vvs) LIPIDPEROXIDÁCI CIÓS S (LP) ÉS S ANTIOXIDÁNS Vajdovich Péter

Átírás

1 BELSİ ÉS S KÜLSK LSİ TÉNYEZİK K HATÁSA A VÖRÖSVV SVÉRSEJTEK (vvs( vvs) LIPIDPEROXIDÁCI CIÓS S (LP) ÉS S ANTIOXIDÁNS NS FOLYAMATAIRA (szarvasmarhákban, juhokban, kutyákban kban és s patkányokban végzett v vizsgálatok) Témavezetı: Mézes Miklós Vajdovich Péter tanszékvezet kvezetı egyetemi tanár, a mezıgazdas gazdaságtudomány kandidátusa, Szent István n Egyetem, Mezıgazdas gazdaság és s KörnyezettudomK rnyezettudományi nyi Kar, Takarmányoz nyozástani Tanszék

2 Célkitőzések I. A szarvasmarhák és s a kutyák vvs-jeiben zajló szabadgyökös s reakciók k kor szerinti vizsgálata a, Szarvasmarhák k ontogenezise során n fellépı szabadgyök-reakci reakciók 1. újszülött borjakban 2. szopós és s növendn vendék k korú borjakban b, A szabadgyökös s reakciók k változv ltozása kutyákban kban a kor és s az ivar függvf ggvényében vizsgálatok beagle kutyákon kon

3 Célkitőzések II. A juhok és s a kutyák vvs-jeiben xenobiotikumok hatására bekövetkez vetkezı szabadgyökös s reakciók k vizsgálata a, A széntetraklorid (CCl 4 ) hatásai 1. juhok vizsgálata 2. kutyák k vizsgálata b, Az alloxán hatásai 1. juhok vizsgálata 2. kutyák k vizsgálata

4 Célkitőzések III. A hypoxia-reperfusi reperfusiónak a vvs-ek LP-s és antioxidáns paramétereire kifejtett hatásainak vizsgálata a, Patkányok vizsgálata 1. arteria mesenterica cranialis lekötés és reperfusio hatására 2. arteria mesenterica cranialis lekötés és reperfusio hatására, allopurinolos elıkezel kezelésben b, Kutyák k vizsgálata vese-autotranszplant autotranszplantáció hatására

5 Célkitőzések IV. Jellemzı szervkárosod rosodásban sban és/vagy anyagforgalmi betegségben gben szenvedı kutyák és s szarvasmarhák vvs-jeinek LP-s és antioxidáns ns paraméterbeli változv ltozásai a, Szervi kórfolyamatokban k szenvedı kutyák vizsgálata b, Szarvasmarhák k ellését t követk vetı relatív energiahiány ny hatásainak vizsgálata

6 A vvs-ek vizsgálat latának indokai a vvs-ek jól l tükrt krözik a szervezetben zajló LP-s és antioxidáns ns folyamatokat a vvs-ek membránja igen gazdag PUFA-kban a vvs-ek a szabadgyökök szempontjából l raktároz rozó szerepet is betöltenek

7 Bevezetés Szabadgyök-képz pzıdés, LP és antioxidáns ns védekezés a vvs-ekben

8 A vörösvv svérsejt O Fe 3+ 2 Hb LH

9 A szabadgyökök Fe 2+ HO.- O 2.- O Fe 3+ 2 Hb LH H 2 O 2

10 A lipidperoxidáci ció (LP) és malondialdehid (MDA) képzk pzıdés Fe 2+ HO.- O 2.- Fe 3+ Hb LH O 2 HO. 2 L. H 2 O 2 MDA LOO. LOOH

11 A nem enzimatikus védekezés és s a glutation-rendszer (GSH, GSSG) E-vit E-vit Fe 2+ HO.- O 2.- Fe 3+ Hb LH O 2 HO. 2 L. GSH GSSG Karotin H 2 O (LH) H 2 O 2 MDA LOO. LOOH

12 A glutation-peroxid peroxidáz (GSH-Px Px) E-vit E-vit Fe 2+ HO.- O 2.- Fe 3+ Hb LH O 2 HO. 2 L. Karotin GSH GSSG H 2 O (LH) H 2 O 2 MDA GSH-Px LOO. LOOH

13 A kataláz (CAT) E-vit Karotin H 2 O O 2 E-vit GSH Fe 2+ CAT GSSG H 2 O (LH) HO.- O 2.- Fe 3+ H 2 O 2 GSH-Px Hb HO. 2 MDA LH L. LOO. LOOH O 2

14 A szuperoxid-dizmut dizmutáz (SOD) E-vit Karotin H 2 O O 2 E-vit CAT GSH Fe 2+ GSSG H 2 O (LH) HO.- O 2.- Fe 3+ SOD H 2 O 2 GSH-Px Hb HO. 2 MDA LH L. LOO. LOOH O 2

15 A kisérletekben vizsgált LP-s és antioxidáns ns paraméterek E-vit H 2 O O 2 Karotin E-vit GSH Fe 2+ CAT GSSG H 2 O (LH) HO.- O 2.- Fe 3+ SOD H 2 O 2 Hb GSH-Px HO. 2 LH L. MDA LOO. LOOH O 2

16 Vizsgált LP-s és antioxidáns ns paraméterek Vörösvérsejt hemolizátumb tumból: Malondialdehid (MDA) - Placer (1966), Matkovics (1988) Redukált glutation (GSH) - Sedlak (1968), Matkovics (1988) Glutation-peroxid peroxidáz (GSH-Px Px) - Lawrence (1976), Matkovics (1988) Szuperoxid-dizmut dizmutáz (SOD) - Misra (1972), Matkovics (1984) Kataláz (CAT) - Beers (1952), Matkovics (1977)

17 Vérplazmából, l, tej-, és s takarmánymint nymintákból: E-vitamin - Bieri (1964) Összkarotin - Brubacher (1980)

18 A vizsgálatok A paraméterek egymást stól l szignifikánsan nsan eltérı értékeit A, B, C, D jelöléssel különítettem k el.

19 A szarvasmarhák és s a kutyák vvs-jeiben zajló szabadgyökös reakciók k kor szerinti vizsgálata A szabadgyökös s reakciók változása beagle kutyákban kban a kor és s az ivar függvf ggvényében

20 Anyag és s módszerm A vizsgálatban szereplı állatok: 28 egészs szséges, kg-os beagle fajtájú kutya 1. csoport: 7, egy évesnél l fiatalabb kan 2. csoport: 7, egy évesnél l fiatalabb szuka 3. csoport: 7, kilenc évesnél l idısebb kan 4. csoport: 7, kilenc évesnél l idısebb szuka A csoportok külön k n kennelekben kerültek elhelyezésre.

21 Mintavétel: tel: Vérvételek 6 órával az etetés s után n törtt rténtek. Laboratóriumi riumi vizsgálatok: teljesvérb rbıl,, vérplazmv rplazmából: l: klinikai laboratóriumi riumi diagnosztikában használt fıbb hematológiai giai- és s biokémiai paraméterek vvs-hemoliz hemolizátumból: MDA-,, GSH-koncentr koncentráció, GSH-Px Px-,, CAT-,, SOD-aktivit aktivitás

22 Eredmények

23 Az MDA- és s a GSH-koncentr koncentráció kutyák vvs-jeiben A A B A 3 A A A B Fiatal kan Fiatal szuka Idõs kan Idõs szuka 0 Fiatal kan Fiatal szuka Idõs kan Idõs szuka P<0,05 MDA µmol/l P<0,001 GSH mmol/l

24 A GSH-Px Px- és s a SOD-aktivit aktivitás kutyák vvs-jeiben C 60 B 40 A A 20 A A B C 0 Fiatal kan P<0,01 Fiatal szuka SOD U/mg fehérje Idõs kan Idõs szuka GSH-Px U/g fehérje P<0,001

25 A juhok és s a kutyák vvs-jeiben xenobiotikumok hatására bekövetkez vetkezı szabadgyökös s reakciók k vizsgálata Az alloxán hatásai: 1. juhok vizsgálata 2. kutyák k vizsgálata

26 Anyag és s módszerm A vizsgálatban szereplı állatok: négy, nem vemhes, 2-42 éves, merino fajtájú jerke öt, 1-51 éves, vegyes ivarú,, kg-os os,, keverék kutya Kezelés: 60 mg/ttkg adagban, 200 g/l alloxán-oldat, oldat, egyszeri alkalommal, intavénásan

27 Mintavétel: tel: vérvétel a kezelés s elıtt, majd a kezelést követk vetı 1., 2., 3., 4. nap Laboratóriumi riumi vizsgálatok: vérplazmából: l: AST-aktivit aktivitás s (juhok), ALT-aktivit aktivitás s (kutyák), k), glükózkoncentr zkoncentráció vvs-hemoliz hemolizátumból: MDA-koncentr koncentráció,, GSH-Px Px-,, SOD-,, CAT-aktivit aktivitás

28 Eredmények

29 Juhok és s kutyák vvs-jeinek MDA-koncentr koncentrációja, és s vérplazmv rplazmájuk májenzim-aktivitása A A A A A B B B 0 alap 1. nap 2. nap 3. nap 4. nap juh MDA µmol/l juh AST U/l B B C B P<0,05 C D B C kutya MDA µmol/l kutya ALT U/l C D D B

30 Juhok és s kutyák k vérplazmv rplazmájának glükóz-koncentr koncentrációja A B C alap 1. nap 2. nap 3. nap 4. nap C C juh glükóz mmol/l P<0,05 kutya glükóz mmol/l

31 A GSH-Px Px,, a SOD és s a CAT aktivitása juhok és s kutyák vvs-jeiben A B C A A A A B C C C 0 alap 1. nap 2. nap 3. nap 4. nap juh GSH-Px U/g fehérje kutya GSH-Px U/g fehérje P<0,05 alap 1. nap 2. nap 3. nap 4. nap juh SOD U/mg feh. juh CAT BE/g feh. kutya SOD U/mg feh. kutya CAT BE/g feh.

32 A hypoxia - reperfusiónak a vvs-ek LP-s és antioxidáns ns paramétereire kifejtett hatásainak vizsgálata

33 A hypoxia - reperfusio egyik fıbb f szabadgyök-képz pzı folyamata A xantin-oxid oxidáz mechanizmus ATP ADP AMP adenozin inozin hypoxantin

34 ép p bélszakaszb hypoxantin + H 2 O + NAD + D-típus xantin + NADH + H xantin + H 2 O + NAD + D-típus húgysav + NADH + H +

35 ischemiás bélszakasz D - O konverzió (proteolitikus folyamat)

36 Reperfusio hatására: oxigén n (O 2 ) kerül l a szövetbe hypoxantin + H 2 + 2O 2 O-típus xantin + 2O H xantin + H 2 + 2O 2 O-típus húgysav + 2O H +

37 A hypoxia - reperfusiónak a vvs-ek LP-s paramétereire kifejtett hatásainak vizsgálata Patkányok vizsgálata: 1. arteria mesenterica cranialis lekötés és reperfusio hatása 2. arteria mesenterica cranialis lekötés és reperfusio hatása, allopurinolos elıkezel kezelésben

38 Anyag és s módszerm 1. kísérletk A vizsgálatban szereplı állatok: tíz, nıivarn ivarú, white whistar patkány Kezelés: narkózis: 0,1 %-os% pentobarbitál-na, 0,4 mg/ttkg adagban, intraperitoneálisan mőtét: t: vena jugularis preparálása, hasüreg felnyitása, art. mes. cran. lekötése, 45 perc múlva m a lekötés s feloldása, 60 perc múlvam extermináci ció

39 Mintavétel: tel: vérvételek: a vena jugularis-ból 1. mőtét m t elıtt, 2. art. mes. cran. lekötését t követk vetı 45. perc múlva, m 3. a reperfusio 45. percében, a lekötést stıl l számított 90. percben Laboratóriumi riumi vizsgálatok: vvs-hemoliz hemolizátumból: MDA-,, GSH-koncentr koncentráció,, GSH-Px Px-,, SOD-aktivit aktivitás

40 A torkolati véna v preparálását t követk vetı vérvétel

41 Az elüls lsı bélfodri verıér r preparálása és s lekötése elülsı bélfodri verıér

42 A hypoxiás és s a reperfusiós szakasz

43 Anyag és s módszerm 2. kísérletk A 2. kísérlet k elrendezése alapvetıen en megegyezett az 1. kísérletk rletével, de itt allopurinolos (xantinoxidáz inhibitoros) elıkezelés történt: az allopurinol 20%-os oldatának, 20 mg/ttkg ttkg-ban intraperitonealisan történı adagolása: 48, 24, 1/2 órával a mőtét m t elıtt.

44 Eredmények

45 Az MDA- és s a GSH-koncentr koncentráció patkányok vvs-jeiben 300 A A B 1,5 A A B perc perc P<0,01 MDA µmol/l 90. perc MDA µmol/l 0,5 allopurinol 0 P<0,01 0. perc 45. perc GSH mmol/l 90. perc allopurinol GSHmmol/l

46 A GSH-Px Px- a SOD-aktivit aktivitás patkányok vvs-jeiben A A P<0,05 0. perc 45. perc A B A 90. perc GSH-Px U/g fehérje GSH-Px U/g fehérje allopurinol perc P<0, perc perc SOD U/g fehérje SOD U/mg fehérje B allopurinol

47 Jellemzı szervkárosod rosodásban sban és/vagy anyagforgalmi betegségben gben szenvedı kutyák és s szarvasmarhák vvs-jeinek LP-s s változv ltozásai Szarvasmarhák k ellését t követk vetı relatív energiahiány ny hatásainak vizsgálata

48 Anyag és s módszerm A vizsgálatban szereplı állatok: Tejelı tehenészetben, kötött k tt tartásban tartott, 2-33 nappal ellés s után álló,, 2-42 éves, kg-os os, holstein-fr fríz z fajtájú tehenek (n=31), tejtermelésük: l / év, takarmányuk: kukoricaszilázs zs,, lucernaszéna, na, tejelıtáp

49 A mintavétel, tel, és s a vizsgálatok ütemezése: fizikális vizsgálat, az állatok kiválaszt lasztása; vizeletminta vétele, helyszíni vizeletvizsgálat, lat, ketonanyagok kimutatása (Ross( Ross-teszt); vérminták k vétele; v plazmabiokémiai vizsgálatok: ketonanyag (Ross-teszt), AST, karbamid, glükóz; az állatok csoportosítása sa a leletek alapján; LP-s és antioxidáns ns paraméterek vizsgálata vvs-hemoliz hemolizátumból: : MDA, GSH, GSH-Px Px, SOD.

50 A csoportosítás s szempontjai: vizelet ketonanyag-tartalma (-, +/-, +, ++, +++), vérplazma ketonanyag-tartalma (-, +/-, +, ++,), vérplazma AST-aktivitása (<60, , 200<)

51 Csoportok: 1. csoport - n=10 (Energia-hiányos): AST: U/l, vizeletketon: : ++/+++, plazmaketon: : +/++; 2. csoport - n=10 (májelfajulásos és s E.-hi hiányos): AST>200 U/l, vizeletketon +/++, plazmaketon: -/+; 3. csoport - n=11 (kontroll): klinikailag egészs szséges, AST<60, vizelet- és plazmaketon: -.

52 Eredmények

53 Tehenek vérplazmv rplazmájának glükóz- és karbamidszintje P<0,05 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Glükóz mmol/l Egészséges A B Karbamid mmol/l B Energiahiányos Májelfajulásos és energiahiányos

54 Tehenek vvs-jeinek MDA- és GSH-koncentr koncentrációja Egészs. E.-hiány MDA µmol/l A B P<0,05 B Májelf. és E.- hiány 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Egészs. E.-hiány GSH mmol/l Májelf. és E.- hiány

55 Tehenek vvs-jeinek GSH-Px Px- és SOD-aktivit aktivitása A B B Egészséges Energiahiányos GSH-Px U/g fehérje SOD U/mg fehérje Májelfajulásos és energiahiányos P<0,05

56 Az eredményekb nyekbıl l levonható következtetések

57 Borjak posztnatális életének elsı két t napján lezajló LP-s reakciók a vvs-ekben nem mutattak jelentıs változást.

58 A borjak életének elsı három hónapjh napjában végzett v vizsgálatok szerint a 60. napos korban (amikor az állatok a borjúnevel nevelıbe kerülnek) LP-fokoz fokozódás jelentkezett a vvs-ekben ekben,, az antioxidáns ns védeke- zés vizsgált elemeinek funkciócs csökkenése mellett.

59 Az idıs kutyák vvs-jeiben az LP-s folyamatok fokozottabban jelentkeztek, fıként f a kanokban. Az idısek között a vizsgált antioxidáns ns enzimek kompenzáló hatását igazolni lehetett, különösen k a szukákban kban.

60 A CCl 4 -toxikózis juhokban, és s kutyákban kban máj-károsodáshoz, shoz, a vvs-jeikben jelentıs LP- fokozódáshoz és antioxidáns ns enzimaktivitás- csökkn kknéshez vezetett. A kutyák k esetében a káro- sító hatások kifejezettebben jelentkeztek.

61 Az alloxán cukorbetegséget get a kutyákban kban idézett elı.. Kutyákban és s juhokban májsejtnekrózist okozott, fokozta a vvs-ek LP-s reakcióit it a vizsgált antioxidáns ns enzimek funkciójának nak károsításasa mellett. A toxikus hatások a kutyákban kban kifejezettebbek voltak.

62 Patkányok elüls lsı bélfodri verıér lekötése, 45 perces hypoxiája és reperfusiója után n 45 perc múlva LP-fokoz fokozódás jelentkezett a vvs-ekben ekben, ami a vizsgált antioxidáns ns enzimek ativitásának csökken kkenésével társult. A fokozott LP allopurinollal kivédhet dhetı volt.

63 Kutyák vese-autotranszplant autotranszplantációjában a reper- fusiót követıen en a 24. órában az LP enyhe fokozódása következett be a vvs-ekben ekben. A vizsgált antioxidáns ns enzimek aktivitása nem változott.

64 Kutyák félheveny veseelfajulása, sa, májfunkcióza- vara, heveny hasnyálmirigy lmirigy-gyulladása és s nem specifikus gyulladásos kórképei során n a vvs-ek LP-ja fokozódott dott,, ami a gyulladással járó kórké- pekben volt a legkifejezettebb,, a vizsgált antioxidáns ns enzimek funkciócs csökkenése (fıként a SOD-é) ) a májelfajulm jelfajulásos csoportnál volt jelentıs.

65 A nem kielégítı energistátuszban tuszban lévı szarvasmarhák ketonaemiás és s májelfajulm jelfajulásos kórképeiben a vvs-ekben fokozott LP volt tapasztalható,, a vizsgált antioxidáns ns enzimek közül l a GSH-Px aktivitásának csökken kkenése volt jelentıs.

66 Köszönetnyilvánítás Hálával tartozom: Mézes Miklósnak Gaál Tibornak Vörös s KárolynakK Karsai Ferencnek Bertók k LórándnakL Németh Tibornak Móra Zsuzsának Ribiczeyné Szabó Piroskának Szilágyi Attilának Forczig Mónikánaknak Jaksics Katalinnak Hapekné Veress Évának Leiner Ildikónak és családomnak

67

68 Nyitás A gyerekkor alkími miája beteljesül, l, sikerül l végre. v Az érintetlen kapukat, az álom zsiliprendszerét t kinyitják. k. Mindenbıl l csönd lesz és s közelsk zelség. Pilinszky JánosJ

69