A magzati sejtekből végzett jövőbeli noninvazív diagnosztika kibontakozásának első lépései

Átírás

1 A magzati sejtekből végzett jövőbeli noninvazív diagnosztika kibontakozásának első lépései Doktori értekezés Dr. Nagy Gyula Richárd Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Papp Zoltán egyetemi tanár, az orvostudományok doktora Hivatalos bírálók: Dr. Tóth Sára egyetemi docens, Ph.D. Dr. Ugocsai Gyula osztályvezető főorvos, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Szende Béla egyetemi tanár, az orvostudományok doktora Dr. Tóth Zoltán egyetemi tanár, az orvostudományok doktora Dr. Csapó Zsolt egyetemi docens, Ph.D. Budapest 2007

2 Tartalomjegyzék RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE BEVEZETÉS MAGZATI SEJTTÍPUSOK A VÁRANDÓS NŐ VÉRÉBEN Trophoblastok Magzati fehérvérsejtek Magzati magvas vörösvérsejtek MAGZATI SEJTEK SZÁMA AZ ANYAI KERINGÉSBEN DÚSÍTÁSI MÓDSZEREK Sűrűséggradiens centrifugálás Percollal Fluoreszcens sejtszortírozás (FACS) Mágneses sejtszortírozás (MACS) ELEMZÉSI MÓDSZEREK Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) Polimeráz láncreakció (PCR) A biochip technológia CÉLKITŰZÉSEK MÓDSZEREK A MAGZATI SEJTEK KIMUTATÁSA, DÚSÍTÁSA ÉS ELEMZÉSE Perifériás vérminta levétele várandós nőktől, sejtszeparálás Percollal Áramlási citometria vizsgálatok az esetleges FACS előtt A sejtek dúsítása MACS segítségével, majd a jelölt sejtek kigyűjtése mikromanipulátorral QF-PCR vizsgálat A GÉNEXPRESSZIÓS LAPKA TECHNOLÓGIA Magzatvízminták gyűjtése Teljes RNS izolálás Minőségi ellenőrzés A jelölt próba előállítása Hibridizáció, mosás, festés, leolvasás Statisztikai elemzés A biochipek hitelesítése EREDMÉNYEK KIMUTATOTT ÉS VIZSGÁLT MAGZATI SEJTEK Áramlási citometriai eredmények Percollal történt sejtszeparálás után A MACS segítségével dúsított, majd mikromanipulátorral kiválasztott sejtek QF-PCR vizsgálata GÉNEXPRESSZIÓS LAPKÁVAL TÖRTÉNŐ VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEI Teljes RNS izolálás, jelölt crns szintézis és hibridizálás a lapkára Génexpressziós különbségek, megkülönböztető gének velőcső-záródási rendellenességnél MEGBESZÉLÉS MAGZATI SEJTEK VIZSGÁLHATÓSÁGA ANYAI VÉRBŐL Áramlási citometria, bizonytalan FACS kilátások Sikeres MACS utáni sejtelemzés A BIOCHIPEK SIKERES ALKALMAZÁSA KÖVETKEZTETÉSEK ÖSSZEFOGLALÁS IRODALOMJEGYZÉK SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

3 Rövidítések jegyzéke (Dőlt betűvel szerepelnek az egyes géneket szimbolizáló rövidítések.) ADO (allele drop-out) allélvesztés AFP alfa-fetoprotein ATIC 5-aminoimidazol-4-karboxamid ribonukleotid formiltranszferáz / IMP ciklohidroláz génje AVPI1 arginine vasopressin-induced 1 gén BRCA-1 breast cancer tumorszuppresszor gén BENE BENE protein génje C9orf3 Chromosome 9 open reading frame 3 gén CBEP4 cytoplasmic polyadenylation element binding protein 4 génje CD cluster of differentiation, CD-antigének. A sejtdifferenciálódás különböző stádiumait jelző felszíni markerek. cdns (complementer) komplementer DNS crns (complementer) komplementer RNS DAPI 4,6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorid DHFR dihidrofolát reduktáz génje DNS dezoxi-ribonukleinsav dntp dezoxi-nukleozid-trifoszfát dsdns (double strand) duplaszálú DNS EDTA etilén-diamin-tetraecetsav EGFR (epidermal growth factor receptor) epidermális növekedési faktor receptorának génje FACS (fluorescent activated cell sorting) fluoreszcens sejtszeparálás FDR (false discovery rate) hamis találati arány FISH (fluorescence in situ hybridization) fluoreszcens in situ hibridizáció FITC fluoreszcens izothiocianát FSC (forward scatter) a fénysugár elõrefelé szóródása GAC genetikai amniocentézis GAPDH glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz génje GEM (glycolipid- and cholesterol-enriched membrane) glikolipid- és koleszterin-gazdag membrán GEO Gene Expression Omnibus GITC guanidin-izotiocianát GlyA glikoforin-a hcg humán chorialis gonadotropin HLA humán leukocyta antigén 3

4 KIAA0669 (TSC22D2) KIAA0669 gén termék / TSC22 domain family, member 2 gén KIAA0779 (TMCC1) KIAA0779 protein / transmembrane and coiled-coil domain family 1 gén KRT24 keratin 24 gén LOC adult retina protein génje LST1 leukocyte specific transcript 1 génje MACS (magnetic activated cell sorting) mágneses sejtszeparálás MAS Microarray Analysis Suite mrns messenger RNS MTR 5-metiltetrahidrofolát-homocisztein metiltranszferáz génje NIFTY Study National Institute of Child Health and Development Fetal Cell Isolation Study NRBC (nucleated red blood cell) magvas vörösvérsejt NT (nuchal translucency) tarkóredő vastagság PAM (Prediction Analysis for Microarrays) microarray predikciós analízis PAPP-A pregnancy associated plasma protein-a PBS phosphate buffered saline PCR (polymerase chain reaction) polimeráz láncreakció PE phycoerythrin PerCP peridinin-klorofill-protein-komplex QF-PCR quantitatív fluoreszcens-pcr RMA robust multi-chip average analysis RNS ribonukleinsav rrns riboszómális RNS SAM (Significance Analysis of Microarrays) microarray szignifikancia analízis SSC (side scatter) a fénysugár oldalirányú szóródása SLA Src-like-adaptor génje SLAP (Src-like adaptor protein) Src-szerű adaptor fehérje SNP (single nucleotid polymorphysm) pontmutáció ssdns (single strand) egyszálú DNS STR short tandem repeat/microsatellita TET tetraklorofluoreszcein TIGD2 tigger transposable element derived 2 gén UBPP2 ubiquitin associated protein 2 gén VZR velőcső-záródási rendellenesség ZNF292 zinc finger protein 292 gén 4

5 1. Bevezetés A prenatális diagnosztika a klinikai genetika azon ága, amely magába foglalja mindazon módszereket és eljárásokat, amelyek segítségével az ébrény, illetve a magzat genetikai állományáról információt nyerhetünk. A módszerek segítségével felismerhetjük azokat a magzati rendellenességeket, amelyek méhen belüli, esetleg korai újszülöttkori kezelést tesznek szükségessé, vagy gyógyíthatatlan esetekben a terhesség befejezését indokolhatják. Napjainkban egyre gyakrabban találkozunk olyan nőkkel, akik 35 éves kor felett vállalnak terhességet, s közülük sokan csak egy gyermeket kívánnak szülni. Az előrehaladottabb anyai életkorban emelkedik a magzati kromoszóma-rendellenességek gyakorisága, ez prenatális genetikai diagnosztika szükségességét veti fel. A vizsgálat elvégzésének előfeltétele a várandós nők gondozása során végzett genetikai tanácsadás. Szűrőmódszerként vizsgálták és vizsgálják a terhesség első harmadában az ún. szérumszűrést, valamint kombinált szűrést (szérumszűrés: szabad béta humán chorialis gonadotropin {hcg}, pregnancy associated plasma protein A {PAPP-A} szintjének anyai szérumból történő meghatározása; kombinált szűrés: a szérumszűrés és a magzati tarkóredő vastagság {NT, nuchal translucency} ultrahangvizsgálattal történő mérésének kombinálása). A második trimeszterben alkalmazott szűrőmódszer a hármas és négyes teszt (anyai szérumból hármas teszt esetén az alfa-fetoprotein {AFP}, össz-hcg és nem konjugált ösztriol, négyes szűrésnél pedig az előző markerek mellett az inhibin-a meghatározása). A szűrővizsgálat nevében is benne van, hogy nem diagnosztikus célt szolgál, azaz egy átlagpopulációból kiszűri azokat az eseteket, amelyekben diagnosztikus vizsgálatra van szükség egy adott betegség szempontjából. Közös jellemzőjük még, hogy döntően a Down-szindrómára koncentrálnak, tehát bár kombinálásukkal a találati arány növekedése érhető el, semmiképpen sem jelentik alapját egy olyan módszernek, ami később bármilyen (pl. monogénes) örökletes betegség diagnosztizálására alkalmas lehet. A magzati kromoszóma-rendellenességek vagy monogénes betegségek definitív diagnózisa jelenleg csak invazív beavatkozások útján lehetséges. Az invazív prenatális diagnosztikai eljárások (genetikai amniocentézis, chorionboholy-mintavétel és chordocentézis) bizonyos fokú kockázatot hordoznak 5

6 magukban (pl.: a genetikai amniocentézisek után a spontán vetélés esélye kb. 1%), az anyák pedig nem szívesen vállalják e módszerekkel járó szövődményeket. A noninvazív genetikai diagnosztika iránti igény növekedése olyan módszerek kifejlesztésére ösztönzi a kutatókat, amelyek nem igényelnek invazív beavatkozást. Ilyen módszer a kialakult morfológiai eltérések kimutatására a magzati ultrahangvizsgálat vagy újabban az anya keringésében megjelenő magzati sejtek genetikai vizsgálata [1]. Schmorl [2] német kórboncnok már a XIX. század végén említést tett terhesség alatt az anyai keringésbe kerülő magzati sejtekről, amikor eclampsia miatt meghalt terhes nők tüdejében trophoblastok jelenlétét fedezte fel ben Walknowska és munkatársai [3] perifériás anyai vér lymphocyta-tenyészeteinek vizsgálata során XY metafázisokat találtak fiúmagzatot hordozó anya vérében. De Grouchy és Trubuchet [4] szintén hasonló megfigyeléseket tett. Később Herzenberg és munkatársai [5] HLA-A2 lymphocytáknak tartott sejteket próbáltak dúsítani, melyeket azért tartottak magzati eredetűnek, mert ez az antigén jelen volt az apa családjában, az anyáéban viszont nem. A vércsoport-inkompatibilitás vizsgálatát célzó tanulmányok során az is világossá vált, hogy magzati vörösvérsejtek és vérlemezkék is bejutnak az anya keringésébe terhesség alatt. A bevezetésben áttekintem a várandós nő vérében előforduló magzati sejttípusokat, számbeli jellemzőiket, valamint dúsítási és elemzési módszereiket Magzati sejttípusok a várandós nő vérében Trophoblastok A trophoblastok jelentik az egyik lehetséges sejttípust a prenatális vizsgálatokhoz, hiszen biztosan magzati eredetűek és további előnyös tulajdonságuk, hogy ellentétben a többi magzati eredetű sejtes elemmel, egyedi morfológiájuk is segít felismerésükben. A hólyagcsíra falát alkotó trophoblastsejtek szaporodásával kitüremkedő trophoblastbimbók felszínén a syncytiotrophoblast- alatta a cytotrophoblast réteg alakul ki. A trophoblastbimbók sejtoszlopokká fejlődnek, melyek tengelyébe kerül a pete extraembrionális mezenchimája, valamint ezzel együtt benyomulnak az erek. A sejtoszlopok elágazódó oldalágakat fejlesztenek, egy bonyolult üregrendszert, végső soron a chorionbolyhokat létrehozva [6]. Az invazív trophoblastok két típusát különböztethetjük meg, az intersticiális trophoblastokat, melyek közvetlen 6

7 kapcsolatban vannak az anyai deciduával és méh-izomfallal, valamint az endovaszkuláris trophoblastokat, melyek a spirális artériák lumenében helyezkednek el [7]. Az utóbbi képezi azt az altípust, mely két fázisban kerül nagyobb mennyiségben az anyai keringésbe. Először az első trimeszter közepén, amikor a decidua artériái, majd második fázisban a héten, amikor a méh spirális artériái felé meginduló trophoblastok inváziója következtében e sejtek átveszik ezen erek endotheljének és muszkuláris falának helyét. Ennek eredményeként vékony falú, alacsony ellenállású erek jönnek létre. Az anyai keringésbe kerülő trophoblastsejtek gyorsan eliminálódnak az anyai tüdőben. Amennyiben a trophoblastokat izolálni akarjuk, hátrányos tulajdonságként jelentkezik a felszíni antigénjei ellenes antitestek relatív hiánya. Több kutatócsoport is próbálta megtalálni az a specifikus markert, melynek segítségével a trophoblastok izolálhatók. Covone és munkatársai [8] írták le elsőként, hogy a trophoblastok különböző terhességi korokban a H315 sejtfelszíni antigén ellenes monoklonális antitest segítségével szeparálhatóak. A későbbiekben éppen ez a kutatócsoport mutatta ki, hogy a szeparált H315 pozitív sejtek sajnálatos módon nem magzati trophoblastok, hanem inkább anyai sejtek, melyek felületére a H315 antigén adszorbeálódott [9]. A későbbiekben más csoportok trophoblast-ellenes monoklonális antitestek készítésével próbálkoztak. Mueller és munkatársai [10] 6800 lepényszövet elleni antitestből 5 olyat találtak, mely a magzati eredetre specifikus. Miután ezek közül két monoklonális antitest segítségével sejtszeparálást végeztek, polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction PCR) segítségével Y kromoszóma-specifikus DNS-t kerestek. A magzat nemének meghatározása 7-ből 7 fiú, és 7-ből 6 leánymagzatnál sikeres volt. Durrant és munkatársai [11] egy 340 néven ismert, mind a syncytio- mind a cytotrophoblastsejtek felszínén megtalálható antigén ellenes monoklonális antitestet írtak le. Van Wijk és munkatársai [12] a HLA-G segítségével XY kromoszómát mutattak ki anyai keringésbe került trophoblastból. A trophoblastok alkalmazásánál hátrányos lehet a placentában előforduló chorionmozaicizmus, amikor a trophoblastban posztzigótikus nondiszjunkció eredményeként létrejöhet másik sejtvonal is (placentára korlátozódó mozaicizmus). Érthető módon a lepényi mozaik sejtvonal sejtjeinek vizsgálata diagnosztikus tévedéshez vezethet. 7

8 Magzati fehérvérsejtek Herzenberg és munkatársai [5] 1979-ben írták le fluoreszcens sejtszeparálás (fluorescent activated cell sorting, FACS) segítségével végzett eredményeiket, melynek során sejtfelszíni antigének elleni fluoreszcens antitestek segítségével választották el a magzati és az anyai sejteket egymástól. Kutatásuk során 138 terhest és férjeiket vizsgálták. Azon terhesek vérmintáit használták sejtszeparálásra, akik HLA-A2 negatívak, férjeik pedig HLA-A2 pozitívak voltak (magzati markerként tehát a HLA- A2-t használták). A perifériás anyai vér Ficoll-Hypaque sűrűséggradiens centrifugálást követően a sejteket HLA-A2 monoklonális antitestekkel festették meg, majd FACS-ot végeztek, a HLA-A2 pozitív sejtekben pedig Y kromoszómát kerestek. A 12 terhességből, ahol fiú született, 5 esetben találtak Y pozitív sejtet. A másik 7 esetben, ahol a sejtek nem reagáltak az anti-hla-a2 antitestekkel, egyik esetben sem találtak Y pozitív sejtet. Eredményeik alapján nagy volt az egyezés a HLA-A2 pozitív perifériás sejtben (tehát magzati eredetűnek vélelmezett sejtben) észlelt Y kromoszóma, valamint az újszülött fiú neme és HLA-A2 pozitivitása között. A HLA ellenes antitestekkel történő magzati eredet azonosítása a mindennapi gyakorlatban nehézkes, mert a hatalmas HLA polimorfizmus miatt nehéz alkalmas antitestet választani, főleg abban az esetben, ha az apa nem ismert. A magzati lymphocyták alkalmazását tovább nehezíti az a tény, hogy több kutatócsoport is leírta ezen sejtek perzisztálását az anyai keringésben több évvel (akár 27 évvel) a terhesség után is, ami egy későbbi terhesség esetén diagnosztikus tévedést eredményezhet [13]. A magzati granulocyták kevésbé kerültek a figyelem középpontjába ben Wessman és munkatársai [14] Ficoll-Paque sűrűséggradiens centrifugálást követően fluoreszcens in situ hibridizációt (FISH) végeztek Y specifikus próbával. Találtak egy kis csoportot az anyai mononukleáris sejtek között (0,26%), melyek Y-pozitívak voltak, morfológiailag pedig granulocytáknak tűntek. A meglepő eredmény feltehetően a próba aspecifikus kötődésével magyarázható, hisz a későbbiekben senkinek nem sikerült igazolnia. 8

9 Magzati magvas vörösvérsejtek A magzati magvas vörösvérsejtek (nucleated red blood cells, NRBC), vagy erythroblastok anyai keringésbe jutását először Creger és Steele [15] írta le 1957-ben, akik az erythroblastosis fetalis okát keresve 23 A vércsoportú nőt vizsgáltak, akiket két csoportra osztottak aszerint, hogy az újszülött 0 vagy A vércsoportú volt. Az anyai vérmintákban megszámolták azokat a sejteket, amelyek nem agglutináltak anti-a antitestek hatására. Azon anyáknál, ahol az újszülött 0 -s vércsoportú volt, szignifikánsan több sejt nem agglutinált, mint az A -s vércsoportú újszülöttek édesanyjainál. A sejtek mennyisége jelentősen lecsökkent a gyermekágyas időszak végére. Voltak kutatócsoportok, akik a Kleihauer-Betke teszt segítségével próbálták meg az anyai keringésbe jutó magzati vörösvérsejtek számát meghatározni [16]. Bianchi és munkatársai [17] voltak az elsők, akik a CD71 (transzferrin receptor) ellenes antitest segítségével végeztek FACS-ot, a CD71 pozitív sejteket lemezre gyűjtötték ki, majd magzati sejteket kerestek a morfológiai kép és a Kleihauer-Betke teszt alkalmazásával. A CD71 pozitív sejtek főleg reticulocyták voltak, emellett magzati hemoglobint tartalmazó magvas vörösvérsejtek, lymphocyták, monocyták, anyai hemoglobint tartalmazó vörösvértestek. Napjainkban a legtöbb kutatócsoport a magzati magvas vörösvérsejteket vizsgálja [18, 19, 20]. A magzati sejtek közül ezek jutnak a legnagyobb mennyiségben az anya keringésébe, ugyanakkor felnőttben nem jellemző, hogy saját erythroblastok a perifériás vérben keringjenek. Troeger és munkatársai [21] hetes terhesek vizsgálta során arra a következtetésre jutottak, hogy az anyai perifériás vérben lévő erythroblastok mintegy fele magzati eredetű. Ezen sejtek további előnyös tulajdonsága, hogy tartalmazzák a teljes magzati DNS állományt és csak a terhesség ideje alatt perzisztálnak az anyai keringésben (élettartamuk kb. 90 nap) [22], így nincs meg annak a lehetősége, hogy egy esetleges előző terhességből származó magzati erythroblast diagnosztikus problémát jelentsen. 9

10 1. 2. Magzati sejtek száma az anyai keringésben Annak ellenére, hogy terhesség alatt az anya keringésébe kerülő magzati sejtekről már a XIX. század elején említést tettek, a kutatómunka döntő hányada mégis a XX. század második felére tehető. A molekuláris biológiai módszerek, a kifinomult sejtizolálási technikák elengedhetetlenek voltak a kutatásokhoz. Napjaink fejlett technikája ellenére sem sikerült még a kutatócsoportoknak egy olyan protokollt összeállítaniuk, ami jó költség-hatékonysággal és nagy biztonsággal alkalmazható lenne a mindennapos prenatális diagnosztika során. A magyarázat az anyai keringésbe kerülő magzati sejtek alacsony számában rejlik. Hány magzati sejt jut át az anyai vérbe terhesség alatt? Krabchi és munkatársai [23] 12 fiúmagzattal várandós nő második trimeszterben levett 3-3ml perifériás vérmintáját vizsgálták. Semmiféle dúsítási eljárást nem alkalmaztak, minden esetben a teljes vérmintát feldolgozták. Az anyai teljes vérben milliliterenként 2-6 magzati sejtet találtak. Bianchi és munkatársai [24] által végzett PCR vizsgálatok szerint átlagosan 1 magzati sejt van az anyai vér 1ml-ében, azonban emelkedett értéket figyeltek meg aneuploid magzatok esetén. Ez utóbbi megfigyelés éppen azért értékes, mert így pontosan egy patológiás esetben van nagyobb esély a sejtek kimutatására és a diagnózis felállítására. Praeeclampsia, az artéria uterina Dopplerrel megfigyelhető keringésromlása praeeclampsia tüneteinek megjelenése előtt, magzati növekedésbeli visszamaradás, magzatvíztöbblet, vagy az invazív genetikai diagnosztika módszerei is kapcsolatba hozhatóak az emelkedett sejtszámmal. Falcidia és munkatársai [25] hatszoros emelkedést tapasztaltak az anyai keringésben megjelenő magzati erythroblast-számban 2-3 héttel az amniocentézis után, ha a magzat Down-szindrómás volt. Áramlási citometriás vizsgálatok szerint kb anyai sejtre jut 1 magzati sejt [26], ami szintén azt támasztja alá, hogy a magzati sejtek igen kis számban fordulnak elő az anyai keringésben, így szükségessé vált a vizsgálatok előtti feldúsításuk. 10

11 1. 3. Dúsítási módszerek A sejtek izolálására alapvetően kétféle eljárás van: pozitív szeparálás: ez a kívánt sejtek feldúsítását jelenti negatív szeparálás: a felesleges sejtek eltávolítása A módszerek alapulhatnak fizikai tulajdonságokon (sűrűséggradiensen történő szeparálás), vagy sejtfelszíni (illetőleg sejtben lévő) struktúrákon (fluoreszcens és mágneses sejtszeparálás) Sűrűséggradiens centrifugálás Percollal Kezdő lépésként tartják számon az alvadásgátolt vérből (gyakran) Percollal történő sűrűséggradiens szeparálást [27, 28], melynek segítségével sok anyai sejt, köztük vörösvértestek és lymphocyták is eltávolíthatóak. A Percoll polivinilpirrolidonnal bevont szilika részecskéket tartalmaz (átmérőjük nm) g/ml közötti tartományban készíthetőek el belőle különböző gradiensek, melyek segítségével a vörösvértestek, a magvas vörösvérsejtek és a mononukleáris sejtek szétválaszthatók. Vannak kutatócsoportok, melyek egy, mások két vagy három különböző sűrűségű Percoll oldatot rétegeznek egymásra, erre kerül a minta. A módszer alapja az, hogy a használatos Percoll-oldatok fajsúlya a mononukleáris sejtekénél nagyobb, a vörösvértestek fajsúlyánál pedig kisebb, a keresett erythroblastok fajsúlya pedig egy Percoll réteg használatakor annál kisebb, két különböző sűrűségű Percoll oldat használatakor a kettő között van, háromnál pedig többnyire a középsőnek megfelelő. A centrifugálás eredményeként két különböző sűrűségű Percoll oldat használatakor köztük alakul ki az erythroblastokban dús réteg, amely Pasteur-pipettával óvatosan leszívható. A kinyert magvas vörösvérsejt gazdag réteget használják fel a további vizsgálatokhoz (1. ábra). 11

12 centrifugálás a. b. 1. ábra: Percollal történő sejtszeparálás. Az a. ábrán két Percoll rétegre (mindkettő áttetsző) rárétegzett alvadásgátolt és hígított anyai perifériás vérmintát látunk, míg centrifugálást követően kapjuk a b. ábrán reprezentált képet. A cső alján a vörösvérsejtek halmozódtak fel, a felső szalmasárga réteg a plazma. A plazma és a felső Percoll réteg határa mononukleáris sejtekben gazdag, a két Percoll réteg között fehér gyűrűszerű rétegben halmozódtak fel a keresett magzati magvas vörösvérsejtek Fluoreszcens sejtszortírozás (FACS) A magzati sejtek további dúsítására két módszert ajánlanak: az egyik a fluoreszcens sejtszeparálás (fluorescent activated cell sorting, FACS). A fluoreszcens sejtszeparálás alapját az áramlási citometria (flow cytometry) jelenti, ami különálló sejtek rendkívül gyors, multiparaméteres vizsgálatára alkalmas laboratóriumi eljárás. Lehetővé teszi sejtpopulációk elkülönítését és szétválasztását az immunfenotípus alapján. Az analizálni kívánt sejtek megkülönböztetésre fluoreszkáló festékekkel történő jelöléseket alkalmaznak. A jelölt sejteket lézersugár világítja meg. A készülék a lézer indukálta optikai jeleket detektálja és dolgozza fel. A rutin vizsgálatokra használt áramlási citométerek alkalmasak 2-4 fluoreszcens festék egyidejű detektálására a sejtméretek és granuláltság felmérésén kívül, így ez gyakorlatilag egy időben 4-6 különféle paraméter detektálását jelenti sejtenként. Az áramlási citometria felhasználásának egy speciális lehetősége a sejtszeparálás. Az áramlási citométerekhez kapcsolt válogató egység (flow sorter) a sejteket méret, granularitás alapján illetve ha a sejteket előtte fluoreszcens festékkel jelölt monoklonális ellenanyaggal inkubáltuk, a fluoreszcens jel alapján képes szétválogatni. Mivel az áramlási citométerben a sejtek egyesével haladnak keresztül a mérőablakon, minden sejtről képes a citométerhez kapcsolt (azt irányító) számítógép információt gyűjteni és az így kapott információt az 12

13 előre betáplált paraméterekkel összehasonlítani. Ez alapján a válogató egység képes mágneses mezővel a rajta áthaladó sejteket eltéríteni, külön-külön összegyűjteni. Ez a módszer rövid idő alatt nagy mennyiségû élő sejt szétválogatására alkalmas (2. ábra). 2. ábra: Fluoreszcens sejtszeparáló berendezés (Forrás: Mágneses sejtszortírozás (MACS) A magzati sejtek további dúsítására ajánlott másik lehetőség a mágneses sejtszortírozás (magnetic activated cell sorting, MACS). A MACS jóval olcsóbb, és könnyen kivitelezhető (3. ábra). Lényege, hogy az apró, mikroszkopikus méretű mágneses gyöngyökhöz, a gyöngyök aktiválása után monoklonális ellenanyag köthető, a sejtszuszpenziót ezekkel a gyöngyökkel keverik össze. A gyöngyökön található ellenanyag felismeri az antigénjét, majd hozzáköt. A sejtkeveréket ezután egy mágneses térbe helyezett oszlopon folyatják le. A mágneses gyöngyöket hordozó sejtek az oszlopon maradnak, a többi sejt átfolyik. Az oszlopot az erős mágneses térből kiemelve a jelölt sejtek is lemoshatók. Negatív és pozitív szelekcióként is használható, mivel a mágneses gyöngyöt hordozó sejtek is életképesek, morfológiailag sértetlenek maradnak (4. ábra). a. b. 3. ábra: a., mágneses sejtszortírozó eszköz b., a mágnesbe illesztett szeparáló oszlop (Forrás: 13

14 a. b. c. 4. ábra: A mágneses sejtszeparálás működési elve (a kék, zöld, narancs és lila színek különböző sejteket reprezentálnak, a mágneses antitestet Y szimbólum jelöli, a végén lila pontocskával) a., a keresett sejt jelölése mágneses antitesttel b., a minta lefolyatása mágneses térbe helyezett oszlopon. A mágneses gyöngyöket hordozó sejtek az oszlopon maradnak, a többi sejt átfolyik c., az oszlopot az erős mágneses térből kiemelve a jelölt sejtek is lemoshatók (Forrás: A sejtszortírozásoknál alkalmazott antitestek A sejtszeparálások során egyes antitestek az anyai sejtek kiszűrését szolgálják, ilyen például a CD45 vagy a CD14 ellenes antitest. Számos monoklonális antitestet használnak magzati sejtek szelekciójához. Ilyen a CD36, a thrombospondinreceptor, a glikoforin-a, vagy a hemoglobin F gamma lánca ellenes antitestek. Az egyik leggyakrabban használt a CD71 (transzferrin receptor) ellenes antitest. Figyelembe kell azonban venni, hogy ezek az antitestek nem specifikusak, így anyai sejtek is jelölődhetnek velük. Napjainkban a magzati eredet igazolására specifikus markerként az embrionális hemoglobin epszilon vagy zéta lánca ellenes antitest szolgál. Al-Mufti és munkatársai [29] szerint kromoszóma-abnormalitás nélküli terhességek esetén az anyai keringésben lévő erythroblastok 97%-a expresszálja az epszilon hemoglobinláncot 10 hetes terhességben, azonban ez a szám kevesebb, mint 1% a 25. hétre. A trophoblastspecifikus Hash2 protein, vagy a trophoblastok felszínén megjelenő HLA G [7, 18] használata is bíztató lehet. Az anyai vérből dúsított magzati sejtek genetikai vizsgálatában a leggyakrabban alkalmazott módszerek a FISH (fluorescence in situ hybridization) és a PCR. 14

15 1. 4. Elemzési módszerek Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) A molekuláris genetikában alkalmazott módszerek fejlődése lehetővé tette, hogy a fluoreszcens in situ hibridizáció (fluorescent in situ hybridisation, FISH) módszerének birtokában ritka, nem osztódó sejtekből kiindulva is meghatározható lehessen a nem vagy a kromoszómális számbeli rendellenesség. FISH során a sejtet nagyon rövid ideig magas ph-jú oldattal kezelik, ezalatt a DNS két szála szétválik (denaturálódik), majd a fluoreszcensen jelölt próbát hibridizáltatják a komplementer szekvenciájú DNS szakasszal, amit a tárgylemezre korábban speciálisan rögzített interfázis- vagy metafázis-preparátumok tartalmaznak. A próbák kötődnek a kromoszómákon található komplementer DNS-szakaszhoz és ezáltal fluoreszcens mikroszkóppal vizsgálhatóak. Az aneuploidiák vizsgálata során interfázisban lévő sejteket használnak [30]. Normális esetben a kromoszóma-párra két fluoreszcens jel utal, triszómiánál három jel látható a sejtmagokban [31]. A 21-es triszómia FISH képét mutatja az 5. ábra. 5. ábra: Interfázis FISH módszerrel végzett 21-es triszómia kimutatása. A DAPI magfestés kék színe előtt a 21-es kromoszómára specifikus vörös SpectrumOrange jelek láthatók, amelyekből három ábrázolódik Polimeráz láncreakció (PCR) Annak ellenére, hogy nagy erőfeszítések történnek annak érdekében, hogy az ultrahangés a szérum-markerek vizsgálatának összekapcsolásával a kromoszómarendellenességek minél nagyobb pontossággal kiszűrhetőek legyenek, a noninvazív módszerek közül ezek még mindig alkalmatlanok monogénes betegségek diagnosztikájára; erre az anyai keringésből kinyert magzati sejtek PCR vizsgálata adhat lehetőséget. A PCR módszert Saiki és munkatársai írták le [32] 1985-ben, majd Mullis és Faloona [33] fejlesztette tovább 1987-ben. A PCR nagyon gyorsan, automatizálva is képes egy kívánt DNS-szakasz akár milliószoros mennyiségre történő sokszorosítására. 15

16 A quantitatív fluoreszcens-pcr (QF-PCR) módszer a PCR továbbfejlesztett változata. Előnye, hogy érzékenysége mintegy 1000-szerese a hagyományos PCR vizsgálatnak, a PCR termékek méretének pontos meghatározására alkalmas, valamint multiplex vizsgálat esetén könnyebben kiértékelhető, mint a hagyományos PCR. Minimális mennyiségű mintát igényel, 1 ml magzatvízből, vagy 1-2 chorionboholyból izolált DNS elegendő. Lényegesen gyorsabb, mint a FISH vizsgálat, eredménye akár 4 órával a mintavétel után készen lehet, automatizálhatósága révén nagy mennyiségű minta gyors vizsgálatára alkalmas [31]. A QF-PCR módszerrel kromoszóma-specifikus ismétlődő úgynevezett short tandem repeat (STR) DNS szekvenciákat vizsgálunk. Az STR-ek az irodalomban microsatellita néven is ismertek. Polimorfizmust mutatnak, tehát egyénenként változó hosszúságúak attól függően, hogy hányszor ismétlődik egy adott tri-, tetra-, vagy pentanukleotid egység [34, 35], valamint a mendeli szabályok szerint öröklődnek, tehát az egyik allél anyai, a másik pedig apai eredetű. A DNS mintából fluoreszcens jelöléssel ellátott primerekkel végezzük a PCR amplifikációt, a keletkezett PCR termékeket automata szekvenálóval mutatjuk ki. Az automata szekvenáló lehetővé teszi a PCR termékek méretének pontos meghatározását és mennyiségének összehasonlítását. Normál heterozigóta (két különböző hosszúságú STR allélt hordozó) egyének esetében a vizsgálat során két eltérő méretű terméknek megfelelő csúcs látható, amelyek közel azonos magasságúak. A triszómiás egyénektől származó minta vizsgálata során három azonos méretű csúcs látható (triallélikus), vagy csak két csúcs, amelyek közül azonban az egyik kétszer akkora, mint a másik (diallélikus). (6. ábra) a. b. c. 6. ábra: A QF-PCR eredményének kiértékelése során a: normál mintázat esetén két csúcs 1:1 aránya figyelhető meg b: triallélikus mintázat esetén három csúcs 1:1:1 aránya figyelhető meg c: diallélikus mintázat esetén két csúcs 2:1 arányát láthatjuk 16

17 Az STR markerek homozigótasága esetén csak egy csúcs figyelhető meg, ekkor neminformatív vizsgálati eredményről beszélünk. Ha egyszerre több marker vizsgálatát végezzük el, a nem-informatív eredmények aránya csökken. A markerek vizsgálata szimultán módon történhet multiplex PCR vizsgálat során. Nehézségek kis kiindulási mennyiségű DNS (egy sejt PCR) esetén Az allélvesztés (allele drop-out, ADO) jelenségét QF-PCR módszer alkalmazása során figyelték meg [36, 37]. Az allélvesztés kis kiindulási mennyiségű DNS-ből történő heterozigóta lókuszok PCR amplifikációja során figyelhető meg. A preferenciális amplifikáció során a primerek jobban kötődnek a heterozigóta allélpár egyik tagjához, és emiatt ezen allél PCR terméke lényegesen nagyobb mennyiségben szaporodik fel, mint az allélpárjáé. Amennyiben a preferenciális amplifikáció során a két termék mennyisége közötti különbség oly nagy mértékű, hogy az egyik termék nem detektálható, allélvesztésről beszélünk [36]. Az allélvesztés jelensége monogénes betegségek PCR diagnosztikája esetén téves diagnózishoz vezethet, az STR markerek vizsgálata esetén pedig a nem informatív esetek számát emelheti. Az allélvesztés előfordulása függ a kiindulási DNS kópiaszámtól, illetve az izolált DNS mintában található szennyezőanyagoktól, amelyek gátolhatják a PCR-t [36, 37]. Mikromanipulátoros kigyűjtés A PCR vizsgálat elvégzéséhez az anyai vérből dúsított jelölt magzati sejtek kiválogatására van szükség, amit mikromanipulációs módszerrel tehetünk meg. A magzati erythroblastok mikromanipulátoros kiválogatása során egyes kutatók a sejtek morfológiai jellemzőit igyekeznek felhasználni beazonosításukra, míg mások a sejtekben található magzati hemoglobin ellenes antitesteket alkalmazzák. Takabayashi [38] az elsők között volt, aki leírta, hogy mikromanipulátorral izolált magzati erythroblastok PCR vizsgálata lehetséges. Mivel perifériás anyai vérből sok esetben nem lehet nagy mennyiségű magzati sejtet kinyerni, sok tanulmány anyai vérhez különböző mennyiségben hozzákevert magzati vért, mint mesterségesen előállított mintát vizsgált, vagy olyan helyzetet használt ki mintavételre, mint például közvetlenül a terhességmegszakítás utáni állapot, amikor sok magzati sejt kerül az anyai keringésbe [22]. A legtöbb ilyen tanulmány sajátossága tehát, hogy a leírt módszer 17

18 magzati sejtek kísérletesen előállított pool -jainak vizsgálatára vonatkozik, így próbálják az egy sejt PCR-nál veszélyeztető allélvesztést kiküszöbölni A biochip technológia Napjainkban a genetikai diagnosztikus módszerek a monogénes betegségek vagy kromoszóma-rendellenességek felderítésére koncentrálnak, a poligénes betegségek genetikai hátterének feltérképezése viszont nehézséget jelent. A poligénes öröklődés lényege, hogy nem egy génpár, hanem sok gén együttesen jelent fogékonyságot egyes környezeti faktorokkal szemben. (Azokat a jellegeket, amelyek poligénes öröklődésűek és kialakulásukban a környezeti faktorok is szerepet játszanak, multifaktoriálisan determinált tulajdonságoknak nevezzük.) Ezen multifaktoriális kóreredetű jellegek lehetnek mennyiségiek, vagy minőségiek. Mennyiségi tulajdonságú pl. a magasvérnyomás-betegség. Minőségi jellegek esetén a betegség vagy jelen van, vagy nincs, ha igen, úgy változó súlyossággal. Ebben az esetben a szülőknél többnyire nem figyelhető meg az eltérés, ők a rendellenességért felelős génekből küszöb alatti de vélhetően ahhoz közeli mennyiséggel rendelkeznek, amelyek fenotípusra gyakorolt hatását az aktív normál gének túlsúlya megakadályozza. A vélhetően sok, különböző kromoszómákon elhelyezkedő hibás (rizikó-) gén a meiózis során kombinálódhat úgy, hogy végül mindkét szülői gaméta nagyobb hányadot juttat az utódba, mint a szülői genotípusban meglévők fele. Bizonyos küszöbérték felett a felboruló egyensúly a rendellenesség manifesztációjához vezet, s minél magasabban van a terheltség a küszöb felett, és/vagy minél nagyobb a provokáló környezeti tényező(k) hatása, a rendellenesség annál súlyosabb. A poligénes rendellenességek genetikai hátterére vonatkozóan javarészt eddig az ikerkutatások adtak lehetőséget [39]. A poligénes betegségek közül például a velőcső-záródási rendellenesség (VZR) [40] (ami a második leggyakoribb veleszületett rendellenesség a világon, 1 jut 1000 élveszülésre), bár könnyen diagnosztizálható terhesség alatt ultrahangvizsgálattal az emelkedett AFP szint a szűrés eszköze, de genetikai hátterének kutatása nehéz. A teljes genomra kiterjedő génexpressziós vizsgálat segítségével közelebb kerülhetünk a kóreredet megismeréséhez. 18

19 Ha prenatális génexpressziós vizsgálatot tervezünk, a vizsgálatokhoz szükséges mintát ideális esetben noninvazív módszer, a várandós nő véréből kinyert magzati sejtek vizsgálata biztosítaná. Jelen pillanatban legfőbb akadály az anyai keringésből kinyerhető magzati sejtek alacsony száma [7], így ez a minta technikailag majd csak a jövőben lesz alkalmas ilyen vizsgálatokra, helyette jelenleg a magzatvíz-mintavétel jelenthet megoldást. A noninvazív magzati és a molekuláris genetikai diagnosztika fejlődése tehát lehetővé teheti számunkra, hogy a következő évtizedekben majdhogynem az összes genetikai betegség már a terhesség korai szakában az anyai vérből vett magzati sejtekből felismerhetővé váljék. Ehhez a nagy teljesítményű biochip technológia jelenthet segítséget [41]. A különböző molekulákat szilárd felszínhez kötve tartalmazó array koncepciója már régóta létezik, klasszikus példája a Southern-blot, mely különböző hosszúságú restrikciós DNS-fragmentumok közül egy bizonyos vizsgálni kívánt darab kiválasztására szolgál. Itt a denaturált, egyszálú, a gélelektroforézissel hosszuk szerint szétválasztott DNS-fragmentumokat egy nitrocellulózmembránra visszük át, majd hibridizáció (megfelelő próba) segítségével választható ki a kérdéses darab. Hasonló eljárás segítségével lehet kiválasztani és kimutatni egy bizonyos RNS molekulát is például egy sejtkivonat összes RNS-ei közül (a módszert Northern-blot eljárásnak nevezik). A biochipek (vagy másnéven microarray-k, vagy lapkák) esetén az ismert nukleotidszekvenciák találhatók a szilárd hordozón, meghatározott elrendezésben, az ismeretlen nukleinsav pedig szolubilis és jelzett formában van. A microarray-k az átfolyási cellát használják a reakció irányítására. Itt nagyon kis térfogatnyi térben, hőmérséklet-optimalizált hibridizációs és mosási lépések gyors és hatékony végrehajtására van lehetőség. A hagyományos array-khez képest a microarray-k nagyobb elemsűrűséggel rendelkeznek (> akár jóval több, mint 100 próba elem/cm 2 ), valamint a porózus hibridizációs membránokat nem porózus üveg vagy szilikon alapúak váltották fel. Ez megnöveli a reakció sebességét, jelentősen csökkenti a reakciótérfogatot, így jelentősen csökkenti a reakcióidőt. A miniatürizált biochipek több ezertől több százezer molekuláris analízis gyors, azonos körülmények között történő egyidejű lebonyolítására használhatók. 19

20 Osztályozásuk megtörténhet a szilárd felszín anyaga szerint (műanyag, nejlon, üveg, szilikon), a szilárd felszínre rögzített molekulák minősége szerint (DNS: ezen belül cdns vagy oligonukleotid; valamint fehérje: peptidek, antitestek), a detektálás módja szerint (izotópos, fluoreszcens, kemilumineszcens), valamint komplexitásuk alapján. Miután a jelölt biológiai minta a hordozó mátrixon immobilizált ismert nukleotidszekvenciákkal sikeresen kapcsolódott, az utolsó lépés a kapcsolódás leolvasása, a detekció. Újabban szinte kizárólagos teret hódító fluoreszcens meghatározási módszereket alkalmaznak. Fényérzékeny fólia kerül a chip felületére, majd meghatározott expozíciós idő után lézerszkenner olvassa le a felvillanások eredményét. Számítógépes elemzéssel az ismert helyen mért intenzitás mértékéből következtetni lehet a vizsgált gén vagy génszakasz tulajdonságaira. Komplexitásukat vizsgálva az alacsony komplexitású lapkák esetén a vizsgált molekulák száma között van, ezeket elsősorban a diagnosztikában alkalmazzák. A közepes komplexitásúak ( vizsgált molekula) génexpressziós mintázat elemzésére alkalmazhatók, míg a nagy komplexitású, a teljes genom szintű génexpressziós vagy a globális polimorfizmus analízisre alkalmas array-k vagy több vizsgált molekulával rendelkeznek [42]. A microarray-k felhasználásuk szerint három fő csoportba sorolhatók. Az egyik terület a DNS szekvenálása. Itt a vizsgált személyeknél a például vérből kivont, felszaporított DNS-t ún. re-sequencing (újraszekvenáló) array-kre viszik, így olyan káros mutációk tárhatók fel, melyek megnövelik pl. a rák valószínűségét (pl. BRCA-1 {breast cancer} tumorszuppresszor gén mutációja). Lehetőség van arra is, hogy a kutató a kívánságának megfelelő gének vizsgálatához szükséges lapkákat tervezzen meg és rendeljen egyes cégektől (ún. custom chip ). A másik fő területet a génexpresszió vizsgálata. A génexpressziós elemzésen alapuló kockázatbecslés és pontosabb diagnózis a betegségek egyre pontosabb prognózisát és egyénre szabható kezelések kidolgozását teszi lehetővé. A legtöbb sejt alkalmazkodik a folyamatosan változó mikrokörnyezethez, és a megváltozott körülményeknek megfelelően módosítja génexpressziós mintázatát. A módszer tehát jól használható a sejtek közvetlen környezetében bekövetkező változások (pl. karcinogének, toxinok, gyógyszerek, stb.) hatására létrejövő sejtválasz tanulmányozására. Kiválóan alkalmas a 20

21 hasonló génexpressziós profilú tumorsejtcsoportok (tumorclusterek) azonosítására, így a szövettanilag hasonló daganatok biológiailag és klinikailag különböző alcsoportjainak elkülönítésére [43, 44]. A nagyszámú gén kifejeződésének gyors vizsgálata során szerzett hihetetlen nagy mennyiségű információ lehetőséget ad arra, hogy újabb diagnosztikai és terápiás célpontokat térképezzünk fel. Egy betegség esetén a géneltérések azonosítása specifikus terápia kidolgozásának a kezdete lehet. Ha pl. adott betegség esetén a túlexpresszált géneket gyűjtjük össze, melyek szekretált vagy membránhoz kötött fehérjetermékeket kódolnak, a szérum alapú diagnosztika, valamint az immunterápia/vakcináció kifejlesztése segíthető. A harmadik területet a genotipizálás jelenti. Egyes kutatások arra irányulnak, hogy hogyan befolyásolja a genetikai variáció pl. a single nucleotid polimorfizmusok (SNPk) a betegségekkel valamint a környezeti kockázati tényezőkkel szembeni érzékenységet. Cél a betegségasszociált SNP-k azonosítása. Az SNP-k többsége indifferens, de azok, melyek a gének kódoló régióiban helyezkednek el, az aminosavsorrenden keresztül befolyásolhatják a kódoló fehérje működését. Szintén fontosak lehetnek azok a nem kódoló régióban lévő SNP-k, melyek a gének promoter, enhancer vagy silencer régióiban vannak, melyek a splicingot változtatják meg, vagy bizonyos DNS-kötő fehérjék felismerő helyén vannak [45]. A génexpressziós vizsgálatokat lehetővé tevő Affymetrix lapkák esetén 25 bázis hosszúságú génszakaszokkal komplementer oligonukleotidokat rögzítenek a lapkára [46]. Az oligonukleotid-lapka technika Az oligonukleotid-lapkák kifejlesztése lehetővé tette nagyszámú gén kifejeződésének összehasonlítását különböző sejtek, szövetek élettani és kóros állapotaiban. A HG-U133 Plus 2.0 oligonukleotid lapka (Affymetrix Inc., High Wycombe, UK) lehetővé teszi az egész emberi genomra kiterjedően a transzkripció mérését egyetlen hibridizációs vizsgálat során (7. ábra). Több mint próbafajtát használ több mint transzkriptum és variáns vizsgálatára, közülük kb a jól meghatározott emberi gén. 21

22 Lényege, hogy a vizsgálatban szereplő génekkel komplementer ún. cél (target) oligonukleotidokat szilárd hordozóhoz kötjük, majd hibridizáltatjuk a vizsgált mintából származó RNS alapján készített jelölt egyszálú crns-molekulákat (ezek a próbák). A vizsgált gén expressziós szintjére a hibridizáció mértékéből lehet következtetni. 7. ábra: Affymetrix GeneChip U133 Plus 2.0 teljes genom transzkripciós lapka (Forrás: A módszer a mintából való teljes RNS izolálásával indul. Az mrns állományról reverz transzkripció során egyszálú cdns, majd duplaszálú cdns készül. A duplaszálú cdnst templátul véve in vitro transzkripciót végzünk crns próbák készítése céljából. Ekkor történik az amplifikációs lépés és a biotinos jelölés is. A lapkán történő hibridizáció előtt a nem beépült jelölt nukleotidok eltávolításával a jelölt próbákat meg kell tisztítani, majd a próba crns fragmentációja történik. A próbákat ezután hibridizációs pufferbe tesszük. A hibridizáció megfelelő páratartalmat és hőmérsékletet biztosító hibridizációs kamrában történik 45 C-on, majd ezt követően a lapkára nem kötődő próbákat a mosási protokollnak megfelelő hőmérsékleten, több lépésben lemossuk. Eközben történik a festés is. A lapkák megfestéséhez antitest amplifikációs festési eljárás használható: a PE (phycoerythrin) festékkel jelzett biotinkötő fehérjét, a streptavidint alkalmazzuk először (már önmagában ez is jelamplifikáció, mert egy biotinhoz több streptavidin is kötődhet), majd biotinilált anti-streptavidin segítségével a streptavidint magát is újabb biotinnal jelöljük, ehhez a biotinhoz újból PE festékkel jelzett streptavidin kapcsolható (8. ábra). 22

23 A hibridizáció mértéke fluoreszcens lapka leolvasó készülékkel történik, az adatok feldolgozása és az eredmények kiértékelése számítógépes elemző programokkal lehetséges. A fent vázolt, más néven egykörös módszer 1-15 μg kiindulási mennyiségű teljes RNS esetében alkalmas a jelölt próbák előállítására. Amennyiben a teljes RNS mennyisége kevesebb ( ng), a kétkörös módszer alkalmazható, melyet a 9. ábra mutat be. (Itt már ábrázoltam a poly-a RNS kontrollokat, ami négy exogén poliadenilált kontrollt jelent, ez a jelölési folyamat belső pozitív kontrollja. A folyamat végén a belőlük detektálható jel független a kiindulási minta minőségétől. Az ábrán feltűntetett hibridizációs kontrollok Escherichia colitól és P1 bakteriofágtól származó biotinilált és fragmentált crns-ek, szerepük pedig a hibridizáció, mosás és festés ellenőrzése. A lapkán természetesen külön elhelyeztek olyan oligonukleotidokat, melyekhez kapcsolódni tudnak.) A 10. ábra mutatja be az oligonukleotid lapka működésének elvét (az egyszerűség kedvéért az ábra fluoreszcensen és nem biotinnal jelölt crns fragmentumokat ábrázol). Minden egyes kis reakciófelületre ugyanazon 25 bázisnyi oligonukleotid milliói vannak szintetizálva. Minél több jelölt crns kötődik be egy kis reakciófelületre, annál intenzívebb lesz a jel. 23

24 8. ábra: Az oligonukleotid-lapka technika egyes lépései (Forrás: 24

25 9. ábra: Kétkörös módszer a jelölt próbák előállítására, majd vizsgálatára (Forrás: 25

26 1,28 cm 1,28 cm 10. ábra: Az oligonukleotid-lapka működési elve (Forrás: 26

27 Az általunk alkalmazott GeneChip U133 Plus 2.0 (Affymetrix Inc., High Wycombe, UK) teljes genom transzkripciós lapka oligonukleotid array, ahol az oligonukleotidok in situ szintézissel, fotolitográfiai technológiával kerülnek a lapka felszínére. Fodor és munkatársai fejlesztették ki a fényirányított kémiai szintézis módszerét [47]. Kezdetben a felszínt egy fényérzékeny anyaggal vonják be, ami megakadályozza az első nukleotid bekötődését. A nyomtatás során a szubsztrátfelszín megfelelő pozícióit fotolitográfiás maszkkal borítják be (kivéve azokat a helyeket ahol az első nukleotid pl. timin), majd megvilágítják a felszínt. Aktiválódnak a maszkon kívül eső területek, majd a megfelelő nukleotiddal (példánkban timinnel) történő inkubálást követően kémiai kötés jön létre az aktivált helyeken. Maga a bekötődő nukleotid is hordozza a fényérzékeny védő csoportot, így a reakció ismételhető. Ezután más maszkot visznek fel (természetesen ez a maszk más pozíciókban {pl. első nukleotid citozin} perforált), majd a felszín megvilágítása és a kémiai kötési lépés következik. A folyamatot mindig a megfelelő fotolitográfiás maszkot alkalmazva addig ismétlik, míg a kellő hosszúságú és bázissorrendű oligonukleotidok elkészülnek (11. ábra). 11. ábra: Az Affymetrix chipek készítésének elve. A szubsztrátfelszín megfelelő pozícióit fotolitográfiás maszkkal borítják be, majd megvilágítják a felszínt. Aktiválódnak a maszkon kívül eső területek, majd a megfelelő nukleotiddal történő inkubálást követően kémiai kötés jön létre az aktivált helyeken. Maga a bekötődő nukleotid is hordozza a fényérzékeny védő csoportot, így a reakció ismételhető. Ezután más maszkot visznek fel, majd a felszín megvilágítása és a kémiai kötési lépés következik. A folyamatot addig ismétlik, míg a kellő hosszúságú és bázissorrendű oligonukleotidok elkészülnek (Forrás: 27

28 Összegezve tehát, a prenatális genetikai diagnosztika jövőjét jelentheti mint noninvazív diagnosztikus módszer a magzati sejtek kinyerése anyai vérből a terhesség alatt. Napjainkban még nem, de a jövőben elképzelhető, hogy a módszer összekapcsolható lesz a microarray technológiával, ami a kutatók reményei szerint lehetővé teheti a magzat szinte valamennyi genetikai betegségének terhesség alatti diagnosztizálását, s akár poligénes betegségek vizsgálatát is (12. ábra). Magzati sejtek a várandós nő perifériás vérében Magzati sejtek izolálása biochip Poligénes betegségek vizsgálata, a jövőben a magzat szinte bármilyen genetikai betegségének diagnosztizálása terhesség alatt 12. ábra: A prenatális genetikai diagnosztika jövője. Magzati sejtek kinyerése anyai vérből a terhesség alatt mint noninvazív diagnosztikus módszer, kombinálva a microarray technológiával lehetővé teheti a magzat szinte valmennyi genetikai betegségének terhesség alatti diagnosztizálását. A világosszürke nyíllal jelzett lépés ma még technikailag nem kivitelezhető 28

29 2. Célkitűzések A prenatális genetikai vizsgálatok jövőjét jelenti a noninvazív magzati diagnosztika, valamint ennek során az oligonukleotid-lapkák alkalmazása. Célul tűztem ki a korábbi tudományos eredményekre alapozva egy olyan protokoll kidolgozását, mely az egyes munkacsoportok próbálkozásainak sikeres elemeit ötvözve az anyai keringésbe jutó magzati sejtek kinyerésével és elemezésével noninvazív genetikai diagnosztika megvalósítását teszi lehetővé, valamint, hogy egy új technológia révén a magzati sejtekből végezhető diagnosztikus eljárások jövőképét vetítsem előre. Már a vizsgálatok kezdetekor világos volt, hogy a várandós nő perifériás vérkeringéséből kinyerhető magzati sejtek száma igen kevés, így ez majd csak a jövőben, a technológia fejlődésével jelenthet elegendő mintát a génexpressziós mintázatot vizsgáló oligonukleotid-lapka technológia számára. Jelen értekezésben így az invazív diagnosztikus beavatkozások közül legbiztonságosabbnak ítélt magzatvíz mintavétel módszerét használtam mintagyűjtésre az oligonukleotid-lapka rutin prenatális diagnosztikában való alkalmazhatóságának vizsgálatakor. A vizsgálatok során a következő célokat tűztem ki: 1. A várandós nők perifériás vérében igen kis számban előforduló magzati magvas vörösvérsejtek feldúsítása. 2. Az embrionális hemoglobin epszilon lánca elleni antitesttel várandós nő véréből származó magzati magvas vörösvérsejtek megjelölése, kimutatása, mikromanipulátorral történő kigyűjtése. A kimutatható sejtek számának meghatározása a terhesség I-II., valamint a II-III. harmadának határán. 3. A mikromanipulátorral kigyűjtött sejtek QF-PCR analízise segítségével a magzat genetikai nemének meghatározása. 4. A génexpressziós-lapka technológia használhatóságának vizsgálata magzatvízmintákban. 5. Génexpressziós különbségek vizsgálata magzati korban egy poligénes betegség (velőcső-záródási rendellenesség) esetén 29

30 3. Módszerek A magzati sejtek kimutatása, dúsítása és elemzése A várandós nő keringésében lévő magzati magvas vörösvérsejtek kimutatására, majd dúsítást követő elemzésére irányuló vizsgálataim február és június között történtek. A terhesek minden esetben részletes tájékoztatást kaptak a vizsgálatról, és beleegyező nyilatkozatot írtak alá. A kutatás etikai bizottsági engedéllyel történt. Az áramlási citometriai vizsgálatok a Magyar Honvédség Egészségvédelmi Intézetében, míg a kutatás többi része a Semmelweis Egyetem I. Sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikáján zajlott Perifériás vérminta levétele várandós nőktől, sejtszeparálás Percollal A könyökhajlati vénából 2x6 ml perifériás anyai vérmintát vettem EDTA-s csövekbe, majd ezeket 24 órán belül feldolgoztam. A mintákat azonos mennyiségű steril PBS-sel (phosphate buffered saline) hígítottam fel, majd 6 ml-es frakcióit egy 15ml-es tubusba előzetesen egymásra rétegezett 2,5-2,5 ml eltérő sűrűségű Percoll oldatokra (1,075 g/ml és 1,090 g/ml) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) pipettáztam, majd 400g-n 30 percig szobahőmérsékleten centrifugáltam. A centrifugát fékezés nélkül állítottam le. Az 1,075 g/ml és 1,090 g/ml Percoll oldat közti rétegét (kb. 4-5 ml) eltávolítottam, majd ezt 10 ml PBS-sel kétszer mostam Áramlási citometria vizsgálatok az esetleges FACS előtt Az első vizsgálati sorozat az esetleges FACS-al történő sejtszeparálás lehetőségeinek feltérképezése irányába történt: 12 várandós nő perifériás vérmintáját vizsgáltam. Egy terhes 20 hetes volt, 11 várandós nő terhességi kora 8 és 13 hét közötti volt. A vérmintákból Percollal történő sűrűséggradiens centrifugálás, majd sejtfelszíni és intracelluláris festést követő áramlási citometria vizsgálattal magzati magvas vörösvérsejtek kimutatása történt. 30