Molekuláris genetika a hal génmegőrzésben - eredmények és trendek -

Átírás

1 Molekuláris genetika a hal génmegőrzésben - eredmények és trendek - Dr. Lehoczky István tudományos főmunkatárs Gödöllő

2 Bevezetés - az emberiség által elfogyasztott halmennyiség felét még ma is a természetes vizekben, elsősorban a tengerekben halászott/fogott halak adják - az akvakultúra jelenleg az emberiség által elfogyasztott állati fehérje mintegy 15%-át adja, ez az arány még magasabb a világ szegényebb, fejlődő felén - a 2050-re becsült emberi populáció élelmezéséhez, 1,5-2x annyi élelmiszert kell termelni, mint ma - mivel a természetes vizekben a halfogás stagnál vagy csökken, a növekvő igényt csak az akvakultúrás termelés növelése tudja kielégíteni Forrás: FAO

3 Bevezetés - a baromfi-, sertés-, juh-, nyúl- és marhahús már régóta nem a vadászatból származik - az állattenyésztés többi ágazatához képest a halak és egyéb vízi élőlények háziasítása és tenyésztése több ezer éves késéssel indult el - a későbbi kezdést gyors fejlődés kompenzálja (az akvakultúra robbanásszerű fejlődése az elmúlt 40 évben) - ahhoz, hogy az akvakultúra fejlődési üteme töretlen maradjon, elengedhetetlen a vízi genetikai erőforrások megőrzése és fenntartható használata Forrás: FAO

4 Bevezetés Forrás: Jeney és mtsai 2011.

5 Bevezetés A világ akvakultúra termelését négy nagy csoport adja: Halak 30 millió tonna (értékben 55%), Kagylófélék 14 millió tonna (értékben 15%), Rákfélék 4 millió tonna (értékben 20%) Vízinövények 14 millió tonna (értékben 10%) (forrás: Sorgeloos, 2010)

6 Bevezetés Forrás: Jeney és mtsai 2011.

7 Bevezetés A Biológiai Sokféleség Egyezmény(1995): genetikai erőforrás bármely növényi, állati, mikrobiális vagy más eredetű, az öröklődés funkcionális egységeit tartalmazó anyag A FAO szerint élelmiszer- és mezőgazdasági célú vízi genetikai erőforrás : a vízi élőlényekből származó genetikai erőforrások, amelyeket emberi fogyasztásra szántak mint élelmet, tápanyagot és gyógy-anyagot, vagy az élelmiszer iparban használják, továbbá a természetes vizekből, vagy tenyésztésből származnak, ideértve az állománynövelést, a horgászatot és az akváriumi halak termelését is

8 Bevezetés Genetikai erőforrás - Genetikai diverzitás: - a mutáció és szelekció eredménye: a mutáció létrehozza, a szelekció csökkenti a változatosságot - egy egyeden (populáción, fajon) belüli genetikai sokféleség - polimorfizmus: a polimorf lókuszok aránya, az allélek száma lókuszonként stb. - egyed max. 2 allél; populációban lehet több is - homo- és heterozigócia: adott lókuszon azonos v. eltérő allél az apai és az anyai kromoszómán - emiatt biokémiai, fiziológiai stb. sokféleség már a szervek és a folyamatok szintjén is

9 Na jó, megőrizzük de hogyan is csináljuk? természetes populáció vagy tenyésztett fajta, nincsenek genetikai információink megőrzés: - in-situ - ex-situ (in vivo és in vitro) genetikai diverzitás vizsgálatok: genomi vagy mitokondriális markerek

10 Genetikai változatosság vizsgálata Mi kellett hozzá? - Crick és Watson DNS modellje, 1953; Orvosi Nobel díj a DNS polimeráz izolálása T. aquaticusból, Frederick Sanger leírja a DNS szekvenálás egyik módszerét, 1977; Nobel díj Kary Mullins leírja a PCR módszert, 1983; Nobel díj

11 Milyen markereket használ(t)unk? fehérje és enzim polimorfizmus: - van genetikai háttere, de kisebb változatosság, mint a DNS szintjén, kisebb felbontás, elavult mitokondriális DNS: - egy rövid gyűrű alakú kromoszóma (kevés gén, létfontosságú gének,kisebb variabilitás), kivéve D-loop, ez nem íródik át (lehet variábilis), csak anyai ágon öröklődik, általában fajszintű meghatározásra alkalmas (pl. hibridek kimutatása, filogenetikai vizsgálatok)

12 Milyen markereket használ(t)unk? sejtmagi (nukleáris) DNS: - több kromoszóma, sok gén, nagy változatosság - kromoszóma szám: legfeljebb fajszintű elkülönülés ivar (X, Y vagy W és Z kromoszóma) - strukturális gének: kifejeződnek (expresszálódnak) (van szelekció, de lehet variábilis) - szatellita DNS: parazita, nem fejeződik ki, nem kódol semmit, nincs áll szelekció alatt ( sokféle mutáció, sok példányban ismétlődő szakaszok, repetitív szekvenciák, STR: short tandem repeat) hipervariábilisek

13 Milyen markereket használ(t)unk? RFLP (Restriction fragment lenght polymorphism): - a polimorfizmusok kodominánsan öröklődnek, függetlenek a génexpressziótól - a DNS-szekvenciában meglévő különbségeket közvetlenül tükrözik - az egész genomról vagy annak bármelyik komponenséről információt adnak, a variációt nem csak a kódoló régióban mutatják ki - elvben valamennyi mutációs eseményt is jelzik - de idő-, pénz- és munkaigényes módszer, valamint izotópos jelöléskor az óvórendszabályok be nem tartása esetén veszélyes lehet

14 Bevezetés PCR alapú markerek RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA): - a módszerrel a genom ismeretlen DNS szekvenciáit lehet felszaporítani 1 vagy 2 önkényesen választott, 10 nukleotidból álló (10mer) primerrel (pl. GGTGACGCAG) - az amplifikáció kiindulását képező primer(ek) a genomon véletlenszerűen hibridizál(nak) a komplementer szekvenciával - dominánsan öröklődik, 1 allél kimutatására alkalmas, nehezen reprodukálható, nem tudhatjuk, hogy a genom melyik részét vizsgáljuk, viszont nem kell hozzá előzetes szekvencia információ, olcsó

15 Milyen markereket használ(t)unk? Mikroszatellit DNS markerek: - olyan egyszerű szekvencia ismétlődések, amelyek rövid (1-6 bázispár) tandem ismétlődő DNS szekvenciákat tartalmaznak, és amelyeket mindkét oldalról egyedi DNS szekvenciák határolnak Például: ATGAATATCGAT CACACACACACACACA CCAGTAGATCAG egyedi határoló szekvencia mikroszatellit egyedi határoló szekvencia

16 Milyen markereket használ(t)unk? Mikorszatellit DNS markerek: - az eukarióta genomban széles körben elterjedtek - az egyedi határoló szekvenciák lehetővé teszik ezen markerek PCR reakció során történő amplifikálását - a különböző hosszúságú mikroszatellitek (fragmensek) jelenítik meg a különböző alléleket - kodominánsan öröklődnek ( mindkét allélt látjuk heterozigóta egyedek esetén, neutrálisak (nem hat rájuk a szelekció, hiszen nem kódolnak semmit) - ismerni kell hozzájuk valamennyire a genomot (hogy primereket lehessen tervezni

17 Milyen markereket használ(t)unk? SNP (Single Nucleotide Polymorphism) -az egypontos nukleotid polimorfizmus egy nukleotid megváltozásával létrejött variációtípus, DNS-szekven ciaváltozat - mendeli módon öröklődnek, kodomináns markerek,alacsony mutációs rátával, - genotípus frekvencián alapuló statisztikai módszerekkel elemezhetők gyakran adaptív jellegekkel társíthatók - aszerint, hogy a genomban hol jönnek létre, más-más következményekkel járnak - előfordulhatnak a gének kódoló vagy nem-kódoló részeiben, illetve intergénikus régiókban

18 Milyen markereket használ(t)unk? SNP (Single Nucleotide Polymorphism) - kódoló részben megkülönböztetünk szinonim és nem-szinonim SNP-ket - a szinonim olyan báziscserét jelent, amely,,csendes mutációt okoz, megváltozik a kodon, de továbbra is ugyanazt az aminosavat kódolja - nem szinonim SNP esetén a bázis megváltozása más aminosav kódolását idézi elő (,,missense típus) vagy új, de értelmetlen mutáció jön létre (,,nonsense típus) - sok van belőlük, új generációs szekvenálással vagy microrray segítségével egyszerre rengeteg (több ezer) ponton is vizsgálhatjuk a genomot -nagy információtartalom

19 Milyen markereket használ(t)unk? Genetikai markerek fejlődése: - egyes jellemző markerek keresése - marker csoportok együttes elemzése (PLEX) - genom szintű vizsgálat (a teljes mag DNS szekvenálása, teljes bázissorrend) - több marker (nagyobb változatosság, nagyobb felbontású vizsgálatok

20 Na jó, megőrizzük de hogyan is csináljuk? természetes populáció vagy tenyésztett fajta, nincsenek genetikai információink megőrzés: - in-situ - ex-situ (in vivo és in vitro) genetikai diverzitás vizsgálatok: genomi vagy mitokondriális markerek

21 Na jó, megőrizzük de hogyan is csináljuk? Helye szerint: In situ Ex situ Formája szerint: In vitro In vivo A genetikai anyag megőrzése Az optimális megoldás: mindkét módszer együttes alkalmazása!

22 Na jó, megőrizzük de hogyan is csináljuk? In vivo Élő állományok fenntartása A genetikai anyag megőrzése fajtapopuláció fenntartó tenyésztése magán és kormányzati kezdeményezéssel és támogatással Hátrányai: drága, munkaerő igényes, kockázatos (betegségek, ragadozók, természeti katasztrófák) In vitro: - mélyhűtött sperma tárolása - korai embrionális sejtek mélyhűtött tárolása (BCs, PGCs) - későbbi felhasználás: mesterséges termékenyítés és kiméra előállítás formájában - génbankok: szövetek, DNS minták, nukleotidszekvenciák tárolása Az optimális megoldás: mindkét módszer együttes alkalmazása!

23 Na jó, megőrizzük de hogyan is csináljuk? Ex situ génmegőrzés, kitekintés a világra - Csehország, Vodnany: ponty, szivárványos pisztráng, compó, szürkeharcsa, marénafélék, tokfélék in vivo és in vitro megőrzése - Norvégia: atlanti lazac in vivo és in vitro megőrzése - Kína: kínai pontyfélék élő génbankja és spermabank fenntartása - Fülöp szigetek: Tilápia élő génbank és fagyasztott spermabank - Oroszország: Tokfélék élő génbankja

24 Hazai helyzet - hazai haszonhalaink közül csak a ponty és a szivárványos pisztráng számít domesztikáltnak, háziasítottnak - a többi faj esetében csak szaporítjuk, neveljük a halakat, nincsenek fajták sem - tenyésztői munkát kellene végezni a jobb termelési paraméterek elérése érdekében (klasszikus szelekciós módszerek, modern eszközök - molekuláris genetika)

25 Hazai helyzet - ehhez ma senki nem rendelkezik olyan állományokkal, amelyeket a magas szintű tenyésztői munka megkezdéséhez hoztak létre és hatékonyan használhatók új fajták, vonalak és változatok kialakítására (fenotípusos és genetikai jellemzőik ismertek) - egyes haszonhalaink természetes vízi populációi nagyon meggyengültek. Okok: invazív halfajok (ezüstkárász, törpeharcsa, kínai razbóra stb.) bejövetele/behozatala, betegségek, élőhelyek megszűnése

26 A ponty génmegőrzése Ponty génbank ex situ, in vivo megőrzés - 50+!!! éves tapasztalat fajtafenntartásban, nemesítésben - jelenleg 20 pontyfajta egyedei a gyűjteményben - 24 fajta ivarterméke lefagyasztva a kriobankban - genotipizált állományok - tapasztalat visszatelepítési programokban (Nasice, Poljana, Tisza folyó)

27 A ponty génmegőrzése In vivo ponty génbank a HAKI-ban - Dr. János Bakos alapította 1962-ben

28 A ponty génmegőrzése - kezdeti célok: alapanyag biztosítása a keresztezési kísérletekhez, hibrid pontyok előállításához - mai fő cél: a genetikai erőforrások megőrzése

29 A ponty génmegőrzése

30 A ponty génmegőrzése A HAKI-ban fenntartott ponty fajták: Magyar tájfajták Bikali tükrös ponty Dinnyési tükrös ponty Felsősomogyi tükrös ponty Gödi tükör ponty Hortobágyi tükrös ponty Nagyatádi tükrös ponty Palkonyai tükrös ponty Sumonyi tükrös ponty Szarvasi tükrös ponty Szarvasi vörös tükrös ponty Szegedi tükrös ponty Tatai pikkelyes ponty Tiszai vadponty ponty Hibridek: Szarvasi 22 tükrös ponty Szarvasi 15 tükrös ponty Szarvasi P33 pikkelyes ponty Szarvasi P31 pikkelyes ponty Szarvasi P34 pikkelyes ponty Szarvasi 215 tükrös ponty Külföldi fajták Amuri vadponty Cseh pikkelyes ponty Cseh tükrös ponty Fresinet pikkelyes ponty Német tükrös ponty Nasicei tükrös ponty Lengyel oldalsoros ponty Lengyel tükrös ponty Poljanai pikkelyes ponty Poljanai tükrös ponty Ropsha pikkelyes ponty Thai pikkelyes ponty Ukrán pikkelyes ponty Vietnámi pikkelyes ponty

31 A ponty génmegőrzése

32 A ponty génmegőrzése Ex situ, in vitro génmegőrzés a HAKI ponty génbankjában: ponty sperma minták tárolása kriobankban

33 A ponty génmegőrzése A HAKI mélyhűtött sperma-génbankjában található fajták

34 A ponty génmegőrzése Molekuláris genetikai vizsgálatok a HAKI Ponty génbankjában

35 A ponty génmegőrzése A mikroszatellit analízis eredménye a genetikai távolság adatokon alapuló dendogram

36 A ponty génmegőrzése fajta/lókusz MFW1 MFW4 MFW6 MFW28 Σ Amuri vadponty 10 (2) 8 (1) 9 (3) 8 (1) 35 (7) Dunai vadponty a folyóból 13 (4) 7 (1) 15 (7) 12 (2) 47 (14) Dunai vadponty a génbankból 10 (0) 8 (1) 6 (1) 8 (0) 32 (2) Tiszai nyurga ponty a génbankból 15 (7) 10 (1) 12 (5) 11 (1) 48 (14) Koi (japán díszponty) 3 (2) 8 (1) 8 (5) 6 (0) 25 (8) Σ Az egyes mikroszatellit lókuszokon talált allélszám és egyedi allélszám adatok

37 A ponty génmegőrzése num. name group loc AM3219 GDV91 TV1988 KO3624 KO3624 classified in 1 FDV1 [ FDV9 ] AM3219!!! 2 FDV10 [ FDV9 ] GDV91 3 FDV11 [ FDV9 ] GDV91 4 FDV12 [ FDV9 ] GDV91 5 FDV13 [ FDV9 ] AM3219!!! 6 FDV14 [ FDV9 ] GDV91 7 FDV15 [ FDV9 ] GDV91 8 FDV16 [ FDV9 ] GDV91 9 FDV17 [ FDV9 ] GDV91 10 FDV18 [ FDV9 ] GDV91 11 FDV19 [ FDV9 ] GDV91 12 FDV2 [ FDV9 ] GDV91 13 FDV20 [ FDV9 ] GDV91 14 FDV3 [ FDV9 ] GDV91 15 FDV4 [ FDV9 ] AM3219!!! 16 FDV5 [ FDV9 ] GDV91 17 FDV6 [ FDV9 ] GDV91 18 FDV7 [ FDV9 ] GDV91 19 FDV8 [ FDV9 ] GDV91 20 FDV9 [ FDV9 ] GDV91 A besoroló teszt eredményei

38 A ponty génmegőrzése - végül 17 ellenőrzött genetikai hátterű anyajelölt hal került be a génbankba

39 A ponty génmegőrzése Megoldás egy problémára - a délszláv háború miatt néhány horvát ponty tájfajta elveszett - a Zágrábi Agrártudományi Egyetem és a HAKI elhatározta, hogy a génbankból visszatelepíti a fajtákat (Nasicei és Poljanai)

40 A ponty génmegőrzése Fajta lókusz Nasice Génbank Nasice Poljana Génbank Poljana MFW (3) 10 (4) 14 (4) MFW4 10 (2) 7 8 (1) 13 (2) MFW (3) 10 (3) MFW7 10 (2) 9 (1) 11 (1) 13 (3) MFW16 6 (1) 11 (5) 6 (1) 14 (4) MFW (1) 13 (1) 10 (1) 51 (5) 56 (10) 58 (11) 74 (17) átlag 8,5 9,33 9,6 12,33 Az allélok és egyedi allélok száma a 4 fajta esetén

41 A ponty génmegőrzése Allélgazdagság értékek Lókusz Nasice Génebank Nasice Fajta Poljana Génebank Poljana MFW1 8,7 11,0 8,5 11,1 MFW4 7, ,4 10,7 MFW6 5,6 5,4 8,6 7,5 MFW7 7,8 7,5 9,1 10,6 MFW16 4,6 9,4 4,4 10,6 MFW28 7,8 9,5 10,4 8,5 mean 7,0 8,1 8,1 9,8

42 A ponty génmegőrzése A fő eredmény: - a 2 fajtát visszatelepítettük anyagazdaságaikba

43 Tok génmegőrzés Tok génbank - az 50-es években kezdődött meg a tokfélék mesterséges szaporítása, ivadéknevelése, majd a génbaki állományaik kialakítása - kezdetben csak a kecsege népesítő-anyagának előállítása, a megritkult természetesvizi állományok pótlása volt. - az 1980-as évek elején a nagy értékű, intenzív rendszerekben is gazdaságosan termelhető, exportképes halfajok iránti igény miatt honosították a vicsegét, valamint a lénai tokot - ma a a fő cél a tokfélék genetikai erőforrásainak fenntartása - genetikai vizsgálatok folynak (mikroszatellit)

44 Tok génmegőrzés - 7 faj (4 őshonos) - sikeres szaporítások. - részben ismert genetikai háttér -kutatási célok -visszatelepítési programok -tenyésztési programok

45 Tok génmegőrzés

46 Sebes pisztráng génmegőrzés - a lillafüredi pisztrángtelepen található az egyik legfontosabb sebes pisztráng tenyészállomány - igen heterogén, ismeretlen genetikai származású populáció - kizárólag fenotípusos szelekció történt. - cél: származás megállapítás genetikai markerekkel, valamint egyedi azonosításra alapozott tenyésztési rendszer kidolgozása. - az állomány nagyobb részt atlanti vérvonalból származik - fontos tenyésztési cél a dunai vonal erősítése az állományban - kidolgozásra került egy egyedi jelölésen és genetikai markereken alapuló, könnyen használható szelekcióstenyésztési rendszer

47 Lápi póc génmegőrzés - Magyarországon fokozottan védett, eszmei értéke Ft - IUCN Vörös Lista sebezhető faj (vulnerable) - szerepel a természetes élőhelyek, valamint a vadon élő állatok és növények védelméről szóló 92/43/EGK irányelv (Élőhelyvédelmi irányelv) II. számú függelékében, mint közösségi jelentőségű állatfaj - felvették az 1979-ben aláírt Berni Egyezmény II. függelékébe - genetikai vizsgálatok (Takács et al. 2015) eredményei: régiók között és legtöbb esetben a régiókon belül is nagymértékű izoláció, ezért nem mindegy, hogy hová milyen állományokat telepítenek (vissza)

48 Széles kárász génmegőrzés - az ezüstkárász a legtöbb élőhelyéről kiszorította. - horgászvizekben lenne rá igény, azonban az új törvény a nem fogható kategóriába sorolja (133/2013. (XII. 29.) VM rendelet 8. melléklet). - mesterséges szaporítása és lárvanevelése kidolgozásra került - genetikai vizsgálata elindult, a diverzitás vizsgálata mellett a legfontosabb a hibrid egyedek kizárása a megőrzésből (mtdns és genomikus DNS markerek)

49 Jövőkép Gazdasági haszonhalaink génmegőrzési munkáinak elkezdése/ folytatása: - compó, széles kárász, harcsa, süllő, sügér genetikai erőforrásainak felmérése (mikoroszatellit, SNP), megőrzése (az élő- és ívóhelyek védelmével együtt!) - génbanki állományok létrehozása, cryobank - nemesítési munka megkezdése a jobb termelési paraméterek eléréséhez - (minimum)kétpólusú rendszer létrehozása

50 Kitekintés Atlanti lazac - tenyésztés a XIX. századtól - tengeri hálóketreces tartás az 1960-as évektől - nagy mennyiségű termék - profit... - kutatás finanszírozás!

51 Kitekintés 2 fő irány a kutatásban: - szelekció támogatása molekuláris markerekkel (gyorsabban, nagyobbra, kevesebb táppal, ellenállóan, gyorsabb ivaréréssel) - megőrzés (genetikai erőforrások megőrzése, hogy legyen mihez visszanyúlni, a fő probléma szökés a hálóketrecekből, betegségek, genetikai integritás megszűnése, eredeti állományok eltűnése)

52 Kitekintés Accuracy of Assignment of Atlantic Salmon (Salmo salar L.) to Rivers and Regions in Scotland and Northeast England Based on Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Markers John Gilbey, Eef Cauwelier, Mark W. Coulson, Lee Stradmeyer, James N. Sampayo, Anja Armstrong,Eric Verspoor, Laura Corrigan,Jonathan Shelley, Stuart Middlemas PLOS Published:October 10, anadrom, vándorló halfaj (édesvízben szaporodik, majd a tengerben él és csak szaporodni tér vissza oda, ahonnan származik) - ezért nagy mennyiségű, egymástól izoláltan szaporodó, az adott folyókhoz jól alkalmazkodott populáció, melyek hanyatlanak a túlhalászat, a genetikai felhígulás és a partközeli ár-apály erőművek, - a megőrzéshez genetikai információra van szükség az egyes populációkról - SNP vizsgálat

53 Kitekintés egyedi minta - 37 folyó helyszín SNP lókusz - Illumina iselect SNP-array

54 Kitekintés

55 Akkor végre lássuk a cápát.. Nagy fehér cápa: - csúcsragadozó - az egyik legősibb cápafaj - a világ legtöbb tengerében jelen van - fiatal korában halakkal táplálkozik - később áttér a tengeri emlősökre - csökkenő állomány, túlhalászat, hiszti, uszonyok levesben, állkapcsok mint emléktárgyak - az ember nem tartozik a természetes táplálékbázisába - korábbi genetikai vizsgálatok szerint nem alkotnak metapopulációt (pedig ez várható lett volna, hiszen hosszú vándorutakat tesznek meg egyes egyedek) - rejtőzködő faj, kevés róla az információ

56 Akkor végre lássuk a cápát.. New insights into the evolutionary history of white sharks, Carcharodon carcharias Sara Andreotti, Sophie von der Heyden1 Romina Henriques, Michael Rutzen, Michael Me yer, Herman Oosthuizen and Conrad A. Matthee Journal of Biogeography (J. Biogeogr.) (2016) 43, szövetminta (biopsziával mintázva) - dupla mintavétel elkerülése: hátúszó azonosítás - 14 mikroszatellit marker és a mtdns kontroll régiója

57 Akkor végre lássuk a cápát..

58 Akkor végre lássuk a cápát.. Mit találtak még? - a dél afrikai populáción belül nem találtak al-populációkat vagy elkülönülést - egy egységként kell a populációt kezelni és a faj védelmén dolgozni - alacsonyabb a genetikai változatosság itt, mint Ausztráliában - az effektív populációméret csak 333 egyed, a kihalás reális veszély! - a faj védelmét erősíteni kell

59 Köszönöm a figyelmet!