Az echinococcus-fertőzöttség szérodiagnózisa

Átírás

1 Paranit. Hung Az echinococcus-fertőzöttség szérodiagnózisa Dr. SURJÁN Lászlóné - Dr. STVERTECZKY Zsófia Országos Közegészségügyi Intézet, Budapest Az echinococcosis szerológiai diagnózisára a század elején bevezetett kompiementumkötési próbát és a CASONI-féle intracután tesztet alkalmazták hosszú ideig. Ezek a régi munkák eredeti formájukban ma már alig hozzáférhetők; legújabban KAGAN (1968) foglalta össze a hydatidosis-betegsépc szerológiai próbáinak történetét. A BOYDEN-féle hemagglutinációs próbára (BOYDEN, 1951) GARABEDIÁN és munkatársai hivták fel a figyelmet (1957). Azóta több szerző is beszámolt a hemagglutináció használatáról (ARABATZIS és PAPAPANAGIOTOU, 1963; HUTCHISON, 1968; CAPRON és munkatársai, 1970). Közben a latex-agglutinációs próbával is végeztek kísérleteket (SZYPRES, 1959; HUTCHISON, 1968), és a fluoreszcens antitest-próbát is alkalmazták (CAPRON és munkatársai, 1970; PISCHMAN és BEGGS, 1970). A BOYDEN-féle hemagglutinációt (HA) saját munkánkban 10 év óta rendszeresen használjuk. Minden nem haemolysáló protein és a megfelelő antitest vizsgálható ezzel a módszerrel.lényege, hogy mosott juh- vagy Rh-negativ, 0 csoportú emberi vörösvérsejtek kiméletes csersavas kezeléssel alkalmassá válnak protein természetű antigének adszorbeálására. Az igy szenzitizált vörösvérsejtek a specifikus ellenanyag hatására agglutinálódnak. A HA számos alkalmazási területe közül érdeklődésünk mindenekelőtt egy fontos gyakorlati kérdésre irányult: diftéria- és tetanusz-toxoiddal oltott gyermekek immunitását vizsgáltuk (SUR-

2 JÁNWÉ és NYERGESSÉ, 1962). Többezer vérsavómintán a HA-próbát a klasszikus biológiai értékméréssel összehasonlítva és az eredményeket matematikai analízissel értékelve azt találtuk, hogy a kétféle titrálás értékeinek logaritmusa között az összefüggés lineáris. A kis számban előforduló eltéréseket a módszerek korlátolt reprodukálhatósága és az ellenanyagok eltérő iramunglobulin-tipusa - IgM vagy IgG dominancia - bőven indokolja. Pár év óta az in vitro antitest-termelés módszeréhez alkalmazzuk' sikerrel a biológiai titrálásoknál sokkal érzékenyebb és gyorsabb HA-próbát. Indokoltnak látszott tehát, hogy sokéves tapasztalat és többezer titrálás után a HA-próbát az echinococcus szérodiagnosztikájába is bevezessük. Jelen munkánkban a komplementumkötéssel párhuzamosan végzett hemagglutinációs próba eredményét ismertetjük. Anyag és módszer Emberi savók. Az Országos Közegészségügyi Intézet Immunológiai osztályára az egész ország területéről echinococcosis szerológiai diagnosztizálására beküldött rutinsavókat vizsgáltunk, kivéve az aspecificitás ellenőrzésére később említendő szérummintákat. Sertéssavók. Vizsgáltuk 50, biztosan fertőzött és 40, biztosan nem fertőzött sertés savóját is a tömlőfolyadék begyűjtésével kapcsolatban. Pozitiv savó. Műtéttel verificált, biztosan echinococcus-fertőzött emberből származó savót liofilizálva tartunk fenn, és azt minden titráláshoz kontrollként használjuk. Ha a kontrollsavó értékében jelentős változást észlelünk, a vörösvérsejt-szuszpenziót, illetve a komplementumkötés antigénjét nem használjuk tovább. Antigén. Több sertés májából összegyűjtött cysta folyadékát 12

3 használjuk antigénként.rutin vizsgálatokhoz ml-es keverékeket készitünk. A sterilen leszivott cysta-folvadékot -20 Con tároljuk, konzerválószer nélkül. Emberi májról eltávolított cysta folyadékát csak egy izben tudtunk szerezni. Kompiementumkötést hagyományos módszerrel, +4 C-on 16 óráig tartó inkubálással végzünk. Antikomplementer hatást nem mutató cysta-folyadékot 0,5% Karbollal konzerválva, 1:2-1:8-as higitásban használjuk. Hemagglutináció. A vörösvérsejt-szuszpenzió csersavas kezelését és a formalinos tartósítást előző közleményünkben részletesen ismertettük (SURJATfflÉ, NYERGESNÉ, 1962). Szenzitizáláshoz jelen munkánkban több cysta-folyadékból nyert keveréket használunk. 2,5%-os, csersawal kezelt, mosott vörösvérsejt-szuszpenzióhoz azonos térfogatú, 6,4-es foszfátpufferben 1:4 arányban higitott cysta-folyadékot adunk. A keveréket 15 percig szobahőn állni hagyjuk, centrifugáljuk. Az üledéket 1% normál humánsavót tartalmazó foszfát-pufférrel ph 7.2-re beállított izotóniás konyhasó-oldatban mossuk, eredeti térfogatra reszuszpendáljuk, majd formalinos kezeléssel tartósítjuk. Az igy készült vörösvérsejtszuszpenzió +4 C-on hónapokig tárolható. A szenzitizált vörösvérsejt-szuszpenzióval egyidőben teljesen azonos módon,de szenzitizálás nélkül is készitünk formalinos vörösvér sejt-szuszpenziót, hogy az esetleges spontán agglutináció okozta álpozitiv reakciót kiküszöbölhessük. A vizsgálat menete. A reakciót mikromódszerrel, TAKÁTSY-féle lemezen végezzük (1956). Poszfát-pufférrel ph 7.2-re beállitott izotóniás konyhasóoldatban l:8-ra higitjuk az inaktivált savókat. Minden fenti szérumhigitásból két tovafutó higitási sort készitünk. A lemezek első mélyedésében tehát l:8-l:10-es, a 12. mélyedésben 1: li as a savók higitása. Az első hi gitási sorba a szenzitizált,a; másodikba a nem szenzitizált verse jt-szuszpenziót cseppentjük. A reakció 1 óra múlva leolvasható. A savó végtiterét az utolsó, ++++ pozitiv reakciót adó higitás reciprokával fejezzük ki.

4 Kisérletek és eredmények Különböző antigének szenzitizáló képességének vizsgálata. Első lépésként az egyes cysta-folyadékból vett mintákkal külön-külön szenzitizáltunk vörösvérsejtet, hogy az antigének közötti egyedi különbségeket vizsgáljuk és a legalkalmasabb anyagot válaszszuk ki szenzitizáláshoz. Egy humán és 3 sertésmájból, illetve sertéstüdőből származó cysta-folyadék szenzitizáló aktivitásának vizsgálatáról az 1. táblázaton számolunk be. 1. táblázat Különböző antigénminták (cysta-folyadékok) szenzitizáló képességének vizsgálata 10 komplementumkötésben pozitiv reakciót adó humansavó HA-titrálásával Table 1 Sensitivity of different antigen samples (cyst fluids) in HA titration of 10 samples of human serum positive in the complement-fixation test Savószám 1. sertésmájból 2. sertésmáj ból A n t 1 gén 3. sertésmájból 4. human májból 5. serte s- tüdőből n. v ? n. v

5 Amint az 1. táblázaton látható, a humán cysta-folyadók látszik legmegfelelőbbnek. Nagy segitséget jelentene, ha rendszeresen hozzájuthatnánk humán sebészeti anyaghoz.a 3 -sertésmájból származó cysta-folyadék között is jelentős különbség van, egy tüdőcystából vett anyag pedig használhatatlannak bizonyult. Célszerű tehát a cysta-folyadékokat előkisérletben megvizsgálni és csak a legjobbakat használni fel a nagyobb mennyiségű törzsantigénhez. Ezekből az adatokból az is látható, hogy több állatból származó cysta-folyadék keverékét célszerűbb felhasználni a szenzitizáláshoz Kpl-kötés+ Kpl-kötés+ Kpl-kötés- HA+ HA HA+- 1. ábra: A komplementumkötési és a hemagglutinációs próba eredményeinek összehasonlítása 50 pozitiv humán savóminta vizsgálata során Pig. 1: Comparison of the complement-fixation and haemagglutination tests during the examination of 50 positive human serum samples

6 A HA-próba összehasonlítása a komplementumkötéssel. A komplementum-kötéseket tömény savóval is beállitjuk, de a HA-próbákhoz kísérleteink első részében 1:20-as alaphigitást készítettünk a savókból. Minden pozitiv savóból komplementumkötéssel is quantitativ próbát végeztünk. Vizsgálatra beküldött 300 vérsavómintából vizsgálataink első részében 50 pozitiv reakciót kaptunk. Széket az eredményeket az 1. ábrán demonstráljuk.adataink szerint mindkét reakcióban pozitiv eredményt adott a savók 50%- a, csak komplementumkötésben pozitiv reakciót adott a savók 38%-a és csak HA-val pozitiv a savók 12%-a. Mivel ezekben a kísérletekben a HA alacsony érzékenységet mutatott,munkánk következő részében a HA-titráláshoz 1:8-as alaphigitásban vizsgáltuk a savókat (lásd a 2. táblázatot). Ezekben a vizsgálatokban 310 beküldött savóból mindkét reakcióval negativ lett 290 savó. HAval pozitiv reakciót adott 18 savó. Mindkét reakcióval pozitiv volt 10 savó, csak komplementumkötéssel pozitiv volt további 2 savó. A HA-próba ezekben a vizsgálatokban tehát valóban nagyobb pozitivitást adott. A 2. ábrán az is látható, hogy a kétféle vizsgálat titerei között csak az esetek egy részében van szoros korreláció, máskor alacsony HA-értékhez magas kompiementum-titer tartozik és megfordítva. Aspecificitás vizsgálata. A reakciók esetleges aspecificitásának vizsgálatára 100 egészséges felnőtt egyén és 42 kórházi beteg savóját vizsgáltuk. Ez utóbbiak klinikai diagnózisa: heveny fertőző betegség 4, krónikus májgyulladás 10, daganat 4, mechanikus icterus 6, cholelithiasis 10, krónikus cholecystitis 8.Ezekhez a vizsgálatokhoz l:4-es alaphigitásban is beállítottuk a savókat. A 42 savóból álpozitiv komplementumkötési reakciót a- dott 3 savó, a HA-próbával feltehetően aspecifikus reakciót a- dott 2 másik savó, de csak a savók l:4-es higitásában. A komplementumköté si reakciók is minimálisak voltak: +, ++ és a 100 egészséges felnőtt savó mindkét reakcióban negativ eredményt a- dott. Ezek szerint a savó 1:8-as vagy annál nagyobb higitásában már nem kell számolnunk aspecifikus reakcióval. Sertéssavók összehasonlító vizsgálata HA-val és komplementumköté ssel. Megvizsgáltuk 50 olyan sertésnek a savóját, amelyeknek

7 Hemagglutinációval és komplementumkötéssel kapott értékek össze hasonlítása. Savók alaphigitása HA-vizsgálathoz 1:8. Table 2 Comparison of haemagglutination and complement-fixation Basic dilution of serum for HA tests: 1:8 titres. Savószám HA-titer Komplementumkötés titere

8 máj-cystájából folyadékot szivtunk le antigén-készitéshez.a HApróbákhoz a savókat 1:10-re higitottuk. A sertések életkora 1-3 év volt. Eredményeinket a 3» táblázaton demonstráljuk. HA 2. ábra: Összefüggés a hemagglutinációs e próba titerei között Pig. 2: Correlations between the titres and complement-fixation tests s of komplementumkötési haemagglutination Amint a táblán látható, komplementumköt5 ellenanyagot nem tudtunk kimutatni. Vizsgáltunk még 80 egészséges sertéssavót is, ezek HA-ban (l:8-as alaphigitásban) negativ reakciót adtak, és természetesen a komplementumkötési reakciójuk is negativ volt.

9 Echinococcusszal fertőzött sertések savóinak szerológiai vizsgálata hemagglutinációval (HA) és komplementumkötéssel Table 3 Serological examination of serum from echinococcus-infected pigs with haemagglutination (HA) and complement-fixation tests. Savó- HA- Komplemen Savó- HA- Komplemenszám titer tumköté s szám titer tumköté s + l ; V ig: 1 éves sertések ig: 2-3 éves sertések Megbeszélés Jelen munkánkban az echinococcis szérodiagnózisának tökéletesítésére a HA-próbát vezettük be és alkalmaztuk a komplementumkö-

10 téssel párhuzamosan. A HA-próba, számos más területen közölt i - rodalmi adatok és a bevezetésben emiitett szerzők egybehangzó véleménye szerint sokkal érzékenyebb, mint a komplementumkötési reakció. Rutin humán savóink 1:20-as alaphigitásának használata esetén a HA-próba sokkal kevésbé érzékeny, mint a párhuzamosan végzett komplementumkötés, természetesen tömény savóval beállitva. Ha azonban hemagglutinációra 1:8-as savóhigitásokat is beállítottunk, akkor a HA-próba adott jelentősen nagyobb pozitivitást. A HA-reakció magasabb érzékenysége a titerekben is megnyilvánult. A komplementumkötések titere között változott, a HA-titereké pedig ig.Irodalmi adatoktól eltérően a HA-reakciók 1:8-as savóhigitások alkalmazása esetén nem adtak aspecifikus reakciót. Kompiementumkötő ellenanyagot sertéssavókban nem találtunk, igy ezeknek vizsgálatára a HA-próbát különösen alkalmasnak tartjuk. Sertéssavókkal végzett komplementumkötési próbák más antigén alkalmazása esetén is közismerten sok problémát okoznak, de ar ra is gondolnunk kell, hogy a cysta kialakulása után lassan je lennek meg a keringő antitestek, 'és fiatal sertésekben a hemagglutináció sem ad minden esetben pozitiv reakciót. Ujabb irodalmi adatok szerint a cysta-folyadéknál érzékenyebb és specifikusabb antigén készithető a scolexből, ARBANTES és ÁVILA (1968) agárgél-diffuziós vizsgálatokhoz, FISCHMAN (1968) komplementumkötéshez használja a scolex-antigént. A szerzők a scolex-antigennel magasabb érzékenységet találtak és használatát előnyösnek tartják azért is, mivel a gazda szöveti antigénjeivel nem kell számolni, és igy a reakciók specifikusabbak. A scolex-antigén használatát saját munkánkban kompiementumkötéshez már bevezettük. Az eddigi eredmények biztatóak. Nagyobb számú vizsgálati anyag birtokában ezeket az adatokat egy későbbi közleményben kivánjuk ismertetni. Humán savók vizsgálata alapján sem a HA-, sem az eddig alkalmazott komplementumkötési próba nem rendelkezik olyan előnnyel,

11 ami a másik reakciót feleslegessé tenné. Megállapíthatjuk tehát, hogy a HA hasznos kiegészítője a komplementumkötésnek. Köszönetnyilvánítás. Hálásan megköszönjük dr. BEZSILLA Ernőnek a sertéssavók beküldését és dr. SURJÁN Jánosnak több hasznos szakmai tanácsát. SURJAN, M. - STVERTECZKY, Zs.: Serodiagnosis of Ech l 'IOCOCCUS- ContaminatioD During examination of 810 human blood-serum samples sent in for echinococcosis diagnosis the authors compared the haemagglutination (HA) and complement-fixâtion (CP) tests. Thirty samples were positive by both tests, 15 by CP test only, and 16 samples by HA test only.the HA test gave more positive results only when a basic dilution of 1:8 and not 1:20 was used. Contrary to reports in the literature, no aspecific reactions were noted at this dilution. The greater sensitivity and specificity of the HA test were striking when the tests were compared on-samples from pigs. Of serum samples from 20 known echinococcus-positive young pigs, 10 reacted with HA test but gave no reaction with CP test. All serum samples from 30 known echinococcus-infected pigs of 2-3 years of age gave a positive HA reaction negative in the CP test.the but were negativity of CP reactions in swine serum can be explained by the difference in CP activity from that of human serum and by the relatively young age of the pigs tested. The quality of cyst-fluids from pigs varied greatly and therefore for testing of human serum the use of human cyst-fluids is considered to be the most suitable; Irodalom ARABATZIS, G. - PAPAPANAGIOTOU, J.: Laboratory test in hydatid disease: a comparison of the indirect haemagglutination, complement-fixâtion and intradermal tests. - Bull. WHO, 28, , 1963.

12 ABRANTES, P. - AVILA, R.: Scolex antigens in the laboratory diagnosis of hydatid disease. - Lancet, 2, , BOYDEN, S. V.: The adsorption of proteins on erythrocytes treated with tannic acid and subsequent hemagglutionation by antiprotein sera. - J.Exp.Med., 22» , CAPRON, A. - YARZABAL, L. - VERNES, A. - FRUIT, J.: Le diagnostic immunologique de 1'échinococcose humaine. - Path.Biol., 18, , PISCHMAN, A.: A new whole-scolex complement-fixation test for hydatid disease. - Bull. WHO, 3_2> 39-43, PISCHMAN, A. - BEGGS, W.A.: A preserved antigen for the hydatid fluorescent-antibody and other tests utilizing scolices. - Bull. WHO, 42, , GARABEDIAN, G.A. - MATOSSIAN, R.M. - DJANIAN, A.Y.: An indirect hemagglutination test for hydatid disease. - J. Immunol., 78, , HUTCHISON, W.P.: Serodiagnosis of echinococcus infection. - Am. J. Trop. Med. Hyg., 17, , KAGAN, I.G. - ALLAIN, D. S. - NORMAN, L.: An evaluation of the hemagglutination and flocculation test in the diagnosis of Echinococcus disease. - Am. J. Trop. Med. Hyg., 8_, 51-55, SURJÁN, M. - NYERGES, G.: Hemagglutination procedure for the assay of tetanus antitoxin of children's sera. - Z. Imm., forsch., 124, , SZYPRES, B. - KAGAN, I. G.: A modified slide latex screening test for hydatid disease. - J. Parasit., 49_, 69-72, TAKÁTSY, Gy. : The use of spiral loops in serological and virological micro-methods. - Acta Microbiol. Acad.- Sei. Hung., 2, , Érkezett: szept. 25. Dr. SURJÁN Lászlóné Országos Közegészségügyi Intézet Budapest IX., Gyáli ut 2.