., Patrinos A., Jordan E., Chakravarti A., Gesteland R., Walters L., DOE, NIH: New goals for the US. Human Genome Project Science Vol.282; pp , 23 Oct Dunham I., Shimizu N., Roe BA., Chissoe S.: The DNA sequence of human chromosome 22 Nature Vol.402: , 2 Dec Knoppers B.M., Hirtle M., Glass K.C.: Commercialization of genetic research and public policy. Science, Vol 286: , 17 Dec Marshall E.: Rival genome sequencers celebrate a milestone together, Science, Vol , 30. June, Pennisi E.: Finally, the book of Life and instructions for navigating it, Science , 30 June, Kónya B.: Új tudományos paradigma a géntérkép értelmezéséhez, Recept X. évf. 8. pp 26-29, D Amaro J: HLA polymorphism in the Netherlands, Drukkerij de Kempenaer, Oesgstgeest pp 15-41, Csiky O., M. Bujdosó Gy., H. Váczy Zs.: Apasági perek, HVG-ORAC Lap- és Könyvkiadó, Budapest ,

79 21. Fowler J.C.S., Burgoyne L.A., Scott A.C., Harding H.W.J: Repetitive deoxyribonucleic acid (DNA) and human genome variation - a concise review relevant to forensic biology, J. Forensic Sci. Vol. 33. No , Rothwell N.V. : Understanding genetics, John Wiley & Sons, Inc, Publication, New York pp , Jeffreys A., Wilson V., Thein S.L.: Hypervariable minisatellite regions in human DNA, Nature Vol March , Nakamura Y., Leppert M., O Connel P., Wolff R., Holm T., Culver M., Martin C., Fujimoto E., Hoff M., Kumlin E., White E.: Variable number of tandem repeat markers for human gene mapping, Science Vol.235, March , Dyer P., Middleton D.: Histocompatibility testing. A practical approach, Irl Press at Oxford University Press, Oxford pp 1-10, Bodmer J.G., Marsh S.G.E., Albert E., Bodmer W.F., Bontrop R. E., Dupont B., Erlich H. A., Hansen J. A., Mach B., Mayr W. R., Parham P., Petersdorf E. W., Sasasuki T., Schreuder G. M. T., Strominger J. L., Svejgaard A., Terasaki P. I.: Nomenclature for factors of the HLA system, 1998.; Tissue Antigens, , 1999.; Human Immunology, 60, , 1999.; European Journal of Immunogenetics, 26, , Terasaki P.I., McLelland J.D.: Microdroplet assay of human serum cytotoxins, Nature 204: , Ray, J. G. Jr.ed. NIAID manual of Tissue Typing techniques 1979:1980, NIH Publication No Bethesda, MD: US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health,

80 29. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. : Molecular Cloning, A laboratory manual, 2 nd ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, pp , Wassmuth R: Molecular analysis of HLA polymorphism and relevance for transplantation, Biotest Bulletin 5; , Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A., Struhl K.: Short protocols in molecular biology 2 nd ed. Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, pp 2-26, Towner P.: Purification of DNA In: Brown T.A.: Essential molecular biology, IRL Press, Oxford University Press Oxford, New York, pp 47-55, Jones P.: Electrophoresis, nucleic acids, essential techniques, John Wiley and Sons Chichester pp 10-12, Patel D.: Gel electrophoresis essential data, Bios Scientific Publishers Ltd, Wiley pp 3-4, Westermeier R.: Electrophoresis in practice, a guide to methodds and applications of DNA and protein separations 2 ND ed. VCH a Wiley Company pp 71-75, Dunbar B.S.: Two-dimensional electrophoresis and immunological techniques, Plenum Press New York and London, pp 4-8, Dowling T.E, Moritz C., Palmer J.D.: Nucleic acids II: Restriction site analysis In: Hillis D.M., Moritz C.: Molecular systematics, Sinauer Assosiates, Inc. Publishers Sunderland, Massachusetts U.S.A., pp , Váradi A., Papp Z.:Klinikai molekuláris genetika In: Papp Z.: Klinikai genetika Golden Book Kiadó, Budapest pp ,

81 39. Bruford M.W., Hanotte O., Brookfield J.F.Y., Burke T: Single-locus and multilocus DNA fingerprinting In: Hoelzel A.R.: Molecular genetic anaysis of populations, a practical approach, Irl Press at Oxford University Press Oxford pp , Holtz J., Schönborn-Sobolewski, Urmetz S.: DNA typing using PCR amplified fragments in the HLA class I region In: Berghaus G., Brinkmann B., Rittner C., Staak M.: DNA technology and its forensic application, Springer-VerlagBerlin, Heildelberg pp 79-85, Yap E.P.H., Lo Y.-M.O., Fleming K.A., McGee J.O'D: Falese-positives and contamination in PCR In: Griffin HG, Griffin AM: PCR technology current innovation, CRC Press pp , Lászik A., Sótonyi P.: DNS-vizsgálatok az igazságügyi orvostanban In: Kopper L., Marcsek Z., Kovalszky I: Molekuláris medicina, Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest pp , Ota M., Inoko H., Seki T., Ichinose A., Honda K., Tsuji K., Fukushima H.: Application of HLA-class II genotyping by the modified PCR-RFLP method to the forensic science, Advances in Forensic Haemogenetics 4. Springer-Verlag, Berlin, Heildelberg pp 90-91, Budowle B., Sajantila A., Hochmeister M.N., Comey C.T.: The application of PCR to forensic science In: Mullis K.B., Ferré F., Gibbs R.A.: The polymerase chain reaction, Birkhäuser, Boston pp , Saiki,R. K.,Walsh, P. S., Levenson, C. H, Erlich,H. A: Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 86, ,

82 46. Bugawan T.L., Begovich A.B., Erlich H.A.: Rapid HLA-DPB typing using enzymatically amplified DNA and nonradioactive sequence-specific oligonucleotide probes, Immunogenetics 32, , Olerup O, Zetterquist H.,: HLA-DRB1*01 subtyping by allele-specific PCR amplification: A sensitive, specific and rapid technique, Tissue Antigens, 37: , Olerup O, Zetterquist H.,: HLA-DR typing by PCR amplification with sequencespecific primers (PCR-SSP) in 2 hours: An alternative to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matching in cadaveric transplantation, Tissue Antigens 39: , Olerup O., Aldener A., Fogdell A..: HLA-DQB1 and DQA1 typing by PCR amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP) in 2 hours. Tissue Antigens Mar. 41: Sadler A.M., Peronzelli F., Krausa P., Marsch S.G.E., Guttridge M.G., Browning M.J., Bodmer J.G.: Low-resolution DNAtyping for HLA-B using sequence-specific primers in allele - or group-specific ARMS / PCR, Tissue Antigens, 44: , Old J.M.: Detection of mutations by the amplification refractory mutation system (ARMS) In: Mathew CG: Protocols in human molecular genetics, Humana Press Inc. Clifton, New Jersey pp 77-84, Newton C.R., Graham A.: P C R, Bios Scientific Publishers, Oxford pp 99-10, Liandong Ma, Penfornis A., Wang X., Schoenfeld D., The DiMe, Tuomilehto-Wolf E., Metcalfe K., Hitman G., Faustman D.: Evaluation of TAP 1 polymorphisms with insulin dependent diabetes mellitus in finnish Diabetic patients, Human Immunology 53, ,

83 54. Rajalingam R., Singal D.P., Mehra N.K.: Transporter associated with antigenprocessing (TAP) genes and susceptibility to tuberculoid leprosy and pulmonary tuberculosis, Tissue Antigens 49; , Tumolo A., Nguyen Q., Witney F., Murphy O.J., Voyta J.C., Bronstein I.: Detection of DNA on membranes with alkaline phosphatase-labeled probes and chemiluminescent AMPPD substrate In: Kricka L.J.: Nonisotopic DNA probe techniques, Academic Press, Harcourt Brace Jovanovich, Publishers San Diego pp , The 12 th International Histocompatibility Workshop Anthropology Component. In: Chasson D (ed.): HLA, volume 1. Paris: EDK, Bunce M., Barnardo M. C. N. M., Procter J., Marsh S. G. E., Vilches C., Welsh K. I.: High resolution HLA-C typing by PCR-SSP: identification of allelic frequencies and linkage disequilibria in 604 unrelated random UK Caucasoids and a comparison with serology, Tissue Antigens, 50: , Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F.:a simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acid Research, 16: , Lahiri D.K., Nurnberger J.I.Jr.: A rapid non-enzymatic method for the preparation of DNA from blood for RFLP studies, Nucleic Acids Res. 19: , Vergnaud G., Mariat D., Apiou F., Aurias A., Lathrop M., Lauthier V.: The use of synthetic tandem repeats to isolate new VNTR loci: Cloning of a human hypermutable sequence, Genomics , Browning M., Krausa P.: Genetic diversity of HLA-A2: evolutionary and functional significance, Immunology Today, Vol.17 No

84 62. Krausa P., Brywka M.3 rd, Savage D., Hui K.M., Bunce M., Ngai J.L., Teo D.L., Ong Y.W., Barouch D., Allsop C.E.: Genetic polymorphism within HLA-A*02: significant allelic variation revealed in different populations. Tissue Antigens, 45:223-31, Arnett K.L., Parham P.:HLA Class I nucletide sequences, Tissue Antigens 45: Carcassi C., Krausa P., Bodmer J., Contu L., Browning M.: Characterization of HLA-A*02 subtypes in the Sardinian population. Tissue Antigens 46:391, Krausa P., Barouch D., Bodmer J.G., Browning M.J.: Rapid characterisation of alleles of highly polymorphic genes by gene mapping using ARMS PCR. Eur. J. Immunogenet. 22:283, Krausa P., Brywka M., Savage D., Hui K.M., Bunce M., Ngai J.L.F., Teo D.L.T., Ong Y.W., Barouch D., Allsop CEM, Hill A.V.S., McMichael A.J., Bodmer J.G., Browning M.J.: Genetic polymorphism within HLA-A*02 - significant allelic variation revealed in different populations. Tissue Antigens 45:223, Sudo T., Kamikawaji N., Kimura A., Date Y., Savoie C.J., Nakashima H., Furuichi E., Kuhara S., Sasazuki T.: Differences in MHC Class I Self Peptide Repertoires Among HLA-A2 subtypes. J. Immunol 155:4749, Krausa P., Browning M.,: Detection of HLA gene polymorphism In: Browning M, McMichael A: HLA and MHC: genes, molecules and function Bios Scientific Publisher pp , The 12 th International Histocompatibility Workshop and Conference, St. Malo, Paris Alleles Haplotypes Societies,

85 70. Edwards A., Hammond H. A., Jin L., Caskey C. T., Chakraborty R.: Genetic variation at five trimeric and tetrameric tandem repeat loci in four human population groups, Genomics, , Laber L., O Connor J.M., Iverson J.T., Liberty J.A., Bergman D.L.: Evaluation of four DNA extraction protocols for DNA yield and variation in RFLP sizes under varying gel condition, Journal of Forensic Science Vol.37 No.2. March pp , Devlin B., Risch N.: A note on Hardy-Weinberg equilibrium of VNTR data by using the Federal Bureau of Investigation's fixed-bin method, Am. J. Hum. Genet. 51: , Weir B.S.: Independence of VNTR alleles defined as fixed bins, Genetics 130: , 1992 (April) 74. Weir B.S.: Independence of VNTR alleles defined as floating bins, Am. J. Hum. Genet. 51: , Budowle B, Giusti AM, Waye JS, Baechtel FS, Fourney RM, Adams DE, Presley LA, Deadman HA, Monson KL: Fixed-bin analysis for statistical evaluation of Continuous distributions of allelic data from VNTR loci, for use in forensic comparisons, American Journal of Human Genetics, Vol. 48.: , Aitken C.G.G.: Statistics and the evaluation of evidence for forensic scientists, John Wiley & Sons Chichester pp , Inman K., Rudin N.: An introduction to Forensic DNA analysis, CRC Press Boca Raton, New York pp 87-91,

86 78. Sensabaugh G.F.: Biochemical markers of individuality In: Saferstein R: Forensic science handbook, Regents / Prentice Hall Englewood Cliffs, New Yersey, pp , Guo S., Thompson E.: Performing the exact test of Hardy-Weinberg proportion for multiple alleles. Biometrics 48: , Levene H.: On a matching problem arising in in genetics. Annals of Mathematical Statistics 20, 91-94, Slatkin M.: Linkage disequilibrium in growing and stable populations. Genetics 137: , Slatkin M., : A correction to the exact test based on the Ewens sampling distribution. Genet Res. 68: , Lewontin R.C., K.Kojima: The evolutionary dynamics of complex polymorphisms. Evolution 14: Schneider S., Roessli D., Excoffier L (2000) Arlequin ver.2.000: A software for population genetics data analysis. Genetics and Biometry Laboratory,University of Geneva, Switzerland 85. Mayr W.R.: Das HLA system in der Paternitätsserlogie. Z. Rechtsmedizin, pp 75, Mehra N.K.: The HLA genes and their diverse polymorphism, Indian Journal of Clinical Biochemistry, 15(Suppl.) , Immunrendszerhez kötött polimorfizmusok funkcionális és patológiai jelentősége In: Petrányi Gy.: Az immungenetika alapjai, Medicina Könyvkiadó Budapest, pp ,

87 88. Grundschober C., Rufer N., Sanches-Mazas A., Madrigal A., Jeannet M., Roosnek E., Tiercy J.-M.: Molecular characterization of HLA-C incompatibilities in HLA- ABDR-matched unrelated bone marrow donor-recipient pairs. Tissue Antigens 49: , Mytilineos J., Christ U., Lempert M., Opelz G.: Comparison of typing results by serology and polymerase chain reaction with squence-specific primers for HLA-Cw in 650 individuals, Tissue Antigens, 50: , Lee H.C., Ladd C., Bourke M.T., Pagliaro E., Tirnady F.: DNA typing in forensic science, he Am. J. Forensic Med. and Path. 15(4): , Lechler R.: HLA and disease, Academic Press, Harcourt Brace and Company, Publishers London pp , Gakarnsky D.M., Davis D.M., Strominger J.L., Pecht I.: Assembly and dissociation of human leukocyte antigen (HLA)-A2 studied by real-time fluorescence resonance energy transfer, Biochemistry, Sep., 12;39 (36): , Meng W.S., von Grafenstein H., Hawoth I.S.: Water dynamics at the binding interface of four different HLA-A2-peptide complexes, Int. Immunol., Jul; 12(7): , Moses J.H., Greville W.D., Downes J., McClenahan W., Kennedy A., Dunckley H.: A new HLA-A*02 allele, A*0234, detected by polymerase chain reaction using sequence-specific primers (PCR-SSP), Tissue Antigens, Febr., 55(2): 175-7, Ellis J.M., Henson V., Slack R. Ng. J., Hartzman R. J., Katovich H.C.: Frequencies of HLA A2 alleles in five U.S. population groups. Predominance of A*02011 and identification of HLA-A*0231, Hum. Immunol. Mar.,61(3): ,

88 96. Fleischhauer K., Zino E., Mazzi B., Severini G.M., Benazzi E., Bordignon C.: HLA- A*02 subtype distribution in Caucasians from northern Italy : identification of A*0220. Tissue Antigens Dec. 48(6): pp 673-9, Frasca L., Tamir A., Jurcevic S., Marinari B., Monizio A., Sorrentino R., Carbonari M., Piccolella E., Lechler R.I., Lombardi G.: Peptide analogues as a strategy to induce tolerance in T cells with indirect allospecificity, Transplantation, Aug (4): , Gatz S.A., Pohla H., Schandel D.J.: A PCR SSP method to specifically select HLA-A*0201 individuals for immunotherapeutic studies. Tissue Antigens June 55(6):532-47, Toth H., Savole C.J., Kamikawaji N., Mute S., Sasazuki T., Kuhara S.: Changes at the floor of the peptide-binding groove induce a strong preference for proline at position 3 of the bound peptide: molecular dynamics stimulations of HLA-A*0217, Biopolymers, Oct.15., 54(5): , Yazaki M., Takahashi T., Ito Y., Ito T., Mori C., Wada Y.: Generation of HLA- A2 subtype specific T lymphocytes from cord blood used for cord blood stem cell transplantation, Bone Marrow Transplant, Aug., 26(4): 451-3, Muts M., Date Y., Ichiyima M., Moriwaki Y., Mori R., Kamikawayi N., Kimura A., Sasazuki T., Aragami C.: Significance of ntibodies to streptococcal M protein in psoriatic arthritis and their association with HLA-A*0207. Tissue Antigens Dec. 48(6): pp , Payami H, Schellenberg GD, Zareparsi S, Kaye J, Sexton GJ, Head MA, Matsuyama SS, Jarvik LF, Miller B, McManus DQ, Bird TD, Katzman R, Heston L, Normann D, Small GW,: Evidence for association of HLA-A2 allele with onset age of Alzheimer s disease. Neurology, Aug. 49 (2) pp ,

89 103. Batalia M.A., Kirksey T.J., Sharma A., Jiang L., Abastado J.P., Yan S., Zhao R., Collins E.J.: Class I MHC is stabilized against thermal denaturation by physiological concentrations of sodium chloride, Biochemistry, Aug. 1.39(30): , Komlos L., Hart J., Klein T., Livni E., Notmann J., Vardimon D., Ben-Rafael Z., Halbrecht I.,: Contribution of class I HLA-A2 antigen in immune reactions. Med. Hypotheses, 45, pp 54-58, Rajczy K., Jaini R., Keresztury L., Pozsonyi E., Garaczi K., Kaur G., Gyodi E., Mehra N.K., Petrányi G.Gy.: Population expression of HLA*02 subtypes indicates a common origin for North Indians and Hungarian Gypsies; 15 th European Histocompatibility Conference Granada, Spanyolország, március 28, Cecuk-Jelicic E., Grubic Z., Zunec R., Labar B., Kerhin-Brkljacic V., Kastelan A.: Implication of molecular analysis of HLA-A*02 subtyping for unrelated bone marrow donor selection. Bone Marrow Transplant, Dec. 22 suppl..4:s27-30, DeVito-Haynes L.D., Janowska-Gan E., Sollinger H.W., Knechtle S.J., Burlingham W.J.: Monitoring of kidney and simultaneous pancreas-kidney transplantation rejection by release of donor-specific, solublem HLA class I. Hum Immunol., 40(3) pp , Sanchez-Mazas A., Steiner Q.-G, Grundschober C., Tiercy J.-M.: The molecular determination of HLA-Cw alleles in the Mandenka (West Africa) reveals a close genetic relationship between Africans and Europeans, Tissue Antigens, 56: , Day S., van Dam M., Buckland E., Dunn P.P.J., Ross J.: Identification of a new variant HLA-Cw*1507, differing from Cw*1502 only at the KIR related dimorphism of codons 77 and 80, Tissue Antigens, 53: ,

90 110. Den Haan J.M., Sherman N.E., Blokland E., Huczko E., Koning F., Drijfhout J.W., Skipper J., Shabanovitz J., Hunt D.F., Engelhard V.H.: Identification of a graft versus host disease-associated human minor histocompatibility antigen. Science, 268 (5216) pp , Marsch S. G. E., Parham P., Barber C. D.: The HLA facts book Acadamic Press London pp 46-51, Santos S., Vicario J.L., Aviles M.J., García-Sánches F., Balas A.: HLA- Cw*1404: a new HLA-C allele with a híbrid 77Asn-80Asn NK motif, Immunogenetics 51: , Bishara A., Amar A., Brautbar C., Condiotti R., Lazarovitz V., Nagler A.: The putative role of HLA-C recognition in graft versus host disease (GVDH) and graft rejection after unrelated BMT. Exp. Haematol. 23 (14) , Hurley C.K., Schreuder G. M. T., Marsh S. G. E., Lau M., Middleton D., Noreen H.: The search for HLA-matched donors: a summary of HLA-A*, -B*, -DRB1 / 3 / 4 / 5* alleles and their association with serologically defined HLA-A, -B, -DR antigens, Tissue Antigens 50: , Pénzes M., Rajczy K., Gyódi É., Petrányi G.Gy: Influence of HLA-DPB1 mismatches on MLR responses: the role of high resolution HLA Class II typing and the MLC in the unrelated donor selection for BMT. Bone Marrow Transplantation 22. S4:32-37, Rajczy K., Pénzes M., Keresztury L., Gyódi É., Petrányi G.Gy.: Molecular characterization of HLA-Cw incompatibilities in HLA-A,B,DR matched unrelated donor-recipient pairs, Central European Transplant 4 th CET Meeting november 3-6,

91 117. Rajczy K., Pénzes M., Keresztury L., Gyódi É., Petrányi G.Gy.: Molecular characterization of HLA-Cw incompatibilities in HLA-A,B,DR matched unrelated donor-recipient pairs, Magyar Immunológiai Társaság XXIX. Kongresszusa, Bük, október 27-29, Rajczy K., Pénzes M., Keresztury L., Bartha A., Masszi T., Gyódi É.,. Petrányi G.Gy.: Molecular characterization of HLA-Cw incompatibilities in HLA-A,B,DR matched unrelated donor-recipient pairs, 14 th European Histocompatibility Conference Montpellier, Franciaország, április Scott L.J. O'Shea M., Bunce J-M, Tiercy R., Argüello H., Firman J., Goldman H.G., Prentice A-M., Little J., Madrigal A.: Molecular typing shows a high level of HLA Class I incompatibility in serological well matched donor/patient pairs : implications for unrelated bone marrow donor selection, Blood vol. 92, No. 12 (15 Dec.) , Rajczy K., Keresztury L., Gyódi É., Pénzes M., Tauszik T., Padányi Á., Petrányi G.Gy.: HLA-C polymorphism in two, geographically isolated Hungarian population settled around XII-XIII. century, Eropean Federation for Immunogenetics, Kréta, április 13-17, Keresztury L., Lászik A., Pénzes M., Hegyesi H., Falus A.: Application of a chemiluminescent labeled single locus probe in the detection of repetitive nucleotide sequences on the human 6-th chromosome, Med. Sci. Monit. 4(4): , Orrego C., King M.C.: Determination of familiar realtionships In: Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J.: PCR protocols. A guide to methods and applications Academic Press, Inc. Harcourt Brace Jovanovich, Publishers, San Diego pp ,

92 123. Keresztury L., Rajczy K., Lászik A., Falus A., Gyódi É., Petrányi G.Gy.: Combination of DNA-based and conventional methods detecting HLA polymorphism and its utilization for paternity testing (Közlésre benyújtva) 124. Chakraborty R., Kidd K.K.: The utility of DNA typing in forensic work, Science Vol , 20 Dec Risch N.J., Devlin B.: On the probability of matching DNA fingerprints, Science Vol , Roberts L.: DNA-fingerprinting: Academy Report, Science Vol , Balazs I.: Forensic applications, Current Op. In Biotech. 3:18-23, Füredi S., Woller S., Pádár Zs.: Hungarian population data for the STR systems THO1 and vwa, Int. I.Legal. Med., 108:48-49, Foissac A., Salhi M., Cambon-Thomsen A.: Microsatellites in the HLA-region: 1999 update, Tissue Antigens 55: , Sanchez-Mazas A., Steiner Q.-G., Grundschober C., Tiercy J.-M: The molecular determination of HLA-Cw alleles in the Mandenka (West Africa) reveals a close genetic relationship between Africans and Europeans, Tissue Antigens 56: , Braun-Prado K., Mion A.L.V., Pereira F.,Culpi L., Petz-Erler M.L.: HLA CLASS I polymorphism, as characterised by PCR-SSOP, in a Brazilian exogamic population, Tissue Antigens, 56: ,

93 132. Vilches C., Bunce M., van Dam M., de Pablo R.: A new pair of HLA-C alleles, Cw*12042 and Cw*1203, differing at the KIR-related dimorphism of codons 77-80, Tissue Antigens, 51: , 1998 Az értekezésben közölt ún. "hálóhely" és Internet-cím: Az ARLEQUIN populációgenetikai szoftverrel kapcsolatban: [email protected] Kemilumineszcens jelölés kapcsán: [email protected] [email protected] VNTR-lókuszok és egyéb genetikai információk: