BIOKATALITIKUS BAEYER-VILLIGER OXIDÁCIÓK

Átírás

1 Pannon Egyetem Műszaki Informatikai Kar Nanotechnológia Tanszék BIKATALITIKUS BAEYER-VILLIGER XIDÁCIÓK Doktori (PhD) értekezés Készítette: Muskotál Adél Környezettudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Vonderviszt Ferenc egyetemi tanár Veszprém 2008.

2 BIKATALITIKUS BAEYER-VILLIGER XIDÁCIÓK Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében Írta: Muskotál Adél Készült a Pannon Egyetem Környezettudományok Doktori Iskolája keretében Témavezető: Dr. Vonderviszt Ferenc Elfogadásra javaslom (igen / nem) A jelölt a doktori szigorlaton... % -ot ért el,. (aláírás) Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: Skodáné dr. Földes Rita igen /nem Bíráló neve: dr. Gál Péter igen /nem A jelölt az értekezés nyilvános vitáján...% - ot ért el.. (aláírás). (aláírás) Veszprém, A doktori (PhD) oklevél minősítése.... a Bíráló Bizottság elnöke Az EDT elnöke 2

3 TARTALMJEGYZÉK KÖSZÖ ET YILVÁ ÍTÁS 5 Kivonat 6 Abstract 7 Auszug 8 1. Bevezetés, célkitűzés 9 2. Irodalmi áttekintés A Baeyer-Villiger monooxigenázok működése Az enzim szerkezete és a katalízis A ciklohexanon-monooxigenáz biokatalitikus alkalmazása Hattagú, heteroatomot nem tartalmazó ketonok biotranszformációja Hattagú, heteroatomot tartalmazó ketonok biotranszformációja A szubsztrátumok előállításához szükséges reakciók irodalmi háttere Izolált enzimek vagy élő sejtes rendszerek használata Filamentáris enzimrendszerek A flagellin és a flagelláris filamentum jellemzése Flagelláris display-technológiák A flagellin-enzim fúziós fehérjék létrehozása Kísérleti rész Felhasznált anyagok és módszerek Cirkuláris dikroizmus E.coli TP10 kompetens sejt készítési eljárás Salmonella SJW2536 elektrokompetens sejt készítési eljárás Általános sémák [4+3] cikloaddíció Cu/Zn katalizátor és pirrol-1-karbonsav-metilészter (1c) előállítása Általános módszer ultrahangos fürdőben kivitelezett reakciókhoz a. 2,4-dibróm-biciklo [3,2,1] okt-6-én-3-on (2a) előállítása b. 2,4-dibróm-8-oxabiciklo [3,2,1] okt-6-én-3-on (2b) előállítása c. 2,4-dibróm-8-metoxikarbonil-8-azabiciklo [3,2,1] okt-6-én-3-on (2c) előállítása Debrómozás Általános módszer debrómozáshoz a. Biciklo [3,2,1] okt-6-én-3-on (3a) előállítása b. 8-oxabiciklo [3,2,1] okt-6-én-3-on (3b) előállítása c. 8-metoxikarbonil-8-azabiciklo [3,2,1] okt-6-én-3-on (3c) előállítása Gyűrűnyitási metatézisek Katalitikus hidrogénezés Általános módszer kémiai Baeyer-Villiger oxidációkhoz Biológiai Baeyer-Villiger oxidációk Biotranszformációk Általános módszer a biotranszformációkhoz a. 1,4-dioxepan-5-on előállítása b. Cisz-2,7-dimetil-1,4-dioxepan-5-on előállítása 43 3

4 3.8.2.c. Cisz-2,7-dietil-1,4-dioxepan-5-on előállítása d. Cisz-2,7-divinil-1,4-dioxepan-5-on előállítása Flagellin-enzim fúziós fehérjék létrehozása D S konstrukciók tervezése D S konstrukciók előállítása D3-deléciós plazmid Fúziós D S konstrukciók D3-deléciós flagellin fehérje Fehérjetermeltetés A D3-deléciós flagellin emésztési vizsgálata tripszinnel Denaturációs hőmérséklet meghatározása CD-vel Eredmények és következtetések Szerves reakciók, szubsztrátumok előállítása Biotranszformációk Flagellin-enzim fúziós konstrukciók létrehozása D3-deléciós flagellin előállítása Flagellin-enzim D S konstrukciók létrehozása 68 Összefoglalás 71 Új tudományos eredmények 73 Major results 75 Mellékletek Melléklet: Rövidítések jegyzéke Melléklet: A reakciók adatai Melléklet: Az előállított vegyületek MR-adatai 79 Irodalomjegyzék 84 4

5 KÖSZÖ ET YILVÁ ÍTÁS Mindenekelőtt hálás köszönetemet szeretném kifejezni témavezetőmnek, Dr. Vonderviszt Ferencnek, aki megismertette velem a molekuláris biológia tudományát, támogatott és tanácsaival segítette munkámat. Kutatómunkámban jelentős segítséget jelentett Dr. Marko D. Mihovilovic támogatása, aki a Bécsben eltöltött idő alatt irányította a munkámat. Külön köszönöm neki, hogy az Európai Unió Marie Curie ösztöndíján keresztül lehetőséget biztosított számomra a szakmai fejlődésre. Kutatásaim elvégzéséhez Dr. Mészáros Ernő, a Környezettudományok Doktori Iskola vezetője is hozzájárult. Fontos volt számomra, hogy folyamatosan kereste a lehetőséget kutatási témám befejezéséhez. A munkám alapját képező génsebészeti alaptechnikák elsajátításában Dr. Gál Pétert tekintem mesteremnek. Az Ő tanításait alkalmazom a munkám során. Tanácsai mindig hasznomra váltak. Külön köszönöm a bírálat során tett értékes megjegyzéseit. Köszönöm Skodáné Dr. Földes Rita bírálatát, lelkiismeretes és segítőkész munkájával nagymértékben hozzájárult disszertációm végleges formájához. Köszönöm Sebestyén Anettnek, hogy a hosszú évek alatt mindig készségesen segített és támogatott. Köszönet illeti Gugolya Zoltánt, aki a Fizika Tanszéken munkatársamként segítségemre volt. A Deák Ferenc Ösztöndíj megpályázásához és a disszertáció megírásához nyújtott önzetlen segítségéért és támogatásáért rendkívül hálás vagyok Dr. Seregélyes Csabának. Munkámat nagyban segítette Dr. Tóth Judit a disszertációm szerves kémiával kapcsolatos részéhez nyújtott konzultációjával. Több éves kutatómunkám befejezéséhez az ktatási és Kulturális Minisztérium Deák Ferenc Ösztöndíja biztosította a hátteret. Köszönöm Dr. Friedler Ferencnek a Műszaki Informatikai Kar dékánjának, hogy támogatást nyújtott a disszertációm befejezéséhez. Hálával tartozom Radka Snajdrova, Florian Rudroff, Joanna Rydz, Krzysztof Kolodziejczyk és Radoslav Flasik szakmai és baráti segítségéért, valamint Parrag Tamásnak és Prettl Zsoltnak, hogy a disszertáció írása alatt megkönnyítették munkámat a laborban és Zsoltnak külön köszönöm az eredmények kiértékeléséhez nyújtott segítségét. Köszönöm a kitartó támogatást és bíztatást Családomnak, Barátaimnak és Férjemnek. 5

6 Kivonat Munkám célja volt, hogy egy egyszerű módszert dolgozzak ki karbo- és heterobiciklusos oktanonok előállítására és ezen molekulák gyűrűnyitási metatézisére gázhalmazállapotú olefin reakciópartnerek közreműködésével. Az így előállított ketonok enantioszelektív Baeyer-Villiger oxidációját rekombináns E. coli sejtekkel kiviteleztem. A munka másik részében génsebészeti eljárások segítségével eltávolítottam a bakteriális filamentum monomer fehérjéjének (flagellin) D3 doménjét abból a célból, hogy helyére különböző monooxigenáz enzimeket beépítve enzimaktivitással és polimerizációs képességgel rendelkező nanoszerkezeteket lehessen megalkotni. Eredményeim azt mutatják, hogy a β-cisz diszubsztituált heteroatomot is tartalmazó biciklusos molekulák előállításának ultrahangos módszere egyszerű és megfelelő hozamú eljárás az eddig nehezen preparálható ketonok előállítására. Ezekből a termékekből difunkcionált hattagú cikloketonokat sikerrel preparáltam gyűrűnyitási metatézissel. Kísérleteim során megállapítottam, hogy az előállított perhidro-piron molekulák alkalmasak sejtes biotranszformációkra, a várt termékek keletkeztek kiváló optikai tisztasággal. Igazoltam a korábbi hipotézist, miszerint a Baeyer-Villiger oxidációt katalizáló monooxigenáz enzimeket a katalizált reakcióik alapján két csoportba lehet osztani. A flagellin-enzim fúziós konstrukciók létrehozása érdekében megalkotott D3- deléciós flagellin vizsgálataiból kiderült, hogy a mutáns fehérje ugyanolyan mennyiségben termelődött, mint a vad, és a mutáns filamentum stabilitása nagyon hasonló a természeteséhez. A D3-deléciós flagellinekből felépített filamentumok jó alapot nyújtanak a továbbfejlesztésre váró flagellin-enzim fúziós konstrukciók létrehozásához. Munkám során elkészítettem a flagellin-monooxigenáz DNS konstrukciókat. 6

7 Biocatalytic Baeyer-Villiger oxidations Abstract The aim of my study was to develop a simple method for preparing carbo- and heterobicyclic octanones and for ring opening metathesis of these molecules by means of gaseous olefinic reaction partners. The enantioselective Baeyer-Villiger oxidation of the formulated ketones was achieved by recombinant E. coli cells. In the other part of the investigation, the D3 domain of monomeric protein of bacterial filament was removed by genetic engineering in order to create nanostructures with enzyme activity and polimerization capacity after inserting in various monooxygenase enzymes. The ultrasonic protocol for synthetizing β-cis bicyclic molecules containing heteroatom, allows access to elusive and poorly described ketones without elaborate workup in yield comparable to previous methods. Difunctionalized sixmembered cycloketones were successfully prepared from these products by ring opening metathesis. I stated that the formulated perhydropyran-type ketones were suitable for whole-cell biotransformations, and the expected products were synthetized with excellent optical purities. The former hypothesis was confirmed that monooxygenases those catalyzing Baeyer-Villiger oxidation could be divided into two groups on the basis of catalyzed reactions. The investigations of D3 deleted flagellin, that was prepared to the flagellinenzyme fusion constructs, suggested that the mutant protein was produced in the same amount as the wild one, and the stability of the mutant filament was very similar to the natural one. The filaments built from the D3 deleted flagellins are suitable bases for producing the flagellin-enzyme fusion constructions, but they need further experiments. The flagellin-monooxygenase DNA constructs were prepared in this work as well. 7

8 Biokatalisierte Baeyer-Villiger xidationen Auszug Das Ziel meiner Arbeit war, eine einfache Methode zur Herstellung von karbo- und heterobicyclischen ktanen und zur ringöffnenden Metathese dieser Moleküle auszuarbeiten, mit Hilfe von lefinreaktionspartnern mit gasförmigem Aggregatzustand. Die enantionselektive Baeyer-Villiger xidation der so hergestellten Ketonen wurde mit rekombinanten E. Coli-Zellen durchgeführt. Im anderen Teil der Arbeit entfernte ich den D3-Domain des monomeren Eiweißes des bakteriellen Filamentums mit Hilfe genchirurgischer Verfahren, um an seine Stelle verschiedene monooxygenase Enzyme einbauend Nanostrukturen mit Enzymaktivität und Polimerisationsfähigkeit gestalten zu können. Meine Ergebnisse zeigen, daß die Ultraschallmethode bei der Herstellung der auch β-zis disubstituiertes Heteroatom enthaltenden bicyclischen Moleküle ein einfaches Verfahren mit entsprechendem Ertrag zur Herstellung der bisher schwer präparierbaren Ketonen ist. Aus diesen Produkten präparierte ich erfolgreich difunktionierte sechsgliedrige cyclische Ketonen mit ringöffnender Metathese. Im Laufe meiner Versuche stellte ich fest, daß die hergestellten Perhydropyron- Moleküle zu Zellenbiotransformationen fähig sind, es entstanden die erwarteten Produkte mit ausgezeichneter optischer Reinheit. Ich bestätigte die frühere Hypothese, nach der die die Baeyer-Villiger- xidation katalisierenden monooxigenasen Enzyme aufgrund ihrer katalisierten Reaktionen in zwei Gruppen geteilt werden können. Aus der Untersuchung des im Interesse der Gestaltung der Flagellin-Enzym-Fusionskontruktionen hergestellten D3-Deletionsflagellins ging hervor, daß das mutante Eiweiß in derselben Menge produziert wurde, wie das wilde, und daß die Stabilität des mutanten Filamentums der des natürlichen ähnlich ist. Die aus den D3-Deletionsflagellinen aufgebauten Filamenten bilden eine gute Basis für die Produktion der Flagellin-Enzym-Fusionskonstruktionen, die aber noch weiterentwickelt werden sollen. Im Laufe meiner Arbeit stellte ich die Flagellin- Monooxygenases-DNA- Konstruktionen her. 8

9 1. Bevezetés, célkitűzés A biokémiai rendszerekben rejlő lehetőségeket a kémiában már régen felismerték és alkalmazzák: mikrobiológiai, fermentációs módszerekkel biológiailag aktív vegyületeket állítanak elő vagy módosítanak. A hagyományos kémiai módszerek mellett napjainkban a környezetvédelem fontossága miatt fokozatosan előtérbe kerülnek a biokatalitikus eljárások mind laboratóriumi, mind ipari méretekben. A biokatalízis, biotranszformáció céljaira felhasználható rendszerek: enzimek, mikroorganizmusok számos előnyös tulajdonsággal rendelkeznek. Számtalan kémiai reakciónak megtalálható az enzimatikus megfelelője, így széles körben alkalmazhatóak a biokatalizátorok, melyeknek szelektivitása és hatékonysága vonzó lehet a szintetikus kémiában. Nem elhanyagolható az a tény sem, hogy az enzimek viszonylag enyhe körülmények között működnek, ez fontos lehet a szubsztrátum és a termék stabilitása szempontjából is. Mindemellett az enzimek királis katalizátorok, sok esetben elkerülhető velük a mérgező, vagy a környezetet súlyosan károsító melléktermékek képződése is. Napjainkban mikroorganizmusok egyszerű reagensként történő felhasználása is terjedőben van, elsősorban olyan enzimatikus folyamatok esetében, amikor az enzim izolált formában nem hozzáférhető, érzékeny, és a kívánt átalakítás multienzimatikus (Poppe et al., 1991). Királis laktonok, mint az enantioszelektív szintézisek értékes prekurzorainak környezetbarát előállítására hatékony módszert kínál a Baeyer-Villiger oxidáció, amellyel lehetőség nyílik szén-szén kötések felszakítására egy oxigénatom beékelődésével. Baktériumokból származó monooxigenáz enzimek képesek katalizálni a Baeyer-Villiger oxidációt. A monooxigenáz enzimcsaládba tartozó fehérjékkel végzett biotranszformációk széles szubsztrátum-specificitást és jó enantioszelektivitást mutatnak. Számos természetben előforduló biológiailag aktív vegyület rendelkezik oxigén- és nitrogéntartalmú heterociklusos szerkezetekkel. A karbo- és heterobiciklusos ketonok Baeyer-Villiger oxidációja ígéretes, megfelelő optikai tisztaságú enantiomert tartalmazó intermediereket szolgáltatna a gyógyszerek szintéziséhez, de közvetlen biotranszformációja nem játszódik le a szintetikus kémiában felhasználható konverzióval (Taschner et al., 1992). Megoldást jelentene a gyűrűnyitás-biooxidáció-gyűrűzárás reakciók egymás utáni kivitelezése, hiszen így a szubsztrátum-hasznosítás szélesítésén túl jobb konverzió és enantioszelektivitás is elérhető lenne. Napjainkban egyre nagyobb az igény a sztereoizomerek - legfőképpen a királis anyagok adott enantiomerjének - tiszta formában történő szintézisére és az összetett, biológiailag aktív anyagok gazdaságos előállítására. A gyógyszer-piacon új termékként ma már csak tiszta enantiomer gyógyszer hatóanyag engedélyeztethető, és hasonló a helyzet a növényvédőszerek piacán is, hiszen ebben az esetben fontos környezetvédelmi szempont, hogy a nem hatásos enantiomert szennyezőanyagként ne juttassák ki a természetbe. A biológiai rendszerek molekuláris szintű megismerése, a génsebészet fejlődése kedvezően hatott a biotranszformáció felhasználási területeinek szélesedésére, hiszen a biokatalitikus 9

10 folyamatok fejlesztése mindinkább célzottá és tervezhetővé válik. Génsebészeti technikákat felhasználva monooxigenáz enzimek fúziós konstrukcióit kívánom létrehozni a polimerizációs képességgel rendelkező flagellin fehérjének, mint a baktériumok flagelláris filamentumait felépítő legfőbb alegységének a segítségével. A flagellin központi része, amely a filamentumok külső részét adja, nagyon variábilis, génsebészeti eszközökkel módosítható, az alegységek citoplazmából való kijutásának és a polimerizációs képességének károsodása nélkül. Célom a flagellin variábilis D3 doménjének lecserélése monooxigenáz enzimekre, és ezeknek a fúziós fehérjéknek (flagzim) a felhasználásával változatos filamentáris nanoszerkezetek létrehozása. Az in vivo flagelláris filamentumok felépülésének eredményeképpen a baktériumok felületén az adott enzim nagy sűrűségben fordulna elő. Ezek a génmódosított baktériumok hordozzák azt a lehetőséget, hogy újszerű mikrobiális biokatalizátorokként működjenek és közvetlenül alkalmazhatóak legyenek biokonverzióknál. Másrészt a tisztított flagzimek használhatóak lennének filamentáris nanoszerkezetek felépítésére, melyek felületén működőképes enzimek több ezer példánya lenne található. Munkám elsődleges célja, hogy gyűrűnyitási metatézist dolgozzak ki különböző heteroatomot is tartalmazó β- cisz biciklusos rendszerekre, majd vizsgáljam az ily módon előállított ketonok Baeyer-Villiger oxidációját rekombináns Escherichia coli sejtekkel. További feladatom a biotranszformációk során keletkező szimmetrikusan szubsztituált heterociklusos laktonok tisztítása, és a tiszta termékek enantiomer-tisztaságának jellemzése. A biotechnológiai folyamatok leegyszerűsítésének érdekében olyan flagellinenzim fúziós fehérje konstrukciók tervezése és előállítása a célom, amelyek enzimaktivitással és polimerizációs képességgel is rendelkeznek. Génsebészeti eljárások segítségével a flagellin variábilis D3 doménjét eltávolítva annak helyére különböző monooxigenázokat kívánok beépíteni. 10

11 2. Irodalmi áttekintés 2.1. A Baeyer-Villiger monooxigenázok működése A Baeyer-Villiger (BV) oxidációt 1899-ben Adolf Baeyer és Victor Villiger fedezte fel (Baeyer et al., 1899). A mechanizmust először Criegee (1948) írta le egy kétlépéses folyamattal (1. ábra), melynek első lépése a karbonilcsoport nukleofil támadása peroxiddal (I,II). Ez egy tetraéderes intermediert eredményez (III), amely átrendeződésen megy keresztül a megfelelő észter kialakulásáig (IV). 1. ábra: A Baeyer-Villiger oxidáció mechanizmusa (Criegee, 1948). A Baeyer-Villiger reakció széles körben alkalmazott oxidálószerei: az m-klórperbenzoesav, a trifluor-peroxisav és a hidrogén-peroxid. Ezen persavak biokatalitikus megfelelői az oxigenáz enzimcsaládba tartozó monooxigenázok. A monooxigenázok különböző oxidációs reakciókat katalizálhatnak, mint pl. alifás és aromás alkoholok hidroxilezését, alkének epoxidációját, és Baeyer-Villiger transzformációkat. Az oxidáció típusa általában az enzim prosztetikus csoportjától függ: a citokróm P450 típusú fém-függő monooxigenázok hidroxilezést és epoxidációt, a flavin-függő enzimek a Baeyer-Villiger oxidációt katalizálják. A Baeyer-Villiger monooxigenázok (BVM) általánosan elfogadott működése az Acinetobacter calcoaceticus baktérium ciklohexanon monooxigenáz (CHM) enzimével kapcsolatos vizsgálatokon alapul. Ez az enzim egy flavin-adenindinukleotid (FAD) molekulával, mint prosztetikus csoporttal rendelkezik, emellett nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát (NADPH)- és oxigén-függő. Walsh (1980) javasolt egy reakcióutat az oxidáció folyamatára (2. ábra). 11

12 2. ábra: A Baeyer-Villiger biokatalízis mechanizmusa (E: enzim) (Mihovilovic et al., 2002). A biokatalízis folyamata a szorosan kötött FAD redukciójával kezdődik a NADPH segítségével. A következő lépés egy gyors oxidáció a molekuláris oxigénnel, melynek terméke a flavin 4a-peroxid anion. Ez az intermedier szolgál oxidáló molekulaként az ezt követő Baeyer-Villiger oxidációban. A flavin-4a-peroxid anion, amely elsőként keletkezett, szubsztrátum hiányában flavin-4a-hidroperoxid stabil molekulává alakul. Szubsztrátum jelenlétében a peroxid nukleofilként viselkedik, a szubsztrátum karbonilcsoportját támadja, kialakítva a klasszikus tetraéderes Criegee intermediert. Az intermedier átrendeződése után keletkezik a lakton és a 4a-hidroxiflavin. A katalitikus kör a víz eliminációjával, FAD keletkezésével, a termék leadásával zárul. A CHM-k működési mechanizmusa modellként szolgál a többi BVM enzim működésének értelmezéséhez, néhány különbséggel, amelyek lényeges mechanizmusbeli változást nem okoznak. Ilyen különbségek pl. hogy a FAD prosztetikus csoportot helyettesítheti flavin mononukleotid (FMN), és kofaktorként működhet a NADH is a NADPH mellett. 12

13 Az enzim szerkezete és a katalízis Napjainkig számos Baeyer-Villiger monooxigenáz enzimet termeltettek és tisztítottak, de eddig csak egy enzimből, a fenilaceton-monooxigenázból (PAM) sikerült olyan kristályokat előállítani, amelyek megfelelőek voltak röntgen-krisztallográfiás mérésekhez. Ez a 62 kda-os, monomer fehérje a Thermobifida fusca termofil baktériumban a fenilacetont alakítja át fenilacetáttá. A PAM aminosavsorrendje nagy homológiát mutat számos ismert és tanulmányozott Baeyer-Villiger monooxigenázzal, ezért is jelent előrelépést a PAM háromdimenziós szerkezetének ismerete (Malito et al., 2004). A PAM és a CHM szekvencia-azonossága 40,3 %, ami lehetővé tette, hogy Bocola és munkatársai (2005) megalkossák a CHM homológia modelljét, a PAM háromdimenziós szerkezetét alapul véve (3. ábra). 3. ábra: A PAM szerkezetének és a CHM homológia-modelljének összehasonlítása (Bocola et al., 2005). 13

14 Mindkét fehérje a FAD-kötő és a NADP-kötő doménből áll, és mindegyik domén az általános dinukleotidkötő szerkezettel rendelkezik. A PAM enzimen pontmutációkat végezve derítették fel a katalízishez nélkülözhetetlen aminosavakat. A kísérletek során derült fény a 337-es arginin központi szerepére is. A kristályos szerkezetben ez az arginin nem egy fix, meghatározott konformációban van, hanem két különböző állapotot képes felvenni. Bekapcsolt állapotban stabilizálja a flavin-peroxid intermediert a katalízis során, kikapcsolt állapotban helyet ad a nikotinamid gyűrűnek a kofaktor redukálásához. A katalízis során létrejövő konformáció-változások, a doménrotáció, a NADP nikotinamid gyűrűjének be/ki mozgásával és a vele egyidejűleg ellentétes, ki/be mozgást végző 337-es arginin oldallánc (ami szintén a NADP-kötő doménhez tartozik) mozgásával jön létre. A legszembetűnőbb különbség a PAM és a CHM modellek között az aktív centrum közelében található argininnel (PAM-nál a 337. arginin, a CHM-nál a 327.) kölcsönható hurokrégióban van (3. ábra), a PAM esetében ez a hurokrégió tartalmaz egy, az arginin felé kinyúló részt (Ser-441- Ala-442- Leu-443), amely a CHM esetében hiányzik. Bocola és munkatársai igazolták, hogy ez a kitüremkedő régió akadályozza meg a PAM esetében (a CHM-val ellentétben), a ciklusos szubsztrátumokat átalakítását, mivel ez a rész sztérikusan körülfogja a 337. arginint, és így nem jut elég hely a ciklusos vegyületekből keletkező intermedierek stabilizálására az enzimreakció során. A CHM korábbi mutagenezis-vizsgálataiban már bebizonyosodott, hogy a 432. pozícióban lévő fenilalanin nagyon fontos az enzimműködés szempontjából. Ezen a helyen történt mutációt követően drámaian megváltozott a BV reakciók enantioszelektivitásának iránya és mértéke. A homológia modellből megállapítható, hogy a 432. fenilalanin a CHM-ban megfelel a PAM 443. leucinjának, ahol a hurokrégióban az arginin felé kidomborodó rész kezdődik. Ezt az ismeretet alapul véve sikerrel állítottak elő olyan mutáns PAM enzimet, amely képes volt gyűrűs szubsztrátumot átalakítani, ezt úgy érték el, hogy az argininnel kölcsönható hurokrégióban lévő kinyúló részben egyedül a 443. leucint hagyták meg, a másik kettő aminosavat kivágták. Mutagenezis-vizsgálatokkal azt is megmutatták a PAM esetében, hogy a 173. helyen lévő hisztidin aminosav elengedhetetlenül szükséges a katalízishez és a FAD-kötéshez. Ez a hisztidin a CHM enzimben is szinte pontosan ugyanezen a helyen található. Megállapították, hogy a 173-as hisztidinnek a katalízis során a doménforgásokban, a konformáció-változásokban van főszerepe és nem a szubsztrátum megkötésében. Négy pontban foglalták össze a PAM katalízisének molekuláris modelljét, ami a krisztallográfiai analízisen és a katalitikus reakció kinetikai adatain alapul, ezt a modellt egyúttal használhatjuk a CHM esetében is annyi különbséggel, hogy a PAM

15 argininje a CHM 327. argininjével állítható párhuzamba (4. ábra) (Malito et al., 2004): 1. A reakció a NADPH megkötésével kezdődik, amely így megfelelő helyzetbe kerül, hogy redukálja a flavint. Ekkor még a 337-es arginin kikapcsolt helyzetben van. 2. A redukált enzim reagál az oxigénnel és létrejön a flavin-peroxid intermedier. Ekkor a domén-forgás összekapcsoltan működik a 337-es arginin és a szomszédos oldalláncok konformáció-változásával, annak érdekében, hogy az arginin megfelelő közelségbe ( bekapcsolt helyzet ) tudjon kerülni a peroxid intermedierhez, hogy stabilizálja azt. 3. A flavin oxidálja a bekötődött szubsztrátumot, a 337-es arginin részt vesz a Criegee intermedier stabilizálásában is, úgy, hogy a flavin peroxocsoportja kölcsönhatásba lép a szubsztrátummal. 4. Az enzim hármas komplexe (enzim/nadp + /termék) disszociál, és a terméket leadja. Ezzel a modellel az enzim működése molekuláris szinten is ismertté, érthetőbbé vált. 4. ábra: Sematikus ábra a katalízis során végbemenő konformáció-változásokról (E: enzim) (Malito et al., 2004). 15

16 2.2. A ciklohexanon-monooxigenáz biokatalitikus alkalmazása Az élőlényekben lejátszódó Baeyer-Villiger oxidációs lépések fontosak különböző természetes vegyületek szintézisekor, mint pl. az aflatoxinok előállítása a gombáknál, különféle toxinok a kagylóknál, illetve a növények esetében számos allergiát kiváltó vegyület keletkezésekor. Ezeken kívül baktériumfajoknál is megfigyelték a Baeyer- Villiger oxidációt. Turtiff 1948-ban használt először élő sejteket a szteroidok A gyűrűjének Baeyer-Villiger oxidációjára, majd 1953-ban kettő kutatócsoport is foglalkozott a progeszteron, illetve a tesztoszteron oxidálásával BVM-kat termelő sejtek segítségével (Mihovilovic et al., 2002). Mióta 1976-ban Donoghue és munkatársai (1976) tisztították és jellemezték az Acinetobacterből származó 61 kda-os (542 aminosavból álló) monomer CHM-t, azóta ez az enzim a legrészletesebben tanulmányozott BVM. A CHM enzim az Acinetobacterben a ciklohexanol lebontásában játszik szerepet (5. ábra). 5. ábra: A ciklohexanol biológiai lebontása (Mihovilovic et al., 2002). Eredetileg a CHM termelődését az Acinetobacter olyan tápoldatban való növesztésével érték el, amelyben egyedüli szénforrásként kizárólag ciklohexanol volt jelen. A CHM génjét 1988-ban klónozták és szekvenálták, és mivel az Acinetobacter patogén, különböző expressziós rendszereket fejlesztettek ki egyszerűbb használatára, élesztő- és nempatogén baktériumfajokkal. A természetben betöltött szerepe mellett a BVM alkalmas, amint az az eddigi kutatásokból kiderült, száznál is több különböző szubsztrátum átalakítására: prokirális ketonok oxidálására éppúgy, mint racém prekurzorok enantioszelektív lebontására (Donoghue et al., 1975; Iwaki et al., 1999; Cheng et al., 2000). Kísérleti úton az enzim aktív centrumának modelljét a szubsztrátum-specificitás, tér- és polaritás-szükségletek tanulmányozásával próbálják felállítani. Az itt bemutatásra kerülő biotranszformációkhoz legyenek azok izolált enzimmel, vagy rekombináns sejtekkel (élesztő, vagy/és E. coli) végzett kísérletek csak kis mennyiségű kiindulási vegyületet használtak, a terméket nem tisztították, a konverzió és enantioszelektivitás adatokat gázkromatográfiás mérésekkel 16

17 határozták meg. A táblázatokban jellel jelöltem azokat az adatokat, ahol nem játszódott le a reakció, vagy amelyeket nem tudtak meghatározni, vagy a keletkezett molekula optikailag nem aktív. A biotranszformációk során keletkezett termékek számozása a 6. ábrán látható. A továbbiakban is az itt megadott számozások az érvényesek. A konverzió a reakció során a kiindulási anyag átalakulása %-ban, ennek meghatározása gázkromatográfiával történt. Hozam a tisztítás utáni tiszta termék mólszáma és a kiindulási anyag mólszámának a hányadosa ábra: A keletkező laktonok számozása Hattagú, heteroatomot nem tartalmazó ketonok biotranszformációja A CHM enzim enantioszelektivitás-eredetének tanulmányozása érdekében összehasonlították a 4-mono, és 4, 4-diszubsztituált ketonok rekombináns sejtekkel végzett biotranszformációkból kapott eredményeit (7. ábra, 1. táblázat). 7. ábra: 4-mono, és 4, 4-diszubsztituált ketonok biotranszformációja. Megfigyelték, hogy a metil- és etilcsoportokkal diszubsztituált szubsztrátumok térbelileg nem gátolták az enzim katalitikus képességét, spirogyűrűs rendszerek esetében is lejátszódott a reakció (1. táblázat). 17

18 R R Konverzió (%) Enantiomer felesleg (%) Me H 61 >98 Me Me 61 - Et H Et Me Et Et 60 - Ciklo-CH 2 CH Ciklo-CH 2 CH táblázat: 4-mono, és 4, 4-diszubsztituált ketonok biotranszformációinak eredményei (Mihovilovic et al., 2002). A két különböző oldalláncot tartalmazó szubsztrátum esetében (R =Et, R =Me) a termék optikai tisztasága alacsonyabb lett, mint monoszubsztituált terméknél. A termodinamikailag kedvező konformáció esetében a 4-alkilcsoport ekvatoriális helyzetben van, így az ellentétes konformációk között jelentős az energiakülönbség. A szubsztituensek közelebbi azonossága miatt az energiakülönbség csökken, akár annyira, hogy a lehetséges Criegee intermedierek között elhanyagolható is lehet, aminek következményeként mindkettő szerkezet (enantiomer) kialakulhat a biotranszformáció során. Példaként megemlítem, hogy a metil- és etilcsoportokkal szubsztituált terméknél a kisebb enantiomer felesleg (ee.) az átmeneti állapotok közötti kis (1,2 kcal/mol) szabadenergia-különbséggel magyarázható. Izolált enzimekkel végzett kísérletekből kiderült (Schwarz-Linek et al., 2001), hogy diszubsztituált ciklohexanonokat szubsztrátumként használva, a termék enantioszelektivitása megfelelő volt, viszont a konverzió értéke az oldallánc helyzetétől nagymértékben függött (2. táblázat). 18

19 Szubsztrátum Főtermék Konverzió / enantiomer felesleg (% / %) 73 / / >98 25 / >98 - / táblázat: Ciklohexanonok biotranszformációinak eredményei az oldalláncok helyzetének függvényében (Mihovilovic et al., 2002). A következő Baeyer-Villiger oxidációt Brevibacteriumból származó CHM-val végezték cisz-3,5-dimetil-ciklohexanonon (8. ábra). 8. ábra: A dimetil-ciklohexanon biotranszformációja. Jellemzően egy baktériumban csak egy CHM enzim van, de a Brevibacteriumban kettőt találtak. Amikor párhuzamosan végezték a biotranszformációkat ezzel a két enzimmel (3. táblázat), azt tapasztalták, hogy hozam és az enantioszelektivitás értékei nagyon hasonlóak, de amíg a Brevi I enzim a negatív előjelű optikai forgatóképességgel rendelkező terméket állította elő, addig a Brevi II épp az ellenkező enantiomert. Tehát 19

20 érdemes ennek a kettő enzimnek a működését tanulmányozni, hiszen azokkal akár elő lehetne állítani egy adott szubsztrátum kettő megfelelő tisztaságú enantiomerjét. Enantiomer Enzim Hozam (%) [α] 20 Abszolút felesleg (%) D (CHCl 3 ) konfiguráció Brevibacterium I ,7 4R, 6S Brevibacterium II ,6 4S, 6R 3. táblázat: Cisz-3,5-dimetil-ciklohexanon biotranszformációjának eredményei (Mihovilovic et al., 2003a) Hattagú, karbociklusos és heteroatomot tartalmazó ketonok biotranszformációja Walsh és munkatársai fedezték fel, hogy a CHM képes heteroatomot tartalmazó molekulákat is oxidálni (Ryerson et al., 1982; Branchaud et al., 1985). A 4-szubsztituáltciklohexanon prekurzorok esetében a CHM jó szelektivitást mutatott S laktonok előállításában (9. ábra és 4. táblázat). R R 9. ábra: 4-szubsztituált-ciklohexanonok biotranszformációja. Az izolált enzimmel és a rekombináns sejtekkel végzett biotranszformációk mind a hozam, mind az enantioszelektivitás tekintetében általában összevethető eredményeket adtak (Stewart et al., 1996). Három szénatomos egyenes szénlánc esetében a szubsztrátum megfelelően illeszkedett az aktív centrumba, nagyobb oldalláncok esetében viszont (pl. butil) megfordult a reakció sztereoszelektivitása. Az enzim érzékeny a sztérikus gátlásokra, a terc-butil oldallánc esetében a térbeli nagyság maximumát meghaladta a szubsztrátum, amit a jelentősen lecsökkent hozam értéke mutat (4. táblázat). A CHM jól tolerálja a különböző funkciós csoportokat, mint pl. a kettős kötéseket a szubsztituensben (Stewart et al., 1998), ezenkívül még metoxi- és halolaktonok előállítására is sikerrel alkalmazták (Taschner et al., 1988; Mihovilovic et al., 2001a). 20

21 R Konfiguráció Konverzió / enantiomer felesleg (% / %) izolált enzimmel Konverzió / enantiomer felesleg (% / %) rekombináns sejttel H S - 79 / - (élesztő) Me S 80 / >98 83 / >98 (élesztő) 61 / >98 (E.coli) Et S 83 / >98 74 / >98 (élesztő) 91 / 97 (E.coli) Pr S 80 / >98 63 / 92 (élesztő) Bu R 70 / 52 - ipr S 60 / >98 60 / >98 (élesztő) tbu S 17 / >98 - Allyl S - 62 / 95 (élesztő) Me S 76 / / 78 (E.coli) Br S - 63 / 97 (E.coli) I S - 60 / 97 (E.coli) 4. táblázat: 4-szubsztituált-ciklohexanonok biotranszformációinak eredményei (Mihovilovic et al., 2002). Walsh és munkatársai (Mihovilovic et al., 2001b összefoglaló cikkben) által CHM-val végzett biotranszformációknál az első hattagú, heterociklusos szubsztrátum kenet tartalmazott. Napjainkra azonban már a heteroatomot tartalmazó szubsztrátumok száma kibővült például nitrogénatomot tartalmazó szubsztrátumokkal is (10. ábra, 5. táblázat). R X R R X R 10. ábra: Heteroatomot tartalmazó hattagú gyűrűs molekulák biooxidációja. 21

22 X R Konverzió / enantiomer felesleg (% / %) S H 48 / - NMe H 50 / - NCMe H 39 / - NCMe H 40 / - H 79 / - Me 79 / >99 5. táblázat: Heteroatomot tartalmazó szubsztrátumok biooxidációinak eredményei (Mihovilovic et al., 2002). Szintén Acinetobacterből származó CHM-val katalizált oxidáció során azt vizsgálták (Mihovilovic et al., 2003b) hattagú, oxigént tartalmazó rendszerekkel, hogy az enzim milyen oldallánc esetén képes még a katalízisre (6. táblázat). Szubsztrátum Hozam (%) Termék csak nyomokban található Termék nem keletkezik 6. táblázat: Pironok Baeyer-Villiger oxidációjának eredményei (Mihovilovic et al., 2003b). 22

23 A metil- és etil- oldalláncok esetén az oxidáció jó konverzióval játszódott le, míg n- propilcsoport esetében alacsony volt az átalakítás. Izopropil- és butil- oldalláncokkal nem ment végbe számottevően a reakció, az oldalláncok már túl nagynak bizonyultak ahhoz, hogy az enzim aktív centrumában lejátszódjon a katalízis. Korábban Mihovilovic és munkatársai (2005) és Iwaki és munkatársai (2002) is vizsgálták különböző laktonok antipódjainak előállítását a BVM enzimcsalád néhány képviselőjével. Ezekkel a kísérletekkel a CHM és CPM (ciklopentanon monooxigenáz) enzimek sztereospecificitását kutatták. A felhasznált BVM-k a következő baktériumfajokból származtak: Acinetobacter, Arthrobacter, Brachymonas, Brevibacterium (I és II), Comamonas (CPM), Rhodococcus (I és II). A kísérletek eredményeiből felállították azt a hipotézist, mely szerint a felhasznált BVM-kat két csoportba lehet sorolni. A BVM-k fő csoportjába tartozó enzimek (a CHM típusúak) a vizsgált szubsztrátumokból az ellentétes optikai forgatóképeséggel rendelkező laktonokat állították elő, mint a CPM Coma és a CHM BreviII. Ez az általános tendencia egyedül a CHM BreviI enzimnél nem volt megfigyelhető, a sztereospecificitást illetően a CHM típusúak közé tartozott, viszont nem alakított át olyan ketonokat, amit a csoport tagjai igen A szubsztrátumok előállításához szükséges reakciók irodalmi háttere A biciklusos rendszerek előállítása szempontjából a [4+3] cikloaddíció az érdeklődés középpontjában áll. Ezzel a reakcióval előállítható biciklo [3,2,1] ketonok értékes molekulák, hiszen ezek a vegyületek fontos építőkövek a szerves kémiában, és a farmakológiailag aktív molekulák széles skálájának prekurzorai (Hoffmann, 1984). Ebben a ciklizációban a perbróm-keton oxiallil vegyületet hoz létre. Az α-α -dehidrohalogénezés az ikerionos oxiallil kation keletkezését idézi elő, amely elektrofilként viselkedik a cikloaddícióban. Az oxiallil kation elektrofil reakcióképességének felfedezése, és a keletkező heteroszubsztituált kationoknak három szénatomos komponensekként való felhasználása a cikloaddíciós reakciókban fontos újítást jelentenek (Fort, 1962). Nem szubsztituált enonok előállítása rendkívüli módon nehéz. Korábban publikált eredményekből kiderül, hogy oxigén-tartalmú biciklusos rendszerek mint különböző természetes vegyületek prekurzorai előállításához eddig toxikus (Noyori, 1979), pirofór (Carrel et al., 2000), drága (Sato et al., 1978) reagenseket, katalizátorokat használtak. Hoffmann (1984) furánt, 2-metoxi-allil-bromidot és katalizátorként ezüst-trifluóracetátot használt a biciklusos molekula előállítására (11. ábra). A ciklizációs reakciókban közvetlenül keletkező dibróm (vagy tribróm) intermedierek kevésbé stabilak, így nagy 23

24 gondot fordítottak ezek azonnali redukálására. + Me AgCCF3 Br 11. ábra: Cikloaddíció ezüst-tartalmú katalizátorral (Hoffmann, 1984). Ezt a módszert továbbfejlesztve Hoffmann és munkatársa (2000) már a következő reakcióval állította elő furánból a terméket, tetrabróm-aceton, trietil-borát és aktivált cink alkalmazásával (12. ábra). Br Br Br Br Br Zn, B(Et)3 + + Br Br Br Br 12. ábra: Cikloaddíció aktivált cinkkel (Hoffmann et al., 2000). Ezzel a 2,5 órás termikus eljárással a dibróm- és a tribróm-biciklusos molekula is keletkezett. A metanolban oldott intermediereket Cu/Zn katalizátor és ammónium-klorid segítségével redukálták -78 C-on. Montana és munkatársa (2001) [4+3] cikloaddíciós reakciókon végeztek összehasonlító vizsgálatot termikus és szonokémiai feltételek mellett (13. ábra). Ultrahang használatával nagyon enyhe körülmények szükségesek a heterogén reakciókban (Bremner, 1994). z + X X Z=CH2,, NCMe X=Br, I Cu/Zn X X 13. ábra: Cikloaddíció réz-cink katalizátorral (Montana, 2001). Megállapították, hogy az ultrahang használatával jelentősen lerövidültek a reakcióidők: dibróm-aceton reakciópartnerrel 90 percre, dijód-acetonnal pedig 7 percre. Ezekből a kísérletekből az is kiderült, hogy a brómozott reakciópartnerrel lényegesen jobb hozam érhető el. A halogénezett intermedierek redukálása Fe 2 (C) 9 (80 C, 18 óra) vagy Cu/NaI (60 C, 4 óra) katalizátorokkal történt. Az előző cikkek alapján alkottam meg a nem szubsztituált enonok szintézisét ultrahangos módszerrel. 24

25 2005-ben a kémiai Nobel-díjat Yves Chauvin, Robert H. Grubbs és Richard R. Schrock tudósok kapták a szerves szintézisekben alkalmazott olefin metatézis módszerének kifejlesztéséért. Eredményeik lehetővé tették, hogy az olefin metatézis fontos és meghatározó módszerré váljon, és bekerüljön a szerves kémikusok eszköztárába. A díjazottak a metatézis mechanizmusának tisztázása mellett hatékony katalizátorokat is kifejlesztettek (többek között az általam is használt Grubbs, Ru-tartalmú katalizátorokat) ezeknek a reakcióknak a kivitelezéséhez. A katalitikus metatézissel a szintézisek lerövidülnek és kevesebb felesleges melléktermék keletkezik. Az olefin metatézis az egyetlen szénlánc rekonfigurációs reakció, amelyben a C-C kötések fémtartalmú karbénkomplexek jelenlétében átrendeződnek (Grubbs et al., 1998; Fürstner, 2000; Grubbs, 2003). Az elmúlt években a polimer kémiában kifejlesztettek egy sokoldalú, hatékony módszert: a gyűrűzárási metatézist, amely makrociklusok előállításához, számos természetes vegyület, és bioaktív termék szintézisére használható (Felpin et al., 2003; Ramachandran et al., 2003; Prunet, 2003; Fuerstner, 2003). Azonban a gyűrűnyitási metatézist (RM), amely hasznos módszer lenne terminális diolefinek előállításához, és funkcionális gyűrűk szintéziséhez, mint komplementer reakciót eddig még nem dolgozták ki megfelelő alapossággal (Weeresakare et al., 2004; Connon et al., 2003; Hofle et al., 2003). Eddig gyűrűnyitási metatézist, csak nagyon feszített biciklusokkal, mint pl. norbornénekkel és ciklobutadiénekkel végeztek (Randall et al., 1995; Randall et al., 1997; Tallarico et al., 1997; Schneider et al., 1996). Wright és munkatársai (2001) biciklo[3,2,1]okt-6-én-3-on típusú molekulákon végeztek már gyűrűnyitási reakciókat Ru-tartalmú katalizátorokkal (14. ábra), és Veldhuizen és munkatársai (2005) Ru- és Ag-tartalmú katalizátorokkal ill. Gillingham és munkatársai (2004) szerkezetileg hasonló vegyületekkel tanulmányoztak egy aszimmetrikus gyűrűnyitási reakciót sztirollal és szintén Ru-tartalmú katalizátorokkal. R R 14. ábra: Gyűrűnyitási reakció Wright (2001) alapján, R= Ph-, o-brph-, CH 3 (CH 2 ) 3 -, BrCH 2 -, BrCH 2 CH 2 -, Me 2 C-, C-. A gyűrűnyitási metatéziseket tárgyaló irodalmakból kiderül az is, hogy gázhalmazállapotú olefineket használva, azok polimerizációja nem figyelhető meg a reakciók során. 25

26 2.4. Izolált enzimek vagy élő sejtes rendszerek használata A monooxigenáz enzimek használata a szintetikus kémiában a kofaktorok miatt bonyolult és drága. A FAD prosztetikus csoport általában szorosan kötődik az enzimhez és a katalitikus körben regenerálódik. A NADPH viszont az enzimatikus transzformáció során elfogy, így a költségtakarékos biotranszformáció eléréséhez a kofaktorokat vissza kell forgatni. Ennek a problémának a megoldására kettő lehetőség kínálkozik: izolált enzimek használata a kofaktorok regenerálásának megoldásával, vagy élő sejtes rendszerekkel végzett biotranszformációk. Izolált enzimek felhasználásakor a legjobb és a legszélesebb körben elterjedt módszer a NADH visszaforgatásához a formát-dehidrogenáz (FDH) enzim alkalmazásával, amely katalizálja a formát oxidációját szén-dioxiddá (Wichmann et al., 1981), a NADPH regenerálásához pedig a glükóz-6-foszfát (G6P)/glükóz-6-foszfát dehidrogenáz (G6PDH) rendszer lehet segítségünkre (Wong et al., 1981). Az élő sejtekkel végzett biokatalízis elegáns megoldást nyújt a kofaktorok problémájára, hiszen az élő organizmusok természetes visszaforgató rendszerrel rendelkeznek az összes szükséges faktorhoz. Mindemellett ebben az esetben elkerülhetők a bonyolult fehérjetisztítási eljárások, melyek izolált enzimek használatakor igencsak megnehezítik és megdrágítják a reakciót, és az enzim instabilitása sem korlátozza annak alkalmazhatóságát. A legtöbb esetben a sejtek könnyen növeszthetők és tárolhatók. Negatívumként viszont meg kell említeni egyrészt, hogy a mikroorganizmusokkal végzett reakciók esetében általában a termék kinyerése okozza a legfőbb gondot a híg, nagytömegű sejtet tartalmazó fermentléből, másrészt pedig az izolált enzimekkel szemben az egész sejtes rendszerek az enzimek sokaságát tartalmazzák, amelyek növelik a rendszer összetettségét. Ez a probléma kiiktatható, ha speciális génmanipulált rendszereket fejlesztünk ki. 26

27 2.5. Filamentáris enzimrendszerek A flagellin és a flagelláris filamentum jellemzése A flagellumok a baktériumok mozgásszervei. A bakteriális flagellum hosszú helikális filamentumai a sejtmembrán felszínén találhatóak és flagellin fehérjék (FliC) több tízezer példányából épülnek fel (Namba et al., 1997). A flagelláris filamentumok önszerveződő rendszerek, azaz megfelelő körülmények között a flagellin monomerek spontán képesek összeállni a natív filemantum szerkezetével megegyező filamentummá. A flagellin alegységek polimerizációja könnyen ellenőrizhető és a képződött filamentumok fizikai, kémiai hatásokkal és proteázokkal szemben ellenállóak, szerkezetét atomi szinten ismerjük (Samatey et al., 2001; Yonekura et al., 2003). A Salmonella typhimurium baktériumból származó flagellin 494 aminosavból áll. Különböző baktériumfajokból származó flagellinmolekulák aminosavsorrendjét összevetve nagyfokú homológia állapítható meg a terminális régiók esetében, - amely alatt Salmonella typhimurium esetében kb. 66 aminosavnyi N-terminális és 44 aminosavnyi C-terminális rész értendő -, azonban a fehérjék központi része nagyon variábilis (Wilson et al., 1994). Különböző eredetű flagellinek molekulatömege tág határok között változik (28-65 kda), ezek a különbségek a központi rész eltérő méreteiből adódnak. A flagellin alegységek a sejt belsejében szintetizálódnak és a flagellum-specifikus exportapparátus segítségével jutnak el beépülési helyükre, a filamentum végére (Macnab 2004; Muskotál et al., 2006). A részlegesen kitekeredett monomerek feltételezhetően a flagellum keskeny központi csatornáján (25-30 Å) keresztül szállítódnak. Ismertté vált, hogy a konzerválódott N-terminális 22 aminosav hosszúságú szegmense szükséges ahhoz, hogy a flagelláris exportrendszer felismerje a szállítandó fehérjét (Végh et al., 2006; Gál et al., 2006). A konzerválódott terminális régióknak is fontos szerepük van a flagellin önszerveződésében (Vonderviszt et al., 1991), hiszen a polimerizálódás során α-helikális kötegekké rendeződve stabilizálódnak és így alkotják a filamentumok központi részét (Mimori-Kiyosue et al., 1997). A flagellin monomerek proteázokkal könnyen emészthetők, pl. tripszinnel is gyorsan megtörténik a rendezetlen terminális régiók eltávolítása és létrejön egy viszonylag stabil 40 kda-os molekula, amely csak lassan emésztődik tovább egy 27 kda-os molekulává. A polimerizáció során a rendezetlen terminális régiókból kialakult α-helikális kötegektől erősödik a szerkezet, így a filamentum már ellenálló a tripszinnel szemben is (Vonderviszt et al., 1989). 27

28 A flagellin alegységek 11 protofilamentumba rendeződve alkotják a flagelláris filamentumot, amelyben a monomerek erős kölcsönhatásban vannak egymással (15. ábra). Csak a flagellin alegységek konzerválódott terminális régiói vesznek részt a filamentum felépítésében, a variábilis központi részük a D3 domént alkotja, amely a filamentum felszínén helyezkedik el (16. ábra). 15. ábra: A flagellin alegységek 11 protofilamentumba rendeződve építik fel a flagelláris filamentumok szerkezetét. (Samatey, et al., 2001). (a) D D (b) 16. ábra: (a) A flagellin alegységek szerkezete. (b) A flagellin alegységek elhelyezkedése a flagelláris filamentumokban. (Yonekura et al., 2003). 28

29 A D3 domén nem lép kölcsönhatásba a szomszédos alegységekkel és nincs lényeges szerepe a filamentáris szerkezetek felépítésében (12. ábra). A D3 domén a génsebészeti eljárások célpontja lehet, mivel könnyen módosítható a flagellin alegységek önszerveződésének és szállítódásának károsodása nélkül Flagelláris display-technológiák Kuwajima (1988) már 1988-ban állított elő olyan E.coli flagellin mutánsokat, amelyeknek variábilis központi részén végeztek deléciókat. A legkisebb deléciós mutáns csupán az N-terminális 193 és a C-terminális 117 aminosavát tartalmazta. Azóta a flagellin központi variábilis régiója jelenti a célpozíciót az idegen eredetű fehérjék génjeinek beillesztéséhez, hogy így azok megjelenhessenek a flagellumok felületén. A flagelláris displayt leggyakrabban az új rekombináns vakcinákkal kapcsolatos kutatásokban használják (Luna et al., 1997), emellett random peptid könyvtárak tesztelésére is alkalmazható, a fág-display technika egyik alternatívájaként. Lu és munkatársai (1995) létrehoztak egy olyan fúziós fehérjét, amelyben az E. coli thioredoxinjának teljes génjét építették be a flagellin gén cserélhető régiójába. Ezaki és munkatársai (Ezaki et al., 1998) szintén E. coli sejtek felszínére juttattak ki eltérő hatékonysággal rekombináns fehérjéket a flagellin gén segítségével. A fúziós fehérjék felszínre jutása az inszert nagyságától és szekvenciabeli helyétől függött, ezeken kívül még számos fel nem derített tényező is áll ennek hátterében A flagellin-enzim fúziós fehérjék létrehozása A flagelláris display esetében demonstrálták, hogy a flagellin variábilis részének nagy fragmentumai eltávolíthatóak és idegen peptideket vagy fehérjéket lehet beültetni erre a helyre úgy, hogy azokat az E. coli vagy a Salmonella baktériumok termeljék (Luna et al., 1997; Lu et al., 1995; Ezaki et al., 1998). Ezeknél az első próbálkozásoknál az eltávolított régiókat véletlenszerűen választották ki nagyfelbontású szerkezeti információk hiányában ben viszont sikerült a Salmonella typhimurium flagelláris filamentumának atomi szerkezetét meghatározni (Samatey et al., 2001). Ennek alapján a Salmonella typhimurium flagellinjének egy szerkezetileg független régióját lehet módosítani, amely pontosan a D3 domén, a aminosavig terjedő rész. Ezt a régiót kívánom lecserélni monooxigenáz enzimek (CHM és CPM) génjeire. A flagellin-enzim fúziós fehérjék egyik lehetséges nagy előnye az lenne, hogy 29

30 különböző filamentáris szerkezetek létrehozására felhasználhatók. A polimerizációs folyamat precíz ellenőrzésével a szükséges méretű filamentumok (0,1µm-20 µm) előállíthatók, amelyek az alegységek ezreit tartalmazzák. Monomer flagellinek oldatában a filamentumképződés elindítható precipitálószerek mint pl. ammónium-szulfát felhasználásával, vagy rövid filamentumok, mint magok, hozzáadásával (Asakura, 1970). Már az egyféle fúziós fehérjéből előállított filamentáris szerkezetek is szolgálhatnak néhány előnnyel: ezeknek a filamentumoknak a felületén nagyon nagy sűrűségben lennének jelen a katalitikus egységek, jellemzően 5 nm-es távolságban egymástól. A filamentáris szerkezetekben az alegységeknek azonos a lokális környezete. Szobahőmérséklethez közeli hőmérsékleten a flagelláris filamentumok hosszú időn át stabilak, és ellenállóak a proteázokkal szemben. Az egyetlen tény, ami veszélyezteti épségüket, az a filamentumok végein található alegységek lassú depolimerizációja, ami alacsony ionerősség mellett következik be. Amennyiben a flagellinenzim fúziós fehérjék képesek lennének exportálódni és filamentumot formálni a baktérium felületén, ezzel egyidejűleg a felületen enzimek nagy mennyiségben jelennének meg. Ezek a baktériumok, mint új mikrobiális biokatalizátorok hatékonyan alkalmazhatóak lennének biokonverziók esetében. Az ilyen felületek létrehozása egy egyszerű módja a rögzített enzimek előállításának és ez a módszer a gyakorlatban megszüntetné az enzimtisztítás szükségességét. Az előzőekben említett eljárásnak viszont vannak nyilvánvaló korlátozó tényezői, mint pl. a vizes közeg és a fiziológiai körülmények szükségessége. Ennek az egyfajta enzimet tartalmazó nanoszerkezetnek is több előnye van a már ismert rendszerekhez képest. Segítségével létrehozhatunk például olyan baktériumokat, amelynek a felszínén biokatalízisre képes filamentumok nőnek, és a reakció végeztével ezek a struktúrák könnyen eltávolíthatók, mivel az enzim fúziós fehérjeként vesz részt a flagellumok kialakításában, nem önmagában van jelen a katalízis során. Az ilyen filamentáris multienzim-szerkezetek a következő előnyökkel rendelkeznének a különböző biotechnológiai alkalmazásokban: hordozók nélkül alkalmazhatók, könnyen elválaszthatók a terméktől centrifugálással vagy ultraszűréssel, amely összehasonlítva a manapság használatos biokatalitikus enzimreakciókkal, elegáns és egyszerű megoldást jelentene, és használhatóak olyan körülmények között is, ami az élő sejtekre ártalmas lehet. A jövőben érdemes lenne továbbfejleszteni a filamentáris enzimszerkezeteket kapcsolt reakciókat katalizáló enzimek használatával, vagy az egyéni enzimeket a kofaktor-regeneráló enzimek együttes alkalmazásával. Ezen az irányvonalon elindulva a molekuláris biológia és biotechnológia modern eszközeivel olyan enantioszelektív és környezetbarát eljárásokat lehet kidolgozni a későbbiekben, amelyek a szerves vegyipari és gyógyszeripari alkalmazások alapját képezhetik. 30

31 3. Kísérleti rész A különböző alfejezetekben az azonos típusú reakciók kivitelezéséhez szükséges összetevők előállítását tárgyalom, megadok egy általános eljárást a reakciók elvégzéséhez, majd egy egy adott molekula előállításához szükséges vegyszereket, azok mennyiségét, illetve a körülményeket ismertetem. A vegyületek előállításánál részletesen csak azt a reakciót fejtem ki, amellyel a legjobb kitermelést értem el. A biciklusos vegyületek előállítására szolgáló ultrahangos fürdőben kivitelezett [4+3] cikloaddíciós reakcióval, majd az így kapott termékek debrómozásával állítottam elő a biciklusos molekulákat. Ezt követően a biciklusos vegyületek gázhalmazállapotú olefinekkel kivitelezett gyűrűnyitási metatézisei következnek. Ezzel a reakcióval előállított molekulákat vagy tisztítás után közvetlenül felhasználtam a biotranszformációkhoz, vagy katalitikus hidrogénezésnek vetettem alá, és ezután került sor a mikrobiális Baeyer-Villiger oxidációra. A biológiai oxidációk kontrolljaként elvégeztem a kémiai Baeyer-Villiger oxidációkat is, a kapott termékek NMR (magmágnes-rezonancia) és gázkromatográfiás (GC) adatait felhasználtam a biotranszformációkkal előállított termékek azonosítására. A kémiai Baeyer-Villiger oxidációkat részletesen nem kívánom kifejteni, csak az általános módszert írom le. Ebben a fejezetben a biológiai oxidációk kivitelezését is tárgyalom, a lejátszódott biooxidációk adatait táblázatba foglalva az Eredmények és következtetések című fejezetben adom meg. Az Eredmények és következtetések című fejezetben részletesen nem tárgyalt reakciók eredményei, a keletkezett termékek analitikai adatai a mellékletben találhatók Felhasznált anyagok és módszerek A munkám során felhasznált szerves oldószereket használat előtt desztilláltam. Az ultrahangos reakciók során Bandelin Sonorex super RK102H ultrahangos fürdőt használtam. A termékek tisztítását szilikagél 60 (40-63 µm, Merck) töltettel kiviteleztem. A GC vizsgálatok ThermoQuest Trace GC 2000 készülékkel készültek, DB5 (30 mm x 0.32 mm ID) és BGB 175 (30 mm x0,25 mm ID, 0,25 µm film) oszlopokkal. Az enantiomer felesleget (e.e.) a királis oszlopon végzett GC adatokból határoztam meg. Az NMR spektrumok felvétele CDCl 3 oldószerben, Me 4 Si belső standarddal, Bruker AC 200 (200 MHz) és Bruker Avance Ultrashield 400 (400 MHz) spektrométeren történt. A fajlagos optikai forgatóképességet ([α] 20 D, 20 C-on, a nátrium D vonalára, 589 nm-re 31

32 vonatkoztatva) Perkin Elmer Polarimeter 241 műszerrel határoztam meg a következő összefüggést használva: [ α] 20 D 100 α = ; α:: a polariméterrel mért érték, a polarizációs sík c l elforgatásának szöge [ ]; c: koncentráció [g/100 ml]; l: az oldat rétegvastagsága [dm]. Reakcióim kivitelezése során vékonyréteg kromatográfiát használtam a konverziók ellenőrzéséhez. A biotranszformációk során felhasznált E. coli expressziós rendszereket Dr. Pierre E. Rouviere (E.I. Dupont Company) től, és Prof. Margaret M. Kayser (University of New Brunswick) től kaptam. A BVM géneket tartalmazó plazmidokkal transzformált E. coli DH5α baktériumokat ampicillin tartalmú Luria-Bertani (LB) táptalajon növesztettem 80 C-on tárolt glicerines kultúrákból, a reakciókhoz a táptalajról különálló baktériumtelepeket választottam ki. A flagellin-enzim fúziós fehérjék létrehozásához a pkt-1 plazmidot használtam, melyet a Magyar Tudományos Akadémia (MTA) Szegedi Biológiai Központ (SZBK) Enzimológiai Intézete bocsátott rendelkezésemre. Ez a plazmid pbr322 alapú, a flagellin promóterét és génjét EcoRI helyen tartalmazza. Az Acinetobacter CHM génjét a pdr01 és a Comamonas CPM génjét a pdr05 plazmidokból PCR-eztem (PCR: polimeráz láncreakció), amelyeket a Bécsi Műszaki Egyetemről Dr. Marko D. Mihovilovic felajánlásával használok. Plazmidok megsokszorozására minden esetben E. coli TP10 sejteket alkalmaztam. A plazmidok tisztításához mega E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit II-t (általában 10 ml baktériumkultúrából preparáltam plazmidot és 50 µl steril deszt. vízzel eluáltam), PCR termékek gélből izolálásához és DNS fragmentumok emésztése után Promega Wizard SV PCR-Clean-up kitet használtam. A DNS-eket a New England Biolabs Inc. restrikciós endonukleázaival emésztettem, az emésztésekhez az enzimeknek megfelelő standard protkollokat alkalmaztam, a PCR reakciókat KD polimerázzal végeztem. A PCR-ekhez és a szekvenáltatáshoz felhasznált primereket a MTA SZBK Nukleinsav Szintézis Laboratóriumából rendeltem. A ligálásokhoz a Fermentas Rapid DNA Ligation Kit-jét használtam az ajánlott előirattal. Az emésztett plazmid defoszforilálására SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase, Promega) enzimet alkalmaztam az enzimhez tartozó leírás alapján. A DNS fragmentumok detektálására és izolálására agaróz gélelektroforézist végeztem. A DNS konstrukciók szekvenálását az MTA SZBK Szekvenáló Laborjában végezték. Az elkészült plazmidokat fehérjetermeltetés érdekében Salmonella SJW2536 flagellin-deficiens baktériumokba elektroporáltam. A baktériumok úszóképességét sötétlátóterű mikroszkóppal (lympus BX FLA, UPlan FI 40x/0,75 objektívvel) és Malapaka és munkatársai (2007) által leírt motilitás teszttel vizsgáltam. A fehérjeminták 32

33 töményítéséhez Microcon oszlopot (30000 MWC, Millipore, Bedford, MA, USA) használtam. A fehérjéket SDS (Sodium dodecylsulfate) gélelektroforézissel detektáltam, a fehérjekoncentrációkat Unicam Helios α fotométer segítségével határoztam meg a 280nmen mért értékekből a fehérjék extinkciós koefficienseit felhasználva (Ɛ 280 =17880 M -1 cm -1 a vad flagellin esetében és Ɛ 280 =10430 M -1 cm -1 a D3-deléciós flagellin esetében (EXPASY)). A vad flagellin és a D3-deléciós flagellin preparálását Vonderviszt és munkatársai (1989) alapján kiviteleztem. Cirkuláris dikroizmus (CD) mérésekhez a MTA SZBK Enzimológiai Intézetében lévő Jasco-720 spektropolarimétert használtam Cirkuláris dikroizmus A Cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia a polarizált fény és egy optikailag aktív anyag (esetemben fehérje) kölcsönhatásán alapulnak, a fehérjeoldat elforgatja a rajta keresztülbocsátott polarizált fény síkját. A CD spektroszkópiával gyorsan nyerhetünk információt a fehérjék szerkezetéről. A távoli ultraibolya tartományban ( nm) felvett CD spektrumból következtethetünk a másodlagos szerkezeti elemek (α-hélix, β- lemez, rendezetlen/random coil láncok) meglétére, illetve ezek arányára a fehérje térszerkezetében, míg a közeli UV tartomány ( nm) az aromás oldalláncokról, azok egymáshoz viszonyított térbeli orientációjáról, vagyis a harmadlagos szerkezetről ad információt. A műszer felhasználható fehérjék különböző környezeti behatások (pl.: ph változás, hődenaturáció) során bekövetkező konformációs változások nyomon követésére is ( Munkám során fehérjék denaturációs hőmérsékletének meghatározására alkalmaztam. A CD mérésekből kapott görbék inflexiós pontjainak meghatározása Qtiplot program felhasználatával készült E.coli TP10 kompetens sejt készítési eljárás 20 ml folyadék tápoldatba 50 µl előző éjjel 1 telepről felnövesztett baktériumkultúrát oltottam és felnövesztettem 37 C-on, míg a 600 nm-en mért abszorbanciája elérte a 0,6-ot (kb. 3-4 óra). A sejteket 4 C-on 4000 rpm-mel 10 percig centrifugáltam, innentől a baktériumcsapadékot a preparálás során jégen tartottam. Először 10 ml 0,1M MgCl 2 -vel óvatosan mostam a csapadékot, majd ismét kiülepítettem a sejteket, és másodszor 700 µl 0,1M CaCl 2 -be vettem fel. A sejtszuszpenziót 1 órán keresztül inkubáltam jégen, ezután az elkészült kompetens sejtekből 200 µl-t használtam transzformálásra. A kompetens sejtet a transzformálni kívánt plazmiddal jégen inkubáltam 33

34 1 órán át, majd 2 perc hősokk következett 42 C-on. Ezt követően ismét lehűtöttem a sejteket és 800 µl folyékony LB tápoldatot adtam hozzá, amiben 37 C-on 45 percig növesztettem. Ezután a transzformált sejteket kikentem a megfelelő antibiotikumot tartalmazó táptalajra Salmonella SJW2536 elektrokompetens sejt készítési eljárás 200 ml folyadék tápoldatot beoltottam 1 ml előző éjjel 1 telepről felnövesztett 20 ml-es starterkultúrából és növesztettem 37 C-on, míg a 600 nm-en mért abszorbanciája elérte a 1,0-t (kb. 3 óra). Centrifugálás előtt a kultúrát 5 percig jégen inkubáltam, majd 4 Con 4000 rpm-mel 10 percig fugáltam. A felülúszót leöntöttem, és a csapadékot 40 ml 4 Cos steril 15%-os glicerinnel felszuszpendáltam. Ezt követően ismét centrifugáltam, és megismételtem az előző mosási lépést. A harmadik centrifugálást követően 20 ml 4 C-os steril 15%-os glicerinnel mostam a csapadékot, majd ismét centrifugáltam. A csapadékot 800 µl 4 C-os steril 15%-os glicerinbe vettem fel, és 40 µl-ként szétosztottam steril eppendorf csövekbe. Az így elkészített elektrokompetens sejtek -80 C-on tárolhatók a felhasználásig. Az elektroporálást 3 kv-tal kiviteleztem 1-2 µl plazmid és 40 µl elektrokompetens sejt felhasználásával. Ezt követően 500 µl folyékony LB-ben növesztettem az elektroporált sejteket 37 C-on 1 órán keresztül, majd kikentem a sejtszuszpenziót a megfelelő antibiotikumot tartalmazó táptalajra. 34

35 3.2. Általános sémák + Br Br Br Br N H N CMe 1c + + Br Br Br Br Br Br Br Br X Br X Br 2 X=CH2 (a) X= (b) X=NCMe (c) 3 4a 4b 3a 4c 35

36 36 N-CMe N CMe N CMe N CMe 5d 6d 5e 6e 4f 6'f 4h 4g 3b 6f 5f 3c 4i 4j 4k

37 3.3. [4+3] cikloaddíció Cu/Zn katalizátor és pirrol-1-karbonsav-metilészter (1c) előállítása A cikloaddícióhoz felhasznált katalizátort LeGoff (1964) módszere szerint készítettem. 2,42 g réz-acetátot 100 ml tömény ecetsavban oldottam és refluxhűtővel hűtöttem. 60 g cinkport lassan hozzáadagoltam az oldathoz keverés mellett. További 5 perc reflux után az elegyet lehűtöttem szobahőmérsékletűre. A csapadékot szűréssel összegyűjtöttem, dietil-éterrel mostam, és vákuummal szárítottam. A Cu/Zn katalizátort argon atmoszféra alatt tároltam. A 3c molekula szintéziséhez először a pirrol-1-karbonsav-metilésztert állítottam elő (amelyet majd a cikloaddíciós reakcióban használtam fel): BuLi N H ClCMe 1c N CMe A reakciót Hodge és munkatársa (1963) leírása szerint kiviteleztem. 55 ml (2,367M, 1ekv.) n-butil-lítiumot csepegtetve hozzáadtam a 165ml dietil-éterben lévő 8,73 g (130,1 mmol, 1 ekv.) desztillált pirrolhoz kevertetés közben -40 C-on argon atmoszféra alatt. Ezután a reakcióelegyet hagytam felmelegedni 0 C-ra, és 12,3 g (130,1 mmol, 1 ekv.) metil-klórformátot tartalmazó 30 ml dietil-étert adtam hozzá. 4 órányi reflux után a keletkezett lítiumsót kiszűrtem, és a szűrletet telített NaHC 3 oldattal mostam. A szerves fázist vízmentes Na 2 S 4 -tal szárítottam, a szárítószer kiszűrését követően a dietil-étert vákuumbepárlóval eltávolítottam. A terméket Kugelrohr desztillációval tisztítottam Általános módszer ultrahangos fürdőben kivitelezett reakciókhoz Br Br Br Br + X Cu/Zn X=CH2 (a) X= (b) X=NCMe (c) X Br 2 Br A Zn vagy a Cu/Zn katalizátor és az acetonitril jéggel hűtött elegyéhez (30 %-os szuszpenzió) acetonitrilben oldott tetrabróm-acetont (TBA, 1 ekv., 40 %-os oldat) adtam. 37

38 (A Zn katalizátort a reakció előtt egy csepp dibróm-metánnal aktiváltam.). Ezután ezt a reakcióelegyet tartalmazó lombikot ultrahangos fürdőbe merítettem és elkezdtem szonikálni, végül frissen desztillált diént (3-15 ekv.) adtam az elegyhez. A reakciót GC-vel követtem nyomon, és víz (55 ekv.) hozzáadásával állítottam le. Az elegyet leszűrtem, és a vizes fázist dietil-éterrel háromszor extraháltam. A szerves fázist vízmentes Na 2 S 4 -tal szárítottam, rotációs vákuumbepárlóval töményítettem (<30 C-os vízfürdőben). A nyersterméket tisztítás nélkül használtam fel a következő debrómozási lépésben a. 2,4-dibróm-biciklo[3,2,1]okt-6-én-3-on (2a) előállítása Br Br Br Br + Zn MeCN 2a Br Br A reakciót az általános ultrahangos módszer szerint kiviteleztem. Egy csepp dibróm-metánt adtam az acetonitril és az 1,97 g cinkpor (3 ekv., 30 %-os szuszpenzió), elegyéhez nitrogén atmoszféra alatt, majd hozzáadtam acetonitrilben oldott 3,8 g tetrabróm-acetont (10,06 mmol, 1 ekv.), végül a frissen desztillált 4,16 ml (5 ekv.) ciklopentadiént. 1 óra szonikálás után állítottam le a reakciót 10 ml (55 ekv.) vízzel. Az extrakció előtt a csapadékot leszűrtem, dietil-éterrel extraháltam, a terméket betöményítettem és tisztítás nélkül használtam fel a debrómozásban b. 2,4-dibróm-8-oxabiciklo[3,2,1]okt-6-én-3-on (2b) előállítása Br Br Br Br + Cu/Zn MeCN 2b Br Br A reakciót az általános eljárás alapján kiviteleztem. 1,97 g (3 ekv.) Cu/Zn katalizátor és acetonitril elegyéhez 3,8 g (10,06 mmol) TBA-t adtam, majd elkezdtem szonikálni. Végül 7,33 ml (10 ekv.) furánt adtam a reakcióelegyhez. 1 óra alatt játszódott le a reakció, amit 10 ml (55 ekv.) vízzel állítottam le. A szerves fázist szűrés után dietiléterrel extraháltam, majd vákuumbepárlóval betöményítettem. 38

39 3.3.2.c. 2,4-dibróm-8-metoxikarbonil-8-azabiciklo[3,2,1]okt-6-én-3-on (2c) előállítása Br Br Br Br + N CMe Zn Br N MeCN CMe 2c Br A reakciót az általános leirat szerint kiviteleztem. 1,4 g (3,7 mmol) TBA-t használtam fel 1,2 g (5 ekv.) cinkporral és 1,39 g 1c vegyülettel acetonitril oldószerben. 2 óra elteltével 3,7 ml (55 ekv.) vízzel állítottam le a reakciót. Szűrés után a vizes fázist háromszor extraháltam dietil-éterrel. 30 C hőmérsékletű vízfürdőben vákuumbepárlóval betöményítettem a terméket, amit tisztítás nélkül használtam fel a következő debrómozási lépésben Debrómozás Általános módszer debrómozáshoz X Br Cu/Zn X X= CH2,, NCMe 2 Br 3 A metanolban oldott dibróm intermedier 10 %-át cseppenként a frissen preparált Cu/Zn (10 ekv.) katalizátort tartalmazó ammónium-klorid metanolos oldatához (25 %) adagoltam 80 C-on keverés közben. A reakcióelegyet 15 percig kevertettem ezen a hőmérsékleten, majd az intermediert továbbadagoltam, ügyelve arra, hogy a hőmérséklet ne emelkedjen 10 C fölé. Miután az összes intermediert a lombikba csepegtettem, szobahőmérsékleten folytattam a keverést 2-12 órán keresztül, a GC eredmény függvényében. Az elegyet szűrtem, a csapadékot mostam dietil-éterrel, majd eltávolítottam a szerves oldószert. A bepárlás utáni maradékot kevés dietil-éter és telített NaHC 3 elegyében oldottam. A keletkezett csapadékot szűréssel eltávolítottam, és a vizes fázist háromszor extraháltam dietil-éterrel. Az egyesített szerves fázisokat nátrium-szulfáton szárítottam, szűrtem és vákuumbepárlóval töményítettem (<30 C-os vízfürdőben). 39

40 3.4.1.a. Biciklo[3,2,1]okt-6-én-3-on (3a) előállítása Br Cu/Zn 2a Br MeH 3a A ciklizációban keletkezett 2,76 g 2a terméket használtam fel az általános debrómozási módszer alapján 20 ml metanolban oldva, 5,56 g (10 ekv.) Cu/Zn katalizátorral 30 ml NH 4 Cl metanolos (25 %) oldatában. 12 óra keverés után, a reakcióelegyet szűrtem, a csapadékot dietil-éterrel átöblítettem, a szerves szűrletet betöményítettem, majd mostam telített NaHC 3 oldattal és dietil-éterrel. A vizes fázist extraháltam dietil-éterrel, nátrium-szulfáttal szárítottam, szűrtem és vákuumbepárlóval betöményítettem b. 8-oxabiciklo[3,2,1]okt-6-én-3-on (3b) előállítása Br Cu/Zn 2b Br MeH 3b Az általános debrómozás módszere szerint kiviteleztem a reakciót, 5,56 g (10 ekv.) Cu/Zn katalizátorral. 1 óra keverés után GC-vel teljes konverzió volt kimutatható. Ekkor a reakcióelegyet leszűrtem, a metanolos szűrletet betöményítettem, majd mostam telített NaHC 3 oldattal és dietil-éterrel. A vizes fázist háromszor extraháltam dietil-éterrel, nátrium-szulfáttal szárítottam, szűrtem és vákuumbepárlóval betöményítettem c. 8-metoxikarbonil-8-azabiciklo[3,2,1]okt-6-én-3-on (3c) előállítása N CMe N CMe Br Cu/Zn 2c Br MeH 3c A ciklizációval előállított 2c terméket alakítottam tovább az általános módszer alapján 2,41 g Cu/Zn katalizátorral. 12 óra kevertetés után az elegyet leszűrtem, a terméket 40

41 betöményítettem, mostam telített NaHC 3 oldattal és dietil-éterrel. A vizes fázist háromszor extraháltam dietil-éterrel, nátrium-szulfáttal szárítottam, szűrtem és vákuumbepárlóval betöményítettem Gyűrűnyitási metatézisek X R X R R= H, CH3, CH2CH3 X= CH2,, NCMe A bicikloketont (1 ekv., 100 mg) diklórmetánban feloldottam, és felette a lombikban átbuborékoltattam egy ballonból az olefint. Az 1 mol% katalizátort (Grubbs I vagy Grubbs II) szintén diklórmetánban (2 ml) oldottam, és beinjektáltam a reakcióelegybe. A reakció során 3 óránként cseréltem az olefines ballont. A konverziót GC-vel ellenőriztem. Az egyensúly elérésekor etil-vinil-étert adtam feleslegben az elegyhez, és 30 percig kevertettem. Az oldószert vákuumbepárlóval eltávolítottam, és a terméket oszlopkromatográfiával tisztítottam (LP/EtAc=40/1). A 3c biciklo vegyületből nem sikerült előállítanom a várt 4i, 4j, 4k molekulákat ld. Eredmények és következtetések c. fejezet Katalitikus hidrogénezés 4f katalitikus hidrogénezésével állítottam elő az 5f molekulát. 4f-t etil-acetátban oldottam és 5 m% Pd/aktívszén katalizátorral Parr apparátusban 70 psi hidrogén nyomás alatt egy éjszakán át kevertem. A teljes konverziót GC-vel ellenőriztem, majd az elegyet szűrtem, a csapadékot etil-acetáttal mostam, végül a terméket betöményítettem. 41

42 3.7. Általános módszer kémiai Baeyer-Villiger oxidációkhoz Az oxidálni kívánt ketont metilén-kloridban oldottam (10 % oldat) és m-cpbs-t (meta-klór-perbenzoesav, 5-10 ekv.) adtam hozzá. A reakcióelegyet szonikáltam. A konverziót GC-vel ellenőriztem. A teljes konverzió után trietil-amint (5 ekv.) adtam az elegyhez, hogy a még megmaradt m-cpbs-sel vízoldható csapadékot hozzon létre. 30 perc múlva az elegyet telített NaHC 3 oldattal mostam, és háromszor extraháltam metilénkloriddal, az egyesített szerves fázisokat nátrium-szulfáton szárítottam, szűrtem, és vákuumbepárlóval töményítettem. A kémiai Baeyer-Villiger oxidációkból kapott termékek NMR és GC adatait használtam fel a biotranszformációkkal előállított termékek azonosítására Biológiai Baeyer-Villiger oxidációk Biotranszformációk A mikroorganizmusok az összes szükséges kofaktor forrásaként szolgálnak. Munkám során genetikailag módosított Escherichia coli kultúrákat használtam a biotranszformációkhoz, amelyek különböző BVM géneket tartalmaztak overexpressziós vektorban. A gének a következő baktérium-fajokból származtak: Acinetobacter sp. NCIMB 9871 (CHM Acineto ) Brevibacterium HCU (CHM BreviI és CHM BreviII ) Comamonas sp. NCIMB9872 (CPM Coma, ciklopentanon monooxigenáz) Acidovorax sp. (CHM Acido ) Arthrobacter sp. BP (CHM Arthro ) Rhodococcus sp. Phi1 (CHM RhodoI ) Rhodococcus sp. Phi2 (CHM RhodoII ) Escherichia coli DH5α baktériumot használtam az enzimek termeltetésére és közvetlenül a biotranszformációra. Ennek a baktériumnak a genomjában található a T7- RNS polimeráz génje, amely a lacuv5 promóter ellenőrzése alatt van. Ennek az aktív polimeráznak a termelődését a baktérium-kultúrához IPTG-t adva lehet indukálni. A T7- RNS polimeráz felismeri a T7 promóter szekvenciát az enzim génje előtt, és elkezdődik a gén transzkripciója, amelynek az eredménye a nagy mennyiségben termelődő enzim (esetemben CHM vagy CPM). 42

43 Általános módszer a biotranszformációkhoz A biotranszformációkat minden esetben 24 ºC-on, 250 ml LB tápoldatot és 200µg/ml ampicillint tartalmazó Erlenmeyer lombikokban végeztem egy éjszakán át, amelyeket előzőleg 2,5 ml overnight baktériumkultúrával oltottam be. 2 óra növesztés után a kívánt CHM termelést 0,025 mm végkoncentrációjú IPTG (iso-propil-β-d-1 tiogalaktopiranozid) hozzáadásával indukáltam. Ekkor adtam a tápoldathoz a 100mg oxidálni kívánt kiindulási vegyületet is. A teljes konverzió általában 1 nap alatt ment végbe. Néhány esetben 1 ekvivalens mennyiségű β-ciklodextrint adtam a biotranszformációk során a tápoldathoz, hogy megnöveljem a konverziót, hiszen az a szubsztrátum oldékonyságát növeli, a szubsztrátum sejtmembránon keresztüli könnyebb bejutását lehetővé teszi, és a toxicitását is lecsökkenti az élő sejtre nézve. A biotranszformációk végén a baktériumokat centrifugálással elválasztottam (4000rpm, 20 perc). A felülúszót háromszor extraháltam metilén-kloriddal, vagy kloroformmal. Ha nehezen ülepedő emulzió jött létre, akkor hyflo-n keresztül átszűrtem az elegyet. A szerves fázist nátrium-szulfáton szárítottam, szűrtem és vákuumbepárlóval töményítettem a. 1,4-dioxepan-5-on előállítása 5d 6d 100 mg (1 mmol) 5d molekulát (Sigma-tól vásároltam) alakítottam át a nyolc rekombináns baktériummal β-ciklodextrin nélkül az általános biotranszformációs eljárás szerint, majd oszlopkromatográfiával tisztítottam b. Cisz-2,7-dimetil-1,4-dioxepan-5-on előállítása 5e 6e 100 mg (0,78 mmol) 5e vegyületet (Birgit Grötzl-től kaptam) használtam fel szubsztrátumként a nyolcféle enzimmel végzett biotranszformációkhoz, β-ciklodextrin (1 43

44 ekv.) felhasználásával. A terméket oszlopkromatográfiával tisztítottam c. Cisz-2,7-dietil-1,4-dioxepan-5-on előállítása 5f 6f 99 mg (0,63 mmol) 5f molekulát transzformáltam CHM Acineto enzimmel, β- ciklodextrin (1 ekv.) jelenlétében. A terméket Kugelrohr desztillációval tisztítottam. A másik hét BVM-val munkatársaim végezték a vizsgálatokat d. Cisz-2,7-divinil-1,4-dioxepan-5-on előállítása 4f 6'f 100 mg (0,66 mmol) 4f vegyülettel végeztem a biotranszformációt a nyolc rekombináns baktériummal β-ciklodextrin (1 ekv.) felhasználásával. A terméket oszlopkromatográfiával tisztítottam. 44

45 3.9. Flagellin-enzim fúziós fehérjék létrehozása D S konstrukciók tervezése A Salmonella typhimurium flagellinjének (FliC) egy szerkezetileg független régióját, a D3 domént ( aminosavig terjedő rész) kívánom lecserélni monooxigenáz enzimek (CHM Acineto és CPM Coma ) génjeire. Első lépésként a D3- deléciós mutánst állítottam elő úgy, hogy a teljes D3 domént eltávolítottam a flic génből, és helyére egy rövid oligonukleotid szakaszt (linkert) illesztettem be. A linker tervezésekor figyelembe kellett vennem, hogy olyan aminosavakat kódoló nukleotidokkal alakítsak ki vágóhelyet a pkt-1 plazmidban, amelyek a flagellin szerkezetét valószínűleg nem, vagy csak kis mértékben változtatják meg és emellett olyan restrikciós endonukleázt kellett választanom, ami nem hasítja az eredeti pkt-1 plazmidot. Így esett a választás a PmeI enzimre. Tehát a D3 domén helyére beépített linker a következő aminosavakat tartalmazta a 190. és a 285. aminosavat is beleértve: GGLNSAA. A glicin kis méretéből adódóan lehetőséget biztosít a peptidlánc flexibilitására, a leucin és az alanin hidrofóbok lévén erősítik a kompakt szerkezetet, α-hélix kedvelő aminosavak. Az aszparagin adott aminosav volt a PmeI vágóhelyet kódoló nukleotidok miatt, a szerinnel együtt poláros aminosavak. Az előzőek alapján megtervezett és előállított D3-deléciós konstrukciót a soron következő kísérletekben használtam fel, mint a heterogén DNS szekvencia alapját. Azokat a flagellin szekvenciarégiókat, amelyek szükségesek és elégségesek a flagellinfehérjék célbajuttatásához, a filamentumok végéhez való transzportálásához, nem módosítottam. Ez remélhetőleg azt eredményezi, hogy a rekombináns flagellin molekula - mivel megmarad az a képessége, hogy a sejt felszínén kifejeződjön - mint a flagelláris filamentumot felépítő alegység - könnyen izolálható és tisztítható lesz. A 17. ábrán részletesen láthatóak DNS-szinten a D3-deléciós illetve a fúziós konstrukciók kivitelezésének részlépései. A flagellin fehérje promóterét és génjét tartalmazó pkt-1 plazmidból először AatII enzimmel kivágtam a flagellin génjét, az előtte lévő génszabályozó szakasszal, a promóterrel együtt, ezt jelzi az ábrán az AatII restrikciós endonukleáz vágóhelyei közötti kisebb fragmentum. Ezen a lineáris DNSszakaszon végeztem a későbbiekben a változtatásokat annak érdekében, hogy a flagellinből a D3 domén génszakaszát el tudjam távolítani. Polimeráz láncreakció (PCR) segítségével PmeI restrikciós vágóhelyet építettem be a D3-deléciós flagellin mutánsba, aminek segítségével lehet bejuttatni a mutáns flagellin génbe a fúzionáltatni kívánt enzim génjét. Ezután a D3 nélküli (deléciós) flagellin DNS-szakaszt visszaépítettem az üres plazmidba, 45

46 így létrejött a D3-deléciós flagellin mutánst tartalmazó plazmid, amely a későbbiekben használható volt arra, hogy a PmeI restrikciós vágóhelyre, a D3 domén helyére beültessek monooxigenáz enzimet. Ehhez az kellett, hogy a monooxigenázok génjét tartalmazó plazmid segítségével úgy sokszorozzam meg a CHM és CPM génjét PCR-rel, hogy annak a két végén PmeI restrikciós vágóhelyek legyenek. A monooxigenáz gének beültetését úgy végeztem el, hogy PmeI restrikciós enzimmel emésztettem a megsokszorozott monooxigenáz géneket és a létrehozott mutáns flagellint tartalmazó plazmidot, majd összekeverve ezt a két komponenst, ligáz enzim segítségével, összeépítettem. 17. ábra: A flagellin-enzim fúziós D S-konstrukció létrehozásának részlépései. 46

47 A rekombináns plazmidokat elektroporálással juttattam be a fehérje termeltetésére használandó SJW2536-os flagellin-deficiens baktériumokba. Vizsgáltam, hogy a fúziós fehérjék exportálódnak-e a flagelláris exportrendszeren keresztül, és filamentumot formálnak-e a baktérium felszínén, vagy a citoplazmában akkumulálódnak. Ennek megállapítására sötétlátóterű mikroszkóp, motilitás teszt és SDS gélelektroforézis szükséges. Ha a fúziós fehérjék a flagelláris exportrendszer segítségével szállítódva flagelláris filamentumokat hoznak létre, akkor könnyedén leválaszthatóak a sejtről mechanikus erő hatására, centrifugálással izolálhatók és hő hatására monomerizálhatók. Remélhetőleg a fúziós fehérjék polimerizációs képessége lehetővé teszi a könnyű tisztítást a polimerizáció és depolimerizáció egymás utáni többszöri kivitelezésével. A tisztított flagzimek feltekeredését kalorimetriai és spektroszkópiai mérésekkel lehet ellenőrizni, a katalitikus aktivitást pedig standard enzimvizsgálatokkal D S konstrukciók előállítása D3-deléciós plazmid A DNS munkát a pkt-1 plazmid AatII restrikciós endonukleázzal történő emésztésével kezdtem (későbbiekben jelölése: pkt-1/aatii). Ennek az enzimnek kettő vágóhelye van ezen a plazmidon, így azt kettő lineáris fragmentumra vágja (2kb és 5kb). A kisebbik fragmentum tartalmazza a flagellin promóterét és génjét, ami templátként szolgál a PCR reakcióhoz. Az AatII-es emésztési elegyet 37 C-on 1,5 órán keresztül inkubáltam, majd 65 C-on 20 percig inaktiváltam az enzimet, ezután gélből izoláltam mindkettő fragmentumot. A kisebb fragmentum felhasználását az előzőekben említettem. Az 5kb-os fragmentumot előkészítettem a későbbi ligáláshoz, hiszen az AatII vágóhelyeken illesztem vissza a módosított flagellint. A plazmidot először defoszforiláltam SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase) enzimmel, mely a DNS 5 végén lévő foszfátcsoportot távolítja el, ennek következtében a fragmentum két vége nem tud kialakítani foszfodiészter kötést egymással, így meg lehet akadályozni, hogy a későbbi ligálás során ez a DNS önmagába kapcsolódjon össze. A defoszforilálás reakcióelegyét 37 C-on 30 percen keresztül inkubáltam. Ezután 65 C-on 15 percig inaktiváltam az enzimet, majd Wizard oszlopon tisztítottam, és 35 µl steril deszt. vízzel eluáltam. 47

48 PCR reakcióval hoztam létre a D3-deléciós inszertet négy primer segítségével. A flagellin N-terminálisának (az első AatII helytől, ami a promóterben van) PCR-ezésére használtam a Del1AatIIfor (5 -CCACCTGACGTCTAAGAAACCATT- 3 ) primert, amely az AatII helyet tartalmazta és a Del1PmeIrev (5 - AGAGTTTAAACCTCCTGTAACAGTTGCAGCCGTATCG- 3 ) primert, ami a PmeI helyet. A C-terminális (a második AatII vágóhelyig, ami a FliC gén utáni terminátor régióban van) felerősítésére a Del1PmeIfor (5 - TAT GGT Ala TTA Leu AAC Asn TCT Ser GCA Ala GCA Ala AATGCTGATTTGACAGAGG-3 ) primert (alsó indexben a inzercióban kódolt aminosavakat tüntettem fel), amely a PmeI helyet tartalmazta és a Del1AatII2rev (5 -CCACCTGACGTCACCTCCGGGC-3 ) primert az AatII vágóhellyel. A reakció templátjaként a pkt-1 plazmid AatII-vel történő emésztéséből izolált kisebb fragmentum szolgált, amelyből úgy sokszoroztam meg az előbb említett primerekkel a flagellin elejét és végét, hogy a középső részét, a D3 domént nem tartalmazta. A flagellin N-terminálisának (Del1AatIIfor és Del1PmeIrev primerekkel) és C-terminálisának (Del1PmeIfor és Del1AatII2rev primerekkel) PCR-ezését a következő összeméréssel és programmal kiviteleztem: 25,8 µl steril deszt. víz 95 C 2 perc 5 µl 10x KD puffer 95 C 20 sec (s) 3 µl 25 mm MgS 4 60 C 10 s 5 µl 2 mm dntp 70 C 15 s 20 ciklus 5 µl 10 pmol/ µl forward primer 70 C 10 perc 5 µl 10 pmol/ µl reverse primer 4 C 2 perc 1,2 µl ~50 ng/µl pkt-1 1 µl 1 U/ µl KD Mindkét PCR-ből 4-4 adaggal készítettem, gélből izoláltam és 50 µl steril deszt. vízzel eluáltam. Ezt követően a tiszta termékeket emésztettem AatII-vel és PmeI-gyel a ligálás előkészítésének érdekében. Az emésztési elegyet (egyszerre mindkét enzimmel) 37 C-on 1 órán keresztül inkubáltam, majd 65 C-on 20 percig inaktiváltam az enzimeket. Ezt követően az emésztett DNS-t Wizard oszlopon tisztítottam és 35 µl steril deszt. vízzel eluáltam. Az így előkészített fragmentumokat ligáltam össze egymással és a pkt-1 plazmid AatII enzimmel emésztett nagy fragmentumával. A ligálás előtt agaróz gélen megfuttattam a DNS mintákat, hogy megtudjam mennyi az egymáshoz viszonyított mennyiségük, milyen összeméréssel kivitelezzem a ligálást. Ez alapján a ligálási elegyhez a következő mennyiségben mértem össze az összetevőket: 1 µl 60 ng/µl flagellin N- terminális PCR termék, 1 µl 50 ng/µl flagellin C-terminális PCR termék, 1 µl 20 ng/µl 48

49 pkt-1/aatii nagy fragmentum, 2 µl 5x ligáz puffer, 4 µl Steril deszt. víz, 1 µl ligáz. A ligálási reakciót 22 C-on 10 percen keresztül inkubáltam, majd jégre tettem és a 10 µl ligálási eleggyel transzformáltam 200 µl E.coli TP10 kompetens sejtet. A sejteket ampicillin tartalmú LB (LB Amp ) táptalajra kikentem és 20 órán keresztül növesztettem 37 C-on. A felnőtt telepeket leoltottam 4-4 ml folyékony LB Amp -ba és felnövesztés után (37 C overnight) ezekből a baktériumkultúrákból plazmidot preparáltam. A rekombináns plazmidok ellenőrzését PmeI és EcoRI enzimeket használva végeztem el, az emésztett mintákat 1%-os agaróz gélen futtattam. A PmeI-es emésztés annak a megállapítására szolgált, hogy a módosított plazmid valóban tartalmazta-e a beépített PmeI vágóhelyet. Az EcoRI-es emésztésnek pedig az eredeti pkt-1 kontrollhoz viszonyított méretcsökkenést kellett mutatnia, mivel a plazmidból kivágott inszertnek a D3 méretével (285 bp) kisebbnek kellett lennie. Így választottam ki azokat a D3-deléciós plazmidokat, amelyeket további ellenőrzés érdekében elküldtem szekvenáltatni. Az így előállított D3-deléciós flagellint tartalmazó pkt-1 plazmidot használtam a flagellin-chm és flagellin-cpm DNS konstrukciók létrehozására a beépített PmeI restrikciós endonukleáz vágóhely segítségével Fúziós D S konstrukciók Először a D3-deléciós plazmidba beépíteni kívánt CHM Acineto és CPM Coma gént sokszoroztam meg PCR segítségével. Ehhez templátként a pdr01 és pdr05 plazmidokat használtam fel, melyeket a biotranszformációk során is alkalmaztam transzformált E.coli sejtek felhasználásával. Első körben a PCR-hez primereket kellett tervezni. A CHM génhez (1620 bp) a CHMPmeIforw (5 - AGAAGTTTAAACATACATATGTCACAAAAAATGGA -3 ) és CHMPmeIrev (5 - TATGGTTTAAACCTTGCTTGATATCTGAACGTTGT -3 ) primereket, a CPM génhez (1650 bp) pedig a CPMPmeIforw (5 - ACAAGTTTAAACATACATATGACCACCATGACCAC -3 ) és CPMPmeI rev (5 - TCAAGTTTAAACGCGAGAAGCCTGCATATCCT -3 ) primereket alkalmaztam, melyek tartalmazták a PmeI restrikciós hasítóhelyet is. CHM Acineto génhez a következő összemérést és programot használtam a PCR során: 49

50 25 µl steril deszt. víz 5 µl 10x KD puffer 3 µl 25 mm MgS 4 5 µl 2 mm dntp 5 µl 10 pmol/ µl CHM PmeIforw primer 5 µl 10 pmol/ µl CHM PmeIrev primer 2 µl ~50 ng/µl pdr01 1 µl 1 U/ µl KD 95 C 2 perc 95 C 20 sec (s) 48 C 10 s 70 C 40 s 20 ciklus 70 C 10 perc 4 C 2 perc A CPM Coma PCR-ezéséhez az alábbiakat: 25 µl steril deszt. víz 95 C 2 perc 5 µl 10x KD puffer 95 C 20 sec (s) 3 µl 25 mm MgS 4 59 C 10 s 5 µl 2 mm dntp 70 C 40 s 20 ciklus 5 µl 10 pmol/ µl CPM PmeIforw primer 70 C 10 perc 5 µl 10 pmol/ µl CPM PmeIrev primer 4 C 2 perc 2 µl ~50 ng/µl pdr05 1 µl 1 U/ µl KD A PCR-ek után a termékeket 1%-os agaróz gélből izoláltam, a CPM esetében egyszerre 4 adag PCR-t, a CHM esetében pedig 8 adaggal, mert jóval kevesebb terméket kaptam a reakció során. Az DNS-eket az oszlopról 45 µl steril deszt. vízzel eluáltam, majd emésztettem PmeI-gyel. Ezzel egyidejűleg a D3-deléciós pkt-1 plazmidot is előkészítettem a ligáláshoz, emésztettem PmeI enzimmel, majd defoszforiláltam SAP enzimmel. A standard ligálási protokoll alapján ligáltam össze a D3-deléciós plazmidot a CHM-val és a CPM-val. Az összemérés a következő volt: 2 µl 12 ng/µl D3-deléciós plazmid/pmei+sap, 3 µl 80 ng/µl CHM/PmeI, 4 µl 5x ligáz puffer, 10 µl steril deszt. víz, 1 µl ligáz. Az összemérés CPM inszerttel is hasonló volt. A ligálási elegyekkel (10-10 µlrel) E.coli TP10 kompetens sejteket transzformáltam. A felnőtt telepeket leoltottam 4-4 ml folyékony LB Amp tápoldatba, ezekből a kultúrákból preparáltam plazmidot. A ligálás eredményességét először PmeI enzimes emésztéssel ellenőriztem, hiszen így 2 lineáris fragmentumra kellett bontania a plazmidomat, a nagyobb az inszert nélküli D3-deléciós plazmid, a kisebb a CHM vagy a CPM génje. Ezt követően orientációellenőrzés érdekében HindIII-as emésztést is végeztem azokkal a plazmidokkal, amelyekben valóban benne volt az inszert. Az orientációellenőrzésre azért volt szükség, mert csak 1 restrikciós 50

51 endonukleázt, a PmeI-t használtam fel a fúziós konstrukciók létrehozására, így az inszertek fordítva is beépülhettek a D3-deléciós plazmidba. Azért a HindIII enzimet választottam erre a célra, mert a pkt-1 plazmidban csak 1 vágóhelye van, valamint az enzimek génjeiben is van 1-1. Tehát szintén 2 lineáris fragmentumot kellett kapnom, melyek a jó orientációjú CHM-s konstrukció esetében: 6072 bp és 1480 bp méretűek. Ha a CHM fordítva épült be, akkor 5802 bp és 1750 bp nagyságúra változnak a fragmentumok. A CPM-s konstrukció esetében jó irányú beépüléssel: 5184 bp és 2389 bp-os DNS-eket, míg rossz orientáció esetében: 6711 bp és 862 bp nagyságú lineáris fragmentumokat kell kapni a HindIII-as emésztés után. Ezek a méretbeli különbségek jól ellenőrizhetők agaróz gélen D3-deléciós flagellin fehérje Fehérjetermeltetés Szekvenáltatás után a hibátlan D3-deléciós plazmidot elektroporáltam Salmonella SJW2536-os elektrokompetens sejtekbe. Ez a Salmonella egy flagellin-deficiens baktérium. Ennek a baktériumnak csak a flagellin génjét távolították el, minden más génje megmaradt, így ha egy olyan plazmidot juttatok bele, amely flagellint kódol, akkor a flagellinek az exportcsatornán átjutva a baktérium felszínén filamentumot hoznak létre és így a nem úszó deficiens baktériumból úszó baktérium lesz. A transzformált baktériumok úszóképességét sötétlátóterű mikroszkóppal, motilitás teszttel és közvetetten SDS gélelektroforézissel vizsgáltam. Ezekhez a vizsgálatokhoz kontroll baktériumokat használtam, melyekhez hasonlítottam a D3-deléciós flagellinnel rendelkező baktérium viselkedését. A pozitív kontroll a pkt-1-gyel elektroporált SJW2536-os baktériumkultúra, a negatív kontrollt pedig a plazmidot nem tartalmazó SJW2536-os baktériumkultúra jelentette. Sötétlátóterű mikroszkóp használatával tudtam összehasonlítani a baktériumok úszását, illetve a preparálás során a kialakult filamentáris kötegek milyenségét. A motilitás agarra oltott baktériumokat 37 C-on növesztettem egy éjszakán keresztül, majd lemértem a felnőtt telepek nagyságát. A motilitás teszthez felhasznált baktériumkultúrát úgy állítottam elő, hogy 37 C-on egy éjszakán keresztül tápoldatban felnövesztettem azt a kultúrát, amiből 10 µl-t oltottam be 4 ml LB-be és ezt növesztettem egészen addig, míg 600 nm-en az abszorbanciája 0,6 körüli érték lett. A vizsgálni kívánt baktériumokat azonos abszorbanciaértékig növesztettem, hogy a motilitás teszt eredménye valóban összehasonlítható legyen. Az SDS gélt a következő mintaelőkészítés után használtam 51

52 annak érdekében, hogy megállapítsam, hogy a baktériumok valóban létrehoznak-e filamentumot a baktériumok felszínén a D3-deléciós flagellinből. 1 ml overnight baktériumkultúrát 60 C-on 10 percig melegítettem, majd rpm-mel 10 percen keresztül centrifugáltam a sejteket. Így az ülepítés után a felülúszóban csak azok a monomer flagellinek voltak, amelyek a sejt felszínén kialakították a filamentumot. Az SDS gélre való felvitel előtt ezeket a felülúszókat töményítettem 1 ml-ről kb. 100 µl-re, és ennek 20 µl-éhez adtam 10 µl mintapuffert és ebből 10 µl-t vittem fel a 12,5%-os gélre. A fehérjetisztítást háromszori depolimerizációs-polimerizációs lépéssel valósítottam meg 3 M ammónium-szulfát oldatot használva, amit 0,8 M végkoncentrációban adagoltam a fehérjeoldatomhoz mindig azonos fehérjekoncentráció mellett, majd szobahőmérsékleten egy éjszakán keresztül inkubáltam. A képződött filamentumokat rpm-en 1 órán keresztül centrifugáltam, a filamentumcsapadékot +4 C-on tároltam. A monomerizálást 10 perc 70 Con történő inkubálással valósítottam meg, amelyet rpm-en 1 órás centrifugálás követett, így lehetséges a fehérje mellett lévő szennyezők eltávolítása, hiszen a monomer flagellin a felülúszóban marad A D3-deléciós flagellin emésztési vizsgálata tripszinnel Párhuzamosan végeztem a vad flagellin és a D3-deléciós flagellin emésztését. A filamentum és a monomer formában lévő minták koncentrációja 0,9 mg/ml-es volt, 20mM foszfát, 150 mm NaCl ph 7,0 puffer használatával. A mintákhoz 300:1 (fehérje:tripszin) tömegarányban adtam a tripszint. Meghatározott időközönként mintát vettem az emésztésekből analízis céljából. 20 µl tripszines mintához 10 µl mintapuffert adtam és 95 C-on 3 percig melegítettem, így állítottam le az emésztést. Ezekből a mintákból futtattam 10 µl-t 12,5%-os SDS gélen Denaturációs hőmérséklet meghatározása CD-vel A vad és D3-deléciós flagellin mintákat ugyanolyan körülmények között háromszori polimerizáltatással tisztítottam. A CD mérés előtt az 1 mg/ml-es flagellinoldatokat 0,8 M végkoncentrációjú szilárd ammónium-szulfáthoz pipettáztam, majd szobahőmérsékleten egy éjszakán keresztül polimerizáltattam. A filamentumcsapadékot háromszor mostam 20mM foszfát, 150 mm NaCl ph 7,0 pufferben (a mosással távolítottam el a maradék ammóniumszulfátot teljesen a csapadékból), a hígításhoz is ezt a puffert használtam. A mérések során 0,1 mg/ml koncentrációjú fehérjeoldatokat vizsgáltam 1 cm-es küvettában, C-ig fűtöttem (100 C/óra) és 222 nm-en detektáltam. 52

53 4. Eredmények és következtetések 4.1. Szerves reakciók, szubsztrátumok előállítása A karbo- és heterociklusos hattagú rendszerek fontos szubsztrátumok, melyekből biooxidatív úton értékes aszimmetrikus molekulák állíthatók elő. A fermentálható prekurzorok szerkezeti összetettségének növelése érdekében meg kellett alkotni egy gyors és hatékony módszert a karbo- és heterociklusos rendszerek létrehozására. Elsőként összegyűjtöttem azokat a vegyületeket (ciklopentadién, furán és pirrol-1-karbonsavmetilészter), amelyek alkalmas prekurzorok lehetnek cisz-3,5-diszubsztituált cikloketonok előállítására. A bejuttatásra váró olefinkötés a szubsztrátumok oldalláncaiban funkcionális bázisként szolgálhatna a későbbi biotranszformációkban, hiszen a C=C kettőskötés inert a mikrobiális Baeyer-Villiger oxidációkban (Mihovilovic et al., 2003b). A biciklusos rendszerek 4 molekulákká történő átalakításához terminális alkéneket használtam az újonnan kidolgozott gyűrűnyitási metatézisek során. Munkám célja, hogy kifejlesszek egy hatékony és egyszerű módszert a 3 biciklo molekulák preparálására, és tanulmányozzam ezeknek a biciklusoknak a gyűrűnyitási metatézisben várható viselkedését gázhalmazállapotú olefinekkel a 4-es szerkezetek előállításához. A kísérleteket először a ciklizációs reakciók körülményeinek megválasztásával kezdtem tetrabróm-acetont használva (18. ábra, 7. táblázat). A táblázatban feltüntetett hozamok a ciklizációs és a debrómozási részlépés utáni értékek. Br Br Br Br + X X Cu/Zn X=CH2 (a) Br 1 X= (b) 2 X=NCMe (c) Br X Br Cu/Zn X Br X=CH2 (a) X= (b) 2 X=NCMe (c) ábra: Ciklizáció és debrómozás 53

54 dién (ekv.) X katalizátor (ekv.) hőmérséklet Szonikálás időtartama termék hozam a 1a (15 ekv.) CH 2 Cu/Zn (3.1 ekv.) -20 C 1 óra 3a 30 % a 1a (3 ekv.) CH 2 Cu/Zn (3.1 ekv.) 5 C 1 óra 3a 40 % a 1a (5 ekv.) CH 2 Zn (3 ekv.) szobahőn 1 óra 3a 62 % a 1b (4.1 ekv.) Zn (3 ekv.) szobahőn 1 óra 3b 50 % a 1b (10 ekv.) Cu/Zn (3 ekv.) szobahőn 1 óra 3b 60 % a 1b (10 ekv.) Cu/Zn (20 ekv.) szobahőn 5 óra 3b 40 % a 1c Zn NCMe szobahőn 2 óra 3c 45 % a (3 ekv.) (5 ekv.) a feldolgozás után, tisztasága 95%-os (GC-vel) 7. táblázat: Ultrahangos fürdőben kivitelezett ciklizációs reakciók körülményei Mivel a 2 dibróm intermedier kevésbé stabil, a ciklizáció nyerstermékét a feldolgozás után azonnal redukáltam Cu/Zn katalizátorral (NH 4 Cl metanolos oldatában) (Hoffmann et al., 2000). Montana és munkatársa (2001) az oxiallil vegyület előállításához is Cu/Zn katalizátort használtak, azonban kísérleteim során már 20 C-on megfigyeltem a ciklopentadién (1a) dimerizációját, amely 5 C felett dominánssá vált, így a 3a termék előállítása egyik esetben sem volt kielégítő. Ez arra ösztönzött, hogy Hoffmann és munkatársainak (2000) módszere alapján a kevésbé aktív Zn port használjam. Ezzel a módszerrel nagyon sikeresen ment végbe a reakció, kevesebb mint 5 % ciklopentadiéndimer keletkezett a konverzió során. A reakció ultrahangos fürdőben 1 óra alatt lejátszódott szobahőmérsékleten. A Cu/Zn katalizált debrómozás után a 3a terméket 62%-os hozammal izoláltam. Az ultrahangos fürdőben cinkkel kivitelezett [4+3] cikloaddíciós eljárást sikeresen alkalmaztam 1c és furán (1b) reakciójára. A 3b oxabicikloketont dehalogénezés után, további tisztítás nélkül 50%-os hozammal izoláltam. Ezzel az eljárással a 3b vegyületet meglehetősen egyszerűbben állítottam elő ugyanolyan hozammal mint az 54

55 irodalomban fellelhető eredmények. Cu/Zn katalizátorral végzett ciklizációval még jobb eredményeket tudtam elérni furán esetében. A 3b nyerstermék >95%-os tisztasággal jött létre (GC) a debrómozás után, további tisztítás nélkül. Ultrahangos fürdőben Cu/Zn katalizátor használatakor in situ debrómozást is tapasztaltam, pl. a 2b dibróm intermedier nyers keverékének analizálásakor egy kevés dehalogénezett 3b termék is kimutatható volt, amely klasszikus termikus reakcióknál nem figyelhető meg. A 3b termék szintézisénél azt is tapasztaltam, hogy több Cu/Zn használata és a meghosszabbított időtartamú szonikálás nem okozott nagyobb konverziót a kétlépéses folyamat során. Az 1c aktivált pirrolszármazékot is sikerült megfelelő hozammal átalakítani a kívánt 3c azabicikloketonná. Miután kidolgoztam egy egyszerű eljárást biciklusos vegyületek (3) előállítására, ezeknek az előállított molekuláknak a viselkedését vizsgáltam gyűrűnyitási metatézisekben (19. ábra, 8. táblázat). Wright és munkatársai (2001) munkáiban megtalálhatóak a 3 biciklo rendszereken végzett transzformációk, munkámban gázhalmazállapotú olefinekkel végeztem ezeket a reakciókat. Az említett irodalmakból az már kiderült, hogy gyűrűnyitási metatézisekben a gázhalmazállapotú olefinek polimerizáció nélkül használhatóak partnerként. X R X R 19. ábra: A gyűrűnyitási metatézis (a táblázatban található jelölésekhez). A reakciók során az olefinnel feltöltött ballon a reakcióelegyhez volt csatlakoztatva. Először az oldószert telítettem az olefinnel, ezután adtam hozzá az elegyhez a katalizátort. Ha a reakció során az elegyen keresztül buborékoltattam az olefint, az nem okozott konverziónövekedést, ez inkább az etilén oligomerizálódásának kedvezett. A 20. ábrán ballon használatával, illetve állandó buborékoltatással kapott konverziót ábrázoltam az idő függvényében. 55

56 Biciklus X R reakció idő katalizátor konverzió termék hozam a E/Z arány 3a CH 2 H 26 h 3a CH 2 CH 3 75 min 3a CH 2 CH 2 CH 3 60 min 3b H 26 h 3b CH 3 4 h 3b CH 2 CH 3 1 h 3c NCMe H 29 h 3c NCMe CH 3 29 h 3c NCMe CH 2 CH 3 27 h Grubbs I (1mol%) Grubbs I (1mol%) Grubbs I (1mol%) Grubbs I (1mol%) Grubbs I (1mol%) Grubbs I (1mol%) Grubbs II (2mol%) Grubbs II (2mol%) Grubbs II (2mol%) 75 % 4a 50 % n.a. c 95 % 4b 40 % 3.6:1 95 % 4c 65 % 6.3:1 75 % 4d 43 % n.a. 86 % 4e 40 % 3.6:1 87 % 4f 42 % 8.5:1 0 % 4g n.r. b n.a. 0 % 4h n.r. n.a. 0 % 4i n.r. n.a. (a) kromatográfiás tisztítás utáni hozam; (b) nincs reakció; (c) nem alkalmazható 8. táblázat: Gyűrűnyitási metatézisek eredményeinek összefoglalása konverzió [%] idő [perc] 20. ábra: Etilén adagolás a reakció során ballonnal [ ], ill. állandó buborékoltatással [ ]. 56

57 Propilénnel és butilénnel dolgozva egy általános tulajdonságot tapasztaltam. A kettős kötés szubsztitúciója megnövelte az olefinen az elektronsűrűséget, amely a reakcióidő megrövidülését, és magasabb konverzióértéket eredményezett. Grubbs II katalizátor használata gázhalmazállapotú alkén partnerekkel nem vezetett rövidebb reakcióidő eléréséhez. Minden transzformációnál egy egyensúly kialakulását figyeltem meg a biciklo vegyület és a diolefin között. A reakcióknál először mindig Grubbs I katalizátort használtam, azokban az esetekben, amikor nem játszódott le megfelelően a reakció, akkor a Grubbs II katalizátorral is megpróbáltam kivitelezni a reakciót. A gázhalmazállapotú reakciópartnerek használatakor a reakcióképesség az alkén kettős kötésének elektronsűrűségétől függött: a konverziót szignifikánsan fokozni lehetett elektrondonor szubsztituens jelenlétével. Az ilyen reakciók mindegyike 75% feletti konverzióval játszódott le és a termékeket megfelelő hozammal izoláltam. A reakciók végén etil-vinil-étert adtam a reakcióelegyekhez, hogy a feldolgozás során végbemenő gyűrűzáródást minimalizáljam. Az aszimmetrikusan szubsztituált termékeknél különböző E/Z arányok voltak megfigyelhetőek. A heteroatomot nem tartalmazó biciklusos molekulákon gázhalmazállapotú olefinekkel kivitelezett sikeres reakciók után a heterociklusos biciklo vegyületek 3b és 3c viselkedését tanulmányoztam gyűrűnyitási metatézisekben. A 3b oxigén-tartalmú rendszer hasonlóan viselkedett mint a 3a karbociklusos prekurzor. Az olefinekkel végzett transzformációk a várt termékeket eredményezték. Az egyensúlyi konverziók és az E/Z arányok is hasonlóak a karbociklusos vegyületekéhez. Azonban a 3c metil-karbamát esetében a RM nem játszódott le gázhalmazállapotú olefinekkel, sem Grubbs I, sem Grubbs II katalizátor jelenlétében. A reakciók során a várt termékek nem képződtek, csak a 3c kiindulási anyagot nyertem vissza mindegyik esetben. Korábban Neipp és munkatársai (2002) is hasonló eredményeket kaptak, amikor a védett nitrogén heteroatomot tartalmazó vegyületekkel próbáltak gyűrűzárási reakciókat végezni Biotranszformációk Az előállított perhidro-piron molekulák alkalmasnak bizonyultak sejtes biotranszformációkra. A feltételezett (Mihovilovic et al., 2005; Iwaki et al., 2002) két enzimcsoport prototípus enzimei a CHM Acineto és CPM Coma, a két csoport között átmenetet képező CHM BreviI -gyel együtt a várt biooxidációs termékeket adták. A táblázatban szereplő eredmények az általam végzett biotranszformációkból származnak (21. ábra, 9. táblázat). 57

58 R R R R 21. ábra: Biotranszformációk a táblázatban található jelölésekhez. Szubsztr. R termék enzim Hozam (%) e.e. (%) 5d H 6d CHM Acineto CHM RhodoI CHM RhodoII CHM Acido CHM Arthro CPM Coma CHM BreviII CHM BreviI e Me 6e CHM Acineto CHM RhodoI CHM RhodoII CHM Acido CHM Arthro CPM Coma CHM BreviII CHM BreviI nyomokban > 99,5 > > 99 > f Et 6f CHM Acineto 90 > 99,5 4f CH=CH 2 6 f CHM Acineto CHM RhodoI CHM RhodoII CHM Acido CHM Arthro CPM Coma CHM BreviII CHM BreviI > táblázat: Az elvégzett biotranszformációk eredményei. A táblázatban feltüntetett szubsztrátumok mellett a laborban dolgozó munkatársaimmal különböző térigényű oldalláncokkal szubsztituált prokirális szubsztrátumokat állítottunk elő a BVM-k szubsztrátum-hasznosításának tanulmányozása 58

59 érdekében. A CHM-típusú enzimek legfeljebb 3 szénatom hosszúságú oldallánc esetében alakították át a vizsgált molekulákat általában kiváló optikai tisztasággal. Az általam felhasznált biokatalizátorok nagy enantioszelektivitását demonstráltam a divinil szubsztrátum szelektív laktonizálásával is, az olefin funkcióscsoport oxidálása nélkül. A lineárisan 3 szénatom hosszú oldallánc képviseli a határt az enzim aktív centrumának hozzáférését illetően, munkatársaim eredményeiből derült ki, hogy az i-propil vagy annál hosszabb szubsztituenssel már nem, vagy csak alacsony hozammal valósult meg a katalízis. Ezeknél a kísérleteknél a szubsztrátum nagysága meghaladta az enzim által tolerált térbeli nagyságot (Mihovilovic et al., 2008). A CHM Acineto enzim, erős katalitikus képességével és változatos szubsztrátumok átalakításával, a szintetikus kémiában jól alkalmazható. Ezt a tényt igazolva kísérleteimben is mindegyik esetben a CHM Acineto eredményezte a legjobb hozam és e.e. értékeket, az ugyanebbe a csoportba tartozó enzimek eredményei minimális eltéréseket mutattak a sztereoszelektivitást illetően. Ezekkel az eredményekkel ellentétben kísérleteim során a CPM csoport két képviselője - a CPM Coma és a CHM BreviII nem alakította át a szubsztituált perhidro-4-piron molekulákat. Hasonló viselkedést tapasztaltam a CHM BreviI -nél is, azonban GC-vel a szubsztituált lakton termékeket nyomokban ki lehetett mutatni. Figyelemre méltó kivételt találtam a divinil vegyület átalakítása során, ugyanis azt a CHM BreviI enzim nagyon jó hozammal és optikai tisztasággal alakította át. Taschner és Black (1988) az általam előállított biooxidációs termékekhez nagyon hasonló oxepan-2-on karboxil analóggal dolgoztak, aminek kísérletileg meghatározták az abszolút konfigurációját. Feltételezve ugyanazt a konfigurációt a két lakton között, amit az optikai forgatóképesség megegyező előjele is megerősít, és figyelembe véve a Kahn- Ingold-Prelog szabályból eredő prioritásváltozásokat, a heterociklusos termékeimre a (2S, 7R) abszolút konfigurációt adom meg (22. ábra). (S) (R) (R) (S) 22. ábra: Taschner és Black (1988) vegyülete és az általam előállított dioxepanon abszolút konfigurációja. Összegezve a BVM-kal kivitelezett biotranszformációs kísérleteimet, a biooxidációk kettő sztereogén centrumot hoztak létre és egy enantiomert eredményeztek 59

60 nagy optikai tisztasággal mindegyik esetben, amikor az enzimek aktív centrumainak térbeli korlátai lehetővé tették a reakciót. A CHM- és CPM- típusú enzimek szignifikánsan eltérő szubsztrátum profilja perhidro-piron szerkezeti egységet tartalmazó heterociklusos ketonok biotranszformációját illetően tovább erősítette a korábbi hipotézist a BVM-k két különböző enzimcsoportjáról (Mihovilovic et al., 2005; Iwaki et al., 2002). Ezzel a szubsztrátum osztállyal a felhasznált enzimek nem állítottak elő enantiokomplementer lakton termékeket, még a CHM BreviII enzim sem eredményezte a + enantiomert, míg a dimetil-ciklohexanonnal vizsgált biotranszformáció során igen (Mihovilovic et al., 2003). Ez a tény a nagyon polarizált heterociklusos ketonok eltérő fizikai-kémiai tulajdonságainak köszönhető, a korábban tanulmányozott nyilvánvalóan jobban lipofil tulajdonságú karbociklusos szubsztrátumokhoz képest. A heteroatom jelenléte, mint erős elektrondonor központ, okozhatja a BVM aktív centrumában a szubsztrátum orientációjának megváltozását a heteroatomot nem tartalmazó gyűrűvel rendelkező vegyületekkel ellentétben. Ezért nehéz meghatározni vagy megjósolni a szubsztrátum vagy a Criegee intermedierek pozícióját és konfigurációját, ehhez hozzá járul az is, hogy az általam felhasznált enzimek pontos szerkezetét még nem ismerjük. A kristályosított PAM enzim áll a legközelebbi rokonságban a CHM-val, és az elkészített homológia modellből (Bocola et al., 2005) eredő konformációváltozásokat, amelyek a katalízis során végbemennek, a gyakorlatban is igazolni kell. Emellet a CHM szuper-szubsztrátum modelljének megalkotásán is sokan fáradoznak, hogy a számítógépes modellen alapuló feltételezett enzimszerkezettel összehasonlítva még pontosabb képünk legyen az enzimek működéséről. 60

61 4.3. Flagellin-enzim fúziós konstrukciók létrehozása D3-deléciós flagellin előállítása A D3-deléciós plazmid előállításához a pkt-1 plazmidot emésztettem AatII-vel. Az alábbi gélfényképen (23. ábra) látható, hogy kettő lineáris fragmentumra vágta a plazmidot. Így jött létre a pkt-1 nagy fragmentuma, amelyet defoszforilálva közvetlenül felhasználtam a későbbi ligáláshoz, és a kis fragmentuma, amelyet a PCR-ekhez használtam fel templátként. 23. ábra: pkt-1 emésztése AatII restrikciós endonukleázzal 1%-os agaróz gélen. A második zsebben a standard sávjai a következők: 10 kbp, 8 kbp, 6 kbp, 5 kbp, 4 kbp, 3,5 kbp, 3 kbp, 2,5 kbp, 2 kbp, 1,5 kbp, 1 kbp, 750bp, 500 bp, 250 bp. ábra). A PCR eredményeként az alábbi gélen megfuttatott termékek keletkeztek ( ábra: Az 1. zseb: flagellin -terminálisának (D3 nélküli) tisztítás nélküli PCR terméke, 2. zseb: flagellin C-terminálisának (D3 nélküli) tisztítás nélküli PCR terméke, 3. zseb: az előző gélen is látható standard. 61

62 A PCR termékek gélből történő izolálása és AatII-vel és PmeI-gyel történő emésztése után gélt futtattam a fragmentumokról, így nyertem információt a ligáláshoz szükséges plazmid-inszert arányokról (25. ábra). 25. ábra: A fragmentumok ligálás előtti mennyiségei. 1. zseb: flagellin -terminálisa, 2. zseb: flagellin C-terminálisa, 3. zseb: pkt-1/aatii+sap nagy fragmentum. A ligálás utáni transzformálás telepeiből 6-ot kiválasztottam és plazmidot preparáltam belőlük, majd ellenőrző emésztést végeztem. Először PmeI-gyel emésztettem. Az alábbi gélen látható, hogy a 2., 4. és 5. zsebben lévő plazmid linearizálódott, a 7. zsebben lévő minta a pkt-1/pmei emésztés, amit kontrollnak szántam, hiszen az eredeti pkt-1-ben nincs PmeI hasítóhely (26. ábra). 26. ábra: A D3-deléciós plazmidok ellenőrzése PmeI-gyel. A plazmidokat további ellenőrzés érdekében EcoRI-gyel is emésztettem. Az alábbi gélen sorrendben ugyanazok a plazmidok láthatók, mint az előzőn, a 7. zsebben a pkt- 1/EcoRI emésztést, mint kontrollt, melynek kisebb fragmentumának méretéhez viszonyítottam az emésztett DNS-eket. A jó D3-deléciós plazmidban a kisebb EcoRI-es fragmentum 285 bp-ral kisebb kell, hogy legyen mint a pkt-1- é, hiszen már nincs benne a D3 domén. Az előző gél alapján jónak vélt plazmidokból csupán a 2. plazmid az, ami az EcoRI emésztést követően jó sávot ad, összehasonlítva a 7. zsebben lévő pkt-1 kontrollal látható az alsó fragmentumok közötti méretkülönbség (27. ábra). 62

63 27. ábra: A D3-deléciós plazmidok ellenőrzése EcoRI-gyel (standard ugyanaz mint az előzőekben). Az emésztéseket követően a 2. zsebben futtatott plazmidot elküldtem szekvenáltatni. Annak érdekében, hogy az egész mutáns flagellin génről információkat nyerjek, négy primerrel szekvenáltattam meg ezt a plazmidot, és bebizonyosodott, hogy valóban egy hibátlan D3-deléciós flagellin plazmid. Ezt követően került sor a fehérjetermelésre, amihez Salmonella SJW2536 flagellindeficiens baktériumokat használtam fel. Első megközelítésben arra voltam kíváncsi, hogy a D3-deléciós flagellinből kialakulnak-e filamentumok. Ennek vizsgálatára szolgált a sötétlátóterű mikroszkóp, a motilitás teszt és az SDS gél. Mindegyik vizsgálati módszernél kontroll mintákat is használtam, és azokhoz viszonyítottam a mutáns baktérium viselkedését. Mikroszkópos vizsgálattal megállapítottam, hogy a pozitív kontrollhoz képest (pkt-1-gyel elektroporált SJW2536) a D3-deléciós flagellinnel rendelkező baktériumok meglehetősen jól úsztak D3 domén nélkül is, mozgásuk hasonló volt. A negatív kontroll, az SJW2536 baktériumok egy kicsit mocorogtak, pörögtek, de nem úsztak. A motilitás teszttel számszerűsíthetők az eredmények, és így jobban összehasonlíthatók, ugyanis az overnight növesztett telepek a híg motilitás agaron a baktériumok mozgásképességétől függően különböző nagyságúak. Mindegyik baktériumnál 3 párhuzamos telepet vizsgálva a következő eredményeket kaptam (10. táblázat): 63

64 Plazmid/baktérium Telepek átmérői (cm) Átmérők átlaga (cm) pkt-1/sjw2536 2,6 2,7 2,7 2,67 D3-deléciós/SJW2536 1,7 1,7 1,8 1,73 -/SJW2536 0,3 0,3 0,3 0,3 10. táblázat: Motilitás teszt eredményei. A Kísérleti rész pontjában leírt módon készítettem az SDS gélre a mintákat annak érdekében, hogy csak a baktériumok felszínén található fehérjékről, a filamentum létezéséről kapjak információt. Az alábbi gél alapján is elmondható, hogy a baktérium a D3-deléciós plazmidból ugyanolyan mennyiségben termeli a mutáns flagellint mint az eredeti pkt-1-ből (28. ábra). A korábbi feltevésemet igazolva valóban nem zavarja a D3 domén hiánya a baktériumot a filamentumképzésben sem. 28. ábra: D3-deléciós (42 kda) és vad flagellin (51kDa) minták hőkezelt töményített felülúszókból, standard sávjai: 66 kda, 45 kda, 36 kda. Ezeket a vizsgálatokat követően párhuzamosan végeztem a vad Salmonella typhimurium flagellinjének preparálását nagy mennyiségben a D3-deléciós flagellinnel, az irodalomban fellelhető módszer alapján (Vonderviszt et al., 1989). Összehasonlítható mennyiségben sikerült termeltetnem a vad és mutáns fehérjéket, 2 liter tápoldatból vad flagellin esetében 51,4 mg-ot, míg a D3-deléciós mutánsból 58,9 mg-ot preparáltam azonos körülmények mellett. Ami még látványosabb volt a preparálás során, az a helikális filamentumkötegek mikroszkópos képe, amelyek méret és milyenség alapján nagyon hasonlóak (29. ábra). 64

65 a, b, 29. ábra: a, vad; b, D3-deléciós helikális kötegek (baktériumokkal) a preparáláskor. A preparálás során a tisztítást a flagellinek későbbi vizsgálataihoz háromszor ismételt monomerizáció-polimerizáció egymás utáni kivitelezésével valósítottam meg. A következő gélen látható (30. ábra), hogy megfelelően tiszta fehérjemintákat lehet előállítani ezzel a módszerrel. 30. ábra: 1. zseb: D3-deléciós flagellin 2. polimerizálás előtt, 2. zseb: 3. polimerizálás előtt, 3. zseb: 3. polimerizáció után zseb: vad flagellin minták esetében ugyanaz mint a D3-deléciós mintáknál. A D3-deléciós fehérje emésztési térképét vizsgáltam tripszinnel filamentum és monomer formában is, összehasonlítva a vad fehérje viselkedésével. A 31. ábrán megfigyelhető, hogy filamentum formában egyik esetben sem volt emésztődés tripszinnel, 65

66 még 3 hét elteltével sem, ami a rendezetlen terminális régiók filamentumképződés során végbemenő stabilizálódásának tudható be. Ezeket a tripszines vizsgálatokat párhuzamosan végeztem a monomer flagellinével ugyanabból a tripszin törzsoldatból dolgozva. a, b, 31. ábra: Filamentumok emésztése tripszinnel, mintavételek különböző időpontokban; a, vad minták: 0 perc ( ), 5, 10, 20, 60, 90, 3 hét; b, D3-deléciós minták: 0, 5, 10, 20, 60, 90, 3 hét. A monomer formában történt D3-deléciós mutáns emésztése során megfigyeltem, hogy hasonló emésztési sávokkal jellemezhető mint a vad flagellin, figyelembe véve azt a különbséget, hogy a mutáns fehérje D3 domént nem tartalmaz (32. ábra). a, b, 32. ábra: Monomerek emésztése tripszinnel, mintavételek különböző időpontokban, az 1. zsebekben használt standard: 66 kda, 45 kda, 36 kda, 29 kda, 24 kda; a, vad minták: 0, 1, 5, 10, 30, 120,240, 20 h, 2 nap; b, D3-deléciós minták: 0, 1, 5, 10, 30, 120, 240, 20 h. A mutáns flagellin esetében is először a rendezetlen terminális régiók emésztődnek el gyorsan. A D3-deléciós és a vad monomer esetében is egyformán kb. 10 percre volt 66

67 szüksége a tripszinnek, hogy a rendezetlen terminális régiókat eltávolítsa. Ezután míg a vad flagellin esetében egy kb. 40 kda-os fragmentum marad vissza, addig a D3-deléciós esetében kb. 31 kda molekulatömegű, melyek már sokkal lassabban emésztődnek el. A mutáns esetében a viszonylag stabil 31 kda-os fragmentumot kb. 110 perc alatt emészti el a tripszin. A CD mérések görbéit (33. ábra) kiértékelve, a kapott inflexiós pontok adják meg a fehérjék olvadáspontját. Ezek alapján az olvadáspontok a következő értékeknek adódtak: D3-deléciós filamentum: 52,32 ± 0,05 C Vad filamentum: 54,16 ± 0,04 C D3-deléciós flagellin 39,7 ± 0,18 C Vad flagellin 47,44 ±0,13 C CD (mdeg) Hőmérséklet ( C) Pme2fila vadfila CD (mdeg) Hőmérséklet ( C) Pme2monomer vadmonomer 33. ábra: CD mérések (Pme2: D3-deléciós flagellin). 67

68 Az előállított D3-deléciós filamentum olvadáspontja 2 C-kal alacsonyabbnak adódott, mint a vad filamentum esetében. Tehát a mutáns flagellinekből felépülő polimer stabilitása kis mértékben eltér az eredetitől. A különbség kis mértéke magyarázható azzal a ténnyel, hogy a monomerként rendezetlen terminális régiók α-helikális kötegekké összeállva stabilizálják a filamentum szerkezetét, és a deléciós konstrukció kialakítása során azokat nem módosítottam. A filamentum stabilitásáról kapott eredmény megerősít abban, hogy a D3 domén helyére tervezett linkert a célkitűzésnek megfelelően terveztem meg. Monomerek esetében viszont ez a különbség jóval nagyobbnak adódott, ami várható volt, hiszen a flagellinek esetében a terminális régiók rendezetlenek, és csak a flagellin középső részének van meghatározott stabil szerkezete. Mivel a flagellin közepéről távolítottam el a D3 domént (kb. 9 kda), így míg a rendezetlen régiók változatlanul megmaradtak, addig a szerkezettel rendelkező részek mennyisége lecsökkent. Ez szemléletesen érzékelhető a korábban bemutatott D3-deléciós flagellin tripszines emésztéséből (28. ábra), hiszen a tripszinnek sokkal kevesebb idő kellett a mutáns monomer teljes elemésztéséhez a vadhoz képest azt is figyelembe véve, hogy a rendezetlen régiókat ugyanannyi idő alatt távolította el mindkét fehérje esetében Flagellin-enzim D S konstrukciók létrehozása A CHM és CPM gének PCR-ezése után előkészítettem a fragmentumokat és a D3-deléciós plazmidot a ligáláshoz. A DNS-eket emésztettem PmeI-gyel, a plazmidot defoszforiláltam. Az alábbi (34. ábra) gélen látható a ligálás előtti állapot, a plazmidinszert arányok vizsgálatához. 34. ábra: Ligálás előtt; 1. zseb: D3-deléciós plazmid/pmei+sap, 2. zseb: CPM inszert, 3. zseb: CHM inszert, 4. zseb: standard (10 kbp, 8 kbp, 6 kbp, 5 kbp, 4 kbp, 3,5 kbp, 3 kbp, 2,5 kbp, 2 kbp, 1,5 kbp, 1 kbp, 750bp, 500 bp, 250 bp). 68

69 Mindegyik ligálásból 5-5 telepem nőtt fel, ezekből preparáltam plazmidot és emésztéssel ellenőriztem a ligálás sikerességét. Először PmeI-gyel emésztettem, így lett látható, hogy az inszert valóban beépült-e a D3-deléciós plazmidba, kontrollként az üres D3-deléciós plazmidot használtam (35. ábra). 35. ábra: 1-5. zseb: D3-deléciós-CHM plazmidok, 6. zseb: D3-deléciós plazmid/pmei, zseb: D3-deléciós-CPM plazmidok Ez alapján megállapítható, hogy a CHM plazmidok közül a 3., 4. és 5. plazmidban volt benne az inszert, a CPM plazmidok közül pedig az 1., 2., 3. és 5. plazmidokban. Ezután csak a jónak vélt plazmidokkal végeztem el az orientációellenőrzést. A korábban leírtak ( fejezetben) alapján a HindIII restrikciós enzim mindkét konstrukcióhoz megfelelőnek bizonyult az orientációellenőrzéshez. A CHM esetében, ha a kisebb fragmentum 240 bp-ral kisebb, akkor van jó orientációban a gén a plazmidban. A CPM esetében pedig 1540 bp-ral nagyobb a kisebb fragmentum jó orientáció esetén (36. ábra). Ezeknek a méreteknek természetesen csak egymáshoz viszonyítva van értelmük. 36. ábra: rientációellenőrzés HindIII-mal: 1-3. zseb: CHM konstrukciók, 4. zseb: D3- deléciós plazmid, 5-8. zseb: CPM konstrukciók. 69